CN114182001B

CN114182001B - 非对称环介导恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒和应用

Info

Publication number: CN114182001B
Application number: CN202111543952.4A
Authority: CN
Inventors: 毛瑞; 吴欣瑶; 蔡挺; 缪青
Original assignee: Guoke Ningbo Life And Health Industry Research Institute; Ningbo Huamei Hospital University of CAS
Current assignee: Guoke Ningbo Life And Health Industry Research Institute; Ningbo Huamei Hospital University of CAS
Priority date: 2021-12-16
Filing date: 2021-12-16
Publication date: 2022-07-26
Anticipated expiration: 2041-12-16
Also published as: CN114182001A

Abstract

本发明公开了非诊断目的非对称环介导恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒和应用。所述方法为：提供一种核酸的步骤，该核酸3’至5’方向依次由Rc、Fc、R、Dc、D区组成，所述核酸的5’端的D区与相邻的Dc退火，3’端的Rc区与同一链上的R区退火，可组成非对称环结构；所述核酸3’端的Rc区与R区退火，以该核酸为模板合成其自身的互补链，将合成的核酸序列称为核酸A；使用引物第一寡核苷酸与所述核酸的Fc区退火，进行合成步骤；所述核酸A的3’端的Dc区与临近的D区退火以核酸自身为模板进行反应使核酸链不断延伸。利用本发明的核酸合成方法，目标片段可仅为40bp左右，较其他恒温扩增方法而言可以容易的实现恒温条件下的核酸扩增。

Description

非对称环介导恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒和应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体地，本发明涉及一种非诊断目的的恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒。

背景技术

聚合酶链反应(PCR)方法被认为是扩增靶基因的方法最经典方法(Saiki，Gelfandet al.1988)，亦是体外核酸序列扩增应用最为普遍的技术。然而PCR方法的主要问题是：实际操作中必须要用专门的程序温度控制系统，这使得应用成本极大提高。

LAMP技术(Notomi，Okayama et al.2000)是可以对靶基因进行恒温条件下的扩增，其核心是利用针对靶基因上的六个区域设计四条特异性引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶，使得链置换DNA合成在不停地自我循环。该技术的其中一个局限是，因该方法高特异性和灵敏度等特点依赖于4条引物的性质，最佳引物的获得通常需要进行序列比对、在线引物设计、引物筛选及特异性试验，这一过程十分繁琐。

发明内容

本发明的目的是提供一种单酶及恒温条件下完成核酸合成的方法，本发明方案是受到DNA常见双螺旋结构、分子信标探针及LAMP启发，提出的以PCR引物为基础重新设计引物的新工作模式，形成非对称环起始扩增结构，设计并优化该结构环的形成过程，并且具有可选加速引物的特点。本发明的一个优势是，较LAMP目标片段最小为120bp，本方法可仅为40bp左右，可较容易的实现核酸恒温扩增的扩增。本发明利用聚合酶催化链置换型的互补链合成而不需复杂的温度控制，有益于核酸的合成。该DNA聚合酶是LAMP等核酸恒温扩增方法中用到的酶。

本发明改进了已知方法3’-OH的供给，结果发现通过利用具有特定结构的寡核苷酸，不需任何额外酶反应3’-OH结构就可被提供，由此得出本发明。即本发明涉及合成核酸的方法，通过用所述核酸合成方法扩增核酸的方法和应用所述方法合成核酸的试剂盒。

本发明的具体技术方案如下：

一种非诊断目的非对称环介导的恒温条件下合成核酸的方法，包括以下步骤：

1)提供一种核酸的步骤，该核酸3’至5’方向依次由Rc、Fc、R、Dc、D区组成，所述核酸的5’端的D区与相邻的Dc退火，3’端的Rc区与同一链上的R区的退火，可组成非对称环结构；

