CN105112565A - 一种检测伪狂犬病毒ge基因的lamp检测方法 - Google Patents

Abstract

为了快速、高效地检测猪伪狂犬病毒(PRV)，本发明采用环介导等温扩增技术(loop-mediated？isothermal？amplification,LAMP)技术建立了一种针对伪狂犬病毒的可视、灵敏、快速、特异的检测方法。本发明提取的是临床样本DNA，更切合实际，只需要在65℃下恒温反应60min就能检测到结果，并且具有操作简便的优点，适合基层养殖场使用。

Description

一种检测伪狂犬病毒GE基因的LAMP检测方法

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体而言，本发明涉及一种检测伪狂犬病毒gE基因的LAMP检测方法。

背景技术

伪狂犬病毒(PseudorabiesVirus，PRV)属于疱疹病毒科，甲型疱疹病毒亚科，猪疱疹病毒Ⅰ型，线状双股DNA病毒。PRV对外界环境的抵抗力较强，在55℃50min、80℃3min或100℃瞬间才能将其杀灭。PRV能感染多种动物，其中，猪是PRV的主要贮存宿主及疫源动物。猪伪狂犬病毒通常引起妊娠母猪繁殖功能障碍和初生仔猪神经症状，仔猪感染率和死亡率可高达100％。近年来，已有50多个国家相继报道了该病的发生，有分析表明该病的流行在全球呈上升趋势。目前，我国也有多个省份的猪场发现了由PRV引起的一系列疾病，这对我国养猪业造成了巨大的经济损失。随着规模化养猪的不断发展和强毒株的出现，PRV的流行日益严重，因此，对PRV快速而又准确的检测对进一步开展伪狂犬病毒的致病性、疫苗免疫、诊断及分子生物学等研究具有重大意义。

目前，对PRV的抗原检测主要依赖聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction,PCR)，抗体检测主要依赖酶联免疫吸附试验(ELISA)。PCR反应和ELISA试验是检测伪狂犬病毒的常规方法，也是目前基层普遍使用的方法。

PCR反应一种分子生物学技术，通过它可以在体外2-3小时内，把少至几拷贝的特定模板DNA扩增到原先的几百万倍。其原理是先将双链DNA解链为单链，引物遂与之结合，根据碱基互补原则向下延伸，即可复制得到两分子拷贝，如此不断循环下去。PCR不仅可以用于基因克隆和序列分析，因为它扩增放大的特点，在疾病诊断中也得到广泛应用。这项对分子生物学意义重大的技术1983年由Mullis发明，经过几十年的发展，已成为实验室最常规有效的实用技术。只是，PCR必须依靠昂贵的仪器才能得以实施，整个循环过程耗时数小时，这对于许多条件受限的基层养殖户是难以承受的，同时也无法满足快速诊断的需要。

ELISA试验是基于免疫酶技术发展起来的，一种对于受检标本的抗原或抗体进行定性和定量分析的生物技术。同样地，ELISA技术也存在操作复杂、耗时长等缺点，难以在基层养殖户推广。

2000年，Notomi等^[1]研发出一种新型核酸扩增技术——环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)。LAMP是一种可对核酸进行高效扩增并广泛应用于疫病快速检测的新型检测方法，它是在具有链置换活性的BstDNA聚合酶作用下，利用能识别目的基因上6个独立区段的4条引物，即正向内侧引物(forwardinnerprimer,FIP)、正向外侧引物(forwardouterprimer,F3)、反向内侧引物(backwardinnerprimer,BIP)、反向外侧引物(backwardouterprimer,B3)，在60～65℃等温条件下高效特异地扩增目的基因。2002年，Nagamine^[2]等在此基础上添加了2条环状引物：上游环状引物(LF)和下游环状引物(LB)，环引物的增加提高了反应速度，缩短了反应时间。应用LAMP技术，只需在60～65℃等温条件下水浴60min即可完成目的基因的扩增。与PCR相比，LAMP拥有诸多优势，特别是整个检测过程仅需要水浴锅、紫外灯这类简单的设备，适合现场使用，且检测时间也大大缩短。

本研究选择提取临床样本DNA，目的是为了更好的切合实际，满足养殖户的实际需要，对日后在基层中的实际推广有着重大的意义。

发明内容

本发明首先涉及一种用于快速检测猪伪狂犬病病毒的环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)引物组，所述引物组的序列结构为：

