CN101712973A

CN101712973A - 常温核酸扩增链替换反应试剂及常温核酸扩增方法

Info

Publication number: CN101712973A
Application number: CN200910153518A
Authority: CN
Inventors: 黄震巨; 丁凌文; 程海荣; 方国伟; 严庆丰; 程奇
Original assignee: NINGBO HUAYUE BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2009-09-30
Filing date: 2009-09-30
Publication date: 2010-05-26
Anticipated expiration: 2029-09-30
Also published as: CN101712973B

Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体公开了一种常温核酸扩增链替换反应试剂，包括以下组分：Tricine缓冲液、氯化钾、氯化镁、二硫苏糖醇、聚乙二醇(PEG)、ATP、dNTPs、磷酸肌酸(Phosphocreatine)、引物组、SSB蛋白、大肠杆菌RecA蛋白、酵母Rad51蛋白、Bsu DNA聚合酶。本发明还公开了常温核酸扩增方法，利用酵母Rad51蛋白和大肠杆菌RecA蛋白的链替换作用，在常温条件下实现非仪器依赖性的、单重或者多重序列一管式同时进行扩增的高灵敏度核酸扩增。本方法可在常温条件下实现高效的链替换核酸扩增，用时少，操作简单，无需PCR仪进行传统的的热循环。本技术也适合于应用到有大量样品的非实验室的检测场所。

Description

常温核酸扩增链替换反应试剂及常温核酸扩增方法

技术领域

本发明属于分子诊断与分子生物学领域，具体阐述了一种利用酵母Rad51蛋白和大肠杆菌RecA蛋白的链替换作用，在常温条件下可实现非仪器依赖性的高灵敏度核酸扩增链替换反应试剂及常温核酸扩增方法。本发明可以用于基础分子生物学研究，疾病病原的快速诊断，遗传病以及肿瘤标志物的筛查等任何需要用到核酸扩增技术的领域。

背景技术

核酸扩增技术被广泛应用于疾病检测等各个领域。通过这一技术，可以实现微量核酸的高效扩增，将极少量的特异核酸序列分子扩增到仪器可以检测到的水平。目前已有的核酸扩增技术主要为PCR技术，这一技术的实现需要在三个温度之间进行反应体系的热循环，即变性，退火以及延伸。通过重复这一过程，使得特定序列的DNA分子实现指数级别的扩增，从原来病理组织，掩饰子样品或者体液样品上的少量疾病病原体的特异DNA分子扩增到可以用仪器检测的水平。利用这个技术，可以对一些疾病的病原微生物进行快速准确的分子诊断：通过对各种微生物的特有片段的扩增，可以判断被诊断样品组织中是否有特定的病原微生物，是否被该微生物所感染，以及是否带有耐药性的质粒等消息，从而进行更好更有针对性的治疗。然而，上述技术目前仍然完全依赖于昂贵而且高耗电的PCR仪，紫外凝胶成像系统以及受过严格训练的数量技术人员，这一缺陷限制了这一技术在实验室之外的广泛应用。

核酸扩增技术有着极高的灵敏度，将这一技术应用到分子诊断以及医疗领域可以给我国的疾病诊断带来革命性的变化。以艾滋病HIV病毒为例子，HIV-1病毒是危害严重的血液/性传播疾病病原体，占我国HIV感染的约60％(另外40％为HIV-2感染)。传统的临床检测方法是使用基于抗原抗体的ELISA和westernblot方法，或者是基于相同原理的简化的胶体金试纸条。但是由于抗体的产生需要一定的时间，不可避免的存着有窗口期的缺点，也即是在高危性行为或者是怀疑感染的情况下，仍然需要一个足够长的时间(22天，也即是窗口期)之后才能用免疫学的方法检测出来。这一缺点，一方面给怀疑患者造成巨大的心理负担，另一方面得我国目前的血站检测以及输血献血，仍然不可避免的存着漏诊的可能和危险性。相比免疫学技术检测，核酸扩增检测技术具有更高的灵敏度，可以在病毒感染的初期就有效检测到病毒特异的核酸序列。常规的PCR检测方法已经被报道过利用于HIV的早期感染筛查，并已有一些利用核酸扩增的方法检测HIV的商业试剂盒，但是这些试剂盒都需要使用特定的专业仪器，需要在专业的实验室内完成检测。另外最重要的是常规聚合酶链式反应技术(PCR技术)难以完全摒除假阳性的问题。这是由于PCR结束电泳需要人工开关PCR管并使用移液器吸取样品，进行琼脂糖凝胶电泳对结果进行判断。由于PCR产物的高浓度，使得在开管闭管以及对产物的处理等步骤对操作人员的要求极高，稍不小心则极为容易使实验室和试验仪器受到含有高浓度目标DNA气凝胶的污染，从而导致后续的假阳性结果的出现。此外，使用这一技术进行核酸扩增放大需要使用到离心机，PCR仪，电泳仪，凝胶成像系统等一系列专业分子生物学仪器。这些仪器都非常昂贵，并且需要受过训练的专业人员来操作。不仅如此，对使用琼脂糖凝胶对电泳结果的进行检测确定不仅耗时长，工序复杂难以实现大样本操作，而且需要操作人员具有非常熟练的分子生物学操作技术，还需要操作人员长时间接触致癌物溴化乙锭等对健康有严重影响的有毒有害化学物质。另一种后来发展的技术，荧光定量PCR技术，通过使用PCR反应的同时测定PCR管内荧光值的变化来对结果进行判读。由于不需要开管取出PCR产物进行电泳判断结果，可以在一定程度上避免PCR产物气凝胶交叉污染的假阳性问题。然而荧光定量PCR技术需要使用昂贵的荧光定量PCR仪，这限制了这个技术的广泛使用，只有少数专业的实验室才能进行相应的检测。

