CN102181567A

CN102181567A - 一种检测光滑假丝酵母菌的实时荧光定量pcr试剂盒

Info

Publication number: CN102181567A
Application number: CN2011101225117A
Authority: CN
Inventors: 王前; 龙燕; 郑磊
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2011-05-12
Filing date: 2011-05-12
Publication date: 2011-09-14

Abstract

本发明公开了一种检测光滑假丝酵母菌的实时荧光定量PCR试剂盒。包括如下物质：PCR反应液、引物探针混合液、PCR反应酶、纯H₂O、阳性定量标准品。用于检测光滑假丝酵母菌核酸扩增水平，可反映患者体内光滑假丝酵母菌感染的状态，可用于真菌感染的监测和防治，有助于疾病的早期诊断和治疗；实时荧光定量PCR技术针对光滑假丝酵母菌核酸特异性序列设计引物、探针，特异性强，灵敏度高，且具有较高通量，操作简便、相对降低成本的优点，适用于大多数患者多种标本的检测。本发明的试剂盒扩增待检标本由市售的实时荧光定量PCR仪完成，操作简单，耗时少，且最大限度地减少了污染的发生。

Description

一种检测光滑假丝酵母菌的实时荧光定量PCR试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测光滑假丝酵母菌（光滑念珠菌）的试剂盒，具体地说，涉及一种以实时荧光定量聚合酶链反应技术检测光滑假丝酵母菌的试剂盒。

背景技术

近年来，随着免疫受损人群（包括恶性肿瘤、血液病、艾滋病、SARS、糖尿病、自身免疫病、严重烧伤和创伤、长期吸毒者等）的不断扩大；广谱抗生素、皮质类固醇激素和免疫抑制剂在临床上广泛应用；器官移植、导管插管、介入治疗等新技术的普遍开展，使机会性真菌感染的发病率急剧上升，已经成为院内感染死亡的主要原因之一。

美国国家医院感染监测中心（NNIS）资料显示，20世纪90年代住院患者深部真菌感染率为80年代的1.9倍。1995-2002年美国49所医院连续7年的监测资料表明，念珠菌败血症在医院感染败血症中居第4位，病死率则居首位。

近年非白念珠菌的分离率升高，其中由光滑念珠菌引起的感染明显增加。调查显示1989—1999年，由光滑念珠菌所致的血源性感染上升，是引起念珠菌血症的第2位常见病原菌，从全球范围来看，约占念珠菌血症的15%。

光滑念珠菌也是口腔黏膜的重要病原真菌，由其引起的口腔感染占艾滋病患者口腔念珠菌感染的14%。同样，光滑念珠菌是分离自尿液的第2位常见病原真菌和引起外阴阴道念珠菌病(VVC)最常见的非白念珠菌，从VVC患者病灶部位分离的念珠菌中，光滑念珠菌占34.5%。

与其他非白念珠菌相比，光滑念珠菌引起的感染的病死率最高，为40%~70%，肿瘤患者和骨髓移植患者发生的光滑念珠菌血症的病死率分别高达50%和100%。

由于真菌感染初期症状不明显，临床表现缺乏特征性，早期诊断困难，易导致抗真菌治疗的延迟。而真菌感染尤其是深部真菌感染时病情凶险，常贻误治疗时机。加上光滑假丝酵母菌对常用抗真菌药物包括两性霉素B的敏感性低，且近年来对氟康唑的耐药率呈上升趋势，致使临床使用常见抗真菌药物治疗效果不佳。因此快速准确的诊断和鉴定感染真菌种类对指导治疗用药十分重要，能显著提高机会性真菌感染患者的生存率。

目前真菌感染的临床鉴定主要依赖于显微镜下孢子和菌丝的形态、培养的菌落特征以及生化结果，但这些传统的诊断方法通常周期长、敏感性差、阳性率低，不能满足临床需要。作为金标准的组织病理学和深部组织培养由于其有创性而难于被患者接受。因此，如何提高真菌感染的早期、特异诊断水平是目前临床真菌学领域的研究热点，也是临床检验中要解决的关键问题。

测定循环抗原与抗体的血清学方法，由于发生真菌感染的宿主多免疫受损，缺乏可检测到的抗体，或者抗体产生的变化较大，因此检测抗体对于诊断的意义不大。目前主要检测血液循环中的抗原，如甘露聚糖、(1, 3)-β-葡聚糖及D-/L-阿拉伯糖醇(DA/LA)等，但致病性真菌之间存在交叉抗原，导致血清学检查难以获得满意结果。

