CN113416799B - 一种检测非洲猪瘟病毒的cda引物组、试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)的CDA引物组、试剂盒及其应用。所述CDA引物组为针对非洲猪瘟病毒的保守区片段扩增的引物组，即ASFV‑MF‑3/ASFV‑MR‑3；其中，ASFV‑MF‑3的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，ASFV‑MR‑3的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。本发明提供的引物组敏感性高、特异性强，由其制成的试剂盒能够快速、准确的检测到待测样品中是否含有非洲猪瘟病毒。另外，本发明所提供的可视化试剂盒将为专业程度不高的养殖场、海关、口岸、社区菜场等地的现场检测提供极大便利。

Description

一种检测非洲猪瘟病毒的CDA引物组、试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测非洲猪瘟病毒的CDA引物组、试剂盒及其应用。
背景技术
非洲猪瘟病毒(ASFV)可引起一种热性、急性、高度接触性传染病—非洲猪瘟(ASF)。该病传播快、致死率高，对养猪业危害极大，是最为严重的疫病，被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告疫病，也被我国列为一类动物疫病。临床表现为高热、皮肤发绀、各脏器的出血和呼吸障碍等。可通过虫媒传播和体液传播，并长期保持活性。另外，被病毒污染的饲料、水源、器具，甚至是农场工作人员和服装，以及污染农场附近的空气都是潜在的传染源。2018年8月3日，我国首次出现非洲猪瘟疫情，随后病毒很快传播到全国大部分地区，造成超过千亿元的经济损失，至今仍然对我国生猪养殖造成严重威胁。
目前尚无疫苗和有效治疗药物，该疾病的防控唯一有效措施是扑杀，因此对该病毒的快速、特异、高灵敏的诊断极为重要。世界动物卫生组织(OIE)推荐用于检测ASFV的方法，包括基于RT-PCR的针对病毒基因组特异性核酸序列的扩增信号的检测，但RT-PCR方法需要在标准生化分析实验室，使用精密的实时荧光PCR仪，并需要试剂准备、标本制备和PCR扩增检测三个独立的试验区，并不适用于现场快速筛查。天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心等研发机构和企业已成功研制出多种有效诊断ASFV的基于PCR和核酸恒温扩增技术的诊断试剂。此外，免疫检测技术所制成的试纸条具有简便快捷的优势，但该方法误检率高、灵敏度低，难于检测处于潜伏期的ASFV携带者，可能造成疫情的扩散。因此，快速、灵敏、高特异性核酸标志物现场检测技术的研发，将为非洲猪瘟的防控提供强有力的保障。
基于闭合颈环介导的核酸恒温扩增技术(Closed Dumbbell mediatedIsothermal Amplification ofnucleic acids，CDA)是由中国科学院大学宁波生命与健康产业研究院开发的新方法，可替代日本LAMP核酸扩增方法(中国专利申请号：202110473121.8)。该方法主要利用2种不同的特异性引物识别靶基因的特定区域，在等温条件进行扩增反应。与常规基因检测手段(如PCR等)相比，CDA反应在恒温水浴箱内便可完成，对仪器设备的要求较低，且操作简单，非专业人士也可准确地完成，适合于基层医疗机构及地方检验检疫部门。并且，CDA还可以缩短操作时间，提高检测效率，降低样品污染的机率，适用于非洲猪瘟病毒的快速诊断。此外，CDA所用关键成环引物约为30bp，较LAMP(40bp)短，这将节省检测成本。
发明内容
本发明的目的是，提供一种检测非洲猪瘟病毒的CDA引物组、试剂盒及其应用。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：
本发明通过对表1所述的4对引物组进行筛选，获得对非洲猪瘟病毒检测效果最优的引物组为ASFV-MF-3/ASFV-MR-3。
表1
Figure BDA0003195117710000021
Figure BDA0003195117710000031
本发明还提供一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述最优的CDA引物组，即ASFV-MF-3和ASFV-MR-3。
作为优选实施方案，所述CDA引物组，引物ASFV-MF和ASFV-MR在反应体系中的浓度均为1～2μM。
作为优选实施方案，所述试剂盒还包括Bst聚合酶、CDA反应缓冲液、超纯水、以及显色剂。
作为优选实施方案，所述显色剂选自Sybr green I、Eva green、羟基萘酚蓝或铬黑T。
作为优选实施方案，所述CDA反应缓冲液包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4和Triton X-100。