2)步骤1)提供的所述核酸的3’端的Rc区与R区退火，以该核酸为模板合成其自身的互补链，将合成完后的核酸序列称为核酸A；

3)使第一寡核苷酸与步骤1)提供的所述核酸的Fc区退火，然后以所述第一寡核苷酸的F区作为合成起点，进行合成步骤；其中所述第一寡核苷酸包括R区与F区；

4)所述核酸A的3’端的Dc区与临近的D区退火，以核酸A为模板合成其自身的互补链，并引发自动的核酸链延伸反应。

参见图1，为本发明中上述合成核酸所对应的合成步骤图解。本发明中的所述恒温是指整个反应过程在60-65℃的温度范围内进行合成。

作为优选实施方案，本发明所述核酸反应中使用的聚合酶为Bst DNA聚合酶、Bca(exo-)DNA聚合酶、DNA聚合酶I克列诺(Klenow)片段、Vent DNA聚合酶、Vent(Exo-)DNA聚合酶(缺少核酸外切酶活性的Vent DNA聚合酶)、Deep Vent DNA聚合酶、Deep Vent(Exo-)DNA聚合酶(缺少核酸外切酶活性的Deep Vent DNA聚合酶)、Φ29phage DNA聚合酶以及MS-2phage DNA聚合酶等中的一种或几种。其中优选使用Bst DNA聚合酶或Bst 2.0DNA聚合酶。

本发明核酸反应中可以加入解链温度调节剂，所述解链温度调节剂优选为甜菜碱，进一步优选地，反应溶液中甜菜碱的浓度为0.2-3.0M。

作为优选实施方案，所述获得的核酸链能够自主配对无限延伸，该核酸链上3’端的Rc区会与该链上的互补区段R区配对作为合成起点以自身为模板合成其自身的互补链，然后该互补链3’端的Dc区与临近的D区退火，引发核酸链不断的延伸反应。

作为优选实施方案，所述合成核酸的方法中通过引入加速引物BP的方法使得核酸扩增加速进行；其中BP是位于原始核酸F区到Rc区的中间区段。

本发明还提供一种核酸，该核酸3’至5’方向依次由Rc、Fc、R、Dc、D区组成，所述核酸的5’端的D区与相邻的Dc退火，3’端的Rc区与同一链上的R区的退火，可组成非对称环结构。

本发明提供的一种核酸的合成方法，包括以下步骤：

1-a)退火步骤，使第一寡核苷酸与模板的Fc区退火，其中所述模板3’至5’方向依次由Fc区和R区组成，所述第一寡核苷酸包括R区与F区，所述R区与F区的5’侧相连，其中，

F区：具有与Fc区互补的核苷酸序列的区，

R区：具有与Rc区互补的核苷酸序列的区；

1-b)以所述第一寡核苷酸的F区作为合成起点，合成第一核酸；所述第一核酸具有与所述模板互补的核苷酸序列，所述第一核酸的5’末端具有可与同一条链上的Rc区退火的R区；

1-c)在恒温条件下，使第二寡核苷酸与所述第一核酸的Rc区退火，其中所述第二寡核苷酸从3’端到5’端依次为R区、Dc区、D区；其中，

R区：具有与Rc区互补的核苷酸序列的区，

Dc与D区：Dc与D区为相互互补的核苷酸序列的区，其序列为任意；

1-d)以所述第二寡核苷酸的R区作为合成起点，合成第二核酸，即获得目标核酸片段。

参见图2，为本发明中上述第二核酸(即3’至5’方向依次由Rc、Fc、R、Dc、D区组成的一种核酸)所对应的合成步骤图解。

作为优选实施方案，步骤1-a)所述模板为RNA，步骤1-b)中的第一核酸通过具有反转录酶活性的酶来合成。

作为优选实施方案，所述F区、和R区的核酸片段均为10-60bp，所使用D区为任意序列，大小为5-30bp。进一步优选地，所述F区和R区的核酸片段均为20bp，D区的核酸片段为10bp。

本发明还提供一种合成核酸的试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：

第一寡核苷酸，其包括F区和R区，所述R区与F区的5’侧相连，其中，

F区：具有与Fc区互补的核苷酸序列的区，

R区：具有与Rc区互补的核苷酸序列的区；

第二寡核苷酸，其包括R区和D、Dc区，所述D区与Dc区的5’侧相连，Dc区与R区的5’侧相连，其中，

R区：具有与Rc区互补的核苷酸序列的区，

Dc与D区：Dc与D区相互互补的核苷酸序列的区，其序列为任意；；

核酸合成催化酶；

核苷酸，其作为所述DNA聚合酶的底物。

作为优选实施方案，所述核酸合成催化酶为链置换DNA聚合酶和/或反转录酶。其中，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶、Bca(exo-)DNA聚合酶、DNA聚合酶I克列诺片段、VentDNA聚合酶、Vent(Exo-)DNA聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶、Deep Vent(Exo-)DNA聚合酶、Φ29phage DNA聚合酶以及MS-2phage DNA聚合酶等中的一种或几种。其中优选使用Bst DNA聚合酶或Bca(exo-)DNA聚合酶。

