CN111004862B

CN111004862B - 用于快速检测并鉴定隐球菌的引物和探针及其应用

Info

Publication number: CN111004862B
Application number: CN202010159852.0A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Beijing Shijitan Hospital
Current assignee: Beijing liangjue Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2020-03-10
Filing date: 2020-03-10
Publication date: 2020-07-03
Anticipated expiration: 2040-03-10
Also published as: CN111004862A

Abstract

本发明属于真菌病原学检测的领域，公开了用于检测隐球菌的引物和探针，所述引物是检测新生隐球菌和格特隐球菌的通用引物；所述探针包括检测新生隐球菌和格特隐球菌的探针。本发明将检测新生隐球菌和格特隐球菌时所需的原料放在同一反应体系内，可同时检测并鉴定新生隐球菌和格特隐球菌，明确病原菌种类，帮助进行快速准确的临床诊断，为疾病治疗赢得宝贵时间。

Description

用于快速检测并鉴定隐球菌的引物和探针及其应用

技术领域

本发明属于真菌病原学检测的领域，具体涉及用于快速检测并鉴定隐球菌的引物和探针及其应用。

背景技术

隐球菌属在真菌分类学上属于半知菌亚门、芽孢菌纲、隐球酵母目、隐球酵母科，隐球菌属内种类较多，在自然界分布很广，其中引起人类感染的主要是新生隐球菌和格特隐球菌。近年来，国内外隐球菌感染呈上升趋势。

由于隐球菌感染后仅根据临床表现容易误诊，病原学检测是诊断和治疗的主要依据。现阶段主要的隐球菌检测方法都存在局限性，其中，脑脊液墨汁染色可以初步观察隐球菌的形态，但敏感性低；隐球菌抗原试剂可以快速检测隐球菌抗原，但不能区分新生隐球菌和格特隐球菌；隐球菌培养鉴定也难以鉴定新生隐球菌和格特隐球菌。文献“新生隐球菌格鲁比变种、新生变种和格特隐球菌的多重聚合酶链反应鉴定，冯晓博《中华皮肤科杂志》2012年” 建立了一种基于核糖体基因内间隔区（IGS）的多重聚合酶链反应（PCR），用于快速鉴定新生隐球菌新生变种、格鲁比变种和格特隐球菌，该方法需要针对每一种菌设计引物，方法比较繁琐，反应不够快捷；专利“CN2017101725670”公开了一种检测并鉴定隐球菌的靶基因、引物和探针及试剂盒，属于医学真菌学的领域。根据隐球菌的靶基因，设计该检测隐球菌基因的引物序列如SEQ ID No.3与SEQ ID No.4和/或SEQ ID No.6与SEQ ID No.7所示，其中SEQ ID No.3与SEQ ID No.4对应于新生隐球菌，SEQ ID No.6与SEQ ID No.7对应于格特隐球菌，可以在同一体系中用于特异性检测新生隐球菌与格特隐球菌两种隐球菌”，该方法只是将特异性扩增新生隐球菌和格特隐球菌引物和检测探针进行组合，需要使用两套扩增引物，成本更高，扩增反应相对繁琐。

因此，需要新的技术和方法来正确检测并鉴定新生隐球菌和格特隐球菌，并针对不同隐球菌对症下药，以减少诊断误差，避免药物滥用。

发明内容

本发明为了克服传统检测新生隐球菌和格特隐球菌方法的操作繁琐、灵敏度低、错误率高等缺陷，提供一种用于快速检测并鉴定隐球菌的引物和探针及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

用于检测隐球菌的引物和探针，所述引物是检测新生隐球菌和格特隐球菌的通用引物；所述探针包括检测新生隐球菌和格特隐球菌的探针。

具体地，

用于检测隐球菌的引物和探针，所述引物由SEQ ID NO：1所示的上游引物和SEQID NO：2所示的下游引物组成；所述探针包括检测新生隐球菌的探针1和检测格特隐球菌探针2。

进一步地，所述探针1 如SEQ ID NO：3所示，用于检测新生隐球菌；所述探针2如SEQ ID NO：4所示，用于检测格特隐球菌。

作为本发明的另一方面，本发明还涉及用于检测隐球菌的检测工具，其包括上述的引物和探针。

优选地，所述检测工具为检测试剂盒。

更优选地，所述检测试剂盒还包括缓冲液、dNTPs、MgCl₂以及Taq DNA聚合酶。

更优选地，所述隐球菌为新生隐球菌和格特隐球菌。

作为本发明的另一方面，本发明还要求保护上述的引物和探针在制备用于检测隐球菌的试剂盒中的应用。

优选地，所述隐球菌为新生隐球菌和格特隐球菌。

与现有技术相比较，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几点：

本发明通过基因组学方法比对数十个新生隐球菌和格特隐球菌基因组序列差异，选择保守序列和差异序列，设计出引物和探针，在进行检测和鉴定新生隐球菌和格特隐球菌的过程中，具备敏感性高、特异性强的特点，灵敏度可达到0.05ng/ul，较现有技术提高两个数量级。另外，利用本发明试剂盒检测新生隐球菌和格特隐球菌时操作简单、检测时间短、适用性强的特点，本发明将检测新生隐球菌和格特隐球菌时所需的原料放在同一反应体系内，可同时检测并鉴定新生隐球菌和格特隐球菌，明确病原菌种类，帮助进行更早期快速准确的临床诊断，减少药物滥用，为疾病治疗赢得宝贵时间。