作为优选实施方案，所述试剂盒反应体系的组成为：
2-50mM Tris-HCl pH8.8
2-20mM KCl
2-20mM(NH4)2SO4
2～20mM MgSO4
0.1～0.5％TritonX-100
0.2～1M甜菜碱
1～1.6mM dNTP
5～10U Bst DNA聚合酶
100～150μmol/L显色剂
1～2μM引物ASFV-MF-3
1～2μM引物ASFV-MR-3
反应溶剂为超纯水。
本发明还提供该试剂盒检测非洲猪瘟病毒的方法，包括以下步骤：
步骤1，将待检测核酸样本和试剂盒的反应体系混合，制得扩增反应液；
步骤2，将步骤1所得扩增反应液，于60～65℃反应20～80min，根据显色结果判断样品是否含有非洲猪瘟病毒。
本发明还提供所述的CDA引物组在以非疾病诊断为目的的非洲猪瘟病毒检测中的应用。
本发明还提供上述试剂盒在以非疾病诊断为目的的非洲猪瘟病毒检测中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1.本发明提供的CDA引物组针对非洲猪瘟病毒的特异保守区域(GenBank:AE014613)，由2条引物组成，为序列内引物对(ASFV-MF-3/ASFV-MR-3)。本发明提供的引物组敏感性高、特异性强，由其制成的试剂盒能够快速、准确的检测到待测样品中是否含有非洲猪瘟病毒。
2.由于本发明提供的引物组具有极高的特异性，CDA扩增所需时间短，进一步缩短了检测时间，且操作简易。
3.本发明提供的方法或试剂盒无需昂贵的仪器、也无需复杂的操作就可完成相关检测，因此，本发明所提供的可视化试剂盒将为专业性不高的机场、海关、社区等地的现场检测提供极大便利，可实现对非洲猪瘟病毒快速准确的检测。
附图说明
图1为本发明实施1中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。
图2为本发明实施2中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。
图3为本发明实施3中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。
图4为本发明实施4中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。
图5为本发明实施5中应用HNB进行反应基于颜色变化的终点监测图。
图6为本发明实施6中应用HNB进行反应基于颜色变化的终点监测图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，可参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1应用Eva Green分别验证四对引物组对非洲猪瘟病毒基因DNA片段的扩增反应
Eva Green同SYBR Green I类似，是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对PCR等核酸扩增反应的抑制远小于后者。Eva Green的荧光信号强度与双链DNA的数量相关。在游离状态下，Eva Green发出微弱的荧光，但与双链DNA结合后，其荧光大大增强。因此，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链DNA数量。
反应溶液组合如下(其余加入ddH2O至25μL)：
20mM Tris-HCl pH8.8
10mM KCl
10mM(NH4)2SO4
14mM MgSO4
0.1％Triton X-100
1M甜菜碱
1.25mM dNTP
8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)
1X Eva Green(Biotum)
引物：
1600nM ASFV-MF-1(SEQ ID NO.1所示)
1600nM ASFV-MR-1(SEQ ID NO.2所示)；
1600nM ASFV-MF-2(SEQ ID NO.3所示)
1600nM ASFV-MR-2(SEQ ID NO.4所示)；
1600nM ASFV-MF-3(SEQ ID NO.5所示)
1600nM ASFV-MR-3(SEQ ID NO.6所示)；
1600nM ASFV-MF-4(SEQ ID NO.7所示)
1600nM ASFV-MR-4(SEQ ID NO.8所示)。
靶：非洲猪瘟病毒基因组DNA dsDNA(SEQ ID NO.9)。
同时四对引物组分别设置无靶的对照组。
设置SLAN 96real time PCR反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。图1结果表明：本发明所提供的四对引物组均可实现对非洲猪瘟病毒特异保守区域的快速扩增，将荧光检测应用于其中可实现实时监测，通过实时扩增曲线可提前判断结果。
实施例2应用Eva Green验证四对引物组对非洲猪瘟病毒基因DNA片段的扩增反应(阴阳性各设置8组的重复实验)
