CN107937624A - 快速检测非洲猪瘟病毒核酸的rpa引物及制备方法和试剂盒 - Google Patents

快速检测非洲猪瘟病毒核酸的rpa引物及制备方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了本发明涉及一种快速检测非洲猪瘟病毒核酸的RPA引物及制备方法和试剂盒，属生物技术领域，筛选出1对特异性高、敏感性强的RPA引物，即上游引物<210>2和下游引物<210>3，通过所述的引物进一步建立了快速检测ASFV核酸的RPA检测系统。与普通PCR方法相比，RPA‑LFA具有以下优势：首先，RPA‑LFA属于等温扩增技术，对仪器设备要求低，仅需要恒温水浴锅即可完成反应。其次，RPA‑LFA检测速度快，反应时间在40min，比常规PCR反应时间要短。第三，可实现检测结果的可视化，这些特点使得本发明建立的RPA‑LFA方法可以用于基层单位普通实验室ASFV快速检测和鉴别诊断。

Description

快速检测非洲猪瘟病毒核酸的RPA引物及制备方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及一种快速检测非洲猪瘟病毒核酸的RPA引物及制备方法和试剂盒，属生物技术领域。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)又称非洲猪瘟疫，是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染引起的一种严重危害猪及野猪的急性、高度接触性传染病，其病程短，死亡率高达100％，是目前对世界养猪业危害最严重的烈性传染病之一。该病属于世界动物卫生组织(OIE)要求报告的动物疫病，在我国动物病原微生物名录中ASFV被列为一类动物病原微生物。我国是以农业为主的养猪大国之一，目前虽然没有发生本病的报道，但与我国接壤的俄罗斯多次发生该病，中俄之间频繁的畜产品贸易往来导致该病输入我国的风险不断增加。同时，由于ASF在临床上和猪瘟(CSF)难以鉴别诊断，目前我国对ASF防控只能依赖于严格的疫病检疫和监测措施。因此，研发ASFV快速检测方法对于防止ASF传入我国具有十分重要的意义。
ASFV属于非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)成员，也是目前已知唯一的虫媒DNA病毒。ASFV基因组为线性双链DNA，大小约为170～193kb，编码151～167个病毒蛋白。
ASFV快速检测方法对于防控ASF具有重要的意义，但国内尚没有商品化ASFV快速检测试剂盒。目前，ASFV的检测主要通过病毒分离、血清学检测和分子生物学检测等方法。然而，ASFV的分离需要在三级生物安全(BSL-3)以上的高级别实验室中进行，不适合于基层单位普通实验室应用。在血清学检测上，荧光抗体试验(FAT)是检测ASFV感染的常用方法，通过利用荧光素标记的抗ASFV特异性抗体检测病料中的ASFV抗原，可用于可疑猪或实验室接种猪病变组织的ASFV抗原检测。虽然该方法具有快速、敏感和特异的优点，但是需要昂贵的荧光显微镜、高质量的荧光标记抗体和专业的实验员，目前该方法仅作为诊断ASF的辅助检测方法。双抗体夹心阻断ELISA也是检测ASFV感染的一种血清学检测方法，该方法利用特异性的ASFV单克隆抗体包被酶标板，加入待检样本后，如果样本中含有ASFV抗原，则ASFV抗原与单抗特异性结合，再加入ASFV抗原另一表位的酶标单抗，形成双抗体夹心复合物，加入底物显色后指示样本中是否含有ASFV抗原。Vidal等以抗ASFV P72蛋白的单克隆抗体建立了夹心ELISA方法。西班牙生产了INGENASA夹心ELISA试剂盒，以包被的P72单抗检测病死猪血液及组织中的样本中的ASFV抗原，具有良好的特异性和敏感性，被OIE指定为ASFV检测的参考试剂盒。然而，该试进口试剂盒价格昂贵，限制了该试剂盒在我国的广泛使用。
随着分子生物学的发展，国内外已经建立了检测ASFV核酸的常规RT-PCR、real-time RT-PCR和巢式RT-PCR等多种分子生物学方法。常规RT-PCR方法具有商度的特异性和灵敏度、操作过程较为简单，并且其生物安全性较高，散毒危险小，且不需要对病原进行分离培养，广泛运用于ASFV的检测，被OIE列为ASFV的PCR标准检测方法。real-time RT-PCR比常规PCR的检测更见快速和敏感，并且该检测在封闭体系中进行，不需进行电泳试验，避免了因电泳引起的交叉污染而造成假阳性，同时，也减少了EB的污染。巢式PCR方法涉及两次对PCR的扩増。先用外引物对其DNA模板进行特异性扩増，扩増产物为第二次扩増的模板，在进行内引物的PCR扩増。两次连续特异性扩増降低了因为靶位点过多而发生错配出现的非特异性扩增的可能，因此在灵敏度及特异化上，都较常规的PCR高，检测结果具有更好的准确性。然而，上述方法或需要昂贵的仪器设备，或需要技术娴熟的技术人员，或需要设计复杂的引物和探针，或反应试剂需要冷链运输和保存，不适合普通实验室的推广应用。