作为优选实施方案，所述试剂盒还包括解链温度调节剂，所述解链温度调节剂优选为甜菜碱。

作为优选实施方案，所述试剂盒还包括加速引物B其特征在于：所述试剂盒还包括加速引物BP，该引物位于原始核酸F区到Rc区的中间区段。

作为优选实施方案，所述试剂盒还包括用于检测核酸合成反应产物的检测试剂，所述检测试剂优选为结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，优选为Sybrgreen I和Eva green。

作为优选实施方案，所述试剂盒还包括能使酶处于合适pH值的缓冲液，退火或维持酶催化活性的必需盐，保护酶的介质。

本发明还提供了所述试剂盒在合成核酸或检测样品中靶核苷酸序列中非诊断目的的应用。本发明适用于各种DNA及RNA，例如各种动植物细胞、细菌和病毒的DNA及RNA的检测。比如，用于H1N1病毒的H1基因和N1基因的cDNA及RNA的检测；用于志贺氏菌的基因组DNA检测等。

基于本发明的在恒温条件下合成核酸的方法，提供一种检测样品中靶核苷酸序列的方法，包括以靶核苷酸为模板，通过本发明的合成核酸的方法进行扩增，并观察是否生成扩增产物。

在上述扩增产物中加入包含与形成的非对称环结构互补的核苷酸序列的探针，可观察两者之间的杂交。还可将所述探针标记在颗粒上，并观察通过杂交而发生的聚集反应。所述的扩增方法可以在核酸检测试剂的存在下实施，并根据信号的变化来观察是否生成扩增产物。

类似PCR扩增技术，基于本发明的合成核酸的方法，还可以提供一种检测样品中靶核苷酸序列突变的方法，包括以靶核苷酸为模板，通过本发明所述的恒温条件下合成核酸的方法进行扩增。其中，核苷酸序列中作为扩增对象的突变阻碍了组成该扩增方法的任一互补链的合成，进而抑制信号的相关产生，从而检测出突变。

本发明合成的核酸基本上由通过成茎环结构连接的互相互补的链组成。参见图3，为本发明合成方法形成的理想扩增核酸产物的示意图。

一般而言，一个在互补配对碱基分离时不能被分离成两个或更多分子的链称为单链。同一链中互补核苷酸序列可形成碱基配对，本发明通过容许具有核苷酸序列首尾连接在单链里的核酸在同一链内碱基配对，可获得分子内碱基配对的产物，该产物包含组成明显双链的区和不涉及碱基配对的环。

本发明具有非对称环结构的核苷酸序列的核酸可被定义为单链核酸，其中包含能在同一链中退火的互补核苷酸序列。具有互补核苷酸序列的核苷酸可退火成不涉及碱基配对的环。成环序列可以是任意的核苷酸序列。成环序列能碱基配对以启动用于置换的互补链的合成。并优先地被提供与位于其它区的核苷酸序列不同的序列，以获得特异性退火。

本发明中基本相同的核苷酸序列定义如下：当以某序列作为模板合成的互补链与靶核苷酸序列退火作为合成互补链的起点时，该序列基本上与靶核苷酸序列相同。例如，与F相同的序列不但完全包括与F相同的序列，还包括能作为模板的核苷酸序列，所述模板能给出与F退火的核苷酸序列并能作为合成互补链的起点。本发明术语“退火”指的是通过根据沃森-克里克定律的碱基配对，形成互补结构的核酸。故而，即使组成碱基配对的核酸链为单链，如果分子内互补核苷酸序列碱基配对，退火亦会发生。通过碱基配对核酸组成双链结构，本发明退火和杂交所表达的含义有重合部分。

本发明组成核酸的核苷酸序列对数至少为1。本发明所期望的模型中，核苷酸序列对数可为1的整倍数。该情况中，本发明组成核苷酸的互补核苷酸序列对数理论上没有上限，在由多组互补核苷酸序列构成的本发明所合成产物核酸时，该核酸由重复相同的核苷酸序列组成。

本发明所指核酸通常既包括DNA又包括RNA，而来自天然DNA或RNA的其核苷酸被人工衍生物所替换的核酸或修饰核酸亦包括在本发明的核酸范围中。通常本发明的核酸被包含于生物样品中，生物样品包括动物、植物或微生物的组织，细胞，培养物和分泌物，以及它们的提取物。本发明所述的生物样品包括细胞内寄生物基因组DNA或RNA，例如病毒或支原体。本发明的核酸一般由包含在所述生物样品的核酸衍生而来。例如由mRNA、微小RNA等合成cDNA，基于生物样品衍生来的核酸而扩增的核酸，是本发明合成的核酸的典型实例。