方法同实施例1。
反应溶液组合如下(其余加入ddH2O至200μL)：
160mM Tris-HCl pH8.8
80mM KCl
80mM(NH4)2SO4
112mM MgSO4
0.8％Triton X-100
8M甜菜碱
10mM dNTP
64U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)
8X Eva Green(Biotum)
引物：
12800nM ASFV-MF-1(SEQ ID NO.1所示)
12800nM ASFV-MR-1(SEQ ID NO.2所示)；
12800nM ASFV-MF-2(SEQ ID NO.3所示)
12800nM ASFV-MR-2(SEQ ID NO.4所示)；
12800nM ASFV-MF-3(SEQ ID NO.5所示)
12800nM ASFV-MR-3(SEQ ID NO.6所示)；
12800nM ASFV-MF-4(SEQ ID NO.7所示)
12800nM ASFV-MR-4(SEQ ID NO.8所示)；
靶：非洲猪瘟病毒基因组DNA dsDNA(SEQ ID NO.9)。
同时四对引物组分别设置无靶的对照组。
设置SLAN 96real time PCR反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。检测结果发现：引物组1/2/4的阴性对照组均出现假阳性，而引物组3无假阳性出现，重复性较好，其荧光强度随反应时间变化的曲线如图2所示。图2结果表明：本发明提供的引物组3可实现对非洲猪瘟病毒基因的快速扩增，且阴性对照组无假阳性出现，将荧光检测应用于其中可进行实时监测，通过实时扩增曲线可提前判断结果。
实施例3应用Eva Green验证引物组3对非洲猪瘟病毒基因DNA片段的扩增反应(重复实验)
方法同实施例1。
反应溶液组合如下(其余加入ddH2O至1000μL)：
800mM Tris-HCl pH8.8
400mM KCl
400mM(NH4)2SO4
560mM MgSO4
4.0％Triton X-100
40M甜菜碱
50mM dNTP
320U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)
40X Eva Green(Biotum)
引物：
64000nM ASFV-MF-3(SEQ ID NO.5所示)
64000nM ASFV-MR-3(SEQ ID NO.6所示)；
无靶。
同时引物组3设置有靶的对照组，反应溶液组合同实施例2。靶:非洲猪瘟病毒基因组DNA dsDNA(SEQ ID NO.9)。
设置SLAN 96real time PCR反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。对引物组3进行40个阴性的重复实验，无假阳性出现，重复性较好，并进行8个阳性的对照实验，其荧光强度随反应时间变化的曲线如图3所示。图3结果表明：本发明提供的引物组3可实现对非洲猪瘟病毒基因的准确检测，荧光检测可实现实时监测，通过实时扩增曲线可提前判断结果。
实施例4应用Eva Green验证引物组3对非洲猪瘟病毒基因DNA片段的扩增反应(重复实验)
方法同实施例1。
反应溶液组合如下(其余加入ddH2O至1000μL)：
800mM Tris-HCl pH8.8
400mM KCl
400mM(NH4)2SO4
560mM MgSO4
4.0％Triton X-100
40M甜菜碱
50mM dNTP
320U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)
40X Eva Green(Biotum)
引物：
64000nM ASFV-MF-3(SEQ ID NO.5所示)
64000nM ASFV-MR-3(SEQ ID NO.6所示)；
有靶，即非洲猪瘟病毒基因组DNA dsDNA(SEQ ID NO.9)。
同时引物组3设置无靶的阴性对照组，反应溶液组合同实施例2。
设置SLAN 96real time PCR反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。对引物组3进行40个阳性的重复实验，并进行8个阴性的对照实验，无假阳性出现，其荧光强度随反应时间变化的曲线如图4所示。图4结果表明：本发明提供的引物组3可实现对非洲猪瘟病毒基因的快速扩增，且阴性对照组无假阳性出现，即可快速检测非洲猪瘟病毒基因，荧光检测可实现实时监测，通过实时扩增曲线可提前判断结果。
实施例5应用羟基萘酚兰(HNB)进行非洲猪瘟病毒CDA扩增反应终点监测
羟基萘酚兰(HNB)属于金属离子指示剂，是针对反应中与副产物焦磷酸盐结合的镁离子或者锰离子量的变化，从而呈现不同指示颜色以实现对结果的判断。
应用羟基萘酚兰(HNB)进行非洲猪瘟病毒CDA扩增的反应溶液的组合如下所示。
反应溶液组合一如下，其余加入ddH2O至1000μL
