CN106591490B - 一种检测伪狂犬病毒的核酸组合、试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

一种检测伪狂犬病毒的核酸组合、试剂盒及应用，属于动物检验检疫领域。本发明提供的检测伪狂犬病毒的核酸组合包括引物对和探针，其碱基序列如SEQ ID NO.1‑3所示，该核酸组合能特异的识别伪狂犬病毒的特异序列，具有较好的特异性；而由于探针的应用，使检测具有更高的灵敏度；在制备检测伪狂犬病毒的试剂盒，应用上述核酸组合，使检测伪狂犬病毒更为快速准确，具有更高的特异性和灵敏度，而且更有利于临床推广和使用。

Description

一种检测伪狂犬病毒的核酸组合、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及动物检验检疫领域，且特别涉及一种检测伪狂犬病毒的核酸组合、试剂盒及应用。

背景技术

猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是一种对畜牧业危害极大的传染病，由伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起，可感染多种家畜及野生动物，临床上主要表现为发热、奇痒(猪除外)、繁殖障碍和脑脊髓炎，具有传播范围广、传播途径多、发病快、死亡率高、病原体顽固等特点。目前该病已呈世界性分布，而且流行愈来愈严重，给全球养猪业造成巨大的经济损失。因此建立一种能够快速、敏感和特异的检测PRV的方法对该病的控制至关重要。

PRV的检测方法目前主要有动物接种、病毒的分离与鉴定、血清学检测方法和分子生物学检测方法。前三种方法虽然具有特异性和敏感性，但对技术条件要求高，操作比较繁琐，检测周期长，因此不利于病毒的快速检测。分子生物学检测方法，检测的是核酸，是敏感性最高的一种检测方法，以其检测快度、灵敏度高、特异性好等特点被广泛应用于临床检测。分子生物学检测方法主要包括常规PCR法和实时荧光定量PCR法(FQ-PCR)。

传统PCR方法虽然检测简单、快速、方便但存在灵敏度和特异性不够。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测伪狂犬病毒的核酸组合，引物组合包含引物对和探针，引物对和探针能特异的结合到目标条带，灵敏度也比较高；而且通过探针标记的显色基团能快速反应出检测结果。

本发明的第二目的在于提供上述的检测伪狂犬病毒的核酸组合在检测伪狂犬病毒中的应用。

本发明的第三目的在于提供上述的检测伪狂犬病毒的核酸组合在制备检测伪狂犬病毒试剂盒中的应用。

本发明的第四目的在于提供一种检测伪狂犬病毒的试剂盒，该试剂盒包括上述核酸组合，组成简单，适用于快速检测伪狂犬病毒，而且成本低廉，便于应用和推广。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

一种检测伪狂犬病毒的核酸组合，核酸组合包括引物对和探针，引物对的碱基序列如SEQ ID NO.1-2所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，探针的5’端标记第一显色基团和探针的3’端标记有第二显色基团。

第一显色基团为异硫氰酸荧光素FITC、6-羧基荧光素6-FAM和生物素Biotin中的一种；第二显色基团为异硫氰酸荧光素FITC、6-羧基荧光素6-FAM和生物素Biotin中的一种；第一显色基团不同于第二显色基团。

上述核酸组合在检测伪狂犬病毒中的应用。

上述的检测伪狂犬病毒的核酸组合在制备检测伪狂犬病毒试剂盒中的应用。

一种检测伪狂犬病毒的试剂盒，包括上述的核酸组合。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：针对伪狂犬病毒特异序列设计的核酸组合包括引物对及探针，具有很高的特异性，因此在样本量较低的情况下，也能检测到样本，所以该核酸组合具有很高的灵敏度；能准确的检测到伪狂犬病毒；检测伪狂犬病毒的试剂盒，包含上述核酸组合，由于上述核酸组合的应用，使检测更为方便快捷，结果更为准确，而且试剂盒成本低廉，具有更广泛的应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例4提供的探针浓度实验结果图；

图2为本发明实施例5提供的试剂盒特异性检测结果图；

图3为本发明实验例1提供的试剂盒特异性检测结果图；

图4为本发明实验例2提供的试剂盒灵敏度检测结果图；

图5为本发明实验例2提供的PCR产物电泳结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的一种检测伪狂犬病毒的核酸组合、试剂盒及应用进行具体说明。