本发明核酸的特征是在核酸的该核酸3’至5’方向依次由Rc、Fc、R、Dc、D区组成，所述核酸的5’端的D区与相邻的Dc退火，3’端的Rc区与同一链上的R区的退火，可组成非对称环结构，3’-末端的Rc区同R区退火时才可在DNA聚合酶的作用下延伸。

本发明中，寡核苷酸是满足两个要求的核苷酸，即必须能形成互补碱基配对，并且在3’-末端供给-OH基为互补链合成的起点。因此，其主链并不必限于磷酸二酯键一种连接。例如，它可由硫代磷酸衍生物组成主链或者是基于肽连接的肽核酸，所述硫代磷酸衍生物为S取代O。碱基是指那些可互补配对的碱基。天然存在五种碱基，即A，C，T，G和U，碱基也可为类似物例如溴脱氧尿苷。优选的是，本发明寡核苷酸不仅可用做合成的起点还可为互补链合成的模板。本发明术语多核苷酸包括寡核苷酸。本发明所用术语“多核苷酸”的链长无限制，而所用术语“寡核苷酸”指的是有相对较短的链长的核苷酸聚合物。

下述各种核酸合成反应中在给定的条件下，本发明寡核苷酸链有能与互补链碱基配对并保持一定特异性的长度。具体地，它由5-200个碱基组成，更优选10-50个碱基对。识别已知聚合酶的链长至少为5个碱基。该聚合酶催化依靠序列的核酸合成反应。故而退火部分的链长应长于该长度。另外，统计学上所期望10个碱基的长度或更长以获得目标核苷酸特异性。另一方面，由于化学合成制备太长核苷酸序列比较困难，因此上述链长是所期望范围的实例。例证的链长指的是部分与互补链退火的链长。正如下面所描述的，本发明寡核苷酸可最终至少分别与两区退火。因此，这里例证的链长应理解为组成寡核苷酸的每个区的链长。

此外，本发明的寡核苷酸可用已知的标记物标记。标记物包括结合配体例如地高辛和生物素，酶，荧光物，发光物，放射性同位素等。

本发明其它寡核苷酸还可被结合到固相。或者，寡核苷酸的任意部分可采用结合配体标记，例如生物素，间接地由结合配体例如固定抗生物素蛋白所固定。固定寡核苷酸为合成的起点时，合成反应产物核酸为固相所捕获，这将利于其分离。通过核酸特异性指示物或与标记探针的杂交可对分离部分进行检测。通过本方法所获得的核酸产物，针对其中靶核酸片段可通过限制酶消化产物而得以回收。

本发明所用术语“模板”是指用于合成互补链时作为模板的核酸。具有核苷酸序列与模板互补的互补链意思是指对应于模板的链。但是二者的关系只是相对的。即合成的互补链可以再次起到模板的功能。也就是，互补链亦可作为模板。

在本发明中，如果目标为RNA，可仅通过额外添加反转录酶构成。即用RNA为模板，通过反转录酶在模板中F与Fc的退火合成互补链。当反转录酶以DNA为模板进行合成互补链的反应时，所有通过反转录酶进行合成互补链的反应包括以与Rc退火的R作为合成起点的互补链的合成，该互补链在链置换反应中作为模板。如上述以RNA为模板获得第一条单链核酸的模式为本发明的优选模式。另一方面，如果使用既具有链置换活性又有反转录酶活性的DNA聚合酶如Bca DNA聚合酶和

RTx反转录酶等，通过相同的酶不但从RNA的第一条单链核酸的合成，而且接下去以DNA为模板的反应可得以类似地进行。

本发明重要的特征是除非许多区的位置关系得以保持，否则一系列反应不能进行。由于这个特征，伴随互补链非特异合成的非特异合成反应得到了有效阻止。因此，本发明的方法用于检测目的时具有较高的特异性。

本发明合成的核酸是单链，其中大部分可通过碱基配对构成互补核苷酸序列。利用这个特征，对合成的产物可进行检测。通过实施本发明合成核酸的方法，可采用荧光色素作为双链特异性嵌入剂(double-specific intercalater)例如溴化乙锭、SYBR Green I、Pico Green或Eva Green，核酸合成过程中随着产物的增加可观察到荧光的强度增加。通过监测荧光强度，可在封闭系统中跟踪实时(real-time)合成反应进行情况。也可考虑在PCR方法中应用该类型的检测系统，但有许多问题，因为不能区分产物信号和引物二聚物的信号等。然而，当本发明应用该系统时，增加非特异碱基配对的能力非常低，因此，预计高灵敏度和低干扰会同时获得，与应用双链特异性嵌入剂(double-specific intercalater)相似，在同一系统中可利用荧光能量的转移实现检测目的。

