KR102592367B1 - 게놈 및 치료학적 적용을 위한 핵산 분자의 클론 복제 및 증폭을 위한 시스템 및 방법 - Google Patents

게놈 및 치료학적 적용을 위한 핵산 분자의 클론 복제 및 증폭을 위한 시스템 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생물학적 샘플로부터의 핵산 분자의 복제 또는 증폭을 위한 방법, 시약, 장치 및 시스템을 제공한다. 본 발명의 하나의 실시형태에서, 핵산 분자를 샘플로부터 단리시키고 단편화시키고, 연결제를 사용하여 하나 이상의 헤어핀 구조를 단편화된 핵산 분자의 각 말단에 연결시켜 하나 이상의 덤벨 주형을 형성시킨다. 상기 하나 이상의 덤벨 주형을 기질에 부착된 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉시키고, 회전환 복제 또는 회전환 증폭시킨다. 생성된 복제된 덤벨 주형 또는 증폭된 덤벨 주형은 전체 게놈 드 노보 서열분석; 서열 변이체 검출, 구조 변이체 검출, 분자 하플로타입의 페이즈 결정, 이수성 검출을 위한 분자적 계수; 서열 변이체 검출, 구조 변이체 검출, 분자 하플로타입의 페이즈 결정을 위한 유전자 패널, 전체 엑솜 또는 염색체 영역의 표적화된 서열 분석 및/또는 이수성 검출을 위한 분자적 계수; 핵산-핵산 결합 상호작용, 핵산-단백질 결합 상호작용 및 핵산 분자 발현 어레이의 연구; 및 소형 분자 저해제 또는 활성화제 또는 핵산 치료제의 효과의 시험을 포함하는 수많은 게놈 적용분야에서 사용된다.

Description

게놈 및 치료학적 적용을 위한 핵산 분자의 클론 복제 및 증폭을 위한 시스템 및 방법{SYSTEMS AND METHODS FOR CLONAL REPLICATION AND AMPLIFICATION OF NUCLEIC ACID MOLECULES FOR GENOMIC AND THERAPEUTIC APPLICATIONS}
본 발명의 실시형태는 일반적으로 핵산 분자의 복제 및 증폭 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 특정 실시형태는 회전환 복제(rolling circle replication)를 이용하는 생물학적 샘플로부터의 DNA 분자 복제와 관련된다. 본 발명의 다른 실시형태는 회전환 증폭을 이용하는 생물학적 샘플로부터의 DNA 분자 증폭과 관련된다. 본 발명의 특정 실시형태는 생물학적 샘플로부터 유래된 게놈 내의 서열 변이를 특징규명하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태는 생물학적 샘플로부터 유래된 전체 염색체 또는 이의 부분의 분자적 계수(molecular counting)에서 이용될 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태는 생물학적 샘플로부터 유래된 게놈 내의 하플로타입 구조의 특징규명에서 이용될 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태는 게놈 과학, 생체의학적 조사, 진단학적 검정과 백신 및 치료제 개발에서 샘플 제조 및 분석을 위해 적용될 수 있다.
고밀도 유전자형 분석 어레이(high-density genotyping array) 및 차세대 서열분석(next-generation sequencing; NGS)과 같은 전체 게놈 기술은 서열 변이, 특히 본원에서 소정의 개체 또는 종의 "서열 변이체"로서 총칭되는 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP) 및 단일 뉴클레오타이드 변이(SNV)를 동정할 수 있다. 그러나, 현재의 방법은 동일 DNA 분자상의 이러한 서열 변이체들의 조합을 측정할 수 없다. 서열 변이체 조합의 측정은 "페이즈(phase)"로 명명되며, 동일 DNA 분자상의 서열 변이체들의 특정한 조합은 "하플로타입"으로 명명된다. 예를 들면, 사람 개체는 이배체로, 각 체세포는 각 부모로부터 물려받은 두 세트의 상염색체를 함유한다. 소정의 개체의 하플로타입 상황을 특징규명하는 것은 질환 유전자를 맵핑하고, 집단 병력을 밝혀내고, 표현형 발현에서 시스(cis)- 및 트랜스(trans)-작용 변이체의 균형을 연구하는데 있어 중요하다.