正向外引物(F3)：ACGAGCCCCGCTTCCA

反向外引物(B3)：AGATGCAGGGCTCGTACA

正向内引物(FIP)：AGACCACGCGCGCGGCATCAG-CTTCCACTCGCAGCTCTTCT

反向内引物(BIP)：GAGAACTTCACCGCCACGCT-CGTAGTACAGCAGGCACCG。

所述的LAMP引物具有高度特异性，能够在扩增模板DNA浓度为10～10¹⁰个拷贝数/每ul时，有效扩增猪伪狂犬病毒基因。

本发明还涉及所述的LAMP引物组在制备检测猪伪狂犬病毒的试剂盒中的应用。

本发明还涉及使用所述的LAMP引物组在检测猪伪狂犬病毒中的应用，所述应用包括如下步骤：

步骤(1)提取病料血清中的病毒DNA；

步骤(2)使用所述LAMP引物在LAMP反应体系中扩增病毒DNA；

步骤(3)LAMP反应结果检测。

所述的步骤(1)的具体方法为：

1)取病料血清500μL于1.5mL离心管。向离心管中加入10％SDS溶液50μL，而后加入蛋白酶K(20mg/mL)10μL，混匀后置56℃水浴1.5-2h。

2)加入200μLTris平衡酚，充分混匀溶液，置高速离心机中4℃12000rpm离心15min。

3)取上清液于一新1.5mL离心管中，加入Tris平衡酚和氯仿各200μL，充分混匀，4℃12000rpm离心15min。

4)取上清液于一新离心管中，加入氯仿200μL，充分混匀，4℃12000rpm离心15min。

5)取上清液于一新离心管中，加入2倍上清液体积的已-20℃预冷的无水乙醇，于冰箱-20℃静置20min后，4℃12000rpm离心15min，弃掉上清液，此时会发现管底附着有透明粘性沉淀。

6)向离心管中加入1mL70％乙醇冲洗沉淀表面和管壁，4℃7500rpm离心5min，弃掉乙醇，用吸水纸吸走余下液体。

7)加入20μL灭菌水将沉淀溶解，置于-20℃保存备用。

所述步骤(2)的具体方法为：

(1)25μL的LAMP反应体系成分如下：

1)BstDNA聚合酶(8U/μL)，1ul；

2)10×ThermoPol缓冲液(100mMKCl,100mM(NH₄)SO₄,200mMTris-HCl,20mMMgSO₄,1％TritonX-100)，2.5ul；

3)步骤(1)获得的DNA样品，2ul；

4)MgSO₄(100nmol/μL)，1ul、Betaine(5μmol/μL)，5ul；

5)dNTP(25mmol/μL)，5ul；

6)BIP&FIP引物(40uM)，2ul、F3&B3引物(10uM)，0.25ul

7)余量为灭菌超纯水。

(2)反应温度控制在65℃，扩增40-60min(优选为60min)，80℃5min终止反应。

所述步骤(3)的具体方法为：

1)琼脂糖凝胶电泳、或2)SYBRGreenI染色法、或3)瞬时离心法；

所述的琼脂糖凝胶电泳法为：

取5μL扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶中电泳，置凝胶成像系统下观察结果；

所述的SYBRGreenI染色法为：

向反应管中加入1μLSYBRGreenI核酸染料，观察溶液颜色变化；

所述的瞬时离心法为：

在反应结束后进行瞬时离心，通过有无沉淀判断反应结果。

本发明还涉及所述的LAMP引物组制备的检测猪伪狂犬病毒的试剂盒，所述的试剂盒包括：

(1)所述的LAMP引物组；

(2)扩增靶标DNA所需必要的扩增制剂，所述的扩增制剂包括但不限于，DNA聚合酶，DNTP，以及用于DNA扩增的盐溶液；

(3)用于检测所需的检测制剂，所述的检测制剂优选为，核酸荧光显色剂。

附图说明

图1.LAMP体系优化反应时间的结果，M.Marker(DL-2000)；N.空白对照；1-5.LAMP反应时间40，45，50，55，60min。

图2.LAMP反应体系特异性的结果(电泳检测)，M.Marker(DL-2000)；M’.Marker(DL-5000)；N.空白对照；1,2.PRVDNA；3.PCV2DNA；4.PPVDNA。

图3.LAMP反应体系特异性的结果(紫外荧光检测)，N.空白对照；1,2.PRVDNA；3.PCV2DNA；4.PPVDNA。

图4.PCR反应体系的电泳结果图，M.Marker(DL-2000)；N.空白对照；1,2.PRVDNA。

图5.LAMP反应体系SYBRGreenⅠ可视化结果，N.空白对照；1,2.PRVDNA。

图6.LAMP反应体系肉眼观察的可视化结果，N.空白对照；1,2.PRVDNA.