本发明合成核酸的方法采用核酸合成催化酶催化互补链反应，所述核酸合成催化酶可以为DNA聚合酶或反转录酶等。其中，DNA聚合酶可选用以下类型的酶。此外，本发明还可采用这些酶的各种突变体，它们都具有用于互补链合成的序列-依赖活性和链置换活性。

Bst DNA聚合酶

Bst DNA聚合酶(大片段)

Bst 2.0DNA聚合酶

Bst Warmstart 2.0DNA聚合酶

Bst 3.0DNA聚合酶

Bca(exo-)DNA聚合酶

DNA聚合酶I克列诺(Klenow)片段

Vent DNA聚合酶

Vent(Exo-)DNA聚合酶(缺少核酸外切酶活性的Vent DNA聚合酶)

Deep Vent DNA聚合酶

Deep Vent(Exo-)DNA聚合酶(缺少核酸外切酶活性的Deep Vent DNA聚合酶)

Φ29phage DNA聚合酶

MS-2phage DNA聚合酶

OmniAmp DNA聚合酶

这些酶中，Bst DNA聚合酶、Bca(exo-)DNA聚合酶、OmniAmp DNA聚合酶是优选采用的酶，因为它们具有较好的热稳定性和高催化活性。在优选的实施方案中，本发明的反应可恒温实现，但由于解链温度的调节(Tm)等，不可能总是能利用恒温条件来维持酶的稳定。因此，采用的酶需要较好的热稳定性。

本发明合成或扩增核酸所必需的各种试剂可被预先包装，并以试剂盒的形式提供。具体地，本发明所提供的试剂盒包含作为合成互补链合成的引物和用于置换反应的外引物所必需的各种寡核苷酸，用于互补链合成的底物dNTP混合物，用于实现链置换型互补链合成的DNA聚合酶，为酶反应提供合适条件的缓冲液，和用于检测合成反应产物所必需的介质。具体地，本发明优选的模式中，所提供的反应试剂已预先全部加入，进而仅通过加入样品就可启动该反应。通过利用可见光信号或荧光信号可在容器内检测反应产物的系统。反应后不必打开和关闭容器。这对于预防污染是非常有利的。

附图说明

图1是本发明恒温条件下核酸合成方法的步骤图解。

图2是本发明提供的一种核酸的合成方法步骤图解。

图3是本发明合成方法形成的理想扩增产物的示意图。

图4是本发明实施例1中H1N1靶核苷酸序列中对应的每个核苷酸序列区的位置关系。

图5是本发明实施例1中以H1N1为模板以本发明单链核酸的合成方法获得的产物琼脂糖电泳结果的照片；其中，泳道1：DNAMarker；泳道2：1fmol H1N1 dsDNA扩增产物。

图6是本发明实施例2中限制酶消化产物的琼脂糖凝胶电泳结果的照片；其中，泳道1：分子量标记DNA ladder；泳道2：纯化产物的EcoRV消化；泳道3：纯化产物。

图7是本发明实施例3在引物的作用下，H1N1靶核苷酸序列DNA扩增过程中的实时荧光曲线图。

图8是本发明实施例4在引物的作用下，H1N1靶核苷酸序列DNA扩增应用HNB进行反应基于颜色变化的终点监测的图。

图9是本发明实施例5中在引物的作用下，H1N1靶核苷酸序列体外转录的RNA扩增过程中的实时荧光曲线图。

图10是本发明实施例6中在不同组合的加速引物组合的作用下，以H1N1体系为例的扩增反应的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图11是本发明实施例7中在志贺氏菌靶核苷酸引物的作用下，含志贺氏菌靶核苷酸序列DNA扩增过程中的实时荧光曲线图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，具体可参照《PCR技术实验指南》(第2版)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1对于甲型流感病毒H1N1中片段的扩增

甲型H1N1病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，甲型流感病毒属(Influenzavirus A)，患者会出现发烧、咳嗽、疲劳、食欲不振等。H1N1的核酸检测一般采用逆转录后PCR技术检测cDNA。故应用本发明核酸合成方法设计出新的引物亦可应用于H1N1病毒的检测。本发明的核酸是利用人工设计的插入有酶切位点的H1N1(来自于GenBank:GQ290690.1)为模板尝试的。实验中用到两种引物为N1-TP(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)和N1-FP(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)。通过利用临近堆积现象将这些设计成退火成环的区。

