CN113881789B - 用于检测隐球菌的探针及引物对组合物及检测方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于真菌检测技术领域，具体涉及一种用于检测隐球菌的探针及引物对组合物及检测方法和应用。该组合物包含：包含探针a和引物对a的第一组分和/或包含探针b和引物对b的第二组分和/或包含探针c和引物对c的第三组分和/或包含探针d和引物对d的第四组分。该组合物在检测菌株水平灵敏度较好，可检测DNA浓度为fg水平的样本，且菌株间无交叉反应，而且包含属水平及变种水平，可双重验证检测的准确性。使用该引物和探针的检测方法可用于不同临床样本(BALF及FFPE组织、渗出液(脓液))的检测，灵敏度较高。
Description
技术领域
本发明属于真菌检测技术领域，具体涉及一种用于检测隐球菌的探针及引物对组合物及检测方法和应用。
背景技术
隐球菌病是由隐球菌属引起的全球分布的感染性疾病，其主要病原菌为新生隐球菌及格特隐球菌。隐球菌病具有较高的发病率和病死率，每年约有600000人死于隐球菌病。临床常用的诊断方法包括培养及隐球菌抗原检测，不过均存在一定限制，而且不同致病菌种的药物敏感性存在差异。
现有专利CN202011254571.X公开了一种准确检测新生隐球菌的方法，该方法是通过设计的引物和探针进行检测，检测的最低下限可检测浓度为0.05ng/μl，最低检测限比较高，灵敏度低。
现有专利CN201911200173.7公开了一种利用拉曼散射鉴别新生隐球菌和格特隐球菌的方法，该方式以区分新生隐球菌和格特隐球菌为切入点，有针对性地研发了能够增强这两种真菌拉曼光谱信号并进行区分的检测方法。结果显示，真菌表面带有负电荷，可很好的吸附正价胶体银，研制合适粒径的正价胶体银可以很好的增强真菌拉曼检测信号，并能够鉴别极其近缘的真菌。该方法检测的限制条件较多，且检测准确度不高。
综上，现有检测隐球菌的方法灵敏度不高，而且大部分检测方法无法鉴定并定量到种隐球菌及隐球菌变种级别。
发明内容
有鉴于此，本发明在于提供一种用于检测隐球菌的探针及引物对组合物，该探针和引物对组合物可以精准检测隐球菌属中不同种的隐球菌，且检测到其中的格特隐球菌的最低检测限为347fg DNA。
所述组合物包含：第一组分，包含探针a和引物对a，所述探针a包含如sequenceNO.1所示的核酸序列，所述引物对a包含如sequence NO.2和sequence NO.3所示的核酸序列。
或所述组合物也可以只包含第二组分，包含探针b和引物对b，所述探针b包含如sequence NO.4所示的核酸序列，所述引物对b包含如sequence NO.5和sequence NO.6所示的核酸序列。该组合物中的探针和引物可以检测出隐球菌属的新生隐球菌新生变种，即可将新生隐球菌鉴定至新生变种。
或所述组合物也可以只包含第三组分，包含探针c和引物对c，所述探针c包含如sequence NO.7所示的核酸序列，所述引物对c包含如sequence NO.8和sequence NO.9所示的核酸序列；该组合物中的探针和引物可以检测出隐球菌属的新生隐球菌格鲁比变种，即可将新生隐球菌鉴定至格鲁比变种。
或所述组合物也可以只包含第四组分，包含探针d和引物对d，所述探针d包含如sequence NO.10所示的核酸序列，所述引物对d包含如sequence NO.11和sequence NO.12所示的核酸序列。该组合物中的探针和引物可以检测出隐球菌属的格特隐球菌。
或作为另一种技术方案，所述组合物包含上述第一组分、第二组分、第三组分、第四组分中的两种以上。
具体地，当包含第一组分和其他三种组分种任选的一种或多种组分时，可以鉴别出样本中是否含有隐球菌，并可以鉴定出是新生隐球菌还是格特隐球菌，或者进一步鉴定出是新生隐球菌新生变种还是新生隐球菌格鲁比变种，可以从属水平到种水平再到种变水平多重鉴定，提高其准确性。
具体地，当包含是第二组分、第三组分、第四组分的两种以上时，可以分别鉴别出新生隐球菌新生变种、新生隐球菌格鲁比变种、格特隐球菌。
进一步，上述的所有方案的检测方法均可以使用qPCR(实时荧光定量检测)方法或者仪器进行检测，而且可以进行定量分析检测出一种或多种隐球菌的含量。
进一步，所述探针a、探针b、探针c、探针d、探针e均带有不同的标记物。