一重或者单重核酸扩增技术可以用于特定的疾病的快速诊断。然而，一种特定的疾病症状，如感冒，腹泻等，有着相似的症状，却可能由多种病源微生物单独或者混合感染所造成。那么准确判断是何种微生物感染，对何种抗生素敏感等信息，对于设计有效的治疗方案，引导医生有针对性的用药等有着极高的指导价值。然而使用传统PCR方法需要进行多管反应，进行多次PCR反应进行筛查，才有可能找到可能的致病病原微生物。这一过程不仅需要制备大量的样品模板，还增加了检测人员的工作量与出错的机会。针对这种情况，可以使用多重的PCR技术来避免这个问题。多重的PCR技术指的是在一个PCR反应体系之内同时加入多个引物，针对多个目标片段，在同一反应管内同时进行扩增的技术。多重PCR的主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定和病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定。多种病原微生物的同时检测或鉴定，是在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物进行PCR扩增。可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染。如肝炎病毒的分型，肠道致病性细菌的检测，性病的检测，乳头瘤病毒的分型，单纯疱疹病毒的分型及癌基因的检测等。

多重PCR主要有如下的特点：高效系统，在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物或者同时进行基因分型，从而实现用一滴血检测多种病原体而进行诊断。多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒，肠道致病性细菌，性病的同时诊断。同时经济简便，多种病原体在同一反应管内同时检出，可以节省时间，试剂，开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。尽管有着巨大的市场应用潜力和前景，多重PCR尚未真正得到广泛使用，这主要是因为其反应体系存在众多引物，为了保证其中某一片段的扩增效率，这些引物需要以较高的浓度存在，这将不可避免的产生非特异性PCR产物，使得结果判断困难。这个问题是多重PCR难以突破的技术瓶颈。在2005年，Shigemori等证明将热稳定的TthRecA蛋白加入到常规PCR反应体系中，可以极为有效的防止引物的错配与极大的提高PCR的特异性，从而发展了新的高效特异的多重PCR(Shigemori，Y.et al.(2005)Nucleic Acids Res.，e 126.)。

常规的单重和多重PCR技术由于热循环的需要完全依赖于电源和昂贵的PCR仪器，从而限制了这一技术在实验室之外的广泛应用。由于上述缺点，科学界一直在试图发展不需要使用PCR仪器的核酸扩增方法以及可以不需要对产物进行开盖凝胶电泳的检测技术。正是基于这种需要，恒温核酸扩增技术的发展将是一个不可逆转的趋势。在过去的十年当中，一些等温核酸扩增技术得到快速发展。如TMA技术(转录介导的核酸扩增技术)，SDA技术(链置换核酸扩增技术)，LAMP(环介导核酸扩增技术)，HDA(解旋酶依赖等温核酸扩增技术)等等都可以用于DNA在等温条件下扩增。这些技术只需要一个反应温度(60-65度)就可以实现高效的核酸扩增，从而使得整个反应摆脱了对精密温度循环控制的PCR仪的依赖。然而这一技术仍然需要温度控制装置来保持反应温度(60-65度)，这种依赖性在某种程度上仍然限制了等温核酸扩增技术的广泛应用。

发明内容

本发明公开了一种常温核酸扩增链替换反应试剂及常温核酸扩增方法，主要利用了Bsu DNA聚合酶在另外几个重组酶蛋白存着的条件下能将新生成的核酸单链从新合成的DNA双链上置换下来的机理，在常温下实现对特定核酸序列进行高效指数扩增。这使得核酸扩增的过程可以直接在无需仪器的室温条件下完成反应，不需要进行传统的热循环。

一种常温核酸扩增链替换反应试剂，其特征在于包括以下组分：Tricine缓冲液、氯化钾、氯化镁、二硫苏糖醇、聚乙二醇(PEG)、ATP、dNTPs、磷酸肌酸(Phosphocreatine)、引物组、SSB蛋白、大肠杆菌RecA蛋白、酵母Rad51蛋白、Bsu DNA聚合酶。

大肠杆菌RecA蛋白和Rad51蛋白均为来自大肠杆菌的重组表达蛋白。这两个蛋白的功能负责介导模板的解链以及实现模板和引物之间的链替换，这一替换过程需要ATP来提供能量。在SSB蛋白的辅助下，Bsu DNA聚合酶可以对链替换后的DNA实现特异的延伸。由于ATP在Phosphocreatine催化下实现再生，这一反应过程中的化学平衡倾向于产物的合成，并且可以不断重复这一过程，从而最终实现核酸的高效扩增。

本发明利用酵母Rad51蛋白和大肠杆菌RecA蛋白两个蛋白实现常温下的蛋白介导的引物/模板间的链替换，替代传统PCR的变性(94度)和退火(50-60度)步骤，并在Bsu DNA聚合酶的催化下进行核酸合成。由于大肠杆菌RecA蛋白在进行链替换的时候对替换序列一致性的高特异性，使得在复杂基因组DNA的反应体系中，只有引物和模版序列完全一致的位置才会出现扩增，避免了常规PCR反应中常见的非特异背景(常规PCR在引物中间有若干碱基不一致的情况下仍可出现非特异的扩增)。

链替换反应试剂中的Tricine为高效的缓冲剂，用于维持反应体系的pH值，Tricine缓冲液的pH值优选为8；适当浓度的氯化钾和氯化镁为反应进行所必需。酵母Rad51蛋白和大肠杆菌RecA蛋白也可以是其它具有相同作用的类似重组蛋白。

为了直接判断扩增结果，本发明的链替换反应试剂还可以包括荧光染料。所述的荧光染料可以是SYBR green I，SYTO-13或SYTO-82中的一种。利用肉眼可见的荧光染料直接判断扩增结果，不仅可避免开盖造成的交叉污染问题，而且无需昂贵的凝胶成像系统，实现非实验室依赖的高效核酸扩增以及结果解读，使整个反应更为简便和快捷，适用于在非实验室的条件下进行大规模疾病的筛查。如果需要进一步的检测可以通过凝胶电泳来判断是何种核酸分子得到扩增。

