CN112458196B

CN112458196B - 一种定量检测耶氏肺孢子菌的引物组及试剂盒和应用

Info

Publication number: CN112458196B
Application number: CN202011456429.3A
Authority: CN
Inventors: 郑柏松; 张文艳; 刘新; 桓晨; 李兆龙; 王虹; 高文英
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2020-12-11
Filing date: 2020-12-11
Publication date: 2023-02-03
Anticipated expiration: 2040-12-11
Also published as: CN112458196A

Abstract

本发明适用于生物技术领域，提供了一种定量检测耶氏肺孢子菌的引物组及试剂盒和应用，该引物组包括正向扩增引物和反向扩增引物；所述正向扩增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示；所述反向扩增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。该引物组可以用于荧光定量PCR检测耶氏肺孢子菌，其设计严谨，操作简单快速，灵敏性高，特异性强，结果判定准确客观。

Description

一种定量检测耶氏肺孢子菌的引物组及试剂盒和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种定量检测耶氏肺孢子菌的引物组及试剂盒和应用。

背景技术

肺孢子肺炎病原体一直被认为是原虫，但在1988年证实是一种介于子囊真菌亚门与担子真菌亚门之间的真核生物，为真菌家族的一员。1999年将寄生于人体导致人类肺孢子菌肺炎(PCP)的病原命名为耶氏肺孢子菌。临床诊断PCP病例依靠临床表现，确诊需要发现的滋养体和或包囊。然而，由于不能体外培养，一般采取染色方法进行诊断，但该方法阳性率低，操作繁琐费时，制约了的病原学诊断，容易造成误诊和漏诊。

近年来，国外多项研究认为，聚合酶链式反应(PCR)方法可以明显提高诊断的敏感性与特异性，并且在疾病早期就能发现是否感染该类真菌，可成为诊断的金标准之一。然而，由于该菌介于真菌和原虫之间，形态类似原虫，采用聚合酶链式反应需要提取该菌的核酸，要破坏该类真菌。技术上有一定的难道，国内有关该菌的检测方法很少报道。专利申请号为描述了用加凝胶电泳法来检测肺孢子菌，但是该方法操作繁琐，开放式的操作还容易造成污染，不适合在临床上应用。

由耶氏肺孢子菌引起的人肺孢子菌肺炎(PCP)多见于免疫功能低下或缺陷人群，死亡率极高。随着肿瘤化疗患者、接受免疫抑制剂治疗的器官移植者、自身免疫性疾病患者等高危人群的扩大，特别是1984年发现首例艾滋病以来，其发病率呈急剧增加的趋势。PCP是艾滋病患者最主要的并发症和致死原因，被视为艾滋病的“标志病”。

PCP的早期诊断比较困难，其原因在于患者的临床症状、体征、X线胸片及常规实验室检查均无特异性；患者少痰，即使采用诱痰法，病原体检出率亦较低；血清抗体检测因健康人群抗肺孢子菌抗体阳性率较高而无临床意义；肺组织活检因创伤较大而难以实行等。

目前现有诊断技术主要有：

1、病原学诊断查获包囊为确诊依据。收集痰液或支气管分泌物涂片染色后镜检，虽取材方便但检出率很低。皮穿刺肺活检、支气管镜肺活检开胸肺活检，虽检出率高，但损伤大，因而不常用。此外，该方法对检验人员的业务能力要求较高，人为因素影响大。常用染色方法有姬姆萨、甲苯胺蓝和四胺银染色法等。

2、免疫学诊断。由于大多数正常人都曾有过肺孢子菌隐性感染，血清中都有特异性抗体存在，故检测血清抗体的方法一般不用于肺孢子菌病的诊断。

3、X线检查。卡氏肺孢子菌肺炎典型病例的线表现为两肺先出现混合性肺泡及间质性改变，以网状结节状浸润为主，从肺门向外周扩展，当病情进展时，可见肺野斑片状实变影，其间常伴有广泛性或局灶性肺气肿和小段肺不张，以肺的外围最为明显。有的斑片状实变影很快融合成大片状均匀致密的浸润影响，病变广泛而呈向心性分布，与肺水肿相似，这一X线表现具有诊断特异性。但该方法不适于疾病的早期诊断，在临床诊疗中意义不大。