2006年，一种新等温基因扩增技术--重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymeraseamplification，RPA)被发明。该技术可在37～42℃条件下、10～30min内等温体外大量扩增目的基因片段。随后，英国TwistDx公司开发出了RPA商品化试剂盒，加快了RPA技术的研发、推广和应用。与聚合酶链式反应(PCR)相比，PRA具有扩增速度快、反应温度恒定、所需仪器简单等优点，特别适用于DNA或RNA的快速检测。目前，RPA已经在病毒、衣原体、支原体、细菌、寄生虫等病原检测方面得到了开发与应用。该技术通过利用重组酶结合引物形成蛋白-DNA混合物，启动寻找模板DNA上的同源序列；当同源序列定位后，则会引发链置换反应。引物结合到对应模板上，聚合酶进而从引物3’末端开始启动DNA合成，实现了在常温下两条引物对靶基因的几何级数扩增。同时，在RPA反应体系中，对引物碱基突变具有较强的耐受性，在引物个别碱基突变后，RPA反应依然可以顺利进行。
免疫侧流层析技术(Lateral flow assay，LFA)是当将含有待测抗原(或抗体)的样品滴在加样区，待测样品中的抗原(或抗体)与结合垫中的胶体金标记的抗体(或抗原)结合并通过毛细作用向前层析，当达到检测区后，与检测线上固定的抗体(或抗原)结合，形成胶体金微粒-抗体-抗原-抗体夹心复合物并被固定在检测线(T线)上，而多余的荧光微球标记物继续向前层析，与固定在质控线(C线)二抗结合。若将RPA和LFA技术相结合，既可以实现ASFV核酸的等温体外快速扩增，又可以实现检测结果的可视化，在无需特殊仪器设备下即可实现ASFV的分子生物学快速检测，为ASF的临床快速诊断提供了一种新的手段，对预防和控制ASF在我国的流行具有十分重要的意义。
本发明通过利用重组酶聚合酶扩增-免疫侧流层析(RPA-LFA)技术实现ASFV核酸的快速、可视化检测。针对ASFV基因组中髙保守的特异性序列P72基因为扩增的靶基因序列，根据RPA引物的设计原则设计了3对RPA特异性引物，上游引物5'端用地高辛标记，下游引物5'端用生物素标记，通过对含有ASFV P72基因的重组质粒DNA进行RPA扩增试验，从中筛选出1对特异性高、敏感性强的RPA引物，建立了检测ASFV核酸的RPA检测方法。在此基础上，将胶体金标记的兔抗地高辛抗体铺在结合垫上，NC膜上检测线包被链霉亲和素，质控线上包被猪抗兔IgG，配合加样垫和吸收垫组装LFA层析试纸条。将RPA扩增产物滴加于LFA试纸条上样垫上，建立了检测ASFV特异性核酸的RPA-LFA可视化检测方法。利用建立的检测方法分别对猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪流感病毒(SIV)、猪2型圆环病毒(PCV-2)、猪伪狂犬病毒(PRV)等多种病毒进行扩增，证实本发明所建立的ASFV RPA-LFA可视化检测方法具有很高的特异性和敏感性，为基层单位普通实验室ASFV感染的诊断提供了一个快速、简便、准确的检测方法。
发明内容
本发明的目的是利用重组酶聚合酶扩增-侧向层析技术(RPA-LFA)建立检测ASFV核酸的可视化快速检测方法。通过对其他病毒核酸样本的检测证实建立的ASFVRPA-LFA可视化检测方法具有很高的特异性和敏感性，为ASFV感染的诊断提供了一个快速、简便、准确的检测方法。
本发明通过利用重组酶聚合酶扩增-免疫侧流层析(RPA-LFA)技术实现ASFV核酸的快速、可视化检测。针对ASFV基因组中髙保守的特异性序列P72基因为扩增的靶基因序列，根据RPA引物的设计原则设计若干对RPA特异性引物，上游引物5'端用地高辛标记，下游引物5'端用生物素标记，通过对含有ASFV P72基因的重组质粒DNA进行RPA扩增试验，从中筛选出1对特异性高、敏感性强的RPA引物，即上游引物<210>2和下游引物<210>3，通过所述的引物进一步建立了快速检测ASFV核酸的RPA检测系统。
在此基础上，将胶体金标记的兔抗地高辛抗体铺在结合垫上，NC膜上检测线包被链霉亲和素，质控线上包被猪抗兔IgG，配合加样垫和吸收垫组装LFA层析试纸条。将RPA扩增产物滴加于LFA试纸条上样垫上，建立了检测ASFV特异性核酸的RPA-LFA可视化检测方法。利用建立的检测方法分别对猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪流感病毒(SIV)、猪2型圆环病毒(PCV-2)、猪伪狂犬病毒(PRV)等多种病毒进行扩增，证实本发明所建立的ASFV RPA-LFA可视化检测方法具有很高的特异性和敏感性，为基层单位普通实验室ASFV感染的诊断提供了一个快速、简便、准确的检测手段。