图7.LAMP反应体系的灵敏度结果，M.Marker(DL-2000)；N.空白对照；1.1×10¹⁰拷贝/每管；2.1×10⁹拷贝/每管；3.1×10⁸拷贝/每管；4.1×10⁷拷贝/每管；5.1×10⁶拷贝/每管；6.1×10⁵拷贝/每管；7.1×10⁴拷贝/每管；8.1×10³拷贝/每管；9.1×10²拷贝/每管；10.1×10¹拷贝/每管；11.1×10⁰拷贝/每管。

图8.LAMP反应体系的临床病料检测结果，(a)莒县病料PCR；(b)莱阳病料PCR；(c)8份病料的LAMP结果，M.Marker(DL-2000)；N.空白对照；1,2,3.莒县病料；1,2,3,4,5.莱阳病料。

具体实施方式

材料与方法

1.1毒株(病料)与试剂

猪伪狂犬病毒病料来自山东某大型猪场，猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)均由山东省畜禽疫病防治及繁育重点实验室保存提供；BstDNA聚合酶(大片段)购自美国NewEnglandBiolabs公司，Betaine购自美国Sigma-Aldrich公司，MgSO₄购自美国Amresco公司，TaqDNA聚合酶购自Fermentas中国公司，SYBRGreenI核酸染料、Tris平衡酚购自北京索莱宝科技有限公司；dNTP、DNAMarkerDL-2000、蛋白酶K均购自宝生物工程(大连)有限公司；其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2主要仪器

CHA-S恒温振荡器(常州国华电器有限公司)、生物安全柜(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)、D-37520型高速冷冻离心机(德国Heraeus公司)、超纯水系统(美国Millipore公司)、NanoDrop2000微量紫外分光光度计(美国ThermoFisherScientific公司)、梯度PCR仪(美国Bio-rad公司)、DK-8D型电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司)、DYY-2稳压稳流电泳仪(北京市六一仪器厂)、凝胶成像系统(美国AlphaInnotech公司)、紫外透射反射分析仪(上海康华生化仪器制造厂)。

实施例1引物的设计与合成

根据登录于GenBank的PRV的gE基因保守序列，应用生物学软件进行序列比对，应用PrimerExplorerV3软件(http://primerexplorer.jp/e/)设计了2对LAMP引物，包括1对外引物(F3/B3)和1对内引物(FIP/BIP)。引物序列如表1所示：

表1LAMP和PCR引物序列

^aF3,forwardouterprimer；B3,backwardouterprimer；FIP,forwardinnerprimer；BIP,backwardinnerprimer.

^bF3为两对通用

实施例2.质粒的抽提

无菌条件下，取一瓶LB液体培养基，首先按1:1000的比例加入氨苄青霉素(Amp，100mg/mL)，摇匀后再以1:100接种含有重组质粒pEASY-Blunt的DH5α菌种，置于振荡器中37℃200r/min摇菌12h。将菌液转至离心管，质粒提取过程参照天根生化科技(北京)有限公司普通质粒小提试剂盒(离心柱型)说明书。

实施例3.病毒DNA的提取

1)取病料血清(猪圆环病毒Ⅰ型、猪圆环病毒Ⅱ型取自细胞毒)500μL于1.5mL离心管。向离心管中加入10％SDS溶液50μL，而后加入蛋白酶K(20mg/mL)10μL，混匀后置56℃水浴1.5-2h。

2)加入200μLTris平衡酚，充分混匀溶液，置高速离心机中4℃12000rpm离心15min。

3)取上清液于一新1.5mL离心管中，加入Tris平衡酚和氯仿各200μL，充分混匀，4℃12000rpm离心15min。

4)取上清液于一新离心管中，加入氯仿200μL，充分混匀，4℃12000rpm离心15min。

5)取上清液于一新离心管中，加入2倍上清液体积的已-20℃预冷的无水乙醇，于冰箱-20℃静置20min后，4℃12000rpm离心15min，弃掉上清液，此时会发现管底附着有透明粘性沉淀。