本发明链替换反应试剂中的聚乙二醇(PEG)的分子量为3350-50000，优选为20000-35000。

本发明链替换反应试剂中的引物个数可以随检测目的基因的数目增加而增加，可用于单重核酸扩增和多重核酸扩增。

进一步地，本发明的常温核酸扩增链替换反应试剂，其配比优选如下：

Tricine缓冲液 50-500mM

氯化钾 0-200mM

氯化镁 5-30mM

二硫苏糖醇 1-10mM

聚乙二醇 3-16％

ATP 1-15mM

dNTPs 0.2-3mM

磷酸肌酸 20-100mM

引物组每种引物50pmol

SSB蛋白 500-1500ng/μl

大肠杆菌RecA蛋白 50-300ng/μl

酵母Rad51蛋白 10-100ng/μl

Bsu DNA聚合酶 5-100ng/μl

本发明还公开了一种常温核酸扩增方法，包括以下步骤：提取DNA和RNA，20～45℃下反转录得cDNA，加入以上所述常温核酸扩增链替换反应试剂，25～45℃下反应10～60分钟，完成核酸扩增。

进一步地，本方法中的反转录温度为30～45℃，优选为42℃。链替换反应温度为30～40℃，优选为37℃。

本方法可在常温(20-45度)条件下进行，无需PCR仪进行传统的热循环即可实现高效的链替换核酸扩增。本方法利用链替换反应试剂中酵母Rad51蛋白和大肠杆菌RecA蛋白两个蛋白实现常温下的蛋白介导的引物/模板间的链替换，替代传统PCR的变性(94度)和退火(50-60度)步骤，并在Bsu DNA聚合酶的催化下进行核酸合成。在单链结合蛋白SSB以及缩合剂聚乙二醇的存在下，这一反应过程中的化学平衡倾向于产物的合成，并且可以不断重复这一过程，从而最终实现核酸的高效扩增。本发明常温核酸扩增方法的原理图如图1所示。

由于酵母Rad51蛋白和大肠杆菌RecA蛋白在链置换过程中对目标序列的高度特异性，使得扩增结果的特异性大为提高，从而实现无本底背景的高效等温核酸扩增。相比PCR技术，本方法更适合于应用到有大量样品的，非实验室的检测场所。使用本方法扩增核酸几乎不需要专业仪器，操作上更为简单，对操作人员技术要求更低，反应时间最快仅需10-60分钟。本方法同时还可以利用荧光染料直接判断扩增结果，避免了传统PCR开盖造成的交叉污染问题，无需昂贵的凝胶成像系统。同时，应用肉眼可见的核酸荧光染料来进行初步结果判断，可使整个反应更为简便和快捷。

本发明还涉及Rad51蛋白和大肠杆菌RecA蛋白在常温核酸扩增中的应用。

附图说明

图1是本发明常温核酸扩增方法的原理示意图；

图2是使用本发明常温核酸扩增试剂及扩增方法得到的可直观判断的结果示意图。

具体实施方式

实施例1

单重核酸扩增

本实施例以对血液中HIV病毒进行血液检测筛查为例子，具体阐述传统PCR以及本发明的单重常温核酸扩增的实现过程。本发明可以但不限于HIV病毒核酸分子的检测。其他的病毒性疾病也可以以相似的方法进行检测。针对不同的病原微生物，只需要对引物序列重新进行设计即可。本实施例中引物均由申请人设计，并委托上海生工公司合成。

具体通过如下步骤来实现：选择HIV-1的全序列，将其分段提交至美国国家生物中心网站上的数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行Blast检索(点击网页左上角Blast按钮，并以fasta格式提交序列，选择nt选项)，通过BLAST程序分析寻找HIV特有的，和其他病毒没有高同源性的DNA片段。在本发明中，发明人根据Blast结果选择HIV聚合酶整合酶(pol-integrase)蛋白编码序列自行进行引物设计。本方案中提供了一套可以用于该位置特异扩增的引物。这套引物均可以对上述病毒的特定位置进行有效链替换扩增。

1、传统PCR核酸扩增：制备HIV-1阳性模板正对照

设计并合成以下引物：

5′GAAGTTATTCCAGCAGAAACAGGGC 3′SEQ ID NO：1

5′TAAAATTGTGGATGAATACTGCCAT 3′SEQ ID NO：2

使用PCR技术制备阳性模板，选择模板序列如下

AGGCCCAAGATGAACATGAGAAATATCACAGTAATTGGAGAGCAATGGCTAGTGATTTTAACCTGCCACCTGTAGTAGCAAAAGAAATAGTAGCCAGCTGTGATAAATGTCAGCTAAAAGGAGAAGCCATGCATGGACAAGTAGACTGTAGTCCAGGAATATGGCAACTAGATTGTACACATTTAGAAGGAAAAGTTATCCTGGTAGCAGTTCATGTAGCCAGTGGATATATAGAAGCAGAAGTTATTCCAGCAGAAACAGGGCAGGAAACAGCATACTTTCTTTTAAAATTAGCAGGAAGATGGCCAGTAAAAACAATACATACAGACAATGGCAGCAATTTCACCAGTACTACGGTTAAGGCCGCCTGTTGGTGGGCGGGAATCAAGCAGGAATTTGGAATTCCCTACAATCCCCAAAGTCAAGGAGTAGTAGAATCTATGAATAAAGAATTAAAGAAAATTATAGGCCAGGTAAGAGATCAGGCTGAACATCTTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGTATTCATCCACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAG SEQ ID NO：3

首先进行反转录反应制备HIV-1病毒cDNA。在生物安全柜中，使用QIAampviral RNA Mini Kit(QIAGEN公司)对病人血液样品提取高纯度RNA，具体操作严格按照其说明书完成。使用上述试剂盒回收得到HIV感染者RNA样品50μl，标记为样品1。从样品1取出2μl到一新的小PCR管，使用SuperScript