将重组酶聚合酶扩增技术(RPA)和免疫侧流层析(LFA)技术有效结合，建立了可快速检测ASFV核酸可视化方法。首先利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA)对ASFV核酸进行扩增，由于RPA的上游引物5'端用地高辛标记，下游引物5'端用生物素标记，因此RPA扩增结果为阳性时，RPA扩增产物可与和胶体金标记的兔抗地高辛抗体IgG结合，继续扩散后又与亲和素发生结合，因此在NC膜的检测线(T线)上会出现特异性的胶体金条带；随着胶体金标记兔抗地高辛抗体IgG的迁移，会与羊抗兔IgG结合，在质控线(C线)也会出现条带。当RPA扩增结果为阴性时，上游引物会被胶体金标记抗地高辛抗体所吸收，下游引物虽然能与亲和素发生结合，但没有携带胶体金颗粒，因此在NC膜的检测线(T线)上不出现特异性的条带；同时随着胶体金标记的兔抗地高辛抗体复合物的迁移，会与猪抗兔IgG结合，因此在NC膜的质控线(C线)上会出现胶体金条带。
本发明主要涉及以下几个方面的内容：
1、ASFV P72基因的合成及其重组质粒的构建
2、ASFV P72基因重组质粒拷贝数的确定
3、ASFV RPA引物的设计
4、ASFV RPA反应体系的配制及操作程序
5、ASFV RPA反应条件的优化
6、RPA-LFA可视化检测方法的建立、操作步骤及结果判定
7、RPA-LFA可视化检测方法特异性的评价
8、RPA-LFA可视化检测方法敏感性的评价
本发明具体过程如下：
1、ASFV P72基因的合成及其重组质粒的构建
根据GenBank中登录的ASFV基因组参考序列(登录号：AY578706)，确定P72基因序列(1941bp)，进行P72全长cDNA(1941bp)的体外合成，并克隆至pMD-18T载体，获得重组质粒pT-ASFV-P72。将pT-ASFV-P72质粒转化至感受态细胞DH5α，通过PCR和测序对构建的重组质粒进行验证。PCR扩增结果可得到出现一条特异性条带；对扩增产物测序结果表明，该序列与ASFV P72基因(AY578706)的同源性为100％。将含有重组质粒的重组阳性菌过夜培养后，提取质粒，并测定浓度。经测定，重组质粒pT-ASFV-P72浓度为52ng/μL。
2、ASFV P72基因重组质粒拷贝数的确定
根据下列公式，计算重组质粒pT-ASFV-P72拷贝数：拷贝数(copies/μL＝6.02×1023×质粒浓度(ng/μL)×10-9/(质粒碱基数×660)。
对合成的质粒进行用OIE推荐的引物(表1)进行PCR鉴定，结果出现一条特异性条带，大小约257bp。测序结果表明序列与ASFV P72基因(AY578706)的同源性为100％。提取重组质粒pT-ASFV-P72的浓度为52ng/μL，重组质粒的碱基数为4633bp，经计算得知提取质粒的拷贝数为1.02×1010拷贝/μL。经系列倍比稀释，将pT-ASFV-P72质粒拷贝数稀释在1×108～100拷贝/μL之间。
3、RPA引物的设计
下载GenBank中登录的ASFV P72基因序列，利用BioEdit分子生物学软件对31个ASFV不同毒株的P72基因进行序列比对，筛选出高度保守的区域作为RPA引物设计的靶序列。根据RPA引物的设计原则，引物长度30～35bp，设计了3对特异性引物(表1)，用地高辛标记上游引物5'端，用生物素标记下游引物5'端，扩增片段大小约为220bp。以重组质粒pT-ASFV-P72DNA为模板进行RPA扩增，通过对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，根据扩增产物的特异性、敏感性和产量来评价和筛选引物扩增效率及特异性，以此选择最佳引物。同时，合成OIE推荐的实时荧光PCR方法使用的引物(表1)。
4、RPA反应体系的配制及操作程序
配制50μL RPA反应体系，其中RPA-F和RPA-R(均10μM)各2.4μL，RehydrationBuffer 29.5μL，dd H2O 12.2μL，模板1μL，280mM醋酸镁(MgAc)2.5μL。将模板DNA和MgAc之外的所有试剂预混后，加入含有冻干酶制剂的0.2mL PCR反应管中，并充分混匀。将1μL模板加入反应管中，并将2.5μL MgAc加入反应管盖中，盖紧后瞬时离心并涡旋，置于40℃恒温水浴锅中进行RPA反应。
5、RPA最佳反应条件的优化
5.1RPA最佳反应时间的确定
为确定RPA最佳反应时间，以1×103拷贝/μL的重组质粒pT-ASFV-P72DNA为模板，分别以10min、20min、30min和40min为不同的反应时间进行RPA扩增。RPA反应结束后，取5μL产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，并用紫外凝胶成像系统分析电泳结果。结果发现，40℃下RPA反应时间为20min时，电泳即可获得一条大小约为220bp的特异性条带。对RPA产物条带用紫外凝胶成像系统进行半定量分析，RPA反应30min后，条带约为20min时条带的6.9倍，而反应40min后扩增的条带没有显著增加，因此将ASFV RPA最佳反应时间确定为30min。
5.2RPA最佳反应温度的确定
为准确比对不同温度下RPA-LFA反应的扩增效率，配制50μL RPA反应体系，充分混匀后，分别放入20、25、30、35、40和45℃水浴箱内进行扩增反应，30min后分别从各管中取10μL扩增液。结果该检测体系在25～45℃的温度范围内均可有效进行，其中40℃时扩增效率最佳，紫外凝胶成像系统分析时条带最深，因此最佳反应温度确定为40℃。