800mM Tris-HCl pH8.8
400mM KCl
400mM(NH4)2SO4
560mM MgSO4
4.0％Triton X-100
40M甜菜碱
50mM dNTP
320U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)
4800μM HNB
引物：
6400nM ASFV-MF-3(SEQ ID NO.5所示)
6400nM ASFV-MR-3(SEQ ID NO.6所示)
无靶。
反应溶液组合二如下，其余加入ddH2O至200μL
160mM Tris-HCl pH8.8
80mM KCl
80mM(NH4)2SO4
112mM MgSO4
0.8％Triton X-100
8M甜菜碱
10mM dNTP
64U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)
960μM HNB
引物：
1280nM ASFV-MF-3(SEQ ID NO.5所示)
1280nM ASFV-MR-3(SEQ ID NO.6所示)
有靶，即非洲猪瘟病毒基因组DNA dsDNA(SEQ ID NO.9)。
扩增反应设置40个阴性对照和8个阳性对照。设置恒温水浴锅反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。阴阳性反应终点结果如图5所示，其中，颜色为紫罗兰表示阴性，天蓝色表示阳性。实验结果表明：使用HNB可通过颜色直观地判断反应结果，无需仪器辅助即可进行判读。
实施例6应用羟基萘酚兰(HNB)进行非洲猪瘟病毒CDA扩增反应终点监测
方法同上述的实例5。
反应溶液组合一如下，其余加入ddH2O至1000μL
800mM Tris-HCl pH8.8
400mM KCl
400mM(NH4)2SO4
560mM MgSO4
4.0％Triton X-100
40M甜菜碱
50mM dNTP
320U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)
4800μM HNB
引物：
6400nM ASFV-MF-3(SEQ ID NO.5所示)
6400nM ASFV-MR-3(SEQ ID NO.6所示)
有靶，即非洲猪瘟病毒基因组DNA dsDNA(SEQ ID NO.9)。
反应溶液组合二如下，其余加入ddH2O至200μL
160mM Tris-HCl pH8.8
80mM KCl
80mM(NH4)2SO4
112mM MgSO4
0.8％Triton X-100
8M甜菜碱
10mM dNTP
64U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)
960μM HNB
引物：
1280nM ASFV-MF-3(SEQ ID NO.5所示)
1280nM ASFV-MR-3(SEQ ID NO.6所示)
无靶。
扩增反应设置40个阳性对照和8个阴性对照。设置恒温水浴锅反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。阴阳性反应终点结果如图6所示，其中，颜色为紫罗兰表示阴性，天蓝色表示阳性。实验结果表明：使用HNB可通过观察颜色判断反应结果，无需仪器辅助即可进行判读。
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院大学宁波生命与健康产业研究院
中国科学院大学宁波华美医院
<120> 一种检测非洲猪瘟病毒的CDA引物组、试剂盒及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 1
cgttgcgagg aggatgctcc gattcagggc 30
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 2
gatatgacta caagcgtgta aacggcg 27
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 3
gctgaccatg gaggatgctc cgattcaggg c 31
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 4
ttcaaacgtt acaagcgtgt aaacggcg 28
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 5
tgcgaggaaa ggatgctccg attcagggc 29
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 6
acggatatga caagcgtgta aacggcg 27
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 7