分子生物学方法在临床病原性真菌检测中的应用，为提高病原性真菌的检测灵敏度和特异性提供了良好的手段。常用的分子生物学方法有PCR、核酸探针、限制性酶切反应、PCR-RFLP、PCR-SSCP、基因芯片技术等。普通PCR因其易引起实验室污染，很少用于临床检验，通用引物PCR具有快速敏感的优势，但分离的特异性差，尤其不能对光滑念珠菌这种对部分抗真菌药物原发不敏感的菌株进行鉴定；核酸探针为增加特异性需要大量的探针，价格昂贵且耗时，不能用于常规实验室检查；PCR-SSCP、PCR-RFLP、基因芯片技术等敏感性和特异性都较好，但操作比较复杂、仪器设备要求高，多用于科研，目前均不宜用于临床检测。因此，寻找一种能快速、敏感和特异检测病原真菌的方法成为临床的迫切需求。

实时荧光定量PCR技术在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。避免了传统PCR以终产物检测定量产生的偏差，提高了实验的重复性。与常规PCR相比特异性更强，有效解决PCR产物污染，自动化程度高，敏感性通常达100拷贝／ml，线性范围宽，重复性好，且检测时间短。目前，实时荧光定量PCR已广泛应用，美国食品与药品管理局（FDA）已经批准了一些定量检测病原体的PCR诊断试剂盒，如用于HIV、结核分枝杆菌、沙眼衣原体等的实时荧光PCR检测的试剂盒。同样，中国目前也已批准了乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HIV和SARS等的实时荧光PCR检测试剂盒的生产和临床应用。在病原性真菌检测中的研究也有报道。在欧盟，基于定量PCR检测融合基因的一些诊断试剂盒已经通过CE认证。因此，开发一种能够检测光滑假丝酵母菌的实时荧光定量PCR试剂盒，为临床提供新的快速早期诊断手段，以期发现更多的光滑假丝酵母菌感染，采用更有效的治疗药物和方案，救治更多的患者；同时也可监测疗效，帮助临床评价治疗效果，并有效降低医疗成本。对IFI的诊断，治疗和预后具有重要意义。

众所周知，在使用已知的实时荧光定量PCR技术检测和定量分析临床样品中某特定靶核酸的实践中，为了减少和避免检测结果的假阴性或假阳性，提高定量分析的准确性，一个关键性的基本技术环节和技术难点是如何基于已知的靶多核苷酸序列设计并制备适当的引物和寡核苷酸探针。本发明人在以往多年从事PCR技术特别是实时荧光定量PCR技术研究的基础上，开发相应的试剂盒应用于光滑假丝酵母菌的检测和定量分析，成功地完成了本发明，并通过了一定样本量的临床试用和评价。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用实时荧光聚合酶链式反应技术进行光滑假丝酵母菌检测的试剂盒，利用本试剂盒可以准确鉴别并定量光滑假丝酵母菌。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

根据GENBANK上公布的核酸序列，寻找光滑假丝酵母菌核酸序列的特异性保守区，并针对保守区设计靶核苷酸引物和探针。这些引物探针在DNA聚合酶、PCR反应酶以及PCR反应液中，通过荧光PCR仪实现体外核酸的循环扩增。

本发明设计的光滑假丝酵母菌特异性的正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明设计的光滑假丝酵母菌特异性的反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明设计的光滑假丝酵母菌的特异性探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。所述探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团ECLIPSE。

一种检测光滑假丝酵母菌的实时荧光定量PCR试剂盒，包括如下物质：

PCR反应液、引物探针混合液、PCR反应酶、纯 H₂O和阳性定量标准品。

所述PCR反应液由Tris-HCl(50mmol/L， pH8.0)、MgCl₂(8mmol/L)和KCl(250mmol/L)组成。

所述引物探针混合液中引物浓度均为0.2mmol/L，探针浓度均为0.1mmol/L。

所述PCR反应酶由Hotstart Taq DNA聚合酶和dNTPs组成。 Taq酶、dNTPs均可采用市售产品；如TaKaRa公司的产品，其中每人份PCR反应酶系中Hotstart Taq DNA聚合酶的用量为5U，dNTPs用量为10mmol/L。

所述阳性定量标准品为含有序列为SEQ ID NO：4的DNA片段的pMD19-T重组质粒。

其中所述阳性定量标准品的制备方法由以下步骤组成：

（1）以提取的光滑假丝酵母菌DNA为模板，用序列为SEQ NO.5和SEQ NO.6的引物扩增出序列为SEQ NO.4的DNA片段，扩增程序为：95℃ 15分钟；94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 30秒，35个循环，最后一步为72℃ 7分钟；