5.3RPA最佳引物的筛选
配制50μL RPA反应体系，以重组质粒pT-ASFV-P72 DNA为模板，分别用3对ASFVRPA引物(RPA FP1-RP1、RPA FP2-RP2、RPA FP3-RP3)进行RPA扩增，随后用对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，用紫外凝胶成像系统进行半定量分析，评价引物扩增效率及特异性，以此选择最佳引物。结果引物(RPA FP2-RP2)的引物扩增效率及特异性最高，成功筛选出检测ASFV的最佳RPA引物RPA FP2-RP2。
6、RPA-LFA检测方法的建立及结果判定
6.1金标抗体的制备
采用柠檬酸三钠还原法制备制备平均颗粒直径为40nm的胶体金溶液。吸取1mL胶体金溶液加入试管中，向其中加入5μg兔抗地高辛抗体IgG，恒温缓慢振荡30min。4℃、13000r/min离心40min。弃去上清液，沉淀溶解于0.1moL/L的Tris-HCL缓冲溶液中(pH＝8.0)。制备好的溶液4℃密封保存，备用。
6.2RPA-LFA试纸条的制备
RPA-LFA试纸条由加样垫、结合垫、硝酸纤维素膜(NC膜)[检测线(T线)和质控线(C线)]、吸收垫和PVC塑料垫5个部分组成(图1)。将制备的胶体金标记兔抗地高辛抗体IgG用移液枪均匀滴加喷到NC膜上，迅速放在真空干燥箱中37℃干燥10min，取出，作为结合垫(金标垫)。在NC膜上，检测线(T线)上包被经PBS(0.01moL/L，pH＝7.4)缓冲液稀释至2mg/mL的链霉亲和素(Streptavidin，SA)，质控线(C线)上包被2mg/mL的猪抗兔IgG，室温下干燥30min。组装的顺序依次为：在PVC板的中间区域贴上NC膜，结合垫贴在NC膜的前方区域；为保证良好的接触，结合垫压NC膜2mm，再在结合垫的前方贴上样品垫，样品垫压结合垫2mm，最后将吸水垫在NC膜的后方，吸水垫压NC膜2mm。用试纸条切割刀切为4mm的试纸条。将制备好的试纸条置于放有干燥剂的锡箱袋内，4℃冰箱中储存备用。
6.3RPA-LFA检测方法操作步骤及结果判定
在RPA扩增结束后，用微量移液器取5μL RPA产物，稀释至80μL，滴加于RPA-LFA试纸条加样垫。为了分析RPA-LFA体系的最适反应时间，将加样完毕的装置放入37℃孵育0、1、5、10、15min，取出RPA-LFA试纸条，用肉眼观察结果。结果显示，在反应5min时，试纸条上开始出现阳性条带，但条带颜色较浅；当反应10min时，条带变得深且清晰。因此，以反应10min作为结果判读时间。若质控线(C线)和检测线(T线)均显色，则判读结果为阳性；若仅质控线显色，则为阴性；若质控线不显色，表明试纸条失效。
7、RPA-LFA检测方法的特异性的评价
用病毒RNA提取试剂盒提取CSFV、PRRSV、FMDV、SIV的总RNA,并参照反转录试剂盒(Prime Script RT-PCR Kit，TaKaRa)的操作，将提取的RNA制备成cDNA，–20℃保存备用。用病毒DNA提取试剂盒提取PRV和PCV-2的病毒基因组DNA,–20℃保存备用。分别以上述病毒的cDNA、DNA及pT-ASFV-P72为模板，进行RPA扩增反应，确定是否出现特异性扩增条带。结果只有pT-ASFV-P72为模板的DNA样品在检测线上出现了特异性的胶体金条带，其他病毒的cDNA或DNA为模板的检测结果均为阴性，表明没有与其他病毒的DNA样品发生交叉反应，证实本发明所建立的ASFV RPA-LFA检测方法具有良好的特异性。
8、RPA-LFA检测方法的敏感性的评价
将重组质粒pT-ASFV-P72进行10倍倍比稀释，使其浓度在1×108～1×100拷贝/μL之间，并将其作为模板进行RPA反应，确定该方法的最低检测浓度。同时比较与OIE推荐的常规PCR方法的敏感性。检测结果发现，RPA-LFA最低可以检测到1×101拷贝/μL重组质粒DNA，常规PCR检测方法最低也可以检测到1×101拷贝/μL重组质粒DNA，表明RPA-LFA与常规PCR方法的敏感性相同，证实本发明所建立的ASFV RPA-LFA检测方法具有良好的敏感性。
本发明具有如下优点：
本发明提供了一种用于检测ASFV核酸的RPA-LFA新方法。与普通PCR方法相比，RPA-LFA具有以下优势：首先，RPA-LFA属于等温扩增技术，对仪器设备要求低，仅需要恒温水浴锅即可完成反应。其次，RPA-LFA检测速度快，反应时间在40min，比常规PCR反应时间要短。第三，可实现检测结果的可视化，这些特点使得本发明建立的RPA-LFA方法可以用于基层单位普通实验室ASFV快速检测和鉴别诊断。
附图说明
图1为ASFV RPA-LFA检测试纸条的组装示意图。
图2为RPA-LFA对pT-ASFV-P72基因重组质粒DNA可视化RPA-LFA检测结果。
图2中：1,3：以pT-ASFV-P72重组质粒DNA为模板的阳性检测结果；2：以CSFV cDNA为模板的阴性检测结果。
图3为表1，为本发明所设计的ASFV特异性引物。
具体实施方式
1、ASFV P72基因的合成及其重组质粒的构建