优选地，所述标记物为荧光标记物。
具体地，在某些具体实施例中，上述探针a、探针b、探针c、探针d、探针e及引物对a、引物对b、引物对c、引物对d的设计方法步骤如下：
(1)对常见致病菌隐球菌转种培养后，提取DNA后对常用ITS区域引物用PCR仪进行扩增，扩增产物进行Sanger测序。
(2)结合NCBI数据库已报道的隐球菌相应菌种(新生隐球菌新生变种、新生隐球菌格鲁比变种、格特隐球菌)的全基因组数据(每个菌种的基因组大小约为17-18Mb)，选择上述3种隐球菌的不同菌株基因组序列，在网站(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)进行数次比对，同时人工逐个碱基比对，查找相应菌种的保守基因，即种内基因的相似区域。
(3)选取上述所得保守基因，在种间及种内(选择10株及以上菌株)序列中逐个碱基进行比对，(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)筛选获得保守片段(即需要扩增的保守片段的一部分)。
(4)在所筛选保守片段中利用NCBI-blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行设计引物及探针。隐球菌属通用的引物及探针共设计1组；种水平引物及探针均设计2组以上。
(5)再次在NCBI数据库中(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对引物所扩增DNA序列，确保引物特异性。所设计引物及探针的特异性均达到100％，即隐球菌属通用引物仅可检测到不同种隐球菌；种水平引物及探针未检测到其他病原真菌。
(6)验证所设计探针及引物的最低检测限及种间有无交叉反应，经过多次重复后，最终确定本发明所述的探针及引物。
本发明目的在于还提供一种前任一所述的组合物在作为或制备隐球菌检测试剂或隐球菌检测试剂盒中的应用。
具体地，当所述的组合作为或制备隐球菌检测试剂时，可以作为PCR的扩增引物，然后再进行相应的定性和定量分析；在制备隐球菌检测试剂(比如qPCR试剂体系)时，可以在探针加上标记物及其他必要的组分后(比如缓冲液等)构成qPCR试剂体系，可用于qPCR设备上样检测。
具体地，当所述的组合制备隐球菌检测试剂盒时，同样的，结合一些必要的试剂和装置也可以制备出检测隐球菌的试剂盒。
进一步，根据上述组合物不同的组合方案，那么制备成的检测试剂或者试剂盒便可以用于检测不同的隐球菌，比如可以单独检测隐球菌属，也可以进一步将隐球菌鉴定至新生隐球菌和格特隐球菌种级别，还可以进一步将新生隐球菌鉴定至新生隐球菌新生变种、新生隐球菌格鲁比变种，也可以单独鉴定新生隐球菌新生变种、新生隐球菌格鲁比变种、格特隐球菌中的一种或多种。
本发明目的在于还提供一种检测隐球菌试剂盒，该试剂盒包含前任一所述的探针及引物对组合物，还包括试剂盒一些必要的试剂与装置，该试剂盒可用于鉴别隐球菌至变种级别。
本发明目的在于还提供一种隐球菌的检测方法，该检测方法可以根据选择不同的探针和引物组，利用qPCR的方法将隐球菌鉴定至属、种以及变种水平，并且可以进行定量，检测限比较低，灵敏度高。
所述隐球菌的检测方法，包括：
(1)将探针-引物对一一组合的方式，将探针a-引物对a、探针b-引物对b、探针c-引物对c、探针d-引物对d其中一种或多种组合进行混合得探针-引物对溶液；将待测样本提取总的DNA得总NDA溶液；所述探针a、探针b、探针c、探针d分别进行不同的荧光标记；
(2)将所述探针-引物对溶液与所述总NDA溶液混合得混合液；
(3)使用荧光定量探针PCR方法检测所述混合液；
步骤(1)中，所述探针a-引物对a组合为隐球菌属通用检测探针-引物组，所述探针b包含如sequence NO.4所示的核酸序列，所述引物对a包含如sequence NO.5和sequenceNO.6所示的核酸序列；所述探针c包含如sequence NO.7所示的核酸序列，所述引物对c包含如sequence NO.8和sequence NO.9所示的核酸序列；所述探针d包含如sequence NO.10所示的核酸序列，所述引物对d包含如sequence NO.11和sequence NO.12所示的核酸序列。
具体地，所述隐球菌属通用检测探针-引物组为本领域技术人员均知的可以检测隐球菌属级别的探针-引物对。
