CN112746134A

CN112746134A - 非洲猪瘟病毒核酸快速检测试剂盒与应用

Info

Publication number: CN112746134A
Application number: CN202110153271.0A
Authority: CN
Inventors: 刘榜; 付明; 周翔; 张庆德
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2021-02-03
Filing date: 2021-02-03
Publication date: 2021-05-04

Abstract

本发明提供了一种非洲猪瘟病毒核酸快速检测方法及试剂盒，属于生物技术领域。本发明试剂盒提供了用于检测非洲猪瘟病毒核酸的特异性RPA标记引物ASF‑F、ASF‑R，其序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示。本发明试剂盒还提供了一种检测试纸条，可针对RPA扩增产物进行检测。采用本发明的RPA引物分别扩增样品DNA，通过试纸条对扩增产物进行检测，可判定样品是否感染非洲猪瘟病毒。本发明针对非洲猪瘟病毒核酸建立的检测方法无需特殊设备，反应时间仅需25min，灵敏度高达100cp/μL，在常见的4种猪源病毒中均无交叉反应，特异性强。本发明为非洲猪瘟病毒核酸的检测提供了简便有效的检测手段，适用于现场检测。

Description

非洲猪瘟病毒核酸快速检测试剂盒与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种快速检测非洲猪瘟病毒核酸的试剂盒。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirμs，ASFV)引起的猪的一种烈性、高度接触性传染病。ASF具有高发病率、高死亡率特点，一旦发生，经济损失巨大。鉴于该病的严重危害性，世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。2018年8月1日，我国确诊了首例非洲猪瘟疫情。

目前针对ASF防控，尚无有效的商品化疫苗，对ASF的控制只能依赖于实验室诊断、对发病动物的捕杀以及采取有效的检疫措施和严格的卫生措施。因此ASFV的快速检测对于控制ASF，防止其造成巨大经济损失，具有极其重要的意义。随着分子诊断技术的发展，目前已经建立了多种具有不同特异性和灵敏性的ASFV检测方法，如针对ASFV核酸检测的PCR、real-time PCR、LAMP等，但上述方法或者需要昂贵的仪器设备、娴熟的技术人员，比较费时，或者需要复杂的引物和探针设计，从而不能有效应用于快速检测；针对ASFV抗体的检测方法目前也有开发，如ELISA和测流层析试纸条，但是在感染早期很难检测到相应抗体，因此建立一种快速检测非洲猪瘟病毒核酸的方法十分必要。

近年来，核酸恒温扩增技术得到了快速发展，与传统PCR相比，核酸等温扩增技术不需要昂贵的PCR仪，可在短时间内快速扩增出目的片段，具有简便、快速、灵敏等优点。重组酶聚合酶介导等温扩增技术(recombinase polymerase amplification，RPA)是在单链DNA结合蛋白的辅助下，模板DNA动态解链，同时在重组酶介导下引物与模板正确配对形成复合体，然后DNA聚合酶延伸引物生成新的DNA链。其最大的特点是不需要通过高低温度循环实现核酸解链和退火，只需在39℃恒温反应20分钟即可完成对模板核酸的扩增。

由于RPA方法与传统PCR方法有着极大的差异，其对引物和探针有更高的要求，是影响RPA方法的关键，不同的引物直接影响扩增速度和检测灵敏度，从而影响现场检测，并且目前没有专门的RPA引物设计软件。因此，RPA的引物设计难度较大。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术不足，提供快速检测非洲猪瘟病毒核酸的RPA引物、试剂盒。

本发明利用异硫氰酸荧光素FITC和生物素Biotin分别标记RPA正反向引物的5’端，随后进行RPA扩增，扩增产物通过试纸条检测能快速检测非洲猪瘟病毒，具有高度专一性，灵敏度高，检测速度快等特点，并且结果可通过肉眼判读，非常简单方便。

为实现上述目的，本发明针对非洲猪瘟病毒P72基因保守序列设计了RPA标记引物，本发明还专门设计组装了针对双标记核酸扩增产物进行检测的胶体金试纸条，试纸条的金标垫上吸附有抗FITC的金标抗体，检测线吸附有生物素抗体，质控线吸附有抗金标抗体的二抗。