VILO^TM cDNA Synthesis kit(购买自Invitrogen公司，步骤严格按照试剂盒说明书进行)进行反转录。反转录在42℃金属浴装置内完成。得到产物cDNA。PCR体系如下：

cDNA 1μl

dNTP 0.5μl

正向引物 2μl

反向引物 2μl

PCR反应缓冲液(Takara公司) 5μl

去离子水 40μl

Ex Taq酶(Takara公司) 0.5μl

将上述所有成分加好至一小PCR管，放入PCR仪，PCR仪器设置反应条件如下：

步骤一 94℃2分钟

步骤 94℃1分钟，然后

54℃1分钟，然后

72℃1分钟

步骤三重复步骤二32次。

将所得PCR产物电泳之后使用QIAquick gel extraction kit试剂盒(购自Qiagen公司)进行胶回收。步骤严格按照试剂盒说明书进行。将得到的回收产物和pGEM-T easy连接(购买自promega公司，连接步骤严格按照试剂盒说明书进行)，4℃过夜连接之后，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞One ShotTOP10(购买自Invitrogen公司，步骤严格按照试剂盒说明书进行)。根据说明书操作挑选阳性克隆，委托北京华大公司测序确认。测序确认正确的菌株使用LB进行扩大培养，然后QIAprep spin miniprep kit(购自Qiagen公司，步骤严格按照试剂盒说明书进行)提取质粒，制备得到HIV-1阳性对照。

2、常温核酸扩增

链替换反应引物设计如下：

正向引物5′CACAGTAATTGGAGAGCAATGGCTAGTGATTTTAAC 3′SEQ ID NO：4

反向引物5′ATGTCTGTTGCTATTATGTCTACTATTCTTTCCCCT 3′SEQ ID NO：5

在生物安全柜中，使用4M异硫氰酸胍溶液对病人血液样品提取高纯度DNA及RNA，得到包含有DNA和RNA的总核酸样品50μl，标记为样品2；及健康人血液包含有DNA和RNA的总核酸样品样品50μl标记为样品1。从样品1和样品2中各取出2μl到一新的小PCR管，使用SuperScript

VILO^TM cDNASynthesis kit(购买自Invitrogen公司，步骤严格按照试剂盒说明书进行)进行反转录。反转录在42℃金属浴装置内完成。得到产物cDNA，分别标记为样品3和样品4。从样品3和样品4中各取出2μl到一新的小PCR管，再加入50μl常温核酸扩增链替换反应试剂(保存于-20℃冰箱)，其成分如下：

Tricine(pH 8.0) 100mM

氯化钾 100mM

氯化镁 14mM

二硫苏糖醇 2.5mM

PEG 20000 8％

ATP 5mM

dNTPs 1mM

Phosphocreatine 50mM

引物A(SEQ ID NO：4) 50pmol

引物B(SEQ ID NO：5) 50pmol

SSB蛋白 900ng/μl

大肠杆菌RecA蛋白 120ng/μl

Rad51蛋白 30ng/μl

Bsu DNA聚合酶 30ng/μl

SYBR green 0.5mM

关上PCR管盖。将管子放入37度恒温金属浴保温1小时。随后将管子取出，肉眼观察管内液体颜色。如果管子内液体变为绿色(参见附图2)，则说明HIV病毒核酸序列得到有效扩增，如果液体颜色不变，则说明样品内不含有HIV病毒的核糖核酸或者脱氧核糖核酸。将阳性结果进一步进行琼脂糖凝胶电泳，可见根一600bp扩增条带。

实施例2

多重核酸扩增

本实施例以对血液中HIV，HBV和HCV三种常见病毒进行血液检测筛查为例子，具体阐述多重链替换核酸扩增的实现过程。本发明可以但不限于这三种病毒核酸分子的检测。其他的病毒性疾病也可以相似的方法进行检测。在实施例中，即包括了RNA病毒HIV，HCV，也包括了DNA病毒HBV。针对不同的病原微生物，只需要对引物序列重新进行设计即可。本实施例中引物均由申请人设计，并委托上海生工公司合成。

具体通过如下步骤来实现：选择HIV-1，HBV以及HCV genotype 1-6的全序列，将其分段提交至美国国家生物技术中心网站上的数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行Blast检索(点击网页左上角Blast按钮，并以fasta格式提交序列，选择nt选项)，通过BLAST程序分析寻找HIV，HBV以及HCV特有的，和其他病毒没有高同源性的DNA片段。在本发明中，发明人根据Blast结果选择HIV聚合酶整合酶(pol-integrase)蛋白编码序列，HBVgp2以及HCV的polyprotein的3末端自行进行引物设计。本方案中提供了一套可以用于该位置特异扩增的引物。这套引物均可以对上述病毒的特定位置进行有效链替换扩增。

1、传统PCR核酸扩增

1)制备HIV-1阳性模板正对照：

设计并合成以下引物：

5′GAAGTTATTCCAGCAGAAACAGGGC 3′SEQ ID NO：1

5′TAAAATTGTGGATGAATACTGCCAT 3′SEQ ID NO：2

使用PCR技术制备阳性模板，选择模板序列如下

cDNA 1μl

dNTP 0.5μl

正向引物 2μl

反向引物 2μl

PCR反应缓冲液(Takara公司) 5μl

去离子水 40μl

Ex Taq酶(Takara公司) 0.5μl

步骤一 94℃2分钟

步骤二 94℃1分钟，然后

54℃1分钟，然后

72℃1分钟

步骤三重复步骤二32次。

将所得PCR产物电泳之后使用QIAquick gel extraction kit试剂盒(购自Qiagen公司)进行胶回收。步骤严格按照试剂盒说明书进行。将得到的回收产物和pGEM-T easy连接(购买自promega公司，连接步骤严格按照试剂盒说明书进行，4℃过夜连接之后，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞One ShotTOP10(购买自Invitrogen公司，步骤严格按照试剂盒说明书进行)。根据说明书操作挑选阳性克隆，委托北京华大公司测序确认。测序确认正确的菌株使用LB进行扩大培养，然后QIAprep spin miniprep kit(购自Qiagen公司，步骤严格按照试剂盒说明书进行)提取质粒，制备得到HIV-1阳性对照。