附图说明

图1：新生隐球菌在不同浓度DNA(50ng，5ng，0.5ng，0.05ng)的扩增曲线；

图2：格特隐球菌在不同浓度DNA(50ng，5ng，0.5ng，0.05ng)的扩增曲线；

图3：新生隐球菌重复三个反应的特异性扩增曲线；

图4：格特隐球菌重复三个反应的特异性扩增曲线；

图5：新生隐球菌的特异性扩增曲线，平行试验检测大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌、白色念珠菌、光滑念珠菌，酿酒酵母菌，阿萨希毛孢子菌；

图6：格特隐球菌的特异性扩增曲线，平行试验检测大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌、白色念珠菌、光滑念珠菌，酿酒酵母菌，阿萨希毛孢子菌。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

新生隐球菌与格特隐球菌检测与鉴定的靶基因、引物、探针及其试剂盒

通过高通量测序技术获得了数十个新生隐球菌和格特隐球菌基因组序列，通过基因组学方法比对数十个隐球菌基因组序列差异，并通过初步的引物和探针设计，最终选择CAP59序列作为靶基因，该基因片段在两种隐球菌种内比较保守，并在新生隐球菌和格特隐球菌间存在一定的差异。检测新生隐球菌和格特隐球菌靶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

针对选择的靶基因序列信息进行引物设计。通过反复对比分析，最终设计出能够用于新生隐球菌和格特隐球菌检测与鉴定的实时荧光PCR检测引物和探针；所述特异性检测与鉴定新生隐球菌和格特隐球菌的特异性寡核苷酸引物序列如SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示，该引物对是检测新生隐球菌和格特隐球菌的通用引物。所述检测新生隐球菌的探针序列如SEQ ID NO：3所示，检测格特隐球菌的探针序列如SEQ ID NO：4所示，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团，5’端连接有一个荧光报告基团。

所述引物序列如SEQ ID NO：1所示：5’-GTATTCGATACGGTGGTTGAACAGA-3’（Tm=62.4℃）和SEQ ID NO：2所示：5’-GGTTCCAACGACCAGACAAAGG-3’（Tm=63.2℃）；所述探针序列分别为SEQ ID NO：3所示：FAM 5’-TCGGATGATGATCCTCAGACCGACC-3’BHQ1用于检测新生隐球菌（Tm=70.2℃），和SEQ ID NO：4所示：HEX 5’-TCGGATGATGATCCTGAGACCGACG-3’BHQ1用于检测格特隐球菌（Tm=71.1℃）。

所述引物特异性识别新生隐球菌中SEQ ID NO：5所示的序列和格特隐球菌中SEQID NO：6所示的序列。用于检测隐球菌的试剂盒，能够同时检测新生隐球菌和格特隐球菌，包括一对通用引物和分别用于检测新生隐球菌和格特隐球菌的探针，还包括缓冲液、dNTPs、MgCl2、Taq DNA聚合酶等。

一、试验材料：实验材料见表1

二、主要试剂与仪器

DNA提取采用天根公司酵母基因提取试剂盒；引物和探针的合成由生物工程有限公司完成；DNA聚合酶和dNTPs购自Takara公司；荧光定量PCR仪购于Roche公司。

三、实验方法

DNA提取和浓度测定：按照DNA提取试剂盒说明书提取DNA，使用分光光度计，测定样品中 DNA 含量，测定OD260/OD280比值。

实时荧光PCR反应体系见表1。扩增条件为：95℃预变性10min；95℃ 10s，60℃60s，45个循环，获得扩增结果。

表1 实时荧光PCR扩增反应体系 (25ul)

四、分析判断扩增结果

样品的实时荧光PCR反应体系中，FAM荧光有荧光对数增长，且Ct值≤30.0时，则新生隐球菌检测结果为阳性；若样品的实时荧光PCR反应体系中，HEX荧光有荧光对数增长，且Ct值≤30.0时，则格特隐球菌检测结果为阳性。