6)向离心管中加入1mL70％乙醇冲洗沉淀表面和管壁，4℃7500rpm离心5min，弃掉乙醇，用吸水纸吸走余下液体。

7)加入20μL灭菌水将沉淀溶解，置于-20℃保存备用^[3]。

实施例4.LMAP体系的建立

LAMP反应体系(25μL)如下表2所示：

表2LAMP反应体系

反应温度控制在65℃，扩增40-60min，80℃5min终止反应。

同时，建立相同体积的PCR反应体系

(25μL)：

表3PCR反应体系

PCR反应条件为：

94℃预变性5min,

94℃变性1min，

63℃退火1min,

72℃延伸1min,

30个循环,

72℃延伸10min。

扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳(电泳图见图4)，在凝胶成像系统下分析结果。

实施例5.LAMP反应体系的优化

LAMP反应结果的检测

(1)琼脂糖凝胶电泳

取5μL扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶中电泳，置凝胶成像系统下观察结果。

(2)SYBRGreenI染色法

向反应管中加入1μLSYBRGreenI核酸染料，肉眼观察溶液颜色变化，进一步确定结果，可将反应管置于紫外分析仪下观察有无荧光。SYBRGreenⅠ可视化结果见图5(紫外灯下)、图6(肉眼观察)。

(3)瞬时离心法

2001年Moil等发现反应副产物焦磷酸离子和反应体系中的镁离子可发生反应生成焦磷酸镁沉淀，使得反应结果可通过肉眼判断：若管内液体浑浊，离心或静置后有白色沉淀集于管底则为阳性，否则为阴性。因此可以在反应结束后进行瞬时离心，通过有无沉淀判断反应结果。

1.反应时间的优化

根据上述实施例4所述的25μLLAMP反应体系进行反应时间的优化，将水浴温度控制在65℃，分别反应40min、45min、50min、55min和60min，反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳进行电泳分析。结果如图1所示，只需要40min就能得到较淡的条带,60min就能得到十分清晰的反应条带。

2.LAMP的特异性检测

在优化后的条件下，分别用PCV2、PPV与PRV为模板同时进行LAMP反应，反应产物用2％琼脂糖凝胶进行电泳分析。

PCV2、PRV、PPV是引起几类主要猪病的重点DNA病毒。在优化后的LAMP反应体系下，分别以PCV2、PRV和PPV的DNA(每种病毒做了两个样)为模板进行反应。电泳结果显示，同等条件下，只有以PRV的DNA为模板的LAMP扩增产物呈现特有的阶梯状条带。其余分别使用PCV2的DNA和PPV的DNA作为模板的反应结果均为阴性。说明该LAMP检测方法对PRV有良好的特异性。电泳结果见图2，可视化结果见图3。

3.LAMP检测方法的灵敏性试验

3.1梯度标准质粒模板的建立

①分子量(M)＝碱基数×碱基平均分子量

＝(扩增片段碱基数+载体碱基数)×2×330

②拷贝数＝质量/分子量*NA＝m/M*NA

按实施例1的方法制备质粒模板，用微量紫外分光光度计测定其浓度，根据①②两个公式计算出此浓度下溶液包含的质粒拷贝数，使用灭菌水倍比稀释该溶液，得到每μL溶液所含质粒拷贝数的数量级按10¹⁰～10⁰依次分布的梯度标准质粒模板。

3.2LAMP和PCR方法的灵敏度测定

以1μL拷贝数为10¹⁰～10⁰梯度标准质粒溶液为模板DNA，按照优化后的体系进行LAMP反应。同时，使用相同的模板DNA进行常规PCR检测。两者的扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，LAMP的扩增产物加入SYBRGreenI核酸染料，置紫外分析仪下观察结果。

另外，我们提取临床已知的8份病料的DNA，同时进行了LAMP和PCR方法的检测，予以比较。

灵敏度测试以含有10¹⁰～10⁰拷贝数的标准质粒溶液为模板DNA。电泳结果可见图7，PCR的条带从第7泳道开始消失，而LAMP的阶梯状条带直到第11泳道，也就是质粒模板仅为个位拷贝数时仍完成扩增。相比较而言，LAMP检测方法的最低检测量为10⁰拷贝，常规PCR检测方法的最低检测量为10⁵拷贝。因此，PRV-LAMP方法的灵敏度相当于常规PCR法的100,000倍。