进一步，所述探针a、探针b、探针c、探针d分别标记荧光a、荧光b、荧光c、荧光d。
具体地，当所述探针-引物对组合溶液包含探针a-引物对a组合和任选地探针b-引物对b组合、探针c-引物对c组合、探针d-引物对d组合一种或多种时，若结果显示所述探针a的荧光颜色，则判定所述待测样本携带隐球菌；若结果同时显示探针a和探针b的荧光颜色，则判定所述待测样本携带新生隐球菌新生变种；若结果同时显示探针a和探针c的荧光颜色，则判定所述待测样本携带新生隐球菌格鲁比变种；若结果同时显示探针a和探针d的荧光颜色，则判定所述待测样本携带格特隐球菌。可以将待检测样品鉴定至种间水平甚至变种水平。在某些具体实施例中，检测隐球菌属的通用探针-引物也可以是其他的可以检测出隐球菌的探针引物，然后结合探针b-引物对b组合、探针c-引物对c组合、探针d-引物对d组合进行检测，也能将待测样品鉴定至种间水平甚至种间变种水平。
具体地，当所述探针-引物对组合溶液包含探针a-引物对a组合、探针b-引物对b组合、探针c-引物对c组合、探针d-引物对d组合其中一种或多种时，那么可以根据qPCR的方法进行鉴定待测样品携带了哪几种隐球菌或者是否携带隐球菌。
优选地，所述探针a包含如sequence NO.1所示的核酸序列，所述引物对a包含如sequence NO.2和sequence NO.3所示的核酸序列。
进一步，根据探针-引物对组合对应的CT值，得到所述待检测样品中所述隐球菌属的含量和/或所述新生隐球菌新生变种含量和/或所述新生隐球菌格鲁比变种含量和/或所述格特隐球菌含量。比如探针a-引物对a组合对应的CT值为CT1，那么就可以根据荧光定量探针PCR方法计算出检测样本中隐球菌的浓度。
进一步，所述探针-引物对溶液中，若只含有一组探针-引物对，则所述探针-引物对的浓度为8-12μM；若含有多种探针-引物对，则所述探针-引物对溶液为浓度为8-12μM的所述多种探针-引物对混合，为了检测更加精准，优选为10μM。
进一步，所述总DNA溶液的体积一般选为0.8-1.2μl，为了更好的检测，优选为1ul。
进一步，所述待测样本来源BALF组织、FFPE组织或渗出液。说明本发明的检测方法检测限比较低，灵敏度高。
具体地，本发明中探针-引物对对隐球菌进行检测时，可以单独进行检测，如先使用所述探针a-引物对a检测是否含有隐球菌，在确定含有隐球菌后，进一步使用探针b-引物对b、探针c-引物对c、探针d-引物对d继续将隐球菌鉴定至新生隐球菌和格特隐球菌种间水平，利用探针b-引物对b、探针c-引物对c还可以将新生隐球菌鉴定至新生隐球菌新生变种、新生隐球菌格鲁比变种。
本发明中，“组合物也可以只包含第二组分”、“组合物也可以只包含第三组分”、“组合物也可以只包含第四组分”指的是除了主要包含第二组分、第三组分或第三组分外，还包括其他的组分，比如荧光标记物及其他试剂，并非是指组合物中仅仅只包含第二组分、第三组分或第四组分。
本发明中，术语“引物”是指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以氢键形式连接，这样的分子称为引物。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3’端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。
本发明中，术语“通用引物”指可与多种病原真菌的DNA模板链结合的引物。
本发明中，术语“特异性引物”指只能与某种真菌的DNA链模板特异结合，不结合其他病原真菌的DNA的引物。
本发明中，术语“探针”是一小段单链DNA或者RNA片段，用于检测与其互补的核酸序列。用放射性同位素(通常用磷-32)、荧光染料或者酶(如辣根过氧化物酶)标记成为探针。
本发明中，术语“保守片段”指在进化过程中基本保持不变的DNA分子中的一个核苷酸片段或者蛋白质中的氨基酸片段。在生物学中，保守序列指的是具有高度相似性或同一性的分子序列，这些序列可以是核酸序列(如RNA或DNA序列)，蛋白质序列，蛋白质结构或糖类中的序列。这些序列高度相似，却来自不同的物种或同一生物体产生的不同分子。
本发明中，术语“靶基因”指目的基因(gene of interest)，也称靶标基因，是指在实验中研究或操纵的特定基因。
