CN113862393A

CN113862393A - 一种快速检测格特隐球菌的方法

Info

Publication number: CN113862393A
Application number: CN202111405179.5A
Authority: CN
Inventors: 薛新颖; 刘玉霞; 赵晟; 臧学磊
Original assignee: Beijing Liangjue Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Liangjue Technology Co ltd
Priority date: 2020-03-10
Filing date: 2020-11-11
Publication date: 2021-12-31
Also published as: CN112359125A; CN111763756A

Abstract

本申请涉及一种用于检测格特隐球菌的引物探针组合、试剂盒及检测方法，其中，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本申请能够快速准确地检测出格特隐球菌，具有较高的灵敏度和特异性。

Description

一种快速检测格特隐球菌的方法

本申请是申请日为2020年11月11日、申请号为202011254539.1、名称为“一种快速检测格特隐球菌的方法”的发明申请的分案申请。

技术领域

本发明属于真菌病原学检测技术领域，具体涉及一种准确检测格特隐球菌的方法。

背景技术

隐球菌是一种病菌，可导致隐球菌病。媒介一般为干的鸽子粪，鲜有人与人之间传播的报告。尚无特效药，一般进行对症处理。隐球菌病是由隐球菌引起的肺部或播散性感染性疾病，主要引起肺炎和脑膜炎，也引起皮肤、骨骼或内脏器官感染。临床上结合临床表现以及显微镜检查结果进行诊断，再通过真菌培养或组织染色加以确认。临床上治疗药物包括两性霉素B、三唑类抗真菌药物和氟胞嘧啶。

隐球菌属目前确定的总类一共有37种，其中新生隐球菌和格特隐球菌致病力较强。此前，隐球菌病多为新生隐球菌所致，鲜有格特隐球菌致病的报道。近10年来，关于格特隐球菌病的报道逐渐增多。格特隐球菌之前被认为是新生隐球菌的格特变种(血清型B和C)，直到2002年被确立为一个独立的物种。和新生隐球菌以及其他真菌病原体一样，格特隐球菌可以从土壤以及腐烂的有机材料中分离得到，通过担孢子或隐球菌酵母细胞的吸入感染宿主引起肺炎，经过2-11个月的潜伏期后可以播散和演变为脑膜炎，未经治疗的免疫功能不全的患者潜伏期可能更长。新生隐球菌仅以所有感染免疫缺陷宿主为感染对象，而格特隐球菌以热带和亚热带地区的免疫功缺陷宿主为感染对象，除此之外，其临床表现、治疗药物以及预后均有所不同。

隐球菌病的诊断通常依靠直接镜检、细菌培养临床样本或检测体液中的隐球菌抗原。临床标本常规染色可以发现隐球菌，印度墨汁染色可以识别痰或脑脊液中的隐球菌但敏感性低。采用酶联免疫吸附实验(ELISA)或乳胶凝技术检测血液中的隐球菌比直接镜检更为敏感。国内已建立了ABC-ELISA法、免疫放射测定法用于检测新生隐球菌抗原，而且特异性和敏感性较高。然而，这些临床微生物实验室难以明确菌种，培养是目前较为常用的可靠的区分格特隐球菌和新生隐球菌的方法。最简单的确定格特隐球菌的方法是把隐球菌分离到刀豆氨酸-甘氨酸-溴麝香草酚蓝培养基中培养：格特隐球菌在培养基上生长并使菌落周围的培养基成为蓝色。

通过培养进行区分格特隐球菌和新生隐球菌的方法工作效率较低，耗费时间长，而且人力物力消耗很大，存在较大的局限性。核酸检测快速便捷，是近年来检测病原体的发展趋势。文献“新生隐球菌格鲁比变种、新生变种和格特隐球菌的多重聚合酶链反应鉴定，冯晓博《中华皮肤科杂志》2012年”建立了一种基于核糖体基因内间隔区(IGS)的多重聚合酶链反应(PCR)，用于快速鉴定新生隐球菌新生变种、格鲁比变种和格特隐球菌，该方法需要针对每一种菌设计引物，方法比较繁琐，反应不够快捷；专利“CN2017101725670”公开了一种检测并鉴定隐球菌的靶基因、引物和探针及试剂盒，属于医学真菌学的领域。根据隐球菌的靶基因，设计该检测隐球菌基因的引物序列如SEQ ID No.3与SEQ ID No.4和/或SEQID No.6与SEQ ID No.7所示，其中SEQ ID No.3与SEQ ID No.4对应于新生隐球菌，SEQ IDNo.6与SEQ ID No.7对应于格特隐球菌，可以在同一体系中用于特异性检测新生隐球菌与格特隐球菌两种隐球菌”，该方法只是将特异性扩增新生隐球菌和格特隐球菌引物和检测探针进行组合，创新性相对较低，而且两套扩增引物，成本更高，扩增反应相对繁琐。

