CN106399471A - 一种耶氏肺孢子虫的检测试剂盒和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种耶氏肺孢子虫的检测试剂盒，它包含序列如SEQ ID NO：1～2所示的引物对。本发明还公开了耶氏肺孢子虫的检测方法。本发明提供的试剂盒和方法可以有效检测耶氏肺孢子虫，特异性强、灵敏度高、耗时短，具有良好的应用前景。

Description

一种耶氏肺孢子虫的检测试剂盒和检测方法

技术领域

本发明涉及一种耶氏肺孢子虫的检测试剂盒和检测方法。

背景技术

耶氏肺囊胞虫肺炎(Pneumocystis Pneumonia,PCP)是由耶氏肺囊胞虫(Pneumocystis Jiroveci)引起的呼吸系统疾病。耶氏肺囊胞虫，又称耶氏肺孢子虫，病菌通常寄生在肺泡内，成簇粘附于肺泡上皮，在健康宿主体内并不引起症状，对于免疫功能低下或缺陷的患者尤其是肿瘤化疗患者、接受免疫抑制治疗的造血干细胞或者器官移植患者,以及艾滋病(AIDS)患者，PCP是最重要的机会性感染之一，约80％左右爱滋病人会出现PCP，也是爱滋病患者最重要的致死原因，早诊断、早治疗可有效地降低患者病死率。

PCP现有的诊断技术包括以下几种:

1、病原学诊断查获包囊为确诊依据。收集痰液或支气管分泌物涂片染色后镜检，虽取材方便但检出率很低。皮穿刺肺活检、支气管镜肺活检开胸肺活检，虽检出率高，但损伤大，因而不常用。此外，该方法对检验人员的业务能力要求较高，人为因素影响大。常用染色方法有姬姆萨、甲苯胺蓝和四胺银染色法等。由于这种方法是一种有创性检查，并不广泛应用。

2、免疫学诊断。常见的方法有对流免疫电泳检测抗原，间接荧光试验，免疫印迹试验。由于大多数正常人在婴幼儿阶段都曾有过肺囊胞虫隐性感染，血清中都有特异性抗体，但缺乏较好的敏感性和特异性，故检测血清抗体的方法一般不用于肺囊胞虫病的诊断。

3、X线检查。此种检查是非特异性的，部分患者胸部X线可正常。卡氏肺囊胞虫肺炎典型病例的X线表现为两肺先出现混合性肺泡及间质性改变，以网状结节状浸润为主，从肺门向外周扩展，当病情进展时，可见肺野斑片状实变影，其间常伴有广泛性或局灶性肺气肿和小段肺不张，以肺的外围最为明显。有的斑片状实变影很快融合成大片状均匀致密的浸润影响，病变广泛而呈向心性分布，与肺水肿相似，这一X线表现具有诊断特异性。但该方法不适于疾病的早期诊断，在临床诊疗中意义不大。

4、PCR检测，由于目前还没有体外培养肺囊胞虫的技术手段，PCR检测成为临床快速检测肺囊胞虫隐性感染的有效手段。为了保证检测的灵敏度和特异性，均采用巢氏PCR对耶氏肺孢子虫进行检测，同时多采用线粒体核 糖体大亚基(mtLSU-rRNA)或二氢蝶酸合成酶(DHPS)等多拷贝基因作为目的基因来检测。由于多拷贝基因导致临床检验结果假阳性率普遍增高，一些由于样品污染、无致病性定植菌被大量检测出来，影响了临床诊断的准确性。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的耶氏肺孢子虫的PCR检测试剂盒和检测方法。

本发明提供了SEQ ID NO：1～2所示的引物对。

本发明还提供了SEQ ID NO：1～2所示的引物对在制备扩增耶氏肺孢子虫的基因的试剂中的用途。

本发明耶氏肺孢子虫的检测试剂盒，它包含序列如SEQ ID NO：1～2所示的引物对。

本发明还提供了检测耶氏肺孢子虫的方法，包括如下步骤：

a，提取样本DNA：提取待检样本中的DNA；

b，基因扩增：用权利要求1所述的试剂盒对待检样本中的DNA进行扩增；

c，结果检测：对DNA扩增结果进行检测。

本发明提供的试剂盒和方法可以有效扩增耶氏肺孢子虫的RTT109基因，特异性强、灵敏度高、耗时短，用于快速检测耶氏肺孢子虫，为耶氏肺囊胞虫肺炎患者的治疗提供可靠的依据，具有良好的应用前景。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1耶氏肺囊胞虫特定基因PCR扩增结果。其中M为DNA标记物，Negative为阴性对照，Positive为阳性对照；

图2提取的人细胞基因组DNA为模版，PCR扩增人GAPDH结果。其中M为DNA标记物，Negative为阴性对照，Genomic DNA从人SKOV3细胞提取的样品；