本发明还提供如下技术方案：

一种快速检测非洲猪瘟病毒核酸的RPA引物、试纸条及试剂盒，包括对非洲猪瘟P72基因保守序列扩增的RPA标记引物；

对非洲猪瘟P72基因保守序列进行扩增的RPA标记引物，具体为：

ASF-F:5’-FITC-CACATTACCTATTATTAAAAACATTTCCGT-3’

ASF-R:5’-Biotin-AGCAGATGCCGATACCACAAGATCAGCCGT-3’

一种快速检测非洲猪瘟病毒核酸的RPA引物、试纸条及试剂盒，其含有所述的RPA标记引物以及自行设计组装的胶体金试纸条。

一种快速检测非洲猪瘟病毒核酸的试纸条检测方法，包括以下步骤：

1)提取样品基因组DNA：

2)RPA扩增：

以待测样品的DNA作为模板，将所述的非洲猪瘟RPA标记引物加入到RPA扩增反应体系中，进行RPA扩增；

3)扩增产物检测：

将步骤2)的扩增产物稀释后滴在划有生物素(Biotin)抗体及异硫氰酸荧光素(FITC)抗体的核酸检测试纸条上，侧向层析2～5分钟，根据显色条带进行判定：若试纸条在检测线和质控线处都有显色，则表示待测样品中含有非洲猪瘟病毒，若仅在质控线处有显色，则表示待测样品中不含有非洲猪瘟病毒，若检测线和质控线处均无显色，则表示无扩增或试纸条无效。

进一步，所述的RPA反应体系中，DNA模板的终浓度为0.5～2ng/μL，正、反向引物的终浓度各为0.3～0.6μmol/L。

优选地，所述RPA反应体系总体积为50μL，其中，浓度为10μmol/L的正向标记引物加入2.4μL、反向标记引物各加入2.4μL，浓度为50ng/μL的DNA模板加入2μL，RPA反应缓冲液29.5μL，ddH₂O补足至50μL。

进一步，步骤2)中，所述RPA扩增反应程序为：恒温反应39℃，扩增20分钟。

本发明利用重组酶聚合酶介导的等温扩增技术(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)快速检测非洲猪瘟病毒核酸。根据特异DNA序列，设计了大量的RPA特异性引物，从中筛选出一组扩增效果较好的RPA引物，再利用异硫氰酸荧光素FITC和生物素分别标记正反向引物的5’端后进行RPA扩增反应，扩增产物经试纸条检测，FITC标记的扩增产物与抗FITC抗体的金标物结合后形成免疫复合物，免疫复合物通过层析膜扩散，扩散到检测线时，生物素标记的扩增产物被生物素抗体捕获，形成具有颜色的检测线。不被捕获的免疫复合物继续扩散到质控线被特异性抗体所捕获，形成具有颜色的质控线。该方法特异性好，检测时间短，结果可经肉眼判读，在非洲猪瘟现场检测中具有广泛应用前景。

本发明提供了快速有效的非洲猪瘟病毒核酸检测方法，并且能对样品中是否含有非洲猪瘟病毒进行有效的鉴定。利用建立的检测方法分别对经典猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪2型圆环病毒(PCV-2)、猪伪狂犬病毒(PRV)等多种病毒进行扩增，证实本发明所建立的检测方法具有很高的特异性和敏感性，为基层单位及普通实验室非洲猪瘟病毒感染的诊断提供了一个快速、简便、准确的检测手段。本发明的方法可以在非洲猪瘟病毒核酸检测中作为标准检测方法使用。本发明试剂盒及检测方法具有简便、快速、全面、特异性强的特点，且十分适用于现场检测。

附图说明

图1是针对PμCsp-ASFV-P72重组质粒序列设计的多对引物进行引物筛选。分别以PμCsp-ASFV-P72重组质粒DNA作为阳性对照，以经典猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪2型圆环病毒(PCV-2)和猪伪狂犬病毒(PRV)DNA混合模板作为阴性对照分别进行RPA扩增，其中P代表阳性对照，N代表阴性对照。结果表明只在ASF-F1、ASF-R1引物组合情况下表现出特异性，而其他引物组合出现假阳性结果。