本发明中，术语“Ct值”是指每个PCR反应管内荧光信号达到所设定的阈值时所经历的循环数(cycle)。
本发明有益效果在于
本发明提供的检测隐球菌的引物及探针是基于基因组水平，更加精准，且经过菌株水平验证，具有较高稳定性，可检测低至347fg水平的DNA浓度。
本发明提供的检测隐球菌的引物及探针在检测菌株水平灵敏度较好，可检测DNA浓度为fg水平的样本，且菌株间无交叉反应。
本发明提供的检测隐球菌的引物及探针包含属水平及变种水平，可双重验证检测的准确性。
本发明提供的检测隐球菌的引物及探针及检测方法可用于不同临床样本(BALF及FFPE组织、渗出液(脓液))的检测，灵敏度较高。
本发明提供的检测隐球菌的引物及探针及检测方法同时可鉴定至种水平，准确性高。
附图说明
图1为本发明探针及引物设计-检测的方法示意简图。
图2为Cry引物与毛霉菌DNA交叉反应情况。
图3为Cry引物与曲霉菌、镰刀菌、赛多孢及念珠菌DNA交叉反应情况。
图4为Neo引物与毛霉、曲霉、镰刀菌、赛多孢、念珠菌DNA交叉反应情况。
图5为Grub引物与毛霉菌DNA交叉反应情况。
图6为Grub引物与曲霉菌、镰刀菌、赛多孢及念珠菌DNA交叉反应情况。
图7为Grub引物与其他两种隐球菌DNA交叉反应情况。
图8为Gatti引物与毛霉菌DNA交叉反应情况。
图9为Gatti引物与曲霉菌、镰刀菌、赛多孢及念珠菌DNA交叉反应情况。
图10为Gatti引物与其他两种隐球菌DNA交叉反应情况。
图11为本发明设计的隐球菌属通用引物及探针(Cry)检测到新生隐球菌结果图。
图12为文献中的隐球菌属通用引物及探针((W-cry))检测到新生隐球菌结果图。
图13为本发明设计的隐球菌属通用引物及探针(Cry)检测到格特隐球菌结果图。
图14为文献中的隐球菌属通用引物及探针(W-cry)检测到格特隐球菌结果图。
图15为文献中的隐球菌属通用引物及探针(W-cry)检测特异性结果图。
图16为本发明设计的格特隐球菌引物探针(Gatti)检测到的格特隐球菌结果图。
图17为文献中的格特隐球菌引物探针(W-gatti)检测到的格特隐球菌结果图。
图18为文献中的格特隐球菌引物探针(W-gatti)检测特异性结果图。
需要说明的是，图11-图18中，曲线的颜色取决于验证时的荧光颜色，不同的探针-引物组，其颜色是不一样的，附图中，做了灰度处理，所以，颜色无法进行区别，但是其颜色是不同的。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本发明实施例中，利用本发明设计的引物对和探针检测样本的方法为：
(1)对设计的属通用引物及探针，种特异性引物及探针分别进行人工合成，并在探针的两端标记上特定的荧光，不同种的探针其标记的荧光不同，合成后将引物和探针用NanoDrop2000超微量分光光度计定量其浓度后备用；
(2)样本取材后进行总DNA提取，用NanoDrop2000超微量分光光度计定量样本的核酸浓度，定量备用；
(3)将步骤(1)中合成的引物、探针与步骤(2)中的样本DNA进行等比例加样混合后，上机，通过PCR(多聚酶链反应)仪器检测。所用PCR仪器为实时荧光定量PCR仪(qPCR)，该仪器可以通过可视化的信号改变来实时检测样本反应情况；
(4)结果判读：若样本携带病原菌(新生隐球菌新生变种、新生隐球菌格鲁比变种、格特隐球菌)，就会和设计的引物及探针结合，产生不同颜色的荧光信号，该信号在qPCR仪上的显示是不同颜色的指数扩增曲线及相应的Ct值，并通过阴性对照和阳性对照品的曲线和Ct值来质控每次的检测准确度，再通过待测样品的曲线颜色和Ct值来判定待测样本中的病原菌种类及含量。
本发明实施例中，按照图1所示的示意简图进行引物和探针的设计、然后进行菌株水平验证，然后进行临床样本检测，最终结果验证本发明设计的引物和探针的精准性。