图3特异性实验结果；

图4灵敏度性实验结果。

具体实施方式

实验材料和仪器

1.主要试剂及试剂盒

(1)PCR扩增引物合成(上海生工)；

(2)DH5α、Rosetta(DE3)菌株(购自北京全式金公司)；

(3)DNA Marker(购自大TAKARA公司)

(4)质粒小抽试剂盒(购自上海生工公司)；

(5)氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素(购自上海生工公司)；

(6)PrimeSTAR PCR扩增试剂盒(购自TaKaRa公司)；

(7)2x MasterMix PCR扩增验证试剂盒(购自北京庄盟生物)；

(8)PCR反应管(购自Axygen公司)；

2.实验主要仪器和设备

(1)落地式高速冷冻离心机(BECKMAN)；

(2)台式低温高速离心机(Thermo Scientific)；

(3)琼脂糖凝胶电泳槽及电泳仪(BIO-RAD)；

(4)MyGene thermo cycler基因扩增仪(LongGene)；

(5)DELTA320-S pH计(Mettler Toledo)；

(6)AB265-S电子天平(Mettler Toledo)；

(7)高温烤箱(BINDER)；

(8)雪花状制冰机(SANYO)；

(9)核酸水平电泳系统(北京六一)；

(10)Nanodrop 2000(Thermo Scientific)；

(11)低速离心机Megafuge 1.0(Heraeus)；

(12)超纯水仪TANKPE110(Millipore)；

(13)高压灭菌锅(SANYO)；

(14)恒温微生物培养箱(SANYO)；

(15)超净工作台(苏净安泰)；

(16)大容量恒温摇床(上海智成)；

(17)恒温水浴锅DZKW-4(北京中心伟业)；

(18)凝胶扫描仪GS-800(Bio-Rad)；

实施例1引物设计

一、实验方法

1、PCR引物设计与合成

根据肺囊胞虫特有基因RTT109，设计引物，经Blast比对后送上海生工合成。

表1PCR引物资料

根据扩增片段，合成阳性对照I，其核苷酸序列(SEQ ID NO：5)为：

TGGTGGGCAAAAGTGTTGGATTGTACAAAAAAAAGCCATCAACCGAAAAAATACATTTTAATACCTGGAATAGATACCCGAGAAACACTTAGTTTTACTCCAAATTATACAAATACCAGTTTAAAATGGATTTGCGGTCACCCATATCAATCTGCAAATAAACCTGCAAGAGAAATTATCCCACATTTTCCAGATGATCCTAAAACTCGACTTCTTGATCAATTAGATATTGACGGACAAGGAGAAACAATAAATGTTGACCAGTTTTGGGAATTAATGGCATTTCGTCAAGAATGTACACTTGGTAGAATTGTCGGTTTCTTAAATATAGAATTTCCTCCAAGCAAAGACCAAGAAAATAAAAAAGATTCGAGTTTAAGCAAGGATTTAAATGAAGAATGTGGTGTTCAAATGAGTGAAAGGATTTATCGAATGCATTATGAAAAGTTATTGCGTTCTGATTTTGAGACAC

2、模板制备

Ⅰ样本预处理

痰或者支气管肺泡灌洗液，加等量生理盐水后混匀，室温4000～6000转离心10分钟。弃去上清液，加1毫升生理盐水重悬沉淀物，并转至1.5毫升小离心管，14000转室温离心10分钟。弃去上清液，沉淀物备用。

Ⅱ提取样本的基因组DNA

给步骤I获得的沉淀物中添加200微升基因组DNA提取裂解液(1～3％乙

基苯基聚乙二醇(NP-40)，5～10％聚苯乙烯基体离子交换树脂

(Chelex-100)，1～3％吐温20(Tween-20)，震荡混匀后，将样品管置于95～

100度加热30分钟。然后，将样品在13000转室温离心10分钟，将上清液转

移至新的1.5毫升小管中，此为样品基因组DNA。

3、PCR扩增

按样品数量准备PCR反应管，以及PCR反应混合液。每反应管总体积20微升，包括0.5微升肺囊胞虫特异性引物混合液(上游引物和下游引物的浓度分别为12.5pm/μL)，0.5微升Tag酶(浓度为1～5U/μL)，5微升PCR反应液(PCR反应液成分为:100mMTris-HCl pH8.3；500mMKCl；15mM MgCl₂；0.01％明胶(gelatin)，dNTP 25mM；0.5％溴酚蓝)和14微升去离子水。在 涡旋器上混匀，并短暂离心后分装至PCR反应管。