因此，需要新的技术和方法来正确检测并鉴定格特隐球菌。

发明内容

本发明为了克服传统检测格特隐球菌的操作繁琐、灵敏度低、错误率高等缺陷，提供一种准确检测格特隐球菌的方法，该方法可以是诊断目的，也可以是非诊断目的。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种快速检测格特隐球菌的方法，其包括如下步骤

步骤1)选择待测样本；

步骤2)提取格特隐球菌DNA；

步骤3)制备实时荧光PCR反应体系；

步骤4)荧光PCR扩增。

进一步地，所述待测样本包括血液和体液。

进一步地，所述步骤4)荧光PCR扩增的条件为：95℃预变性10min；95℃10s，60℃60s，45个循环。

进一步地，所述实时荧光PCR反应体系包括引物和探针。

更近一步地，所述引物由SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ ID NO:2所示的下游引物组成；所述探针为HEX 5’-TCGGATGATGATCCTGAGACCGACG-3’BHQ1。

优选地，所述荧光PCR反应体系为：

Reagents	Voume(μL)
		10×ExTag Buffer	2.5μL
Original DNA	1μL
		dNTP	2μL
探针(10nmol/ml)	0.5μL
		上游引物(10nmol/ml)	0.5μL
下游引物(10nmol/ml)	0.5μL
		TaKaraExTag enzyme(5U/μL)	0.25μL
ΜLtrapure water	17.25μL

本发明还要求保护实时荧光PCR反应体系在同时检测新生隐球菌和格特隐球菌中的应用，其包括引物、探针1和探针2；所述引物由SEQ ID NO:1所示的上游引物和SEQ IDNO:2所示的下游引物组成；所述探针1为：FAM 5’-TCGGATGATGATCCTCAGACCGACC-3’BHQ1，所述探针2为：HEX 5’-TCGGATGATGATCCTGAGACCGACG-3’BHQ1。

优选地，所述荧光PCR反应体系为：

与现有技术相比较，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几点：本发明能够快速准确地检测出格特隐球菌，灵敏度和特异性较高；通过基因组学方法比对数十个新生隐球菌和格特隐球菌基因组序列差异，选择保守序列和差异序列，设计出引物和探针，在进行检测和鉴定新生隐球菌和格特隐球菌的过程中，具备敏感性高、特异性强的特点。另外，利用本发明试剂盒检测新生隐球菌和格特隐球菌时操作简单、检测时间短、适用性强的特点，本发明将检测新生隐球菌和格特隐球菌时所需的原料放在同一反应体系内，可同时检测并鉴定新生隐球菌和格特隐球菌，明确病原菌种类，帮助进行快速准确的临床诊断，为疾病治疗赢得宝贵时间。

附图说明

图1：新生隐球菌在不同浓度DNA(50ng，5ng，0.5ng，0.05ng)的扩增曲线；

图2：格特隐球菌在不同浓度DNA(50ng，5ng，0.5ng，0.05ng)的扩增曲线；

图3：新生隐球菌重复三个反应的特异性扩增曲线；

图4：格特隐球菌重复三个反应的特异性扩增曲线；

图5：新生隐球菌的特异性扩增曲线，平行试验检测大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌、白色念珠菌、光滑念珠菌，酿酒酵母菌，阿萨希毛孢子菌；

图6：格特隐球菌的特异性扩增曲线，平行试验检测大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌、白色念珠菌、光滑念珠菌，酿酒酵母菌，阿萨希毛孢子菌。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

新生隐球菌与格特隐球菌检测与鉴定的靶基因、引物、探针及其试剂盒

通过高通量测序技术获得了数十个新生隐球菌和格特隐球菌基因组序列，通过基因组学方法比对数十个隐球菌基因组序列差异，选择CAP59序列作为靶基因，该基因片段在两种隐球菌种内比较保守，并在新生隐球菌和格特隐球菌间存在差异。检测新生隐球菌和格特隐球菌靶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

针对选择的靶基因序列信息，采用primer软件进行引物设计。通过反复对比分析，最终设计出能够用于新生隐球菌和格特隐球菌检测与鉴定的实时荧光PCR检测引物和探针；所述特异性检测与鉴定新生隐球菌和格特隐球菌的特异性寡核苷酸引物序列如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示，该引物对是检测新生隐球菌和格特隐球菌的通用引物。所述检测新生隐球菌的探针序列如SEQ ID NO:3所示，检测格特隐球菌的探针序列如SEQ ID NO:4所示，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团，5’端连接有一个荧光报告基团。