根据GenBank中登录的ASFV基因组参考序列(登录号：AY578706)，确定P72基因序列(1941bp)，进行P72全长cDNA(1941bp)的体外合成，并克隆至pMD-18T载体，获得重组质粒pT-ASFV-P72。将pT-ASFV-P72质粒转化至感受态细胞DH5α，通过PCR和测序对构建的重组质粒进行验证。PCR扩增结果可得到出现一条特异性条带；对扩增产物测序结果表明，该序列与ASFV P72基因(AY578706)的同源性为100％。将含有重组质粒的重组阳性菌过夜培养后，提取质粒，并测定浓度。经测定，重组质粒pT-ASFV-P72浓度为52ng/μL。
2、ASFV P72基因重组质粒拷贝数的确定
根据下列公式，计算重组质粒pT-ASFV-P72拷贝数：拷贝数(copies/μL＝6.02×1023×质粒浓度(ng/μL)×10-9/(质粒碱基数×660)。
对合成的质粒进行用OIE推荐的引物(表1)进行PCR鉴定，结果出现一条特异性条带，大小约257bp。测序结果表明序列与ASFV P72基因(AY578706)的同源性为100％。提取重组质粒pT-ASFV-P72的浓度为52ng/μL，重组质粒的碱基数为4633bp，经计算得知提取质粒的拷贝数为1.02×1010拷贝/μL。经系列倍比稀释，将pT-ASFV-P72质粒拷贝数稀释在1×108～100拷贝/μL之间。
3、RPA引物的设计
下载GenBank中登录的ASFV P72基因序列，利用BioEdit分子生物学软件对31个ASFV不同毒株的P72基因进行序列比对，筛选出高度保守的区域作为RPA引物设计的靶序列。根据RPA引物的设计原则，引物长度30～35bp，设计了3对特异性引物(表1)，用地高辛标记上游引物5'端，用生物素标记下游引物5'端，扩增片段大小约为220bp。以重组质粒pT-ASFV-P72DNA为模板进行RPA扩增，通过对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，根据扩增产物的特异性、敏感性和产量来评价和筛选引物扩增效率及特异性，以此选择最佳引物。同时，合成OIE推荐的实时荧光PCR方法使用的引物(表1)。
4、RPA反应体系的配制及操作程序
配制50μL RPA反应体系，其中RPA-F和RPA-R(均10μM)各2.4μL，RehydrationBuffer 29.5μL，dd H2O 12.2μL，模板1μL，280mM醋酸镁(MgAc)2.5μL。将模板DNA和MgAc之外的所有试剂预混后，加入含有冻干酶制剂的0.2mL PCR反应管中，并充分混匀。将1μL模板加入反应管中，并将2.5μL MgAc加入反应管盖中，盖紧后瞬时离心并涡旋，置于40℃恒温水浴锅中进行RPA反应。
5、RPA最佳反应条件的优化
5.1RPA最佳反应时间的确定
为确定RPA最佳反应时间，以1×103拷贝/μL的重组质粒pT-ASFV-P72 DNA为模板，分别以10min、20min、30min和40min为不同的反应时间进行RPA扩增。RPA反应结束后，取5μL产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，并用紫外凝胶成像系统分析电泳结果。结果发现，40℃下RPA反应时间为20min时，电泳即可获得一条大小约为220bp的特异性条带。对RPA产物条带用紫外凝胶成像系统进行半定量分析，RPA反应30min后，条带约为20min时条带的6.9倍，而反应40min后扩增的条带没有显著增加，因此将ASFV RPA最佳反应时间确定为30min。
5.2RPA最佳反应温度的确定
为准确比对不同温度下RPA-LFA反应的扩增效率，配制50μL RPA反应体系，充分混匀后，分别放入20、25、30、35、40和45℃水浴箱内进行扩增反应，30min后分别从各管中取10μL扩增液。结果该检测体系在25～45℃的温度范围内均可有效进行，其中40℃时扩增效率最佳，紫外凝胶成像系统分析时条带最深，因此最佳反应温度确定为40℃。
5.3RPA最佳引物的筛选
配制50μL RPA反应体系，以重组质粒pT-ASFV-P72 DNA为模板，分别用3对ASFVRPA引物(RPA FP1-RP1、RPA FP2-RP2、RPA FP3-RP3)进行RPA扩增，随后用对扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，用紫外凝胶成像系统进行半定量分析，评价引物扩增效率及特异性，以此选择最佳引物。结果引物(RPA FP2-RP2)的引物扩增效率及特异性最高，成功筛选出检测ASFV的最佳RPA引物RPA FP2-RP2。
6、RPA-LFA检测方法的建立及结果判定
6.1金标抗体的制备
采用柠檬酸三钠还原法制备制备平均颗粒直径为40nm的胶体金溶液。吸取1mL胶体金溶液加入试管中，向其中加入5μg兔抗地高辛抗体IgG，恒温缓慢振荡30min。4℃、13000r/min离心40min。弃去上清液，沉淀溶解于0.1moL/L的Tris-HCL缓冲溶液中(pH＝8.0)。制备好的溶液4℃密封保存，备用。