本发明实施例中，现有文献指的是以下两篇文献：(1)Veron V,Simon S,BlanchetD,Aznar C.Real-time polymerase chain reaction detection of Cryptococcusneoformans and Cryptococcus gattii in human samples.Diagn Microbiol InfectDis.2009Sep；65(1):69-72。(2)Satoh K,Maeda M,Umeda Y,Miyajima Y,MakimuraK.Detection and identification of probable endemic fungal pathogen,Cryptococcus gattii,and worldwide pathogen,Cryptococcus neoformans,by real-time PCR.Microbiol Immunol.2011Jun；55(6):454-7。
实施例1引物和探针的设计
(1)对北京大学第一医院真菌保藏中心保藏的常见致病菌隐球菌转种培养后，提取DNA后，常用ITS区域引物用PCR仪进行扩增，扩增产物进行Sanger测序(测序仪器为ABI3730xl)。
(2)结合数据库已报道隐球菌相应菌种(新生隐球菌新生变种、新生隐球菌格鲁比变种、格特隐球菌)的全基因组数据(每个菌种的基因组大小约为17-18Mb)。选择上述3种隐球菌的不同菌株基因组序列，在网站(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)进行数次比对，同时人工逐个碱基比对，查找相应菌种的保守基因(本实施例中共查找到2个保守基因)，即种内基因的相似区域。
(3)选取步骤(2)中所得保守基因，在种间及种内(选择10株及以上菌株)序列中逐个碱基进行比对，(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)筛选获得保守片段(即需要扩增的保守片段的一部分)。
(4)在所筛选保守片段中利用NCBI-blast
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行设计引物及探针。隐球菌属通用的引物及探针共设计1组；种水平引物及探针均设计2组以上。
(5)再次在NCBI数据库中(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对引物所扩增DNA序列，确保引物特异性。所设计引物及探针的特异性均达到100％，即隐球菌属通用引物仅可检测到不同种隐球菌；种水平引物及探针未检测到其他病原真菌。
(6)选择6种曲霉(共12株)、8种毛霉(共16株)、2镰刀菌(共6株)、赛多孢(共4株)5种念珠菌(共10株)、3种隐球菌(共6株)接种至沙氏培养基培养3-7天。制备一定浓度的菌悬液，提取DNA，Nanodrop2000超微量分光光度计定量。倍比稀释验证所设计探针及引物的最低检测限及种间有无交叉反应，所有结果均重复2-3次。经过多次重复后，最终确定引物及探针如下表1所示。
表1引物及探针的序列信息
实施2菌株水平验证
选择北京大学第一医院真菌保藏中心保藏的烟曲霉、土曲霉、黑曲霉、黄曲霉、聚多曲霉、构巢曲霉、总状毛霉、不规则毛霉、多枝横梗霉、伞枝横梗霉、少根根霉、匍枝根霉、小孢根霉、微小根毛霉、新生隐球菌新生变种、格鲁比变种及格特隐球菌、念珠菌及镰刀菌进行验证。隐球菌菌种计数孢子，考虑提取效率为100％，倍比稀释检测引物及探针可检测最低DNA浓度及稳定性。隐球菌属引物探针灵敏度高于种特异性引物探针，每反应孔最低可检测347fg的DNA，其他菌株最高浓度，检测菌株间有无交叉反应，结果如下表2和图2-图10所示。
表2菌株间交叉反应情况
从图2和图3可以得知，Cry引物与毛霉菌DNA无交叉反应(如图2所示)；Cry引物与曲霉菌、镰刀菌、赛多孢及念珠菌DNA无交叉反应(如图3所示)。
从图4可以得知，Neo引物与毛霉、曲霉、镰刀菌、赛多孢、念珠菌DNA无交叉反应。
从图5-图7可以得知，Grub引物与毛霉菌DNA无交叉反应(如图5所示)；Grub引物与曲霉菌、镰刀菌、赛多孢及念珠菌DNA无交叉反应(如图6所示)；Grub引物与其他两种隐球菌DNA无交叉反应(如图7所示)。
从图8-图10可以得知，Gatti引物与毛霉菌DNA无交叉反应(如图8所示)；Gatti引物与曲霉菌、镰刀菌、赛多孢及念珠菌DNA无交叉反应(如图9所示)；Gatti引物与其他两种隐球菌DNA无交叉反应(如图10所示)。
实施例3临床样本检测