实施例6.LAMP反应体系的临床病料检测结果

对于临床的8份病料(3份来自莒县某猪场，5份来自莱阳某猪场)。PCR方法共检测出3例阳性结果(其中一份弱阳性病例)，而LAMP方法则检测出了6例阳性结果，相比PCR方法能多检测出3例阳性病料，见图8。

最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用于对本发明保护范围的限制。

Claims (7)

1.一种用于快速检测猪伪狂犬病病毒的环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)引物组，所述引物组的序列结构为：

正向外引物(F3)：ACGAGCCCCGCTTCCA

反向外引物(B3)：AGATGCAGGGCTCGTACA

正向内引物(FIP)：AGACCACGCGCGCGGCATCAG-CTTCCACTCGCAGCTCTTCT

反向内引物(BIP)：GAGAACTTCACCGCCACGCT-CGTAGTACAGCAGGCACCG。

2.根据权利要求1所述的LAMP引物，其特征在于，所述引物具有高度特异性，有效扩增猪伪狂犬病毒基因的扩增模板DNA浓度为10～10¹⁰个拷贝数/每ul。

3.权利要求1所述的LAMP引物组在制备检测猪伪狂犬病毒的试剂盒中的应用。

4.由权利要求1所述的LAMP引物组制备的检测猪伪狂犬病毒的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：

(1)所述的LAMP引物组；

(2)扩增靶标DNA所需必要的扩增制剂，所述的扩增制剂包括但不限于，DNA聚合酶，DNTP，以及用于DNA扩增的盐溶液；

(3)用于检测所需的检测制剂，所述的检测制剂优选为，核酸荧光显色剂。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒的检测应用包括如下步骤：

步骤(1)提取病料血清中的病毒DNA；

步骤(2)使用所述LAMP引物在LAMP反应体系中扩增病毒DNA；

步骤(3)LAMP反应结果检测。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，

所述的步骤(1)的具体方法为：

1)取病料血清500μL于1.5mL离心管。向离心管中加入10％SDS溶液50μL，而后加入蛋白酶K(20mg/mL)10μL，混匀后置56℃水浴1.5-2h。

2)加入200μLTris平衡酚，充分混匀溶液，置高速离心机中4℃12000rpm离心15min。

3)取上清液于一新1.5mL离心管中，加入Tris平衡酚和氯仿各200μL，充分混匀，4℃12000rpm离心15min。

4)取上清液于一新离心管中，加入氯仿200μL，充分混匀，4℃12000rpm离心15min。

5)取上清液于一新离心管中，加入2倍上清液体积的已-20℃预冷的无水乙醇，于冰箱-20℃静置20min后，4℃12000rpm离心15min，弃掉上清液，此时会发现管底附着有透明粘性沉淀。

6)向离心管中加入1mL70％乙醇冲洗沉淀表面和管壁，4℃7500rpm离心5min，弃掉乙醇，用吸水纸吸走余下液体。

7)加入20μL灭菌水将沉淀溶解，置于-20℃保存备用；

所述步骤(2)的具体方法为：

(1)25μL的LAMP反应体系成分如下：

1)BstDNA聚合酶(8U/μL)，1ul；

2)10×ThermoPol缓冲液(100mMKCl,100mM(NH₄)SO₄,200mMTris-HCl,20mMMgSO₄,1％TritonX-100)，2.5ul；

3)步骤(1)获得的DNA样品，2ul；

4)MgSO₄(100nmol/μL)，1ul、Betaine(5μmol/μL)，5ul；

5)dNTP(25mmol/μL)，5ul；

6)BIP&FIP引物(40uM)，2ul、F3&B3引物(10uM)，0.25ul

7)余量为灭菌超纯水。

(2)反应温度控制在65℃，扩增40-60min，80℃5min终止反应；

所述步骤(3)的具体方法为：

1)琼脂糖凝胶电泳、或2)SYBRGreenI染色法、或3)瞬时离心法；

所述的琼脂糖凝胶电泳法为：

取5μL扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶中电泳，置凝胶成像系统下观察结果条带；

所述的SYBRGreenI染色法为：

向反应管中加入1μLSYBRGreenI核酸染料，观察溶液颜色变化；

所述的瞬时离心法为：

在反应结束后进行瞬时离心，通过有无沉淀判断反应结果。

7.根据权利要求4至6任一所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒用于检测目标病料中的伪狂犬病毒。