图2是利用SEQ ID NO 1～SEQ ID NO 2序列进行的特异性检测结果。以PμCsp-ASFV-P72重组质粒DNA作为阳性对照，以经典猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪2型圆环病毒(PCV-2)和猪伪狂犬病毒(PRV)DNA模板作为阴性对照分别进行RPA扩增，以双蒸水作为空白对照(C)，扩增产物经试纸条检测，结果显示在阳性对照中试纸条T、C线均出现条带，阴性对照中试纸条仅在C线出现条带。

图3是利用SEQ ID NO 1～SEQ ID NO 2序列进行的灵敏度检测结果。PμCsp-ASFV-P72重组质粒DNA拷贝数分别为10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹拷贝/μL(编号为1、2、3、4、5、6)，编号7为空白对照，结果显示当拷贝数低至100拷贝/μL时仍可检测到条带。

图4利用SEQ ID NO 1～SEQ ID NO 2序列进行的真实样品检测结果。编号1-3分别为三个ASFV阳性DNA样品，4-6分别为三个ASFV阴性DNA样品，7为空白对照。结果显示在1-3号样品中试纸条T、C线均出现条带，4-7号样品中试纸条仅在C线出现条带，说明SEQ ID NO1～SEQ ID NO 2序列可用于真实样品的检测。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所做的修改或润色均属于本发明的范围。

实施例1特异性检测

1.引物设计

根据RPA引物的设计原则，引物长度30～35bp，设计若干对特异性引物，用异硫氰酸荧光素标记上游引物5'端，用生物素标记下游引物5'端，扩增片段大小为292bp，以重组质粒PμCsp-ASFV-P72 DNA为模板进行RPA扩增，通过对扩增产物进行试纸条检测，根据扩增产物的特异性来评价和筛选引物扩增效率及特异性，以此选择最佳引物。

本发明设计合成了若干引物，本例中经过筛选的引物序列如表1所示，其中引物设计了多条，经过筛选最终选取的引物序列如序列表SEQ ID NO 1～SEQ ID NO 2所示。

表1本发明设计的RPA扩增引物

2.恒温扩增

2.1试样RPA扩增反应

将表1中引物利用TwistDx RPA试剂盒进行重组酶聚合酶等温扩增，RPA反应体系总体积为50μL，其中，浓度为10μmol/L的正向引物加入2.4μL、反向标记引物各加入2.4μL，浓度为50ng/μL的DNA模板加入2μL，RPA反应缓冲液29.5μL，ddH₂O补足至50μL。

RPA扩增反应程序为：恒温反应39℃，扩增20分钟。

2.2对照RPA扩增反应

2.2.1在试样RPA扩增反应的同时，设置阴性对照、阳性对照及空白对照。各对照RPA扩增反应体系中，除模板外其余组分及RPA反应条件与2.1相同，且阴性、阳性对照DNA模板浓度也应达到试样DNA模板浓度要求。

2.2.2以猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪2型圆环病毒(PCV-2)、猪伪狂犬病毒(PRV)基因组DNA模板作为RPA反应体系的阴性对照模板。

2.2.3以PμCsp-ASFV-P72重组质粒DNA作为RPA反应体系的阳性对照模板。

2.2.4以双蒸水作为RPA反应体系的空白对照模板。

3.产物检测

将固定有生物素抗体和异硫氰酸荧光素抗体的双标记核酸恒温扩增检测试纸条插入到步骤2的扩增反应体系中，2-5分钟内，显示结果。

4.结果分析与表述

如图1所示，分别以PμCsp-ASFV-P72重组质粒DNA作为阳性对照，以经典猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪2型圆环病毒(PCV-2)和猪伪狂犬病毒(PRV)DNA混合模板作为阴性对照分别进行RPA扩增，其中P代表阳性对照，N代表阴性对照，结果表明，ASF-F1、ASF-R1引物组合表现最好，只在阳性P样品中有条带，而在ASF-F1、ASF-R1阴性对照N中无条带出现，并且无假阳性结果出现。筛选好的引物特异性结果如图2所示，以PμCsp-ASFV-P72重组质粒DNA作为阳性对照，以经典猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪2型圆环病毒(PCV-2)和猪伪狂犬病毒(PRV)DNA模板作为阴性对照分别进行RPA扩增，以双蒸水作为空白对照(C)，扩增产物经试纸条检测，结果显示在阳性对照中试纸条T、C线均出现条带，阴性对照中试纸条仅在C线出现条带。