检测确诊侵袭性真菌病患者的FFPE组织，应用激光捕获显微切割技术精准捕获确诊侵袭性真菌病患者FFPE组织中的病原真菌，利用实施例1中设计的引物及探针使用qPCR体系检测病原真菌，共检测43例侵袭性真菌病样本，其中隐球菌病4例。经实施例1设计的引物及探针使用qPCR体系检测的结果：属水平引物探针灵敏度、特异度均可达100％，并将1例鉴定至变种水平(新生隐球菌格鲁比变种)。共检测肺泡灌洗液(BALF)418例，其中检出隐球菌属DNA 84例。
实施4与文献中的引物及探针进行菌株水平检测比较
合成现有文献中已发表的引物和探针，分别为隐球菌属通用引物探针(W-cry)、新生隐球菌引物探针(W-neo)以及格特隐球菌引物探针(W-gatti)。
(1)隐球菌属通用引物探针比较
使用实施例1所设计隐球菌属(Cry)通用引物及探针检测菌液，检测结果如图11和图13所示，使用现有文献中的隐球菌属通用引物(W-cry)及探针检测菌液，检测的结果如图12和图14所示，将文献的隐球菌属通用引物(W-cry)及探针检测的结果与本发明的实施例1所设计隐球菌属(Cry)通用引物及探针检测的结果进行对比，如下表3和表4所示。表3本发明(Cry)与文献中(W-cry)的隐球菌属通用引物及探针检测新生隐球菌情况
表4本发明(Cry)与文献中(W-cry)的隐球菌属通用引物及探针检测格特隐球菌情况
从表3和表4可以得知，实施例1所设计隐球菌属(Cry)通用引物及探针可检测347fg DNA，文献中的W-cry检测低限为3470fg，说明实施例1所设计隐球菌属(Cry)通用引物及探针在检测格特隐球菌方面具有更高的灵敏度。
从图15可以得知，文献W-cry引物探针与总状毛霉、多育赛多孢、热带念珠菌及光滑念珠菌存在交叉反应，特异性交差，实施例1中设计的引物探针与其他菌株无交叉反应。
(2)格特隐球菌引物探针比较
使用实施例1所设计格特隐球菌引物探针(Gatti)检测菌液，检测结果如图16所示，使用现有文献中的格特隐球菌引物探针(W-gatt)检测菌液，检测的结果如图17所示，将文献的实施例1所设计格特隐球菌引物探针(Gatti)检测的结果与本发明的现有文献中的格特隐球菌引物探针(W-gatt)检测的结果进行对比，如下表5所示。
表5本发明(Gatt)与文献中(W-gatt)的隐球菌属通用引物及探针检测格特隐球菌情况
从表5可以得知，实施例1所设计格特隐球菌引物探针(Gatti)具有更高的灵敏度，检测低限为34.7pg DNA；文献中所涉及的格特隐球菌引物探针(W-gatt)检测低限为3470pg。
而且如图18所示，文献W-gatt引物探针与土曲霉、不规则毛霉存在交叉反应，特异性交差，实施例1中设计的引物探针与其他菌株无交叉反应，即本发明设计的格特隐球菌引物探针(Gatti)特异度更高，菌株间无交叉反应。
实施例5与文献中的引物及探针进行FFPE组织样本检测比较
文献引物探针灵敏度为25％，且仅将致病菌鉴定至新生隐球菌水平，未鉴定至变种水平；实施例1中设计的引物探针检测确诊隐球菌病例，灵敏度达100％，并将1例临床样本鉴定至新生隐球菌格鲁比变种水平。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 北京大学第一医院
<120> 用于检测隐球菌的探针及引物对组合物及检测方法和应用
<130> 2021-9-27
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 1
ttagtgggaa ggtgattac 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 2
gacgtcggct cgccttaaa 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 3
ccataggccc agcgaaact 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 4
ttcagacgtt cccatgtgt 19
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 5
tgtgcttttg gaatatgcat cct 23
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 6
ggcatgttca ttgtcgagac a 21