6.2RPA-LFA试纸条的制备
RPA-LFA试纸条由加样垫、结合垫、硝酸纤维素膜(NC膜)[检测线(T线)和质控线(C线)]、吸收垫和PVC塑料垫5个部分组成(图1)。将制备的胶体金标记兔抗地高辛抗体IgG用移液枪均匀滴加喷到NC膜上，迅速放在真空干燥箱中37℃干燥10min，取出，作为结合垫(金标垫)。在NC膜上，检测线(T线)上包被经PBS(0.01moL/L，pH＝7.4)缓冲液稀释至2mg/mL的链霉亲和素(Streptavidin，SA)，质控线(C线)上包被2mg/mL的猪抗兔IgG，室温下干燥30min。组装的顺序依次为：在PVC板的中间区域贴上NC膜，结合垫贴在NC膜的前方区域；为保证良好的接触，结合垫压NC膜2mm，再在结合垫的前方贴上样品垫，样品垫压结合垫2mm，最后将吸水垫在NC膜的后方，吸水垫压NC膜2mm。用试纸条切割刀切为4mm的试纸条。将制备好的试纸条置于放有干燥剂的锡箱袋内，4℃冰箱中储存备用。
6.3RPA-LFA检测方法操作步骤及结果判定
在RPA扩增结束后，用微量移液器取5μL RPA产物，稀释至80μL，滴加于RPA-LFA试纸条加样垫。为了分析RPA-LFA体系的最适反应时间，将加样完毕的装置放入37℃孵育0、1、5、10、15min，取出RPA-LFA试纸条，用肉眼观察结果。结果显示，在反应5min时，试纸条上开始出现阳性条带，但条带颜色较浅；当反应10min时，条带变得深且清晰。因此，以反应10min作为结果判读时间。若质控线(C线)和检测线(T线)均显色，则判读结果为阳性；若仅质控线显色，则为阴性；若质控线不显色，表明试纸条失效。
7、RPA-LFA检测方法的特异性的评价
用病毒RNA提取试剂盒提取CSFV、PRRSV、FMDV、SIV的总RNA,并参照反转录试剂盒(Prime Script RT-PCR Kit，TaKaRa)的操作，将提取的RNA制备成cDNA，–20℃保存备用。用病毒DNA提取试剂盒提取PRV和PCV-2的病毒基因组DNA,–20℃保存备用。分别以上述病毒的cDNA、DNA及pT-ASFV-P72为模板，进行RPA扩增反应，确定是否出现特异性扩增条带。结果只有pT-ASFV-P72为模板的DNA样品在检测线上出现了特异性的胶体金条带，其他病毒的cDNA或DNA为模板的检测结果均为阴性，表明没有与其他病毒的DNA样品发生交叉反应，证实本发明所建立的ASFV RPA-LFA检测方法具有良好的特异性。
8、RPA-LFA检测方法的敏感性的评价
将重组质粒pT-ASFV-P72进行10倍倍比稀释，使其浓度在1×108～1×100拷贝/μL之间，并将其作为模板进行RPA反应，确定该方法的最低检测浓度。同时比较与OIE推荐的常规PCR方法的敏感性。检测结果发现，RPA-LFA最低可以检测到1×101拷贝/μL重组质粒DNA，常规PCR检测方法最低也可以检测到1×101拷贝/μL重组质粒DNA，表明RPA-LFA与常规PCR方法的敏感性相同，证实本发明所建立的ASFV RPA-LFA检测方法具有良好的敏感性。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
<110> 石河子大学
<120> 快速检测非洲猪瘟病毒核酸的RPA引物及制备方法和试剂盒
<141>
<160> 5
<210> 1
<211> 1941
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）
<220>
<221> misc_feature
<223> P72基因
<400> 1
1 ATGGCATCAG GAGGAGCTTT TTGTCTTATT GCTAACGATG GGAAGGCCGA CAAGATTATA
61 TTGGCCCAAG ACTTGCTGAA TAGCAGGATC TCTAACATTA AAAATGTGAA CAAAAGTTAT
121 GGGAAACCCG ATCCCGAACC CACTTTGAGT CAAATCGAAG AAACACATTT GGTGCATTTT
181 AATGCGCATT TTAAGCCTTA TGTTCCAGTA GGGTTTGAAT ACAATAAAGT ACGCCCGCAT
241 ACGGGTACCC CCACCTTGGG AAACAAGCTT ACCTTTGGTA TTCCCCAGTA CGGAGACTTT
301 TTCCATGATA TGGTGGGCCA TCATATATTG GGTGCATGTC ATTCATCCTG GCAGGATGCT
361 CCGATTCAGG GCACGTCCCA GATGGGGGCC CATGGGCAGC TTCAAACGTT TCCTCGCAAC
421 GGATATGACT GGGACAACCA AACACCCTTA GAGGGCGCCG TTTACACGCT TGTAGATCCT
481 TTTGGAAGAC CCATTGTACC CGGCACAAAG AATGCGTACC GAAACTTGGT TTACTACTGC