本发明利用Taq酶的5’端-3’端外切酶活性，在PCR反应系统中加入标记过的探针。该探针可与引物扩增序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5’端标记为异硫氰酸荧光素(FITC)、6-羧基荧光素(6-FAM)或生物素(Biotin)中的一种，探针的3’端标记为异硫氰酸荧光素(FITC)、6-羧基荧光素(6-FAM)或生物素(Biotin)中的一种，探针的5’端和3’端标记不同的显色基团；试纸条上有识别上述显色基团的特异性抗体。

当模板中不含有目的片段的时候，探针没有结合的对象，不会被Taq酶切断，能保持探针的完整。当探针保持完整时，显色基团能够被特异性抗体识别，试纸条出现两条红色条带，检测结果即判定为阴性。当PCR反应体系中有目的片段存在，荧光探针即会根据碱基配对的原理与之杂交；PCR反应就会扩增出特异核酸片段，当PCR进入延伸(复制)期，Taq酶从引物3’端开始，随新链延伸沿DNA模板移动，当移动到探针结合位置时，其Taq酶5’端-3’端外切酶活性作用，将探针切断，从而不能被特异性抗体识别，试纸条只出现一条红色条带，检测结果即判定为阳性。

一种检测伪狂犬病毒的核酸组合，核酸组合包括引物对和探针，引物对的碱基序列如SEQ ID NO.1-2所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，探针的5’端标记第一显色基团和探针的3’端标记有第二显色基团。

进一步地，第一显色基团为异硫氰酸荧光素FITC、6-羧基荧光素6-FAM和生物素Biotin中的一种；第二显色基团为异硫氰酸荧光素FITC、6-羧基荧光素6-FAM和生物素Biotin中的一种；第一显色基团不同于第二显色基团。

该引物对能特异识别出猪伪狂犬病毒的特异区段，具有较强的特异性，同时探针也是针对猪伪狂犬病毒的特异区段进行设计，同样具有较高的特异性；能够在样本含量很低的情况下，检测出样本来，所以上述的核酸组合也具有较高的灵敏度。而探针通过标记异硫氰酸荧光素FITC、6-羧基荧光素6-FAM和生物素Biotin，通过标记使探针发挥作用，更有利于对伪狂犬病毒检测；而且，探针的5’端和3’端标记不同显色基团，能够交叉验证，避免发生误检的情况，使检测的结果更为准确和合理。

上述核酸组合在检测伪狂犬病毒中的应用。

进一步地，上述核酸组合在检测伪狂犬病毒中的应用时，以待检样本DNA或cDNA为模板，加入上述引物对和探针，进行PCR反应。

进一步地，上述PCR扩增反应的程序为：94℃预变性5min，95℃变性30s，58-63℃退火10s，72℃延伸15s，40个循环，72延伸2min。

选择58-63℃退火温度，能扩增出特异性的条带，避免扩增出非特异的条带干扰实验结果，40个循环能扩增出大量片段，将微量的模板放大，利于检测。

上述的检测伪狂犬病毒的核酸组合在制备检测伪狂犬病毒试剂盒中的应用。

应用上述的核酸组合，能是检测结果更准确可靠。

一种检测伪狂犬病毒的试剂盒，包括上述的核酸组合。

进一步地，上述试剂盒还包括试纸条，试纸条包被有识别第一显色基团的第一特异性抗体和识别第二显色基团的第二特异性抗体。

通过试纸条上包被抗体，通过抗原抗体反应和显色，能提高反应灵敏度、特异性和准确性。而且识别简单，一目了然，能清楚、直观、准确的反映出检测结果。

进一步地，试纸条上具有检测线和质控线；所述检测线包被所述第一特异性抗体，所述质控线包被所述第二特异性抗体；或者检测线包被所述第二特异性抗体，所述质控线包被所述第一特异性抗体。

质控线和检测线分别包被不同的抗体；不同的抗体与探针上对应的显色基团结合，发生抗原抗体反应；通过两种不同的抗体的包被，可以联合检查探针，提高检测的准确性、特异性和灵敏度。