2)制备HBV阳性模板正对照

设计并合成以下引物：

5′CTCCACAACATTCCACCAAGCTCTG 3′SEQ ID NO：6

5′ACATACTTTCCAATCAATAGGTCTA 3′SEQ ID NO：7

使用PCR技术制备阳性模板，选择模板序列如下

CTCCACAACATTCCACCAAGCTCTGCTAGATCCCAGAGTGAGGGGCCTATATTTTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCCGGAACAGTAAACCCTGTTCCGACTACTGCCTCACCCATATCGTCAATCTTCTCGAGGACTGGGGACCCTGCACCGAACATGGAGAGCACAACATCAGGATTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAGCACCCACGTGTCCTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAACTTGTCCTGGCTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTACCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAGGAACATCAACTACCAGCACGGGACCATGCAGAACCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGCTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTATTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTGAACCCTAATAAAACCAAACGTTGGGGCTACTCCCTTAACTTCATGGGATATGTAATTGGAAGTTGGGGTACTTTACCGCAGGAACATATTGTACAAAAACTCAAGCAATGTTTTCGAAAATTGCCTGTAAATAGACCTATTGATTGGAAAGTATGT SEQ ID NO：8

首先制备HBV病毒DNA。在生物安全柜中，使用QIAamp DNA blood Kit(QIAGEN公司)对病人血液样品提取高纯度DNA，具体操作严格按照其说明书完成。使用上述试剂盒回收得到HBV感染者DNA样品50μl，标记为样品1。PCR体系如下：

DNA 1μl

dNTP 0.5μl

正向引物 2μl

反向引物 2μl

PCR反应缓冲液(Takara公司) 5μl

去离子水 40μl

Ex Taq酶(Takara公司) 0.5μl

步骤一 94℃2分钟

步骤二 94℃1分钟，然后

54℃1分钟，然后

72℃1分钟

步骤三重复步骤二32次。

将所得PCR产物电泳之后使用QIAquick gel extraction kit试剂盒(购自Qiagen公司)进行胶回收。步骤严格按照试剂盒说明书进行。将得到的回收产物和pGEM-T easy连接(购买自promega公司，连接步骤严格按照试剂盒说明书进行)，4℃过夜连接之后，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞One ShotTOP10(购买自Invitrogen公司，步骤严格按照试剂盒说明书进行)。根据说明书操作挑选阳性克隆，委托北京华大公司测序确认。测序确认正确的菌株使用LB进行扩大培养，然后QIAprep spin miniprep kit(购自Qiagen公司，步骤严格按照试剂盒说明书进行)提取质粒，制备得到HBV阳性对照。

3)制备HCV阳性模板正对照：

设计并合成以下引物：

5′TATGGAGACAGTGCATGGGAGGCAA 3′SEQ ID NO：11

5′CACAGTACAGGCGTTGGGTGAGTGA 3′SEQ ID NO：12

使用PCR技术制备阳性模板，选择模板序列如下

TATGGAGACAGTGCATGGGAGGCAATATCACGCGAGTAGAGGCTGAGAACAAGGTCGAGATCCTTGACTGCTTCAAGCCGCTCAAAGAGGAAGAAGATGACAGAGAGATCTCCGTGTCCGCCGACTGCTTTAAGAAGGGACCGGCGTTTCCCCCCGCTCTGCCAGTGTGGGCAAGGCCGGGGTATGACCCGCCCCTCTTGGAGACTTGGAAGCGACCGGATTATGACCCCCCTCAGGTGTGGGGCTGCCCGATACCACCTGCGGGCCCCCCGCCTGTCCCGCTTCCGCGGAGGAAAAGGAAGCCAATGGAACTATCTGATTCTACCGTGTCCCAAGTCATGGCCGACTTGGCGGACGCCAGGTTCAAGGTCGACACACCATCCATTGAAGGCCAGGATTCTGCGTTGGGTACTAGCAGCCAACACGATTCGGGGCCTGAGGAGAAGCGTGATGACAACTCGGACGCGGCTTCATATTCTTCCATGCCTCCGCTAGAGGGCGAACCTGGGGACCCTGACCTTTCGTCAGGGTCATGGTCAACCGTCAGCGGTGAGGACAACGTGGTGTGTTGCTCCATGTCATACACCTGGACTGGGGCGCTCATCACCCCTTGCTCTGCTGAAGAGGAAAAATTACCCATCAATCCCTTAAGCAACACCTTATTACGCCACCACAATCTTGTGTACTCCACCTCCTCTCGGAGTGCGGGTCTGAGGCAGAAAAAGGTCACTTTTGACAGGCTACAAGTCCTCGACGACCACTACAGAGAGGTTGTGGACGAGATGAAGCGATTAGCCTCCAAGGTTAAGGCCAGACTACTGCCCCTAGAGGAAGCCTGTGGGTTAACACCACCCCACTCCGCCCGTTCCAAGTACGGATACGGCGCGAAGGAAGTTCGCTCTCTCGACAAGAAAGCCCTTAAGCACATAGAGGGTGTGTGGCAAGACTTATTGGATGACTCTGATACCCCATTGCCGACAACCATCATGGCAAAAAACGAAGTGTTCGCAGTGGAGCCGTCTAAGGGGGGGAAGAAGCCTGCACGGCTGATAGTCTACCCCGACCTTGGAGTCCGCGTCTGCGAGAAGCGGGCTTTGTACGACGTAGCTCAAAAACTGCCGACAGCCCTTATGGGGCCCTCGTATGGGTTTCAGTACTCCCCAGCGCAGCGGGTTGACTTCTTACTGAAGGCGTGGAAATCTAAGAAGATCCCCATGGCTTTCTCCTATGACACCCGCTGCTTTGACTCGACCATTACCGAACATGACATAATGACTGAAGAGTCCATTTACCAATCATGTGACTTGCAGCCTGAGGCGCGCGTGGCAATACGGTCACTCACCCAACGCCTGTACTGTSEQ ID NO：13