하플로타입 정보를 측정하기 위한 3가지의 일반적 접근법이 있다: (i) 집단 추론, (ii) 부모 추론 및 (iii) 분자적 하플로타입 분석(molecular haplotyping). 하플로타입을 페이징(phasing)하기 위한 가장 통상적인 접근법은 집단 또는 부모 유전자형으로부터 수득된 데이터로부터 추론 및 통계학적 방법을 사용하는 것이다. 그러나, 전체 게놈 전반에 걸친 하플로타입 정보는, 특히 소정의 염색체 영역에 대한 연관 불균형(linkage disequilibrium)이 낮은 경우 및 희귀한 변이체의 경우에 컴퓨터 방법을 사용하여 분석될 수 없다. 반면에, 부모 추론 방법은 가계도의 범주에서 서열 변이의 유전형질 유전의 원리에 의존한다. 적절히 수행된다면 강력하지만, 많은 생물학적 샘플은 충분한 가계 정보가 부족하거나 소정의 관심대상 샘플의 하플로타입 상황을 추론하기에 적절한 가족 샘플을 요구한다.
컴퓨터 기반 접근법의 한계를 극복하기 위한 몇가지 분자적 하플로타입 분석 방법이 공지되어 있다. 이들 분자적 방법은 이후에 소정의 생물학적 샘플의 하플로타입 구조를 결정하기 위해 유전자형 분석되거나 서열분석될 개개의 DNA 분자 또는 개개의 DNA 분자의 세트를 단리하기 위한 각종 전략들을 포함한다. 한가지 이러한 전략은 대형-삽입 클론(즉, 포스미드) 라이브러리의 작제를 수반한다. 이어서, 이들 클론은 다중-웰 플레이트(즉, 96웰 또는 384웰 플레이트)의 개개의 웰로 희석되고, 주형 라이브러리로 생성되고, 특정 클론을 개개의 웰까지 추적하기 위해 바코드가 부착되고, 유전자형 분석 또는 서열분석 방법에 의해 특징규명된다.
개개의 염색체 또는 이의 부분의 하플로타입을 페이징하는 것에 대한 도전은 마이크로티터 플레이트 내의 희석된 풀(pool)에서 보다 작은 DNA 단편을 특징규명하는 것으로 줄어들 것이다(즉, 크기가 수백 메가베이스부터 수십 수백 킬로베이스로). 대형-삽입 클론을 생성시키는 대신에 DNA 단편을 크기 조정하거나 게놈 DNA를 이용하고 이어서 희석하고, 전체-게놈 방법에 의해 증폭시키고, 주형 라이브러리를 생성시키고 서열분석하여 소정의 샘플의 하플로타입을 결정하는 것도 보고되었다. 전체 염색체 또는 이의 부분을 또한 유동 분류(flow sorting) 방법 또는 미세절제 접근법에 의해 단리시키고, 이어서 희석하고, 전체-게놈 방법에 의해 증폭시키고, 주형 라이브러리를 형성시키고 유전자형 분석 또는 서열분석하여 생물학적 샘플로부터의 소정의 게놈의 하플로타입 구조를 결정할 수 있다. 이러한 모든 접근법들은 소정의 생물학적 샘플의 하플로타입을 페이징하는데 있어 높은 수준의 기술적 전문성 및 다수의 개별적 주형 라이브러리(대략 수백개)의 생성을 필요로 한다.