accatgggca ggatgctccg attcagggc 29
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 引物(primer)
<400> 8
cagcttcaaa caagcgtgta aacggcg 27
<210> 9
<211> 601
<212> DNA
<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)
<400> 9
ggagactttt tccatgatat ggtgggccac catatattgg gtgcatgtca ttcgtcctgg 60
caggatgctc cgattcaggg cacggcccag atgggggccc atggtcagct tcaaacgttt 120
cctcgcaacg gatatgactg ggacaaccaa acacctttag agggcgccgt ttacacgctt 180
gtagatccct ttggaagacc tattgtaccc ggcacaaaga atgcgtaccg aaacttggtt 240
tactactgcg aataccccgg agaacgactt tatgaaaacg taagattcga tgtaaatgga 300
aattccctgg acgaatatag ttcggatgtc acaacgcttg tgcgcaaatt ttgcatccca 360
ggggataaaa tgactggata taagcacttg gtcggccagg aggtatcggt ggagggaact 420
agtggccctc tcctatgcaa cattcatgat ttgcacaagc cgcaccaaag caaacctatt 480
cttaccgatg aaaatgatac gcagcgaacg tgcagccata ccaacccgaa attcctttca 540
caacattttc ccgagaactc tcacaatatc caaacagcag gtaaacaaga tattactcct 600
a 601

Claims (9)

1.一种非疾病诊断目的的检测非洲猪瘟病毒的CDA引物组，其特征在于：所述引物组为ASFV-MF-3和ASFV-MR-3，其中ASFV-MF-3的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，ASFV-MR-3的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。
2.一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的CDA引物组。
3.根据权利要求2所述的一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于：所述CDA引物组中的引物ASFV-MF-3和ASFV-MR-3在反应体系中的浓度均为1～2 μM。
4.根据权利要求2所述的一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括Bst聚合酶、CDA反应缓冲液、超纯水和显色剂；所述CDA反应缓冲液包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4和Triton X-100。
5.根据权利要求4所述的一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于：所述显色剂选自Sybr green I、Eva green、羟基萘酚蓝、铬黑T中的一种。
6.根据权利要求2所述的一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的反应体系的组成为：
2-50 mM Tris-HCl pH8.8；
2-20 mM KCl；
2-20 mM (NH4)2SO4；
2～20 mM MgSO4；
0.1～0.5 % Triton X-100；
0.2～1 M 甜菜碱；
1～1.6 mM dNTP；
5～10 U Bst DNA 聚合酶；
100～150μmol/ L 显色剂；
1～2 μM 引物ASFV-MF-3；
1～2 μM 引物ASFV-MR-3；
反应溶剂为超纯水。
7.权利要求6所述的试剂盒用于非疾病诊断目的的检测非洲猪瘟病毒的方法，包括以下步骤：
步骤1，将待检测核酸样本和试剂盒的反应体系混合，制得扩增反应液；
步骤2，由步骤1制得的扩增反应液，于60～65℃反应20～80 min，根据显色结果判断样品是否含有非洲猪瘟病毒。
8.权利要求1所述的CDA引物组在以非疾病诊断为目的的非洲猪瘟病毒检测中的应用。
9.权利要求2-6任一项所述的试剂盒在以非疾病诊断为目的的非洲猪瘟病毒检测中的应用。
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