所述引物序列如SEQ ID NO:1所示：5’-GTATTCGATACGGTGGTTGAACAGA-3’(Tm＝62.4℃)和SEQ ID NO:2所示：5’-GGTTCCAACGACCAGACAAAGG-3’(Tm＝63.2℃)；所述探针序列分别为SEQ ID NO:3所示：FAM5’-TCGGATGATGATCCTCAGACCGACC-3’BHQ1用于检测新生隐球菌(Tm＝70.2℃)，和SEQ ID NO:4所示：HEX5’-TCGGATGATGATCCTGAGACCGACG-3’BHQ1用于检测格特隐球菌(Tm＝71.1℃)。

所述引物特异性识别新生隐球菌中SEQ ID NO:5所示的序列和格特隐球菌中SEQID NO:6所示的序列。用于检测隐球菌的试剂盒，能够同时检测新生隐球菌和格特隐球菌，包括一对通用引物和分别用于检测新生隐球菌和格特隐球菌的探针，还包括缓冲液、dNTPs、MgCl2、Taq DNA聚合酶等。

一、试验材料：实验材料见表1

二、主要试剂与仪器

DNA提取采用天根公司酵母基因提取试剂盒；引物和探针的合成由生物工程有限公司完成；DNA聚合酶和dNTPs购自Takara公司；荧光定量PCR仪购于Roche公司。

三、实验方法

DNA提取和浓度测定：按照DNA提取试剂盒说明书提取DNA，使用分光光度计，测定样品中DNA含量，测定OD260/OD280比值。

实时荧光PCR反应体系见表1。扩增条件为：95℃预变性10min；95℃10s，60℃60s，45个循环，获得扩增结果。

表1 实时荧光PCR扩增反应体系(25μL)

四、分析判断扩增结果

样品的实时荧光PCR反应体系中，FAM荧光有荧光对数增长，且Ct值≤30.0时，则新生隐球菌检测结果为阳性；若样品的实时荧光PCR反应体系中，HEX荧光有荧光对数增长，且Ct值≤30.0时，则格特隐球菌检测结果为阳性。

五、敏感度、特异性和重复性检测

敏感度检测：将提取的新生隐球菌和格特隐球菌的模板DNA稀释成以下浓度：50ng/μL，5ng/μL，0.5ng/μL，0.05ng/μL，经荧光定量PCR方法检测得到新生隐球菌和格特隐球菌的最低可检测浓度，如图1-2所示新生隐球菌和格特隐球菌的最低下限可检测浓度为0.05ng/μL，灵敏度较高。

重复性检测：将新生隐球菌和格特隐球菌分别重复试验，如图3-4所示，各自三个反应的结果一致，重复性优异。

特异性检测：所设计的引物分别对新生隐球菌和格特隐球菌进行特异性扩增，所设计的探针能鉴定新生隐球菌和格特隐球菌。平行试验检测大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌、白色念珠菌、光滑念珠菌，酿酒酵母菌，阿萨希毛孢子菌，如图5-6所示，结果均为阴性，没有非特异性扩增曲线。

本发明通过引物和探针与模板的特异性杂交来鉴别模板的实时荧光PCR检测方法特异性高，假阳性低。检测PCR扩增后的荧光，放大了反应信号，灵敏度大大提高。本发明的方法巧妙地运用PCR技术的DNA高效扩增、核酸杂交的特异性和荧光检测技术的快速和敏感性，具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确、灵敏度高等优点，对新生隐球菌和格特隐球菌最低下限可检测浓度为0.05ng/μL，有利用精确区分两种隐球菌感染，灵敏度远优于现有试剂盒。本发明用于临床能有利于医师进行对新生隐球菌和格特隐球菌感染疾病的早期快速区分和诊断，改善治疗方案，减少药物的滥用。本发明技术方案操作方便，易于推广，具有较好的应用前景。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方式对本案作了详尽的说明，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所作的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 北京量觉科技有限责任公司

<120> 一种快速检测格特隐球菌的方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtattcgata cggtggttga acaga 25

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggttccaacg accagacaaa gg 22

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcggatgatg atcctcagac cgacc 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcggatgatg atcctgagac cgacg 25

<210> 5

<211> 560

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acggtacgcg cctcttgtcg ggtacaagaa gccttggtcc aactctggct ggttgggcaa 60

actgtttggc ggtaagagtg attcccacct gaccatggcg tcgaccactg gaaacgacag 120

gatggacagt atcaagcggg atctgcaagc gaggcagcac aagtacttct tcgccatcaa 180

cctgtacaac tcgtttgacg ttatccctga tatctttgcg acactcttcc gagcagctgc 240

catcttgggc taccacaatg tctttgtctc catttacgaa aacggttcca acgaccagac 300

aaaggcactc ttgaagattt ttgatgccct cgcgcgaacg gtcggtctga ggatcatcat 360

ccgaacatct atgcgtaccc gcggtctgtt caaccatcgt atcgaatacc tcgccgaagt 420

tcgaaacgcc gccatgctgc ccctccacga gcttcgtgac aatgacggag aagtcttcga 480

ctcggtcgtt ttcatgaatg atatcttgcc ttgcgtggac gacttgctcg agttgatttg 540

gcagagtagg agacagaatg 560

<210> 6

<211> 557

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acggtacgcg ccgctcgtag gctacaagaa accgtggtcc aactctggct ggttgcgcaa 60