541 GAATACCCCG GAGAACGACT TTATGAAAAC GTAAGATTCG ATGTAAATGG AAATTCCCTA
601 GACGAATATA GTTCGGATGT CACAACGCTT GTGCGCAAAT TTTGCATCCC AGGGGATAAA
661 ATGACTGGAT ATAAGCACTT GGTTGGCCAG GAGGTATCGG TGGAGGGAAC CAGTGGCCCT
721 CTCCTATGCA ACATTCATGA TTTGCACAAG CCGCACCAAA GCAAACCTAT TCTTACCGAT
781 GAAAATGATA CGCAGCGAAC GTGTAGCCAT ACCAACCCGA AATTTCTTTC ACAGCATTTT
841 CCCGAGAACT CTCACAATAT CCAAACAGCA GGTAAACAAG ATATTACTCC TATCACGGAC
901 GCAACGTATC TGGACATAAG ACGTAATGTT CATTACAGCT GTAATGGACC TCAAACCCCT
961 AAATACTATC AGCCCCCTCT TGCGCTCTGG ATTAAGTTGC GCTTTTGGTT TAATGAGAAC
1021 GTGAACCTTG CTATTCCCTC AGTATCCATT CCCTTCGGCG AGCGCTTTAT CACCATAAAG
1081 CTTGCATCGC AAAAGGATTT GGTGAATGAA TTTCCTGGAC TTTTTGTACG CCAGTCACGT
1141 TTTATAGCTG GACGCCCCAG TAGACGCAAT ATACGCTTTA AACCATGGTT TATCCCAGGA
1201 GTCATTAATG AAATCTCGCT CACGAATAAT GAACTTTACA TCAATAACCT GTTTGTAACC
1261 CCTGAAATAC ACAACCTTTT TGTAAAACGC GTTCGCTTTT CGCTGATACG TGTCCATAAA
1321 ACGCAGGTGA CCCACACCAA CAATAACCAC CACGATGAAA AACTAATGTC TGCTCTTAAA
1381 TGGCCCATTG AATATATGTT TATAGGATTA AAACCTACCT GGAACATCTC CGATCAAAAT
1441 CCTCATCAAC ACCGAGATTG GCACAAGTTC GGACATGTTG TTAACGCCAT TATGCAGCCC
1501 ACTCACCACG CAGAGATAAG CTTTCAGGAT AGAGATACAG CTCTTCCAGA CGCATGTTCA
1561 TCTATATCTG ATATTAGCCC CGTTACGTAT CCGATCACAT TACCTATTAT TAAAAACATT
1621 TCCGTAACTG CTCATGGTAT CAATCTTATC GATAAATTTC CATCAAAGTT CTGCAGCTCT
1681 TACATACCCT TCCACTACGG AGGCAATGCG ATTAAAACCC CCGATGATCC GGGTGCGATG
1741 ATGATTACCT TTGCTTTGAA GCCACGGGAG GAATACCAAC CCAGTGGTCA TATTAACGTA
1801 TCCAGAGCAA GAGAATTTTA TATTAGTTGG GACACGGATT ACGTGGGGTC TATCACTACG
1861 GCTGATCTTG TGGTATCGGC ATCTGCTATT AACTTTCTTC TTCTTCAGAA CGGTTCAGCT
1921 GTGCTGCGTT ACAGTACCTA A
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）
<220>
<221> misc_feature
<223> RAP-FP2引物
<400> 1
5'-TGATTTGCACAAGCCGCACCAAAGCAAACCTATTC-3'
<210> 3
<211> 35
<212>DNA
<213> 非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）
<220>
<221> misc_feature
<223> RAP-RP2引物
<400> 1
5'-AGGGGTTTGAGGTCCATTACAGCTGTAATGAACAT-3'

Claims (6)

1.一种快速检测非洲猪瘟病毒核酸的RPA引物，其特征在于，其上游引物核苷酸序列为<210>2，其下游引物核苷酸序列为210(3)。
2.根据权利要求1所述的快速检测非洲猪瘟病毒核酸的RPA引物，其特征在于，主要通过下列步骤制备：
ASFV P72基因的合成及其重组质粒的构建：
确定P72基因序列进行P72全长cDNA的体外合成，并克隆至pMD-18T载体，获得重组质粒pT-ASFV-P72，将pT-ASFV-P72质粒转化至感受态细胞DH5α，将含有重组质粒的重组阳性菌过夜培养后，提取质粒，并测定浓度；