质控线包被的抗体，抗体与胶体金颗粒或乳胶颗粒结合，当探针未被酶切，探针保持完整；探针上标记的第一显色基团与质控线上相对应的第一特异性抗体结合，然后由于毛细现象的作用，探针第一显色基团与胶体金颗粒或乳胶颗粒结合形成复合体，运动到检测线，探针上的第二显色基团与检测线上的第二特异性抗体结合显色；由于探针完整，可以判断结果为阴性。而当待测样品中含有目的片段的时候，在进行PCR反应的时候，探针被酶切，探针上与质控线上抗体结合的显色基团与抗体结合形成复合物；由于毛细现象，复合物运动到检测线，但是探针被酶切，没有与检测线上包被的抗体结合的显色基团，不能显色，故仅有质控线显色，判断检测结果为阳性。

进一步地，上述试剂盒还包括PCR反应缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶和Mg²⁺中的一种或多种。

试剂盒中包括上述的试剂，有利于PCR反应的操作，可以快速的进行反应。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种检测伪狂犬病毒的核酸组合，该核酸组合包括引物对和探针，引物对的碱基序列如SEQ ID NO.1-2所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，探针的5’端标记异硫氰酸荧光素FITC且3’端标记有生物素Biotin。

引物对和探针的序列如下：

上游引物：5’-CCCTTCGACGCCTTCGG-3’；

下游引物：5’-CTTGGTGACCGTGACGTACT-3’；

探针序列：FITC-5’-GCTGTACGTGCTCGTGATGA-3’-Biotin。

探针序列上的FITC作为第一显色基团，Biotin作为第二显色基团。

实施例2

本实施例提供一种检测伪狂犬病毒的核酸组合，该核酸组合包括引物对和探针，引物对的碱基序列如SEQ ID NO.1-2所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，探针的5’端标记生物素Biotin且3’端标记有6-羧基荧光素6-FAM。

引物对和探针的序列如下：

上游引物：5’-CCCTTCGACGCCTTCGG-3’；

下游引物：5’-CTTGGTGACCGTGACGTACT-3’；

探针序列：Biotin-5’-GCTGTACGTGCTCGTGATGA--3’6-FAM。

探针序列上的Biotin作为第一显色基团，FITC作为第二显色基团。

实施例3

本实施例提供一种检测伪狂犬病毒的试剂盒，该试剂盒包括实施例1提供的核酸组合。该试剂盒能广泛应用于伪狂犬病毒的检测，且具有较高的特异性和灵敏性。

实施例4

本实施例提供一种检测伪狂犬病毒的试剂盒，该试剂盒包括实施例2提供的核酸组合，以及试纸条。试纸条包括衬垫、吸水板、样品板和硝酸纤维素膜，衬垫的长度比硝酸纤维素膜长；硝酸纤维素膜设置在衬垫上，吸水板和样品板也设置在衬垫上，且吸水板和样品板分别位于硝酸纤维素膜的两端；硝酸纤维素膜设置有检测线和质控线，质控线设置在有样品板的一端，检测线设置在另外一端。试纸条的检测线包被有识别Biotin的第一特异性抗体，第一特异性抗体固定于硝酸纤维膜。质控线包被有识别FITC的第二特异性抗体；第二特异性抗体吸附于胶体金颗粒，

当然，在其他实施例中，本发明提供的检出伪狂犬病毒的试剂盒还包括PCR反应缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶和MgSO₄中的一种或多种。

该试剂盒可以用于检测待测样本中是否含有伪狂犬病毒。且本实施例提供的试剂盒具有良好的灵敏性和特异性，使检测结果更为准确。

本实施例提供探针的灵敏度的检测，具体方法如下：

第一部分，DNA模板的制备

以PRV Fa株为提取样本，DNA的提取采用AXYPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒(磁珠法)，具体操作过程如下：