（2）回收并纯化扩增所得的DNA片段SEQ NO.4；

（3）将DNA片段SEQ NO.4插入到pMD19-T，即可。

在上述检测光滑假丝酵母菌的实时荧光定量PCR试剂盒中，还可以添加阴性质控品和阳性质控品。所述阴性质控品为生理盐水，所述阳性质控品为灭活的光滑假丝酵母菌菌液，菌液浓度为5.0×10³~5.0×10⁶拷贝/mL。试剂盒中进行待检标本检测可同时进行两种质控品的检测，仅当阳性质控品检测时FAM通道荧光信号呈阳性，阴性质控品检测FAM通道荧光信号均呈阴性时，待检标本的检测结果才有效。

上述检测光滑假丝酵母菌的实时荧光定量PCR试剂盒的PCR扩增的条件为： 95℃ 15分钟；94℃ 15秒，58℃ 45秒，40个循环（58℃时收集荧光信号）。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）对光滑假丝酵母菌核酸扩增水平进行检测，可反映出患者体内光滑假丝酵母菌感染的状态，可用于真菌感染的监测和防治，有助于疾病的早期诊断和治疗；（2）实时荧光PCR技术针对光滑假丝酵母菌核酸特异性序列设计引物、探针，具有较高通量，操作简便、相对降低成本的优点，更适用于大多数患者检测。（3）本发明的试剂盒扩增待检标本由市售的实时荧光定量PCR仪自动完成，操作简单，耗时少，且最大限度地减少了污染的发生。检测结果可用于光滑假丝酵母菌检测、辅助临床诊断及常规监测等多个领域研究。

附图说明

图1为试剂盒阴性质控品的扩增曲线。图中没有S型扩增曲线，说明FAM通道荧光信号均呈阴性。

图2为试剂盒阳性质控品的扩增曲线。图中FAM通道的扩增曲线为S型，说明该通道的荧光信号呈阳性。

图3为阳性定量标准品的实时荧光定量PCR的标准曲线图。

图4为3例阴性样本的扩增曲线。图中没有S型扩增曲线，说明检测样本中无光滑假丝酵母菌核酸。

图5为3例标本（血液、痰液、肺泡灌洗液）样本的扩增曲线。图中FAM通道的扩增曲线为S型，说明样本有光滑假丝酵母菌核酸的扩增，表示样本中存在光滑假丝酵母菌。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1 光滑假丝酵母菌检测试剂盒及其使用

1、制备包括下列组成成分的试剂盒：引物探针混合液（25μl/管）1管，PCR反应液（250μl/管）1管，PCR反应酶系（75μl/管）1管，阳性质控品（200μl/管）1管，阴性质控品（200μl/管）1管，纯 H₂O（2000μl/管）1管。阳性定量标准品4管（10⁷拷贝/ml、10⁶拷贝/ml、10⁵拷贝/ml、10⁴拷贝/ ml）。

2、标本的采集、保存和运输

2.1标本类型：血液、痰液、肺泡灌洗液等。

2.2标本采集、保存和运送：取200ul的血液、痰液、肺泡灌洗液等置于无菌离心管中，贴好标签，置冰壶内携至实验室或低温（-20℃～-70℃）冻存。标本长途运送采用干冰。

3、核酸提取：

可采用市售的DNA提取试剂盒，建议使用TaKaRa的Yeast DNAiso Kit提取试剂盒，并按照试剂盒的说明书进行操作，最后收集约50μl DNA溶液，直接进行检测或保存于-20℃备用。

4、实时实时荧光定量PCR扩增及检测

4.1 试剂准备：按比例取相应量的引物探针混合液、PCR反应液、PCR反应酶系（引物探针混合液1μl/人份+ PCR反应液10μl/人份+ PCR酶系3μl/人份+纯 H₂O 16μl/人份），充分混匀后按30μl/管分装成PCR反应管，备用。

4.2 加样：向PCR反应管中，分别加入提取后的阴、阳性质控品、样本DNA溶液20μl，同时加入4管阳性定量标准品，盖紧管盖，放入仪器样品槽。

4.3 编辑：（ABI Prism 7500实时荧光定量PCR仪）

打开Setup窗口，按对应顺序设置阴、阳性和空白质控品及待测标本，并在Name栏中设置样品名称。选中所有设置样品孔，双击，选择Add Detector，选择Reporter为FAM和Quencher为ECLIPSE，在Passive Reference中选择（none）。打开instrument窗口设置循环条件：95℃ 15分钟；94℃ 15秒，58℃ 45秒，40个循环。所有设置完成后保存文件，运行。