五、敏感度、特异性和重复性检测

敏感度检测：将提取的新生隐球菌和格特隐球菌的模板DNA稀释成以下浓度：50ng/ul，5 ng/ul，0.5 ng/ul，0.05 ng/ul，经荧光定量PCR方法检测得到新生隐球菌和格特隐球菌的最低可检测浓度，如图1-2所示新生隐球菌和格特隐球菌的最低下限可检测浓度为0.05 ng/ul，灵敏度较高。

重复性检测：将新生隐球菌和格特隐球菌分别重复试验，如图3-4所示，各自三个反应的结果一致，重复性优异。

特异性检测：所设计的引物分别对新生隐球菌和格特隐球菌进行特异性扩增，所设计的探针能鉴定新生隐球菌和格特隐球菌。平行试验检测大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌、白色念珠菌、光滑念珠菌，酿酒酵母菌，阿萨希毛孢子菌，如图5-6所示，结果均为阴性，没有非特异性扩增曲线。

本发明通过引物和探针与模板的特异性杂交来鉴别模板的实时荧光PCR 检测方法特异性高，假阳性低。检测PCR扩增后的荧光，放大了反应信号，灵敏度大大提高。本发明的方法巧妙地运用PCR 技术的DNA高效扩增、核酸杂交的特异性和荧光检测技术的快速和敏感性，具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确、灵敏度高等优点，对新生隐球菌和格特隐球菌

最低下限可检测浓度为0.05 ng/ul，有利用精确区分两种隐球菌感染，灵敏度远优于现有试剂盒。本发明用于临床能有利于医师进行对新生隐球菌和格特隐球菌感染疾病的早期快速区分和诊断，改善治疗方案，减少药物的滥用。本发明技术方案操作方便，易于推广，具有较好的应用前景。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方式对本案作了详尽的说明，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所作的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 首都医科大学附属北京世纪坛医院

<120> 用于快速检测并鉴定隐球菌的引物和探针及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtattcgata cggtggttga acaga 25

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggttccaacg accagacaaa gg 22

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcggatgatg atcctcagac cgacc 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcggatgatg atcctgagac cgacg 25

<210> 5

<211> 560

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acggtacgcg cctcttgtcg ggtacaagaa gccttggtcc aactctggct ggttgggcaa 60

actgtttggc ggtaagagtg attcccacct gaccatggcg tcgaccactg gaaacgacag 120

gatggacagt atcaagcggg atctgcaagc gaggcagcac aagtacttct tcgccatcaa 180

cctgtacaac tcgtttgacg ttatccctga tatctttgcg acactcttcc gagcagctgc 240

catcttgggc taccacaatg tctttgtctc catttacgaa aacggttcca acgaccagac 300

aaaggcactc ttgaagattt ttgatgccct cgcgcgaacg gtcggtctga ggatcatcat 360

ccgaacatct atgcgtaccc gcggtctgtt caaccatcgt atcgaatacc tcgccgaagt 420

tcgaaacgcc gccatgctgc ccctccacga gcttcgtgac aatgacggag aagtcttcga 480

ctcggtcgtt ttcatgaatg atatcttgcc ttgcgtggac gacttgctcg agttgatttg 540

gcagagtagg agacagaatg 560

<210> 6

<211> 557

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acggtacgcg ccgctcgtag gctacaagaa accgtggtcc aactctggct ggttgcgcaa 60

gctgtttggc ggctcagacg cccagtccac catggcgtcc atcaccggga acgatcggat 120

ggacgtcatc aagagggatc tccaggcgag gcagcacaag tactttttcg ccatcaactt 180

gtacaactcg tttgacgtta tccccgatat ctttgcaacg ctcttccggg cagccgccat 240

cttgggatac cacaatgtct ttgtctccat ctacgaaaac ggttccaacg accagacaaa 300

ggcgctcttg aagattttcg atgccctcgc gcggaccgtc ggtctcagga tcatcatccg 360

aacatccatg cgtacccgtg gtctgttcaa ccaccgtatc gaataccttg ccgaagtccg 420

aaacgccgcc atgctgcccc tccacgaact ccgtgacaat gacggcgaag tctttgactc 480

ggtcgtcttc atgaacgata tcttgccctg tgtcgacgac ttgctcgagt tgatctggca 540

gagtagaaga cagaatg 557

Claims

1.用于检测隐球菌的引物对和探针组合，其特征在于，所述引物对由SEQ ID NO：1所示的上游引物和SEQ ID NO：2所示的下游引物组成；所述探针包括检测新生隐球菌的探针1和检测格特隐球菌探针2；所述探针1为：FAM 5’-TCGGATGATGATCCTCAGACCGACC-3’BHQ1；所述探针2为：HEX 5’-TCGGATGATGATCCTGAGACCGACG-3’BHQ1。

2.用于检测隐球菌的检测工具，其特征在于，所述检测工具包括权利要求1所述的引物对和探针组合。

3.根据权利要求2所述的检测工具，其特征在于，所述检测工具为检测试剂盒。