gctgtttggc ggctcagacg cccagtccac catggcgtcc atcaccggga acgatcggat 120

ggacgtcatc aagagggatc tccaggcgag gcagcacaag tactttttcg ccatcaactt 180

gtacaactcg tttgacgtta tccccgatat ctttgcaacg ctcttccggg cagccgccat 240

cttgggatac cacaatgtct ttgtctccat ctacgaaaac ggttccaacg accagacaaa 300

ggcgctcttg aagattttcg atgccctcgc gcggaccgtc ggtctcagga tcatcatccg 360

aacatccatg cgtacccgtg gtctgttcaa ccaccgtatc gaataccttg ccgaagtccg 420

aaacgccgcc atgctgcccc tccacgaact ccgtgacaat gacggcgaag tctttgactc 480

ggtcgtcttc atgaacgata tcttgccctg tgtcgacgac ttgctcgagt tgatctggca 540

gagtagaaga cagaatg 557

Claims

1.一种用于检测格特隐球菌的引物探针组合，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述探针为核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的物质。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合，所述探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的引物探针组合，所述探针为HEX 5’-TCGGATGATGATCCTGAGACCGACG-3’BHQ1。

4.根据权利要求1所述的引物探针组合，所述引物特异性识别所述格特隐球菌中如SEQID NO:6所示的核苷酸序列。

5.一种用于检测格特隐球菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：如权利要求1-4中任一项所述的引物探针组合。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述上游引物的浓度为10nmol/mL，所述下游引物的浓度为10nmol/mL。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的浓度为10nmol/mL。

8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，每25μL所述试剂盒的反应体系中包括0.5μL所述上游引物、0.5μL所述下游引物。

9.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，每25μL所述试剂盒的反应体系中包括0.5μL所述探针。

10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：缓冲液，每25μL所述反应体系中包括2.5μL所述缓冲液。

11.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：模板DNA，每25μL所述反应体系中包括1μL所述模板DNA。

12.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：脱氧核苷三磷酸dNTP，每25μL所述反应体系中包括2μL所述dNTP。

13.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：DNA聚合酶，每25μL所述反应体系中包括0.25μL所述DNA聚合酶。

14.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：超纯水，每25μL所述反应体系中包括17.25μL所述超纯水。

15.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为10×缓冲液，所述DNA聚合酶的浓度为5U/μL。

16.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的荧光聚合酶链式反应PCR扩增的反应过程包括：

第一过程，95℃预变性10min；

第二过程，95℃，10s；

第三过程，60℃，60s；

第四过程，循环第二过程至第三过程45次。

17.一种检测格特隐球菌的方法，其特征在于，所述方法包括：

获取待测样本；

从所述待测样本中提取模板DNA；

对所述模板DNA进行荧光PCR扩增以获取扩增结果，所述荧光PCR扩增的反应物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述探针为核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的物质；

根据所述扩增结果判断所述待测样本中所述格特隐球菌的检测结果为阳性或阴性。

18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述根据所述扩增结果判断所述待测样本中所述格特隐球菌的检测结果为阳性或阴性包括：

当所述扩增结果中所述荧光报告基团有荧光对数增长，且循环阈值Ct小于或等于30.0时，判断所述待测样本中所述格特隐球菌的检测结果为阳性；

当所述扩增结果中所述荧光报告基团没有荧光对数增长，或当所述扩增结果中所述荧光报告基团有荧光对数增长，且循环阈值Ct大于30.0时，判断所述待测样本中所述格特隐球菌的检测结果为阴性。

19.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述对所述模板DNA进行荧光PCR扩增以获取扩增结果包括：

第一过程，95℃预变性10min；

第二过程，95℃，10s；

第三过程，60℃，60s；

第四过程，循环第二过程至第三过程45次以获取扩增结果。

20.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述待测样本包括血液和体液。

21.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。

22.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述探针为HEX 5’-TCGGATGATGATCCTGAGACCGACG-3’BHQ1。

23.根据权利要求17所述的方法，其特征在于，所述引物特异性识别所述格特隐球菌中如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

24.根据权利要求17-23中任一项所述的方法，其特征在于，所述上游引物的浓度、所述下游引物的浓度和所述探针的浓度均为10nmol/mL。

25.根据权利要求17-23中任一项所述的方法，其特征在于，所述荧光PCR扩增的反应体系包括：缓冲液、模板DNA、dNTP、DNA聚合酶、MgCl₂。

26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为10×缓冲液，所述DNA聚合酶的浓度为5U/μL。