实施例2灵敏度试验

分别以拷贝数为10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹的PμCsp-ASFV-P72质粒DNA为模板，按照实施例1的条件，进行RPA扩增。扩增产物经试纸条检测，结果如图3所示。PμCsp-ASFV-P72重组质粒DNA拷贝数分别为10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹拷贝/μL(编号为1、2、3、4、5、6)，编号7为空白对照，结果显示当拷贝数低至100拷贝/μL时仍可检测到条带。

实施例3试纸条

本发明提供一种针对RPA核酸扩增产物进行检测的胶体金试纸条，其包括金标垫、检测线和质控线，所述金标垫上吸附有抗FITC的金标抗体。所述金标抗体的包被浓度为(1mg/L)和包被量为(1μL)；所述检测线吸附有生物素抗体，其包被浓度为(1mg/L)和包被量(1μL)；所述质控线吸附有抗金标抗体的二抗，其包被浓度为(1mg/L)和包被量为(1μL)。

实施例4非洲猪瘟病毒核酸快速检测试纸条的应用

该实施例中阳性样品为感染ASFV猪组织DNA样品，阴性样品为正常猪组织DNA样品。分别以ASFV阳性DNA样品和ASFV阴性DNA样品为模板，进行RPA扩增，RPA扩增反应程序为：恒温反应39℃，扩增20分钟，扩增产物经试纸条检测，结果如图4所示。编号1-3分别为三个ASFV阳性DNA样品，4-6分别为三个ASFV阴性DNA样品，7为空白对照。结果显示在1-3号样品中试纸条T、C线均出现条带，4-7号样品中试纸条仅在C线出现条带，说明SEQ ID NO 1～SEQ ID NO 2序列可用于真实样品的检测。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 非洲猪瘟病毒核酸快速检测试剂盒与应用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 1

cacattacct attattaaaa acatttccgt 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 2

agcagatgcc gataccacaa gatcagccgt 30

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 3

attattaaaa acatttccgt aactgctcat gg 32

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 4

ctgggttggt attcctcccg tggcttcaa 29

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 5

attattaaaa acatttccgt aactgctcat 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 6

ccactgggtt ggtattcctc ccgtggcttc 30

Claims

1.非洲猪瘟病毒核酸检测特异性RPA标记引物，其特征在于，所述RPA正反向标记引物序列如SEQ ID No.1和2所示，其中RPA正向引物5’端标记荧光素FITC，反向引物5’端标记生物素Biotin。

2.包含权利要求1所述非洲猪瘟核酸检测特异性RPA标记引物的检测试剂。

3.含有权利要求1所述非洲猪瘟核酸检测特异性RPA标记引物或权利要求2所述检测试剂的检测试剂盒。

4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其还包括针对RPA核酸扩增产物进行检测的胶体金试纸条，该试纸条包括金标垫、检测线和质控线，所述金标垫上吸附有抗FITC的金标抗体，所述检测线吸附有生物素抗体，所述质控线吸附有抗金标抗体的二抗。

5.一种快速检测非洲猪瘟病毒核酸的检测方法，其步骤如下所述：

1)提取样品基因组DNA；

2)用权利要求1所述的引物进行RPA扩增；

3)检测扩增产物。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，其中步骤3)采用胶体金试纸条对RPA核酸扩增产物进行检测，所述试纸条包括金标垫、检测线和质控线，所述金标垫上吸附有抗FITC的金标抗体，所述检测线吸附有生物素抗体，所述质控线吸附有抗金标抗体的二抗。

7.根据权利要求5所述的分子检测方法，其特征在于，所述RPA扩增的50μL扩增体系中加入浓度为10μmol/L的正向、反向标记引物各2μL，DNA模板2μL，RPA反应缓冲液29.5μL，醋酸镁2.5μL，ddH₂O 12μL。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，RPA反应程序如下：恒温反应39℃，20分钟。