首先进行反转录反应制备HCV病毒cDNA。在生物安全柜中，使用QIAampviral RNA Mini Kit(QIAGEN公司)对病人血液样品提取高纯度RNA，具体操作严格按照其说明书完成。使用上述试剂盒回收得到HCV感染者RNA样品50μl，标记为样品1。从样品1取出2μl到一新的小PCR管，使用SuperScriptVILO^TM cDNA Synthesis kit(购买自Invitrogen公司，步骤严格按照试剂盒说明书进行)进行反转录。反转录在42℃金属浴装置内完成。得到产物cDNA。PCR体系如下：

cDNA 1μl

dNTP 0.5μl

正向引物 2μl

反向引物 2μl

PCR反应缓冲液(Takara公司) 5μl

去离子水 40μl

Ex Taq酶(Takara公司) 0.5μl

步骤一 94℃2分钟

步骤二 94℃1分钟，然后

54℃1分钟，然后

72℃1.5分钟

步骤三重复步骤二32次。

将所得PCR产物电泳之后使用QIAquick gel extraction kit试剂盒(购自Qiagen公司)进行胶回收。步骤严格按照试剂盒说明书进行。将得到的回收产物和pGEM-T easy连接(购买自promega公司，连接步骤严格按照试剂盒说明书进行)，4℃过夜连接之后，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞One ShotTOP10(购买自Invitrogen公司，步骤严格按照试剂盒说明书进行)。根据说明书操作挑选阳性克隆，委托北京华大公司测序确认。测序确认正确的菌株使用LB进行扩大培养，然后QIAprep spin miniprep kit(购自Qiagen公司，步骤严格按照试剂盒说明书进行)提取质粒，制备得到HCV阳性对照。

2、常温核酸扩增

1)HIV-1链替换反应引物设计如下：

正向引物5′CACAGTAATTGGAGAGCAATGGCTAGTGATTTTAAC 3′SEQ ID NO：4

反向引物5′ATGTCTGTTGCTATTATGTCTACTATTCTTTCCCCT 3′SEQ ID NO：5

2)HBV链替换反应引物设计如下：

正向引物5′TTCCACCAAGCTCTGCTAGATCCCAGAGTGAGGGG 3′SEQ ID NO：9

反向引物5′ATGATAAAACGCCGCAGACACATCCAGCGATAGCC 3′SEQ ID NO：10

3)HCV链替换反应引物设计如下：

正向引物5′AATGGAACTATCTGATTCTACCGTGTCCCAAGTCA 3′SEQ ID NO：14

反向引物5′CTTAGATTTCCACGCCTTCAGTAAGAAGTCAACCC 3′SEQ ID NO：15

VILO^TM cDNASynthesis kit(购买自Invitrogen公司，步骤严格按照试剂盒说明书进行)进行反转录。反转录在42℃金属浴装置内完成。得到产物cDNA，分别标记为样品3和样品4。从样品3和样品4中各取出2μl到一新的小PCR管，再加入50μl链替换反应试剂(保存于-20℃冰箱)，其成分如下：

Tricine(pH 8.0) 100mM

氯化钾 100mM

氯化镁 14mM

二硫苏糖醇 2.5mM

PEG 20000 8％

ATP 5mM

dNTPs 1mM

Phosphocreatine 50mM

引物A (SEQ ID NO：4) 50pmol

引物B(SEQ ID NO：5) 50pmol

引物C(SEQ ID NO：9) 50pmol

引物D(SEQ ID NO：10) 50pmol

引物E(SEQ ID NO：14) 50pmol

引物F(SEQ ID NO：15) 50pmol

SSB蛋白 900ng/μl

大肠杆菌RecA蛋白 120ng/μl

Rad51蛋白 30ng/μl

Bsu DNA聚合酶 30ng/μl

SYBR green 0.5mM

关上PCR管盖。将管子放入37度恒温金属浴保温1小时。随后将管子取出，肉眼观察管内液体颜色。如果管子内液体变为绿色(参见附图2)，则说明特异的病毒核酸序列得到有效扩增，如果液体颜色不变，则说明样品内不含有上述三种病毒的核糖核酸或者脱氧核糖核酸。在本实验中，样品1管内液体仍然为橙红色(以SYBR green作为显色剂)，说明初始检测样品中不含有病毒的脱氧核糖核酸，即该样品提供者未被上述三种病毒感染。而样品2中的液体变为绿色，说明其中含有含有病毒的脱氧核糖核酸，即该样品提供者已被上述三种病毒中的一种或者多种感染。

为进一步判断是何种病毒感染，将阳性结果进一步进行琼脂糖凝胶电泳。根据电泳结果，如果出现一条600bp大小的扩增条带，则说明该样品被HIV-1感染。出现400bp条带，则为HBV感染。出现900bp条带，则为HCV感染。若出现2-3个条带，则说明是2-3个病毒的混合感染。

实施例3

本实施例以HCV病毒为例，具体阐述本发明的常温核酸扩增方法中链替换反应温度分别为25，30，40℃实现高效核酸扩增过程的例子。本实施例中引物由申请人设计，并委托上海生工公司合成。

链替换反应引物设计如下：

正向引物5′AATGGAACTATCTGATTCTACCGTGTCCCAAGTCA 3′SEQ ID NO：14

反向引物5′CTTAGATTTCCACGCCTTCAGTAAGAAGTCAACCC 3′SEQ ID NO：15

在生物安全柜中，使用4M异硫氰酸胍溶液对病人血液样品提取高纯度DNA及RNA，得到包含有DNA和RNA的总核酸样品50μl，标记为样品1；从样品1中取出2μl到一新的小PCR管，使用SuperScript

VILO^TM cDNA Synthesiskit(购买自Invitrogen公司，步骤严格按照试剂盒说明书进行)进行反转录。反转录在42℃金属浴装置内完成。得到产物cDNA，分别标记为样品2。从上述制备得到的样品2中分别取出2μl到三个新的小PCR管，再加入50μl链替换反应试剂，其成分如下：