将5微升基因组DNA样品，阳性对照样品I和阴性对照样品分别加于标记好的PCR管中，进行PCR扩增。

为了确认样品基因组DNA是否提取成功，以GAPDH作为内参，检测时用基因组DNA对照人GAPDH特异性引物(SEQ ID NO：3:上游引物序列：5’-CGGATTTGGTCGTATTGGGC-3’；SEQID NO：4:下游引物序列：5’-TGGAAGATGGTGATGGGATTTC-3’；引物浓度分别为12.5pm/μL)替代肺囊胞虫特异性引物进行PCR扩增，采用阳性对照样品II(GAPDH基因，SEQ ID NO：6)为阳性对照，阴性对照样品不变。

阳性对照样品II的核苷酸序列：

ATGGTTTACATGTTCCAATATGATTCCACCCATGGCAAATTCCATGGCACCGTCAAGGCTGAGAACGGGA

AGCTTGTCATCAATGGAAATCCCATCACCATCTTCCAGGAGCGAGATCCCTCCAAAATCAAGTGGGGCGA

TGCTGGCGCTGAGTACGTCGTGGAGTCCACTGGCGTCTTCACCACCATGGAGAAGGCTGGGGCTCATTTG

CAGGGGGGAGCCAAAAGGGTCATCATCTCTGCCCCCTCTGCTGATGCCCCCATGTTCGTCATGGGTGTGA

ACCATGAGAAGTATGACAACAGCCTCAAGATCATCAGCAATGCCTCCTGCACCACCAACTGCTTAGCACC

CCTGGCCAAGGTCATCCATGACAACTTTGGTATCGTGGAAGGACTCATGACCACAGTCCATGCCATCACT

GCCACCCAGAAGACTGTGGATGGCCCCTCCGGGAAACTGTGGCGTGATGGCCGCGGGGCTCTCCAGAACA

TCATCCCTGCCTCTACTGGCGCTGCCAAGGCTGTGGGCAAGGTCATCCCTGAGCTGAACGGGAAGCTCAC

TGGCATGGCCTTCCGTGTCCCCACTGCCAACGTGTCAGTGGTGGACCTGACCTGCCGTCTAGAAAAACCT

GCCAAATATGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTCGGAGGGCCCCCTCAAGGGCATCCTGGGCT

ACACTGAGCACCAGGTGGTCTCCTCTGACTTCAACAGCGACACCCACTCCTCCACCTTTGACGCTGGGGC

TGGCATTGCCCTCAACGACCACTTTGTCAAGCTCATTTCCTGGTATGACAACGAATTTGGCTACAGCAAC

AGGGTGGTGGACCTCATGGCCCACATGGCCTCCAAGGAGTAA

PCR扩增反应条件为95℃预变性5分钟，之后94℃变性45秒、55℃退火1分钟、72℃延伸1分钟、如此进行35循环；再72℃延伸10分钟。

4、结果检测

配制1.5％的琼脂糖凝胶，用电泳液混匀后在微波炉中加热1分钟，待琼脂糖完全融化并冷却到65℃左右，按终浓度0.5g/ml加入溴化乙锭，混匀倒入制胶模中。待胶凝固后拔出梳子，在加样孔中分别加样25微升，1OOV电压下电泳30分钟，之后在紫外灯下观察结果。

二、结果

实验结果如图1所示，用SEQ ID NO：1～2所示引物对扩增时，空白对照无扩增条带，而阳性样本则能扩增出长度为471bp的PCR产物。

内参GAPDH的扩增结果如图2所示，空白对照无扩增条带，而阳性样本(人卵巢癌SKOV3细胞提取的样品)则能扩增出长度为315bp的PCR产物。

实验证明，本发明SEQ ID NO：1～2所示引物对可以有效扩增耶氏肺孢子虫的基因，能够准确检测带检样本是是否有耶氏肺孢子虫。

实施例2特异性试验

一、试验方法

1、PCR引物

取实施例1中的引物对1。

2、模板制备

为检验本发明方法的特异性，采用不同真菌来源的Rtt109表达质粒作为模版进行PCR扩增。模版DNA包括来自包括卡氏肺孢子虫(Pc)、耶氏肺孢子虫(Pj)、啤酒酵母(Sc)、白色念株菌(Ca)的Rtt109编码序列。阴性模版为人卵巢癌SKOV3细胞提取的基因组样品。

3、PCR扩增

同实施例1。

4、结果检测

同实施例1。

二、结果

如附图3所示，尽管Rtt109基因在不同属的真菌中是相对保守的，但本发明中的Rtt109引物(本发明SEQ ID NO：1～2所示引物对)只特异性扩增耶氏肺孢子虫(Pj)的Rtt109基因，不能扩增其它三种真菌包括卡氏肺孢子虫(Pc)、啤酒酵母(Sc)和白色念株菌(Ca)来源的Rtt109基因。同时，以人卵巢癌SKOV3细胞提取的基因组DNA样品为模版也未能扩增出任何条带。该结果说明，本发明中的Rtt109引物(本发明SEQ ID NO：1～2所示引物对)特异性非常高，无非特异性扩增。