1.1在1.5mL离心管中加20μL Proteinase K；

1.2加200μL病毒上清液；

1.3加200μL Buffer BV-L，涡旋振荡混合均匀，56℃水浴10分钟；

1.4加500μL磁珠溶液于一新的1.5mL离心管中，将离心管置于磁力架上静置30秒，直至磁珠全部吸至管壁，吸弃管内液体，移去磁力架，离心管内磁珠待用；

1.5将步骤3中的溶液加入有磁珠的离心管内，然后加入500ul异丙醇，上下颠倒5-8次，混合均匀；

1.6静置10分钟，每隔2分钟上下颠倒离心管4-6次，使管内磁珠分布均匀；

1.7将离心管置于磁力架上，静置至磁珠全部吸附至管壁，吸弃管内液体；

1.8移去磁力架，加入500ul Buffer W1A，用移液器吸头轻柔吹打管壁磁珠，直至分布均匀；

1.9将离心管置于磁力架上，静置磁珠全部吸附至管壁，吸弃管内液体；

1.10移去磁力架，加入700ul Buffer W2，用移液器吸头轻柔吹打管壁磁珠，直至分布均匀；

1.11将离心管置于磁力架上，静置至磁珠全部吸附至管壁，吸弃管内液体；

1.12可选步骤：将离心管置于磁力架上，加入400ul Buffer W2，静置至磁珠全部吸附至管壁，吸弃管内液体；

1.13打开管盖，让磁珠在安全柜中干燥2分钟；

1.14移去磁力架，加入50ul Buffer TE(nuclease-free)或去离子水，用移液器吸头轻柔吹打管壁磁珠，直至分布均匀，静置2分钟；

1.15将离心管置于磁力架上，静置至磁珠全部吸附至管壁，吸取上清至一新的离心管中，即得到病毒DNA。

第二部分，探针最低工作浓度的确定

采用1pmol/μL、0.1pmol/μL、0.01pmol/μL、0.001pmol/μL、0.0001pmol/μL 5个不同探针浓度，分别用不加DNA模板的反应体系进行PCR扩增。采用25ul反应体系，反应体系中加入DNA模板，0.5μL；浓度为10μmol/L的引物对，各1μL；以及上述浓度的探针，1μL；PCR反应缓冲液，2.5μL；浓度为10mmol/L的dNTPs，1μL；Taq DNA聚合酶，0.5μL；浓度为25mmol/L的MgCl₂，1μL；用ddH₂O补足反应体系到25μL，混合均匀；反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火10s，72℃延伸15s，40个循环，72℃延伸2min。PCR扩增产物用试纸条进行检测，以检测结果为阴性的临界值，为探针标准。

检测的时候，试纸条的样品板一端插入待测样品中，待测样品不得没过质控线。

检测结果如图1所示，图中1中1-5分别表示探针的浓度为1pmol/μl、0.1pmol/μl、0.01pmol/μl、0.001pmol/μl及0.0001pmol/μl。当探针浓度低至0.001pmol/μL时，出现两条红色带，说明探针检测能达到很高的灵敏度。

实施例5

本实施例提供一种检测伪狂犬病毒的试剂盒，该试剂盒包括实施例1提供的核酸组合；以及检测用的试纸条，试纸条质控线设置有识别FITC的第一特异性抗体，检测线包被有识别Biotin的第二特异性抗体；第一特异性抗体吸附于胶体金颗粒，第二特异性抗体固定于硝酸纤维膜。

当然，在其他实施例中，本发明提供的检测伪狂犬病毒的试剂盒还包括PCR反应缓冲液、dNTPs，Taq DNA聚合酶和MgCl₂中的一种或多种。

该试剂盒可以用于检测待测样本中是否含有伪狂犬病毒。且本实施例提供的试剂盒具有良好的灵敏性和特异性，使检测结果更为准确。

试剂盒的有效性检测和检测特异性评价

PCR反应体系为25μL；反应体系中加入DNA模板，0.5μL；浓度为10μmol/L的引物对，1μL、0.001pmol/μL的探针，1μL；PCR反应缓冲液，2.5μL；浓度为10mmol/L的dNTPs，1μL；TaqDNA聚合酶，0.5μL；浓度为25mmol/L的MgCl₂，1μL；用ddH₂O补足反应体系到25μL，混合均匀；按以下反应条件进行反应：94℃预变性5min，94℃变性30s，63℃退火10s，72℃延伸15s，40个循环，72℃延伸2min。

以实施例3第一部分介绍的DNA提取方法，提取的PRV DNA并以PRV DNA为模板作为阳性组，同时设置阴性对照，进行PCR扩增。

试纸条检测结果如图2所示，图中1表示伪狂犬病毒DNA模板，2表示阴性对照。图中加入伪狂犬病毒DNA模板的试验组出现一条红色带，即检测结果为阳性，阴性对照组出现两条红色带，即检测结果为阴性，结果表明试剂盒能够成功检测到PRV。

实验例1

本实验例用实施例4提供的试剂盒，对试剂盒的特异性进行验证。

选择猪细小病毒(DNA)、猪瘟病毒(RNA)、猪流行性腹泻病毒(RNA)、猪传染性胃肠炎病毒(RNA)、A群猪轮转病毒(RNA)、大肠杆菌16S DNA和猪伪狂犬病毒PRV(DNA)为实验组，同时设置一组阴性对照。