Tricine(pH 8.0) 100mM

氯化钾 100mM

氯化镁 14mM

二硫苏糖醇 2.5mM

PEG 20000 16％

ATP 5mM

dNTPs 1mM

Phosphocreatine 50mM

引物E(SEQ ID NO：14) 50pmol

引物F(SEQ ID NO：15) 50pmol

SSB蛋白 900ng/μl

大肠杆菌RecA蛋白 120ng/μl

Rad51蛋白 30ng/μl

Bsu DNA聚合酶 30ng/μl

SYBR green 0.5mM

关上PCR管盖。将上述三个管子分别放入25，37，40度恒温金属浴保温20分钟进行反应。反应完毕之后观察反应管颜色和进行凝胶电泳判断反应是否成功完成。结果显色，在25，30，40度恒温金属浴保温20分钟进行反应，均可以得到成功的结果。将上述片段进行胶回收DNA测序并对序列进行分析，结果确认目的片段得到有效扩增。

实施例4

本是实施例以HCV病毒为例，具体阐述本发明的常温核酸扩增方法在37℃下，10-60分钟范围内实现高效核酸扩增过程的例子。本实施例中引物由申请人设计，并委托上海生工公司合成。

链替换反应引物设计如下：

正向引物5′AATGGAACTATCTGATTCTACCGTGTCCCAAGTCA 3′SEQ ID NO：14

反向引物5′CTTAGATTTCCACGCCTTCAGTAAGAAGTCAACCC 3′SEQ ID NO：15

在生物安全柜中，使用4M异硫氰酸胍溶液结合对病人血液样品提取高纯度DNA及RNA，得到包含有DNA和RNA的总核酸样品50μl，标记为样品1；从样品1中取出2μl到一新的小PCR管，使用SuperScript

VILO^TM cDNASynthesis kit(购买自Invitrogen公司，步骤严格按照试剂盒说明书进行)进行反转录。反转录在42℃金属浴装置内完成。得到产物cDNA，分别标记为样品2。从上述制备得到的样品2中分别取出2μl到6个新的小PCR管，再加入50μl链替换反应试剂，其成分如下：

Tricine(pH 8.0) 100mM

氯化钾 100mM

氯化镁 14mM

二硫苏糖醇 2.5mM

PEG 20000 8％

ATP 5mM

dNTPs 1mM

Phosphocreatine 50mM

引物E(SEQ ID NO：14) 50pmol

引物F(SEQ ID NO：15) 50pmol

SSB蛋白 900ng/μl

大肠杆菌RecA蛋白 120ng/μl

Rad51蛋白 30ng/μl

Bsu DNA聚合酶 30ng/μl

SYBR green 0.5mM

关上PCR管盖。将上述6个管子放入37℃恒温金属浴分别保温10，20，30，40，50，60分钟进行反应。反应完毕之后观察反应管颜色和进行凝胶电泳判断反应是否成功完成。结果显示，20，30，40，50，60分钟的反应时间均可以得到成功的结果。在反应时间为10分钟时，也有产物生成，然而产物产量相比20分钟有较大减少。将上述片段进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收DNA测序并对序列进行分析，结果确认目的片段得到有效扩增。

SEQUENCE LISTING

<110>宁波华越生物科技有限公司

<120>常温核酸扩增链替换反应试剂及常温核酸扩增方法

<130>

<160>15

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>引物

<400>1

gaagttattc cagcagaaac agggc 25

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>引物

<400>2

taaaattgtg gatgaatact gccat 25

<210>3

<211>670

<212>DNA

<213>HIV-1

<400>3

aggcccaaga tgaacatgag aaatatcaca gtaattggag agcaatggct agtgatttta 60

acctgccacc tgtagtagca aaagaaatag tagccagctg tgataaatgt cagctaaaag 120

gagaagccat gcatggacaa gtagactgta gtccaggaat atggcaacta gattgtacac 180

atttagaagg aaaagttatc ctggtagcag ttcatgtagc cagtggatat atagaagcag 240

aagttattcc agcagaaaca gggcaggaaa cagcatactt tcttttaaaa ttagcaggaa 300

gatggccagt aaaaacaata catacagaca atggcagcaa tttcaccagt actacggtta 360

aggccgcctg ttggtgggcg ggaatcaagc aggaatttgg aattccctac aatccccaaa 420

gtcaaggagt agtagaatct atgaataaag aattaaagaa aattataggc caggtaagag 480

atcaggctga acatcttaag acagcagtac aaatggcagt attcatccac aattttaaaa 540

gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag 600

acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt cgggtttatt 660

acagggacag 670

<210>4

<211>36

<212>DNA

<213>引物

<400>4

cacagtaatt ggagagcaat ggctagtgat tttaac 36

<210>5

<211>36

<212>DNA

<213>引物

<400>5

atgtctgttg ctattatgtc tactattctt tcccct 36

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>引物

<400>6

ctccacaaca ttccaccaag ctctg 25

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>引物

<400>7

acatactttc caatcaatag gtcta 25

<210>8

<211>990

<212>DNA

<213>HBV

<400>8

ctccacaaca ttccaccaag ctctgctaga tcccagagtg aggggcctat attttcctgc 60

tggtggctcc agttccggaa cagtaaaccc tgttccgact actgcctcac ccatatcgtc 120

aatcttctcg aggactgggg accctgcacc gaacatggag agcacaacat caggattcct 180

aggacccctg ctcgtgttac aggcggggtt tttcttgttg acaagaatcc tcacaatacc 240

acagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta gggggagcac ccacgtgtcc 300

tggccaaaat tcgcagtccc caacctccaa tcactcacca acctcttgtc ctccaacttg 360

tcctggctat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcata ttcctcttca tcctgctgct 420

atgcctcatc ttcttgttgg ttcttctgga ctaccaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480