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 7
agagtttggt tccgattat 19
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 8
gttgctgacg aagggatgag a 21
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 9
gcacaagcaa tagattcgat caa 23
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 10
atttgactac atccgtggct 20
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 11
gagagaggtt ttggttctga ttattactt 29
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 12
aagtgtgcca gtcgagacat ctaa 24
Claims (9)
1.用于检测隐球菌的探针及引物对组合物，其特征在于，包含：
（1）第一组分，包含探针a和引物对a，所述探针a如sequence NO.1所示，所述引物对a如sequence NO.2和sequence NO.3所示；和
（2）第二组分，包含探针b和引物对b，所述探针b如sequence NO.4所示，所述引物对b如sequence NO.5和sequence NO.6所示；和
（3）第三组分，包含探针c和引物对c，所述探针c如sequence NO.7所示，所述引物对c如sequence NO.8和sequence NO.9所示；和
（4）第四组分，包含探针d和引物对d，所述探针d如sequence NO.10所示，所述引物对d如sequence NO.11和sequence NO.12所示。
2.根据权利要求1所述的探针及引物对组合物，其特征在于，所述探针a、探针b、探针c、探针d、探针e均带有不同的标记物。
3.权利要求1-2任一所述的探针及引物对组合物在制备隐球菌检测试剂或隐球菌检测试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述隐球菌检测试剂或隐球菌检测试剂盒中用于检测隐球菌属和/或用于检测新生隐球菌和/或格特隐球菌和/或新生隐球菌新生变种和/或新生隐球菌格鲁比变种。
5.一种检测隐球菌试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-2任一所述的探针及引物对组合物。
6.一种非诊断目的的隐球菌的检测方法，其特征在于，包括：
（1）将待测样本提取总的DNA得总DNA溶液；
（2）将权利要求1所述的用于检测隐球菌的探针及引物对组合物与所述总DNA溶液混合得混合液；所述探针a、探针b、探针c、探针d分别进行不同的荧光标记；
（3）使用荧光定量探针PCR方法检测所述混合液。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述探针a、探针b、探针c、探针d分别标记荧光a、荧光b、荧光c、荧光d；所述用于检测隐球菌的探针及引物对组合物包含探针a-引物对a组合、探针b-引物对b组合、探针c-引物对c组合和探针d-引物对d组合；若结果显示所述探针a的荧光颜色，则判定所述待测样本携带隐球菌；若结果同时显示探针a和探针b的荧光颜色，则判定所述待测样本携带新生隐球菌新生变种；若结果同时显示探针a和探针c的荧光颜色，则判定所述待测样本携带新生隐球菌格鲁比变种；若结果同时显示探针a和探针d的荧光颜色，则判定所述待测样本携带格特隐球菌。
8.根据权利要求6-7任一所述的检测方法，其特征在于，所述用于检测隐球菌的探针及引物对组合物的浓度为8-12μM。
9.根据权利要求6-7任一所述的检测方法，其特征在于，所述待测样本来源BALF组织、FFPE组织或渗出液。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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