提取上述实验组的DNA(方法参考实施例4)或RNA并反转录成cDNA(参考《分子克隆实验指南》第三版)，进行试验。

PCR反应体系为25μL；反应体系中加入上述模板，0.5μL；浓度为10μmol/L的引物对，各1μL；0.001pmol/μL的探针，1μL；PCR反应缓冲液，2.5μL；浓度为10mmol/L的dNTPs，1μL；Taq DNA聚合酶，0.5μL；浓度为25mmol/L的MgSO₄，1μL；用ddH₂O补足反应体系到25μL；PCR反应的程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火10s，72℃延伸15s，40个循环，72℃延伸2min。

用试剂盒中的试纸条检测，结果如图3所示，图3中1为猪细小病毒模板；2为猪瘟病毒模板；3为猪流行性腹泻病毒模板；4为猪传染性胃肠炎病毒模板；5为A群猪轮状病毒模板；6为大肠杆菌16S DNA模板；7为伪狂犬病毒模板；8为阴性对照。从图中可以看出仅有猪伪狂犬病毒PRV(DNA)呈阳性反应，其余均呈阴性反应。说明试剂盒能较为特异的识别出伪狂犬病毒；具有较高的特异性，检测的准确性和可靠性都很高。

实验例2

应用实例3提供的试剂盒，检测试剂盒的灵敏度

以实施例3提取的猪伪狂犬病毒PRV的DNA为模板，连续10倍倍比稀释，按照10⁰-10⁶连续7个倍比关系稀释成相应浓度的模板，以实施例4提供的反应体系和反应程序进行PCR扩增反应。

反应结束后，用试剂盒中的试纸条进行检测，同时对反应结果进行电泳检测。结果如图4和图5所示；图4中1-7分别为按照10⁰-106倍数稀释浓度猪伪狂犬病毒DNA模板，8位阴性对照；图5中M:DL2000DNA分子质量标准；0-6分别为按照10⁰-106倍数稀释浓度猪无狂犬病毒DNA模板；-表示阴性对照；从图示结果可以看出伪狂犬病毒PRV的DNA的模板稀释10⁴倍后依然能检测出结果，而传统的电泳检测只能检测到稀释10³倍的浓度范围。因此本试剂盒能更高的灵敏性。

综上所述，本发明实施例的检测伪狂犬病毒的核酸组合能特异的在识别出伪狂犬病毒，检测伪狂犬病毒的试剂盒包含上述的核酸组合，应用该试剂盒具有较传统方法更高的灵敏性和特异性，而且较传统方法操作也更为简单，快速和便捷。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川华神兽用生物制品有限公司

<120> 一种检测伪狂犬病毒的核酸组合、试剂盒及应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> Susscrofa domestica

<400> 1

cccttcgacg ccttcgg 17

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Susscrofa domestica

<400> 2

cttggtgacc gtgacgtact 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Susscrofa domestica

<400> 3

gctgtacgtg ctcgtgatga 20

Claims (5)

1.一种检测伪狂犬病毒的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合包括引物对和探针，所述引物对的碱基序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述探针的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，所述探针的5’端标记第一显色基团和所述探针的3’端标记有第二显色基团；

所述第一显色基团为异硫氰酸荧光素FITC、6-羧基荧光素6-FAM和生物素Biotin中的一种；所述第二显色基团为异硫氰酸荧光素FITC、6-羧基荧光素6-FAM和生物素Biotin中的一种；所述第一显色基团不同于所述第二显色基团。

2.如权利要求1所述的检测伪狂犬病毒的核酸组合在制备检测伪狂犬病毒试剂盒中的应用。

3.一种检测伪狂犬病毒的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的核酸组合。

4.根据权利要求3所述的检测伪狂犬病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括试纸条，所述试纸条包被有识别所述第一显色基团的第一特异性抗体和识别所述第二显色基团的第二特异性抗体；

所述试纸条上具有检测线和质控线；所述检测线包被所述第一特异性抗体，所述质控线设置有所述第二特异性抗体；或者检测线包被所述第二特异性抗体，所述质控线设置有所述第一特异性抗体。

5.根据权利要求3所述的检测伪狂犬病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶和Mg²⁺中的一种或多种。

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