4.4 结果分析及判断：

反应结束后保存检测数据文件。在Results 下打开Amp plot窗口。选择分析的目的样品所在位置。将Baseline数值改为start：3，stop：10，并打开manual设定Threshold：1.5±100000。双击Rn坐标上数值打开Graph settings窗口，将Post Run Settings中Log改为Linear，OK后打开Analysis preferences窗口，在Analysis菜单下选择Analyze自动分析结果。

结果判断：C（t）值小于35.0为阳性；大于35.0且无典型扩增曲线者为阴性；若C（t）值大于35.0且有典型扩增曲线者建议重做，重做结果出现C（t）值和典型扩增曲线者判为阳性，否则为阴性。起始模板拷贝数则根据标准曲线和所得的C（t）值计算。

实施例2 应用光滑假丝酵母菌检测试剂盒检测临床样品

选取3例经过培养方法鉴定为光滑假丝酵母菌阴性，3例经过培养方法鉴定为光滑假丝酵母菌阳性的标本，标本的核酸提取，PCR扩增及结果分析步骤参照实施例1进行，同时进行阴、阳性质控品的检测。

检测结果：阴性质控品的扩增曲线不呈S型（见图1），阳性质控品的扩增曲线为明显S型曲线（见图2），阴、阳性质控品均符合试剂盒的质控要求；仪器根据阳性定量标准品绘制的标准曲线（见图3）线性关系好，提示扩增效率一致，因此待检标本的检测结果是有效的。由待检标本的检测结果可知本试剂盒能特异地检测到相应光滑假丝酵母菌核酸的扩增（见图5），无光滑假丝酵母菌核酸的标本无扩增曲线（见图4）。

本次试验中6例标本的检测结果与真菌培养鉴定结果完全吻合，说明利用本试剂盒检测光滑假丝酵母菌是可行的。本试剂盒操作简便，检测时间短，可实现高通量检测，加之其价格低廉，有望应用于光滑假丝酵母菌的临床检测。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学

<120> 一种检测光滑假丝酵母菌的实时荧光定量PCR试剂盒

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgtgtttgg tagtgagtga tactc 25

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgagcagcag attaatagag aagc 24

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgctcgtgtc ccacatactg atatggc 27

<210> 4

<211> 234

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tccttctcaa acacgttgtg tttggtagtg agtgatactc tcgtttttga gttaacttga 60

aattgtaggc catatcagta tgtgggacac gagcgcaagc ttctctatta atctgctgct 120

cgtttgcgcg agcggcgggg gttaatactg tattaggttt taccaactcg gtgttgatct 180

agggagggat atgtgagtgt tctgtgcgtg ctgggcagac agacgtcttt aagt 234

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tccttctcaa acacgttgtg tt 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acttaaagac gtctgtctgc cc 22

Claims

1.光滑假丝酵母菌特异性的正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.光滑假丝酵母菌特异性的反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.光滑假丝酵母菌的特异性探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

4.如权利要求3所述的特异性探针，其特征在于所述探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团ECLIPSE。

5.一种检测光滑假丝酵母菌的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于包括如下物质：

PCR反应液、引物探针混合液、PCR反应酶、纯 H₂O、阳性定量标准品。

6.如权利要求5所述的检测光滑假丝酵母菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于所述PCR反应液由Tris-HCl(50mmol/L, pH8.0)、MgCl₂(8mmol/L)和KCl(250mmol/L)组成。

7.如权利要求5所述的检测光滑假丝酵母菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于所述引物探针混合液中引物浓度均为0.2mmol/L，探针浓度均为0.1mmol/L。

8.如权利要求5所述的检测光滑假丝酵母菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于所述PCR反应酶由Hotstart Taq DNA聚合酶和dNTPs组成，其中每人份PCR反应酶系中Hotstart Taq DNA聚合酶的用量为5U，dNTPs用量为10mmol/L。

9.如权利要求5所述的检测光滑假丝酵母菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于还含有阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品为生理盐水，所述阳性质控品为灭活的光滑假丝酵母菌菌液，菌液浓度为5.0×10³~5.0×10⁶拷贝/mL。

10.如权利要求5所述的检测光滑假丝酵母菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于所述定量阳性模板为含有序列为SEQ ID NO：4的DNA片段的pMD19-T重组质粒。