通过所述引物N1-TP和N1-FP，在靶核苷酸H1N1两端合成非对称环结构。通过这些引物合成本发明核酸的方法的反应溶液的组合如下面所示。

反应溶液组合如下，其余加入ddH₂O至25μL

20mM Tris-HCl pH8.8

10mM KCl

10mM(NH₄)₂SO₄

14mM MgSO₄

0.1％Triton X-100

1M甜菜碱

1.25mM dNTP

8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)

引物：

1600nM N1-TP

1600nM N1-FP

靶核酸:H1N1 dsDNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)。参见图4，为H1N1靶核苷酸序列中对应的每个核苷酸序列区的位置关系。

混合物于63℃反应1小时，反应后，于80℃10分钟终止该反应，然后重新转到用冰预冷的水中。

反应的证实：将1μL常规核酸电泳上样缓冲液(Takara DNA ladder附赠)加到5μL上面终止反应后的反应液中，样品于90mV在GelRed预染的(Biotum)1％琼脂糖凝胶(TAE溶解)电泳1小时。电泳后的凝胶以验证反应合成的核酸，结果参见图5，为以H1N1为模板获得的产物琼脂糖电泳结果的照片；其中，泳道1DNA Marker；泳道2：产物。结果显示：获得了宽分子量分布的核酸产物，即验证了本发明方法所得到的核酸可无限自组装退火延伸得到超大核酸分子。

实施例2通过限制酶的消化证实实施例1中的反应产物

为了验证本发明实施例1获得的核酸具有互补核苷酸序列以环状结构连接在单链内的结构形式，用限制酶消化产物。如果通过消化能生成理论上的片段，同时不存在高分子量处产生不清晰成片条带模式和未被电泳的带，就可推定实施例1的合成产物为具有互补序列交替地连接在单链内的核酸。

实施例1中反应终止后的反应液通过用乙醇的沉淀作用得以沉积和纯化，回收产生的沉淀并重新溶于超纯水中，用限制酶EcoRV于37℃消化2小时，样品于90mV在GelRed预染的(Biotum)1％琼脂糖凝胶(TAE溶解)电泳1小时。用DNA ladder作为分子量标记。通过电泳后的凝胶以验证核酸。结果在图6中显示，结果表明：所获得的核酸产物由大片段可酶切为小片段，证明产物为针对目标核酸扩增所得，未出现非特异性扩增，证实了本发明方法的特异性，以及核酸产物为互补序列交替连接。

实施例3应用EvaGreen验证H1N1基因扩增反应产物

EvaGreen同SYBR Green I类似，是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对PCR等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，EvaGreen发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，EvaGreen的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链DNA数量。

通过引物N1-TP(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)和N1-FP(核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示)，合成本发明核酸的方法的反应溶液的组合如下面所示。

反应溶液组合如下，其余加入ddH₂O至25μL

20mM Tris-HCl pH8.8

10mM KCl

10mM(NH₄)₂SO₄

14mM MgSO₄

0.1％Triton X-100

1M甜菜碱

1.25mM dNTP

8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)

1X EvaGreen(Biotum)

引物：

1600nM N1-TP

1600nM N1-FP

靶核酸:H1N1 dsDNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)。扩增反应设置8个阳性对照和8个阴性对照。设置圣湘sansure real time PCR反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图7所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可知：在反应25分钟后，荧光强度逐渐增强，说明合成的核酸产物不断延伸并形成交替连接的互补序列。

实施例4应用羟基萘酚兰(HNB)进行扩增反应终点监测

羟基萘酚兰(HNB)属于金属离子指示剂，是针对反应中与副产物焦磷酸盐结合的镁离子或者锰离子的量的变化，从而呈现不同指示颜色以实现对结果的判断。

反应溶液组合如下，其余加入ddH₂O至25μL

20mM Tris-HCl pH8.8

10mM KCl

10mM(NH₄)₂SO₄

14mM MgSO₄

0.1％Triton X-100

1M甜菜碱

1.25mM dNTP

8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)

120μM HNB

引物：

1600nM N1-TP

1600nM N1-FP

靶核酸:H1N1 dsDNA(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)。扩增反应设置8个阳性对照和8个阴性对照。设置恒温水浴锅反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。阴阳性反应终点结果如图8所示，其中，颜色为紫罗兰表示阴性，天蓝色表示阳性。实验结果表明：将HNB应用于其中可实现通过颜色判断反应结果，无需仪器辅助即可进行判读。