由于健康人群中体内肺孢子菌的阳性率较高，因此，定性的核酸检测缺少意义，而定量检测方法对判断免疫低下患者罹患PCP的风险具有提示作用，对PCP患者的早期诊断具有重要作用。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种定量检测耶氏肺孢子菌的引物组，旨在解决背景技术中提出的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种定量检测耶氏肺孢子菌的引物组，其包括正向扩增引物和反向扩增引物；所述正向扩增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1或SEQID NO:2所示；所述反向扩增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。

本发明实施例的另一目的在于提供一种定量检测耶氏肺孢子菌的试剂盒，包括PCR反应液以及上述的引物组。

作为本发明实施例的一种优选方案，所述正向扩增引物的浓度为5～15μmol/L。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述反向扩增引物的浓度为5～15μmol/L。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述PCR反应液包括dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)、荧光染料和Taq聚合酶。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述试剂盒还包括阳性对照物；所述阳性对照物为肺孢子菌线粒体18S rRNA的一段特异性片段克隆得到的质粒。

作为本发明实施例的另一种优选方案，肺孢子菌线粒体18S rRNA的一段特异性片段的基因序列如序列表SEQ ID NO:5所示。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的引物组在制备用定量检测耶氏肺孢子菌的试剂盒中的应用。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的引物组在制备用于荧光定量PCR检测耶氏肺孢子菌的试剂盒中的应用。

具体的，耶氏肺孢子菌的荧光定量PCR检测方法，其包括定量方法，DNA提取方法，PCR反应程序，阳性对照，阴性对照，并通过样本的预处理，样本DNA的提取，PCR扩增及产物观察等步骤提供了肺孢子菌的特异PCR检测方法，本发明的PCR检测方法设计严谨，同时，此检测方法操作简单快速，灵敏性高，特异性强，结果判定准确客观。

本发明实施例提供的一种定量检测耶氏肺孢子菌的引物组，设计严谨，操作简单快速，灵敏性高，特异性强，可应用于人感染肺孢子菌的血液或肺泡灌洗液样本中病原核酸检测，其结果判定准确客观。本发明完成一次样本检测实际时间控制在2小时，同时也保证了约80％准确性。

附图说明

图1为实施例6测定的阴性对照组的PCR扩增曲线结果示意图。

图2为实施例6测定的阳性对照组的PCR扩增曲线结果示意图。

图3为实施例6测定的样本核酸提取物的电泳结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

该实施例提供了一种定量检测耶氏肺孢子菌的引物组，其设计方法如下：

经过多株肺孢子菌序列比对，发现肺孢子菌18S rRNA基因在250-270、370-395、570-590、720-750等区域，碱基保守性较好，因此针对这些区段设计引物。其中，肺孢子菌线粒体18S rRNA的一段特异性片段的基因序列如序列表SEQ ID NO:5所示。另外，肺孢子菌线粒体18S rRNA，此基因为肺孢子菌的各个种所共有且种间变异最小的一段基因，序列中保守的部分，在NCBI中比对为多个肺孢子菌种所共有，且同源性大于70％，符合属特异检测标准。

设计时，尽量保证选定的区域GC含量在40％～60％之间，扩增长度在100bp-400bp之间，引物T_m值在50℃-65℃之间。用primer6和NCBI里primerBLAST进行双重筛选，最终得到以下两对扩增引物。正向扩增引物具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，反向扩增引物具有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

