CN113718053A

CN113718053A - 用于检测耶氏肺孢子菌探针及引物对及检测方法和应用

Info

Publication number: CN113718053A
Application number: CN202111160897.0A
Authority: CN
Inventors: 宋营改; 刘晓; 李若瑜
Original assignee: Peking University First Hospital
Current assignee: Peking University First Hospital
Priority date: 2021-09-30
Filing date: 2021-09-30
Publication date: 2021-11-30

Abstract

本发明属于真菌检测技术领域，具体涉及一种用于检测耶氏肺孢子菌探针及引物对及检测方法和应用。所述探针及引物对选择以下任意两组中其中一组：(1)探针及引物对a，其中，探针包含如sequence NO.1所示的核酸序列，引物对包含如sequence NO.3和sequence NO.4所示的核酸序列；或(2)探针及引物对b，其中，探针包含如sequence NO.2所示的核酸序列，引物对包含如sequence NO.5和sequence NO.6所示的核酸序列。使用该探针及引物进行qPCR检测样本时，在菌株间无交叉反应，特异性高；且具有较高的灵敏度。

Description

用于检测耶氏肺孢子菌探针及引物对及检测方法和应用

技术领域

本发明属于真菌检测技术领域，具体涉及一种用于检测耶氏肺孢子菌探针及引物对及检测方法和应用。

背景技术

近年来，随着更广泛地使用有效的免疫抑制剂，包括各种单克隆抗体，以及器官移植的日益增多，肺孢子菌病在未感染艾滋病毒的患者中的发病率一直在上升。目前真菌镜检仍为诊断肺孢子菌病的金标准，但灵敏度较低。

现有专利CN202110279354.4公开了一种用于定性检测耶氏肺孢子菌的试剂盒和方法，该方法是利用RNA恒温扩增和CRISPR检测技术开发的耶氏肺孢子菌定性检测试剂盒，主要包括：1)扩增缓冲液；2)扩增酶；3)检测缓冲液；4)检测酶；5)矿物油；6)质控品，该检测方法步骤复杂，且仅仅适用于活菌检测。

现有专利CN201811064984.4公开了一种检测耶氏肺孢子菌的LAMP引物组合物和方法，该方法是基于环介导恒温扩增技术，该方法最终的判别使用肉眼进行判断颜色变化，灵敏度低，在鉴定低含量耶氏肺孢子菌时，具有很大的局限性。

综上，现有技术存在灵敏度低、操作复杂，仅适用活菌检测等问题。

发明内容

有鉴于此，本发明在于提供一种用于检测耶氏肺孢子菌的探针及引物对，该引物对及探针对耶氏肺孢子菌的特异性强，与其他菌种无交叉反应，用来检测耶氏肺孢子菌时，精确度高。

所述探针及引物对选择以下任意两组中其中一组：(1)探针及引物对a，其中，探针包含如sequence NO.1所示的核酸序列，引物对包含如sequence NO.3和sequence NO.4所示的核酸序列；或(2)探针及引物对b，其中，探针包含如sequence NO.2所示的核酸序列，引物对包含如sequence NO.5和sequence NO.6所示的核酸序列。

进一步，所述探针两端带有标记物。

进一步，所述标记物为荧光标记物。

具体地，在某些具体实施例中，所述探针及引物对的设计方法如下：

(1)查询数据库(Ensemble及NCBI数据库)已报道耶氏肺孢子菌的全基因组数据，结合已发表文献，选择保守基因(本实施例筛选2个保守基因，在folic acidsynthesisprotein fol1和hsp77-like protein基因区域找到靶基因)。选取上述所得保守基因，在种内(选择10株及以上菌株)序列中逐个碱基进行比对，(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)筛选获得保守片段(即需要扩增的保守片段的一部分)。

(2)在所筛选保守片段中利用NCBI-blast

(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行设计引物对及探针，耶氏肺孢子菌引物对探针共设计4组。

(3)再次在NCBI数据库中(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对引物所扩增DNA序列，确保引物特异性。所设计引物及探针的特异性均达到100％，即该引物仅可检测到耶氏肺孢子菌。