ASFV P72基因重组质粒拷贝数的确定：
将pT-ASFV-P72质粒拷贝数稀释在1×108～100拷贝/μL之间，
RPA引物的设计
利用BioEdit分子生物学软件对若干个ASFV不同毒株的P72基因进行序列比对，筛选出高度保守的区域作为RPA引物设计的靶序列，根据RPA引物的设计原则，引物长度30～35bp，设计若干对特异性引物，用地高辛标记上游引物5'端，用生物素标记下游引物5'端，扩增片段大小约为220bp，以重组质粒pT-ASFV-P72DNA为模板进行RPA扩增，通过对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据扩增产物的特异性、敏感性和产量来评价和筛选引物扩增效率及特异性，以此选择最佳引物；
RPA反应体系的配制及操作程序
配制RPA反应体系，包含RPA-F、RPA-R、Rehydration Buffer 29.5μL、dd H2O、模板和醋酸镁，将模板DNA和MgAc之外的所有试剂预混后，加入含有冻干酶制剂的PCR反应管中，并充分混匀，将模板加入反应管中，并将MgAc加入反应管盖中，盖紧后瞬时离心并涡旋，置于35-45℃恒温水浴锅中进行RPA反应35-45min；
RPA最佳引物的筛选：
配制RPA反应体系，以重组质粒pT-ASFV-P72DNA为模板，分别用所选出的若干对ASFVRPA引物进行RPA扩增，随后用对扩增产物进行的琼脂糖凝胶电泳，用紫外凝胶成像系统进行半定量分析，评价引物扩增效率及特异性，以此选择最佳引物。
3.根据权利要求2所述的快速检测非洲猪瘟病毒核酸的RPA引物，其特征在于，通过下列步骤制备：采用柠檬酸三钠还原法制备制备平均颗粒直径为40nm的胶体金溶液，将胶体金溶液加入试管中，向其中加入兔抗地高辛抗体IgG，恒温缓慢振荡25-35min，3-5℃、12500-13500r/min离心35-45min，弃去上清液，沉淀溶解于Tris-HCL缓冲溶液中，低温密封保存，得胶体金标记兔抗地高辛抗体IgG。
4.一种快速检测快速检测非洲猪瘟病毒核酸的试剂，其特征在于，根据权利要求1或2所述的引物制备。
5.一种快速检测快速检测非洲猪瘟病毒核酸的试剂盒，其特征在于，根据权利要求3所述的胶体金标记兔抗地高辛抗体IgG制备，
所述试剂盒分至少包含以下5个部分：
加样垫、结合垫、NC膜、吸收垫和PVC塑料垫，所述的NC膜上设有检测线，即T线和质控线即C线，将所述的胶体金标记兔抗地高辛抗体IgG用移液枪均匀滴加喷到NC膜上，迅速放在真空干燥箱中干燥后取出，作为结合垫，在NC膜上，检测线上包被经PBS缓冲液稀释的链霉亲和素，质控线上包被猪抗兔IgG，干燥，组装的顺序依次为：在PVC板的中间区域贴上NC膜，结合垫贴在NC膜的前方区域；结合垫压NC膜1.5-2.5mm，再在结合垫的前方贴上样品垫，样品垫压结合垫1.5-2.5mm，最后将吸水垫在NC膜的后方，吸水垫压NC膜1.5-2.5mm，用试纸条切割刀切为3.5-4.5mm的试纸条，将制备好的试纸条包装。
6.一种快速检测非洲猪瘟病毒核酸的RPA引物，其特征在于，主要包含下列步骤：
ASFV P72基因的合成及其重组质粒的构建：确定P72基因序列进行P72全长cDNA的体外合成，并克隆至pMD-18T载体，获得重组质粒pT-ASFV-P72，将pT-ASFV-P72质粒转化至感受态细胞DH5α，将含有重组质粒的重组阳性菌过夜培养后，提取质粒，并测定浓度；
ASFV P72基因重组质粒拷贝数的确定：将pT-ASFV-P72质粒拷贝数稀释在1×108～100拷贝/μL之间，
RPA引物的设计：利用BioEdit分子生物学软件对若干个ASFV不同毒株的P72基因进行序列比对，筛选出高度保守的区域作为RPA引物设计的靶序列，根据RPA引物的设计原则，引物长度30～35bp，设计若干对特异性引物，用地高辛标记上游引物5'端，用生物素标记下游引物5'端，扩增片段大小约为220bp，以重组质粒pT-ASFV-P72DNA为模板进行RPA扩增，通过对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据扩增产物的特异性、敏感性和产量来评价和筛选引物扩增效率及特异性，以此选择最佳引物；
RPA反应：配制RPA反应体系，包含RPA-F、RPA-R、Rehydration Buffer 29.5μL、dd H2O、模板和醋酸镁，将模板DNA和MgAc之外的所有试剂预混后，加入含有冻干酶制剂的PCR反应管中，并充分混匀，将模板加入反应管中，并将MgAc加入反应管盖中，盖紧后瞬时离心并涡旋，置于35-45℃恒温水浴锅中进行RPA反应35-45min；
RPA最佳引物的筛选：配制RPA反应体系，以重组质粒pT-ASFV-P72DNA为模板，分别用所选出的若干对ASFV RPA引物进行RPA扩增，随后用对扩增产物进行的琼脂糖凝胶电泳，用紫外凝胶成像系统进行半定量分析，评价引物扩增效率及特异性，以此选择最佳引物。
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