实施例5应用基于EvaGreen的实时荧光实现RNA靶基因扩增

AMV反转录酶可以RNA为模板合成cDNA，配合Bst DNA聚合酶可以实现RNA的检测。

通过引物N1-TP(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)和N1-FP(核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示)以RNA为模板合成cDNA，反应溶液组合如下，其余用ddH₂O至25μL

20mM Tris-HCl pH8.8

10mM KCl

10mM(NH₄)₂SO₄

14mM MgSO₄

0.1％Triton X-100

1M甜菜碱

1.25mM dNTP

8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)

5U AMV反转录酶

1X EvaGreen(Biotum)

引物：

1600nM N1-TP

1600nM N1-FP

靶核酸:H1N1 RNA，该H1N1 RNA是由H1N1 dsDNA(序列如SEQ ID NO.3所示)体外转录而得。

设置圣湘sansure real time PCR反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图9所示。此结果说明本方法应用于RNA检测同样可行。

实施例7应用加速引物对于H1N1 dsDNA靶基因扩增

将加速引物组合分为两组，仅引物组合不同：

a，无加速引物

b，有加速引物

反应溶液组合如下，其余加入ddH₂O至25μL

20mM Tris-HCl pH8.8

10mM KCl

10mM(NH₄)₂SO₄

14mM MgSO₄

0.1％Triton X-100

1M甜菜碱

1.25mM dNTP

8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)

1X EvaGreen(Biotum)

a引物：

1600nM N1-TP(序列如SEQ ID NO.1所示)

1600nM N1-FP(序列如SEQ ID NO.2所示)

b引物：

1600nM N1-TP(序列如SEQ ID NO.1所示)

1600nM N1-FP(序列如SEQ ID NO.2所示)

1600nM N1-BP(序列如SEQ ID NO.4所示)

a，b各组引物对应的靶核酸均为:H1N1 dsDNA(序列如SEQ ID NO.3所示)。设置圣湘sansure real time PCR反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图10所示。所得a、b组的Ct值分别约为18min、21min，说明加速引物起到加速效果。

实施例8对于志贺氏菌靶基因扩增

志贺氏菌(Shigella，SH)是革兰氏阴性细菌，1898年由日本细菌学家志贺洁首先发现。人对志贺氏(杆)菌的易感性很高，是它的唯一宿主，主要通过摄取(粪便-口的污染)食物感染，最常见的症状是腹泻(水腹泻)、发烧、恶心、呕吐、胃抽筋、肠胃气胀和便秘。快速、灵敏、高特异性核酸标志物检测技术研发将为志贺氏菌防控提供强有力的保障。故挑选志贺氏菌(Shigella)应用本发明方法作为潜在应用对象。

反应溶液组合如下，其余加入ddH₂O至25μL

20mM Tris-HCl pH8.8

10mM KCl

10mM(NH₄)₂SO₄

14mM MgSO₄

0.1％Triton X-100

1M甜菜碱

1.25mM dNTP

8U Bst DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)

1X EvaGreen(Biotum)

引物：

1600nM SH-TP(序列如SEQ ID NO.5所示)

1600nM SH-FP(序列如SEQ ID NO.6所示)

靶核酸为:SH dsDNA(序列如SEQ ID NO.7所示)

设置圣湘sansure real time PCR反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图11所示。扩增曲线说明本方法可适用食品安全的检测应用领域。

上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改。所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

序列表

<110> 国科宁波生命与健康产业研究院

中国科学院大学宁波华美医院

<120> 非对称环介导恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒和应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 43

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 1

ctcactagca tcaggataac agggttgaat gcccctaatt acc 43

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 2

caacaaggta tccttgttgc tcactagcat caggataaca gg 42

<210> 3

<211> 99

<212> DNA

<213> Influenza A virus

<400> 3

aaaggtagta aaatcagttg agttgaatgc ccctaattac cactatgaag agtggatatc 60

ttcctgttat cctgatgcta gtgaggtgat gtgtgtatg 99

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 4

actatgaaga gtggatatct t 21

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 5

ggaaaaactc agtgcctctc tcagtggcat cagcag 36

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 6

caacaaggta tccttgttgg gaaaaactca gtgcctc 37

<210> 7

<211> 500

<212> DNA

<213> 志贺氏菌(Shigella)