具体的，SEQ ID NO:1的序列为5‘-ACTCATGATTGCGGAACATCG-3’；

SEQ ID NO:2的序列为5‘-GTTGGTGTAGATATAATTCGAAC-3’；

SEQ ID NO:3的序列为5‘-GTATTTGACTCAGCAACAAGTG-3’；

SEQ ID NO:4的序列为5‘-ATACACATGTGGATGAAGCAAC-3’。

实施例2

该实施例提供了一种定量检测耶氏肺孢子菌的试剂盒，其包括PCR反应液、引物组、阳性对照物和阴性对照物。

其中，PCR反应液可以采用市售的2*SYBR Green MIX，其包括dNTP、荧光染料、Taq聚合酶以及反应缓冲液。

引物组包括正向扩增引物和反向扩增引物，正向扩增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1，具体为5‘-ACTCATGATTGCGGAACATCG-3’；反向扩增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示，具体为5‘-GTATTTGACTCAGCAACAAGTG-3’；另外，正向扩增引物和反向扩增引物的浓度均为10μmol/L。

阴性对照物为去离子水；阳性对照物为肺孢子菌线粒体18S rRNA的一段特异性片段克隆得到的质粒。其中，肺孢子菌线粒体18S rRNA的一段特异性片段的基因序列如序列表SEQ ID NO:5所示。

实施例3

引物组包括正向扩增引物和反向扩增引物，正向扩增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2，具体为5‘-GTTGGTGTAGATATAATTCGAAC-3’；反向扩增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示，具体为5‘-ATACACATGTGGATGAAGCAAC-3’；另外，正向扩增引物和反向扩增引物的浓度均为10μmol/L。

实施例4

引物组包括正向扩增引物和反向扩增引物，正向扩增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1，具体为5‘-ACTCATGATTGCGGAACATCG-3’；反向扩增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示，具体为5‘-GTATTTGACTCAGCAACAAGTG-3’；另外，正向扩增引物和反向扩增引物的浓度均为5μmol/L。

实施例5

引物组包括正向扩增引物和反向扩增引物，正向扩增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1，具体为5‘-ACTCATGATTGCGGAACATCG-3’；反向扩增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示，具体为5‘-GTATTTGACTCAGCAACAAGTG-3’；另外，正向扩增引物和反向扩增引物的浓度均为15μmol/L。

实施例6

该实施例提供了一种荧光定量PCR检测耶氏肺孢子菌的方法，其包括以下步骤：

S1、样本核酸提取：人血液或肺泡灌洗液样本DNA提取，采用Qiagen公司销售的QIAamp DNA Blood Mini Kit(商品号51106)对实施例样本进行样本总DNA的提取，得到样本核酸提取物。

S2、取上述实施例2提供的试剂盒，将10μL的PCR反应液、1μL的正向扩增引物、1μL的反向扩增引物、5μL的样本核酸提取物、3μL的的去离子无菌水进行混合，作为实验组反应体系；将10μL的PCR反应液、1μL的正向扩增引物、1μL的反向扩增引物、5μL的阳性对照物、3μL的的去离子无菌水进行混合，作为阳性对照组反应体系；将10μL的PCR反应液、1μL的正向扩增引物、1μL的反向扩增引物、5μL的阴性对照物、3μL的的去离子无菌水进行混合，作为阴性对照组反应体系。

S3、将上述得到的实验组反应体系、阳性对照组反应体系和阴性对照组反应体系分别按照表1所示的PCR反应程序进行PCR扩增反应。表1中，*位置为荧光采集阶段。

表1

S4、结果判定：(1)阴性对照应无Ct值，阳性对照有Ct值；(2)内对照应为阳性，但标本如果为强阳性，内对照可以出现阴性结果。其中样本阴性结果如图1所示，阳性结果如图2和图3所示。

实施例7

S2、取上述实施例3提供的试剂盒，将10μL的PCR反应液、1μL的正向扩增引物、1μL的反向扩增引物、5μL的样本核酸提取物、3μL的的去离子无菌水进行混合，作为实验组反应体系；将10μL的PCR反应液、1μL的正向扩增引物、1μL的反向扩增引物、5μL的阳性对照物、3μL的的去离子无菌水进行混合，作为阳性对照组反应体系；将10μL的PCR反应液、1μL的正向扩增引物、1μL的反向扩增引物、5μL的阴性对照物、3μL的的去离子无菌水进行混合，作为阴性对照组反应体系。