acttccagga acatcaacta ccagcacggg accatgcaga acctgcacga ttcctgctca 540

aggaacctct atgtttccct cttgttgctg tacaaaacct tcggacggaa actgcacttg 600

tattcccatc ccatcatcct gggctttcgc aagattccta tgggagtggg cctcagtccg 660

tttctcctgg ctcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac 720

tgtttggctt tcagctatat ggatgatgtg gtattggggg ccaagtctgt acaacatctt 780

gagtcccttt ttacctctat taccaatttt cttttgtctt tgggtataca tttgaaccct 840

aataaaacca aacgttgggg ctactccctt aacttcatgg gatatgtaat tggaagttgg 900

ggtactttac cgcaggaaca tattgtacaa aaactcaagc aatgttttcg aaaattgcct 960

gtaaatagac ctattgattg gaaagtatgt 990

<210>9

<211>35

<212>DNA

<213>引物

<400>9

ttccaccaag ctctgctaga tcccagagtg agggg 35

<210>10

<211>35

<212>DNA

<213>引物

<400>10

atgataaaac gccgcagaca catccagcga tagcc 35

<210>11

<211>25

<212>DNA

<213>引物

<400>11

tatggagaca gtgcatggga ggcaa 25

<210>12

<211>25

<212>DNA

<213>引物

<400>12

cacagtacag gcgttgggtg agtga 25

<210>13

<211>1358

<212>DNA

<213>HCV

<400>13

tatggagaca gtgcatggga ggcaatatca cgcgagtaga ggctgagaac aaggtcgaga 60

tccttgactg cttcaagccg ctcaaagagg aagaagatga cagagagatc tccgtgtccg 120

ccgactgctt taagaaggga ccggcgtttc cccccgctct gccagtgtgg gcaaggccgg 180

ggtatgaccc gcccctcttg gagacttgga agcgaccgga ttatgacccc cctcaggtgt 240

ggggctgccc gataccacct gcgggccccc cgcctgtccc gcttccgcgg aggaaaagga 300

agccaatgga actatctgat tctaccgtgt cccaagtcat ggccgacttg gcggacgcca 360

ggttcaaggt cgacacacca tccattgaag gccaggattc tgcgttgggt actagcagcc 420

aacacgattc ggggcctgag gagaagcgtg atgacaactc ggacgcggct tcatattctt 480

ccatgcctcc gctagagggc gaacctgggg accctgacct ttcgtcaggg tcatggtcaa 540

ccgtcagcgg tgaggacaac gtggtgtgtt gctccatgtc atacacctgg actggggcgc 600

tcatcacccc ttgctctgct gaagaggaaa aattacccat caatccctta agcaacacct 660

tattacgcca ccacaatctt gtgtactcca cctcctctcg gagtgcgggt ctgaggcaga 720

aaaaggtcac ttttgacagg ctacaagtcc tcgacgacca ctacagagag gttgtggacg 780

agatgaagcg attagcctcc aaggttaagg ccagactact gcccctagag gaagcctgtg 840

ggttaacacc accccactcc gcccgttcca agtacggata cggcgcgaag gaagttcgct 900

ctctcgacaa gaaagccctt aagcacatag agggtgtgtg gcaagactta ttggatgact 960

ctgatacccc attgccgaca accatcatgg caaaaaacga agtgttcgca gtggagccgt

1020

ctaagggggg gaagaagcct gcacggctga tagtctaccc cgaccttgga gtccgcgtct

1080

gcgagaagcg ggctttgtac gacgtagctc aaaaactgcc gacagccctt atggggccct

1140

cgtatgggtt tcagtactcc ccagcgcagc gggttgactt cttactgaag gcgtggaaat

1200

ctaagaagat ccccatggct ttctcctatg acacccgctg ctttgactcg accattaccg

1260

aacatgacat aatgactgaa gagtccattt accaatcatg tgacttgcag cctgaggcgc

1320

gcgtggcaat acggtcactc acccaacgcc tgtactgt 1358

<210>14

<211>35

<212>DNA

<213>引物

<400>14

aatggaacta tctgattcta ccgtgtccca agtca 35

<210>15

<211>35

<212>DNA

<213>引物

<400>15

cttagatttc cacgccttca gtaagaagtc aaccc 35

Claims

1.一种常温核酸扩增链替换反应试剂，其特征在于包括以下组分：Tricine缓冲液、氯化钾、氯化镁、二硫苏糖醇、聚乙二醇、ATP、dNTPs、磷酸肌酸、引物组、SSB蛋白、大肠杆菌RecA蛋白、酵母Rad51蛋白、Bsu DNA聚合酶。

2.如权利要求1所述的常温核酸扩增链替换反应试剂，其特征在于还包括荧光染料。

3.如权利要求2所述的常温核酸扩增链替换反应试剂，其特征在于所述的荧光染料为SYBR green I，SYTO-13或者SYTO-82中的一种。

4.如权利要求2所述的常温核酸扩增链替换反应试剂，其特征在于所述的聚乙二醇的分子量为3350-50000。

5.如权利要求2所述的常温核酸扩增链替换反应试剂，其特征在于所述的引物组至少包括两种引物。

6.如权利要求1所述的常温核酸扩增链替换反应试剂，其特征在于其配比如下：

Tricine缓冲液 50-500mM

氯化钾 0-200mM

氯化镁 5-30mM

二硫苏糖醇 1-10mM

聚乙二醇 3-16％

ATP 1-15mM

dNTPs 0.2-3mM

磷酸肌酸 20-100mM

引物组每种引物 50pmol

SSB蛋白 500-1500ng/μl

大肠杆菌RecA蛋白 50-300ng/μl

酵母Rad51蛋白 10-100ng/μl

Bsu DNA聚合酶 5-100ng/μl

7.一种常温核酸扩增方法，其特征在于包括以下步骤：提取DNA和RNA，20～45℃下反转录得cDNA，加入权利要求1-6中任一项所述常温核酸扩增链替换反应试剂，25～45℃下反应10～60分钟，完成核酸扩增。

8.如权利要求7所述的常温核酸扩增方法，其特征在于反转录温度为30～45℃。

9.如权利要求8所述的常温核酸扩增方法，其特征在于反转录温度为42℃。

10.如权利要求7所述的常温核酸扩增方法，其特征在于链替换反应温度为25～40℃。

11.如权利要求10所述的常温核酸扩增方法，其特征在于链替换反应温度为37℃。

12.酵母Rad51蛋白和大肠杆菌RecA蛋白在常温核酸扩增中的应用。