实施例3灵敏度试验

一、试验方法

1、PCR引物

取实施例1中的引物对1。

2、模板制备：

按照实施例1的方法提取样品基因组DNA，经检测，样品基因组DNA的浓度为25ng/μl，5倍梯度稀释，得浓度分别为5.0ng/μl、1.0ng/μl、0.2ng/μl、0.04ng/μl、0.008ng/μl、0.0016ng/μl的样品。

3、PCR扩增

同实施例1。

4、结果检测

如附图4所示，本发明中的Rtt109引物(本发明SEQ ID NO：1～2所示引物对)可检测到PjRtt109最低含量为0.04ng/μl，证实了本试剂盒具有非常高的检测灵敏度。

实施例4本发明试剂盒的组成

本发明试剂盒中的全部组分、含量和使用方法如下：

一、试剂盒的组成

请提供本发明试剂盒的组成，如50人份的各个试剂的浓度和用量，可以参照下表列出。

模板制备试剂(50人份)：

PCR扩增试剂(50人份)：

阳性对照(50人份)：

二、试剂盒使用方法

1)DNA提取

Ⅰ样本预处理

痰或者支气管肺泡灌洗液，加等量生理盐水后混匀，室温4000～6000转离心10分钟。弃去上清液，加1毫升生理盐水重悬沉淀物，并转至1.5毫升小离心管，14000转室温离心10分钟。弃去上清液，沉淀物备用。

Ⅱ提取样本的基因组DNA

给步骤I获得的沉淀物中添加200微升基因组DNA提取裂解液(1～3％乙 基苯基聚乙二醇(NP-40)，5～10％聚苯乙烯基体离子交换树脂(Chelex-100)，1～3％吐温20(Tween-20))，震荡混匀后，将样品管置于95～100度加热30分钟。然后，将样品在13000转室温离心10分钟，将上清液转移至新的1.5毫升小管中，此为样品基因组DNA。

2)PCR扩增

按样品数量准备PCR反应管，以及PCR反应混合液。每反应管总体积20微升，包括0.5微升肺囊胞虫特异性引物混合液(上游引物和下游引物的浓度分别为12.5pm/μL)，0.5微升Tag酶(浓度为1～5U/μL)，5微升PCR反应液(PCR反应液成分为:100mMTris-HCl pH8.3；500mMKCl；15mM MgCl₂；0.01％明胶(gelatin)，dNTP 25mM；0.5％溴酚蓝)和14微升去离子水。在涡旋器上混匀，并离心后分装至PCR反应管。

将5微升基因组DNA样品，阳性对照样品I和阴性对照样品分别加于标记好的PCR管中，进行PCR扩增。

为了确认样品基因组DNA是否提取成功，以GAPDH作为内参，检测时用基因组DNA对照人GAPDH特异性引物(上游引物序列：5’-CGGATTTGGTCGTATTGGGC-3’；下游引物序列：5’-TGGAAGATGGTGATGGGATTTC-3’；引物浓度分别为12.5pm/μL)替代肺囊胞虫特异性引物进行PCR扩增，采用阳性对照样品II为阳性对照，阴性对照样品不变。

PCR扩增反应条件为95℃预变性5分钟，之后94℃变性45秒、55℃退火1分钟、72℃延伸1分钟、如此进行35循环；再72℃延伸10分钟。

3)检测

配制1.5％的琼脂糖凝胶，用电泳液混匀后在微波炉中加热1分钟，待琼脂糖完全融化并冷却到65℃左右，按终浓度0.5g/ml加入溴化乙锭，混匀倒入制胶模中。待胶凝固后拔出梳子，在加样孔中分别加样25微升，100V电压下电泳30分钟，之后在紫外灯下观察结果。

综上，本发明提供的检测试剂盒和检测方法可以特异扩增耶氏肺孢子虫的基因，特异性强、敏感性高、耗时短，检测快速，具有良好的应用前景。

Claims (6)

1.SEQ ID NO：1～2所示的引物对。

2.SEQ ID NO：1～2所示的引物对在制备扩增耶氏肺孢子虫的基因的试剂中的用途。

3.一种耶氏肺孢子虫的检测试剂盒，其特征在于：它包含序列如SEQ ID NO：1～2所示的引物对。

4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于：它还包括待检样品的阳性对照模板，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

5.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于：它还包括内参基因的扩增引物对和阳性对照模板，其扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示，其阳性对照模板的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

6.一种检测耶氏肺孢子虫的方法，其特征在于：包括如下步骤：

a，提取样本DNA：提取待检样本中的DNA；

b，基因扩增：用权利要求1所述的试剂盒对待检样本中的DNA进行扩增；

c，结果检测：对DNA扩增结果进行检测。