S3、将上述得到的实验组反应体系、阳性对照组反应体系和阴性对照组反应体系分别按照上表1所示的PCR反应程序进行PCR扩增反应。

S4、结果判定：(1)阴性对照应无Ct值，阳性对照有Ct值；(2)内对照应为阳性，但标本如果为强阳性，内对照可以出现阴性结果。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 一种定量检测耶氏肺孢子菌的引物组及试剂盒和应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

actcatgatt gcggaacatc g 21

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gttggtgtag atataattcg aac 23

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtatttgact cagcaacaag tg 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atacacatgt ggatgaagca ac 22

<210> 5

<211> 1077

<212> DNA

<213> 耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jiroveci)

<400> 5

atggcaactc aaattcttcg atttcaaggc catgaatatt ttacacaaag attaatacta 60

tctttattaa gtaaaaaaat gatacgaatt gaaaagatcc gttctgatga tacaaatcct 120

ggccttcgag attatgaaat ttcatttctt cgtttattgg aaacaattac aaatggttcg 180

caaattaata tttcatatac aggcacaatt attttattta aaccaggtca aattcatgga 240

ggaaaattta ctcatgattg cggaacatcg agatcgatag gatattttct tttaccatta 300

cttagcattt tgccattctc aaaaatacca tttgacttaa catttactgg cttaactgtt 360

gataattatg atgttggtgt agatataatt cgaacaagta ttcttccaat tatgcgtaaa 420

tttggaataa atgatggact cgaacttcga attttaaaac ggggttcttc gcctcttgga 480

ggtggtgaaa ttcgttttat atgtccatct attcgtgcac tttgtacagt tcatctttta 540

tcatctggac gaataaaacg tattcgtgga gttgcttcat ccacatgtgt atctccttct 600

attgctaata ggcttgttga atctgcgaga agcatactga atagatttat tcctgatata 660

tttatatata cagatgttcg aaaaggagaa gaatgcggaa aatctccagg attttcttta 720

tcacttgttg ctgagtcaaa tacggaatct ttatatacaa gtgaattgtc aggagaagca 780

ggagatattc ctgaagatat aggtattaac tgtgccaaaa ttttattgtc gcaaatccta 840

aatggaggtt gcgttgataa cattgcatgt aaatatgttc ttcttggaat ggttttaggg 900

tcggaagatg tcggacgcat aagaatatct agaaaaattg atgaacactt agtagcattt 960

ttaagagatg ttaaattatt ttttaatata gaaatgagat ttattcctag tggaaatgaa 1020

ataatagtaa gctgtaaggg tataggatat actaattata ataaaatggt cacttaa 1077

Claims

1.一种定量检测耶氏肺孢子菌的引物组，其特征在于，包括正向扩增引物和反向扩增引物；所述正向扩增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；所述反向扩增引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示。

2.一种定量检测耶氏肺孢子菌的试剂盒，包括PCR反应液，其特征在于，还包括如权利要求1所述的引物组。

3.根据权利要求2所述的一种定量检测耶氏肺孢子菌的试剂盒，其特征在于，所述正向扩增引物的浓度为5~15μmol/L。

4.根据权利要求2所述的一种定量检测耶氏肺孢子菌的试剂盒，其特征在于，所述反向扩增引物的浓度为5~15μmol/L。

5.根据权利要求2所述的一种定量检测耶氏肺孢子菌的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括dNTP、荧光染料和Taq聚合酶。

6.根据权利要求2~5中任一项所述的一种定量检测耶氏肺孢子菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照物；所述阳性对照物为肺孢子菌线粒体18S rRNA的一段特异性片段克隆得到的质粒。

7.根据权利要求6所述的一种定量检测耶氏肺孢子菌的试剂盒，其特征在于，肺孢子菌线粒体18S rRNA的一段特异性片段的基因序列如序列表SEQ ID NO:5所示。

8.一种如权利要求1所述的引物组在制备用定量检测耶氏肺孢子菌的试剂盒中的应用。

9.一种如权利要求1所述的引物组在制备用于荧光定量PCR检测耶氏肺孢子菌的试剂盒中的应用。