<400> 7

accacggccc acggatttac ttctccatga gtgacggaca acagaataca ctccatcgcc 60

cctggctgat gccgtgacag catggttccc ggaaaacaaa caatctgatg tatcacagat 120

atggcatgct tttgaacatg aagagcatgc caacaccttt tccgcgttcc ttgaccgcct 180

ttccgatacc gtctctgcac gcaatacctc cggattccgt gaacaggtcg ctgcatggct 240

ggaaaaactc agtgcctctg cggagcttcg acagcagtct ttcgctgttg ctgctgatgc 300

cactgagagc tgtgaggacc gtgtcgcgct cacatggaac aatctccgga aaaccctcct 360

ggtccatcag gcatcagaag gccttttcga taatgatacc ggcgctctgc tctccctggg 420

cagggaaatg ttccgcctcg aaattctgga ggacattgcc cgggataaag tcagaactct 480

ccattttgtg gacgagatag 500

Claims

1.非诊断目的的恒温条件下合成核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）提供一种核酸，该核酸3’至5’方向依次由Rc、Fc、R、Dc、D区组成，所述核酸的5’端的D区与相邻的Dc退火，3’端的Rc区与同一链上的R区的退火，可组成非对称环结构；

2）步骤1）提供的所述核酸的3’端的Rc区与R区退火，以该核酸为模板合成其自身的互补链，将合成完后的核酸序列称为核酸A；

3）使第一寡核苷酸与步骤1）提供的所述核酸的Fc区退火，其中所述第一寡核苷酸包括R区与F区；然后以所述第一寡核苷酸的F区作为合成起点，进行合成步骤；所述R区与Rc区互补，所述F区与Fc区互补；

4）所述核酸A的3’端的Dc区与临近的D区退火，以核酸A为模板合成其自身的互补链，并引发自动的核酸链延伸反应。

2.根据权利要求1所述的恒温条件下合成核酸的方法，其特征在于：所述合成核酸的方法中通过引入加速引物BP，该引物是位于F区到Rc区的中间区段。

3.一种核酸，其特征在于：核酸3’至5’方向依次由Rc、Fc、R、Dc、D区组成；所述核酸的5’端的D区与相邻的Dc退火，3’端的Rc区与同一链上的R区的退火，可组成非对称环结构。

4.权利要求3所述的核酸的合成方法，包括以下步骤：

1-a）退火步骤，使第一寡核苷酸与模板的Fc区退火，其中所述模板3’至5’方向依次由Fc区和R区组成，所述第一寡核苷酸包括R区与F区，所述R区与F区的5’侧相连，其中，

F区：具有与Fc区互补的核苷酸序列的区，

R区：具有与Rc区互补的核苷酸序列的区；

1-b）以所述第一寡核苷酸的F区作为合成起点，合成第一核酸；所述第一核酸具有与所述模板互补的核苷酸序列，所述第一核酸的5’末端具有可与同一条链上的Rc区退火的R区；

1-c）在恒温条件下，使第二寡核苷酸与所述第一核酸的Rc区退火，其中所述第二寡核苷酸从3’端到5’端依次为R区、Dc区、D区；其中，

R区：具有与Rc区互补的核苷酸序列的区，

Dc与D区：Dc与D区是相互互补的核苷酸序列的区；

1-d）以所述第二寡核苷酸的R区作为合成起点，合成第二核酸，即获得目标核酸片段。

5.根据权利要求4所述的核酸的合成方法，其特征在于：步骤1-a）所述模板为RNA，步骤1-b）中的第一核酸通过具有反转录酶活性的酶来合成。

6.根据权利要求4或5所述的核酸的合成方法，其特征在于：所述F区、和R区的核酸片段均为10-60bp，所使用D区为任意序列，大小为5-30bp。

7.一种合成核酸的试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：

F区：具有与Fc区互补的核苷酸序列的区，

R区：具有与Rc区互补的核苷酸序列的区；

第二寡核苷酸，其包括R区和D、Dc区，其中D区与Dc区的5’侧相连，Dc区与R区的5’侧相连，其中，

R区：具有与Rc区互补的核苷酸序列的区，

Dc与D区：Dc与D区相互互补的核苷酸序列的区，其序列为任意；

核酸合成催化酶；

核苷酸，其作为DNA聚合酶的底物。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括加速引物BP，该引物位于原始核酸F区到Rc区的中间区段。

9.权利要求7-8任一项所述试剂盒在合成核酸或检测样品中靶核苷酸序列中非诊断目的的应用。