(4)进行菌株水平的特异性验证，最终确定2组如上所述的耶氏肺孢子菌引物及探针。

在某些具体实施例中，将两种探针及引物对混合使用，标记不同的荧光颜色，不仅不会影响检测的准确性，而且还有双重验证的效果，

本发明目的在于还提供一种检测耶氏肺孢子菌或肺孢子菌肺炎的试剂盒，所述试剂盒包含前任一所述的探针及引物对，还包括试剂盒一些必要的试剂与装置，比如缓冲液、孔板等。

本发明目的在于还提供一种耶氏肺孢子菌的检测方法，该检测方法是基于前述的探针及引物对进行的qPCR方法进行检测，可精确的检测出耶氏肺孢子菌，且适用的范围比较广。

所述检测方法，包括：

(1)将权利要求1所述的探针及引物对混合得探针-引物对溶液；将待测样本提取总的DNA得总NDA溶液；

(2)将所述探针-引物对溶液与所述总NDA溶液混合；

(3)使用荧光定量探针PCR方法检测所述混合液。

进一步，所述待测样本选自BALF样本、FFPE组织或渗出液。

进一步，所述探针-引物对溶液的浓度为8-12μM，为了检测方便，一般选择为10μM。

进一步，所述总DNA溶液的体积一般选为0.8-1.2ul，为了方便检测，一般固定为1ul。

进一步，若两种探针同时使用时，则所述两种探针两端设置成不同的标记物。

本发明目的在于还提供一种前任一所述的探针及引物对在检测耶氏肺孢子菌中的应用；以及前任一所述的探针及引物对在作为或制备检测耶氏肺孢子菌试剂或试剂盒中的应用。

本发明中，术语“引物”是指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以氢键形式连接，这样的分子称为引物。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3’端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。

本发明中，术语“通用引物”指可与多种病原真菌的DNA模板链结合的引物。

本发明中，术语“特异性引物”指只能与某种真菌的DNA链模板特异结合，不结合其他病原真菌的DNA的引物。

本发明中，术语“探针”是一小段单链DNA或者RNA片段，用于检测与其互补的核酸序列。用放射性同位素(通常用磷-32)、荧光染料或者酶(如辣根过氧化物酶)标记成为探针。

本发明中，术语“保守片段”指在进化过程中基本保持不变的DNA分子中的一个核苷酸片段或者蛋白质中的氨基酸片段。在生物学中，保守序列指的是具有高度相似性或同一性的分子序列，这些序列可以是核酸序列(如RNA或DNA序列)，蛋白质序列，蛋白质结构或糖类中的序列。这些序列高度相似，却来自不同的物种或同一生物体产生的不同分子。

本发明中，术语“靶基因”指目的基因(gene of interest)，也称靶标基因，是指在实验中研究或操纵的特定基因。

本发明中，术语“Ct值”是指每个PCR反应管内荧光信号达到所设定的阈值时所经历的循环数(cycle)。

本发明有益效果在于

本发明提供的用于检测耶氏肺孢子菌的探针及引物在菌株间无交叉反应，特异性高；且临床样本中检测具有较高的灵敏度。

本发明提供的用于检测耶氏肺孢子菌的探针及引物及检测方法对是基于基因组水平，更加精准，可用于不同临床样本(BALF及FFPE组织、渗出液(脓液))的检测，灵敏度较高。

附图说明

图1为用于检测耶氏肺孢子菌的探针及引物对的设计-验证步骤示意图。

图2为PCP1a探针-引物对特异性检验结果。

图3为PCP2a探针-引物对特异性检验结果。

图4为现有文献中用于检测耶氏肺孢子菌引物探针及引物对的特异性结果图。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

本发明实施例中，利用本发明设计的探针及引物对检测样本的方法为：

(1)对探针及引物组PCP1a和PCP2a分别进行人工合成，并在探针的两端标记上特定的荧光，不同种的探针其标记的荧光不同，合成后将引物和探针用NanoDrop2000超微量分光光度计定量其浓度后备用；

(2)样本取材后进行总DNA提取，用NanoDrop2000超微量分光光度计定量样本的核酸浓度，定量备用；

(3)将步骤(1)中合成的引物、探针与步骤(2)中的样本DNA进行等比例加样混合后，上机，通过PCR(多聚酶链反应)仪器检测。所用PCR仪器为实时荧光定量PCR仪(qPCR)，该仪器可以通过可视化的信号改变来实时检测样本反应情况；

(4)结果判读：若样本携带耶氏肺孢子菌，就会和设计的引物及探针结合，产生不同颜色的荧光信号，该信号在qPCR仪上的显示是不同颜色的指数扩增曲线及相应的Ct值，并通过阴性对照和阳性对照品的曲线和Ct值来质控每次的检测准确度，再通过待测样品的曲线颜色和Ct值来判定待测样本中的病原菌种类及含量。

本发明实施例中，按照图1所示的示意简图进行引物和探针的设计、然后进行菌株水平交叉验证，然后进行临床样本检测，最终结果验证本发明设计的引物和探针的精准性。

本发明实施例中，现有文献指的是以下文献：Yang SL,Wen YH,Wu YS,Wang MC,Chang PY,Yang S,Lu JJ.Diagnosis of Pneumocystis pneumonia by real-time PCR inpatients with various underlying diseases.J Microbiol Immunol Infect.2020Oct；53(5):785-790。

实施例1引物和探针的设计

(1)查询数据库(Ensemble及NCBI数据库)已报道耶氏肺孢子菌的全基因组数据，结合已发表文献，选择保守基因(本实施例筛选2个保守基因，在folic acid synthesisprotein fol1和hsp77-like protein基因区域找到靶基因)。选取上述所得保守基因，在种内(选择10株及以上菌株)序列中逐个碱基进行比对，(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)筛选获得保守片段(即需要扩增的保守片段的一部分)。

(2)在所筛选保守片段中利用NCBI-blast

(4)选择6种曲霉(共12株)、8种毛霉(共16株)、2镰刀菌(共6株)、赛多孢(共4株)、5种念珠菌(共10株)、3种隐球菌(共6株)接种至沙氏培养基培养3-7天。制备一定浓度的菌悬液，提取DNA，Nanodrop2000超微量分光光度计定量。倍比稀释验证所设计探针及引物与其他致病菌种间有无交叉反应。所有结果均重复2-3次。经过多次重复后，最终确定2组耶氏肺孢子菌引物及探针如下表1所示。

表1用于检测耶氏肺孢子菌的探针-引物对序列信息

实施2其他菌株的交叉验证

选择北京大学第一医院真菌保藏中心保藏的烟曲霉、土曲霉、黑曲霉、黄曲霉、聚多曲霉、构巢曲霉、总状毛霉、不规则毛霉、多枝横梗霉、伞枝横梗霉、少根根霉、匍枝根霉、小孢根霉、微小根毛霉、镰刀菌、赛多孢、念珠菌及隐球菌进行验证，分别检测引物探针PCP1a、PCP2a与其他最高浓度的检测菌株间有无交叉反应，结果如下表2所示。

表2菌株间交叉反应情况

注：因耶氏肺孢子菌无法培养，故无法获得菌株进行菌株水平灵敏度检测。

从图2可知，PCP1a探针-引物对与毛霉、曲霉、镰刀菌、赛多孢、念珠菌及隐球菌菌株间无交叉反应。

从图3可知，PCP2a探针-引物对与毛霉、曲霉、镰刀菌、赛多孢、念珠菌及隐球菌菌株间无交叉反应。

实施3样本检测

检测确诊侵袭性真菌病患者的FFPE组织，应用激光捕获显微切割技术精准捕获确诊侵袭性真菌病患者FFPE组织中的病原真菌，共检测43例侵袭性真菌病样本。

利用病理科病理检测(病理科的检测断是通过组织病理特殊染色后，根据组织中的真菌形态来鉴定的)，均未鉴定至耶氏肺孢子菌感染。

使用实施1设计的PCP1a探针-引物对使用qPCR体系检测病原真菌，3例可检测到为耶氏肺孢子菌感染(组织病理显示存在耶氏肺孢子菌与丝状菌混合感染)，2例可检测到耶氏肺孢子菌DNA，提高了这类临床样本中耶氏肺孢子菌的检出率。

使用实施1设计的PCP2a探针-引物对使用qPCR体系检测病原真菌，3例病理可见耶氏肺孢子菌菌体成分的病例，该引物探针2例检测成功，此外1例病理未见菌体成分者，可检测到耶氏肺孢子菌DNA。

利用实施例1设计的PCP1a探针-引物，共检测肺泡灌洗液(BALF)418例，其中耶氏肺孢子菌的检出率为10.29％(43/418)。

实施4与文献中的引物及探针进行比较

合成文献中已报道耶氏肺孢子菌探针引物对W-PCP。

(1)菌株水平验证特异性

将W-PCP进行菌株水平验证特异性，结果如图4所示，与烟曲霉、小孢根霉、多育赛多孢、白色念珠菌存在交叉反应。

(2)样本检测

检测实施例3中的经过实施例1设计的探针及引物组检测出阳性的FFPE组织DNA，文献中已报到的探针引物对W-PCP检测5例均为阴性。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 北京大学第一医院

<120> 用于检测耶氏肺孢子菌探针及引物对及检测方法和应用

<130> 2021-9-27

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 1

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<210> 2

<211> 22

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<210> 3

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<211> 20

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<213> 人工合成(Artificial Sequence)

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Claims

1.用于检测耶氏肺孢子菌的探针及引物对，其特征在于，所述探针及引物对选择以下任意两组中其中一组：(1)探针及引物对a，其中，探针包含如sequence NO.1所示的核酸序列，引物对包含如sequence NO.3和sequence NO.4所示的核酸序列；或(2)探针及引物对b，其中，探针包含如sequence NO.2所示的核酸序列，引物对包含如sequence NO.5和sequence NO.6所示的核酸序列。

2.根据权利要求1所述的探针及引物对，其特征在于，所述探针两端带有标记物。

3.根据权利要求2所述的探针及引物对，其特征在于，所述标记物为荧光标记物。

4.一种检测耶氏肺孢子菌或肺孢子菌肺炎的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-3任一所述的探针及引物对。

5.一种耶氏肺孢子菌的检测方法，其特征在于，包括：

(1)将权利要求1所述的探针及引物配制成溶液得探针-引物对溶液；将待测样本提取总的DNA得总DNA溶液；

(2)将所述探针-引物对溶液与所述总DNA溶液混合；

(3)使用荧光定量探针PCR方法检测所述混合液。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述待测样本选自BALF样本、FFPE组织或渗出液。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述探针-引物对溶液的浓度为8-12μM。

8.根据权利要求5-7任一所述的检测方法，其特征在于，将所述探针两端设置荧光标记物。

9.权利要求1-3任一所述的探针及引物对在检测耶氏肺孢子菌中的应用。

10.权利要求1-3任一所述的探针及引物对在作为或制备检测耶氏肺孢子菌试剂或试剂盒中的应用。