대부분의 영상화 시스템은 단일 형광성 이벤트를 검출할 수 없고, 따라서 샘플 중의 DNA 분자는 증폭되어야 한다. 현재 3가지 차세대 서열분석 방법이 존재한다: (i) 에멀젼 PCR(emPCR), (ii) 고체상 증폭 및 (iii) 용액-기반 회전환 복제. 이들 모든 방법의 경우, DNA 단편의 라이브러리를 생성시키기 위해 전형적으로 게놈 DNA를 표준 물리적 전단 기술을 사용하여 단편화시킨다. 단편화가 필수적이지 않을 수 있다는 예외가 있다. 예를 들면, 암 환자 또는 임신한 여성으로부터 수득된 혈장 또는 혈청과 같은 일부 생물학적 공급원은 전형적으로 1,000염기쌍(bp) 미만 및 일부 경우에 500bp 미만의 크기로 존재하는 순환성 무세포 게놈 DNA 단편을 함유한다. 크기 선별의 개재 단계가 필요한지 여부에 따라서, 범용 프라이밍 부위를 함유하는 어댑터 서열이 후속적으로 DNA 단편 말단에 연결된다. 통상의 PCR 프라이머를 사용하여 제한된 횟수의 PCR 사이클이 수행된다. 상기 3가지 방법들은 이러한 단계에서 벗어나지만, 모든 경우에 상기 클론성 증폭 방법들은 전형적으로 크기가 1,000bp 미만이고 보다 전형적 예에서는 700bp 이하로 제한되는 작은 단편을 복제 또는 증폭시키는 것으로 제한된다. 예를 들면, 일루미나(Illumina)의 고체상 증폭 방법은 기껏해야 크기가 단지 700bp인 DNA 단편을 증폭시킬 수 있다. 이러한 크기 제약은 사람 게놈을 신생(de novo) 조립하는 능력을 제한한다.
현재 전체 게놈 기술, 특히 NGS의 심각한 문제점은, 이후에 대규모의 평행한 포맷으로 클론성 증폭될 짧은 주형 라이브러리로부터 유래된 서열 리드(sequence read)에 대한 의존성이다. 중요하게도, 현재의 쌍형성된-말단(paired-end) 라이브러리 작제 방법은 본질적으로 정상 사람 게놈 간에 존재하고 많은 질환의 발병에 특히 중요한 것으로 보이는 대형의 복합적 구조적 변경을 쉽게 동정하는 능력을 파괴한다. 게놈의 구조적 변이는 초기 종양발생 및 암 진행, 질환 감수성 및 치료제 내성에서의 구동력을 대표할 수 있다. 짧은 주형 라이브러리부터 유래된 서열 리드는 신생 조립을 통해 신규한 반복적 질환-변경된 서열을 완전히 분석하는 것을 대단히 어렵게 만든다. 이와 같이, 대부분의 전체 게놈 서열분석 노력은 여전히 참조 게놈에 대한 서열 리드의 정렬에 의존한다. 따라서, NGS 데이터 세트는 특징규명되지 않은 채로 남겨진 사람 게놈 서열의 대형 스트레치(stretch)를 함유할 수 있고, 질환 기작의 이해는 게놈 구조 정보의 부족에 의해 편향될 수 있다.
대부분의 전체 게놈 서열분석 노력은 여전히 참조 게놈에 대한 서열 리드의 정렬에 의존한다. 정렬 실험은 서열 변이체의 상당 부분을 포획할 수 있지만, 대략 10 내지 100kb의 대형 주형은 구조적 변이의 대부분을 분석하고/하거나 사람 게놈 전반에 걸친 하플로타입의 페이즈를 제공하는 것을 필요로 한다. 크기 제약을 극복하기 위해 다수의 분자생물학 및 컴퓨터 소프트웨어 기술이 이용되었다. 약간의 개선을 제공함에도 불구하고, 이로 인한 단점은 생물학적 작업흐름의 복잡성 및 시약, 노동력 및 컴퓨터 하드웨어와 관련된 비용의 상당한 증가이다.
선형 핵산 단편의 말단들을 연결시켜 DNA 환을 생성시키는 것은 매우 비효율적 과정으로서, 생물학적 샘플로부터 상당량의 출발 물질을 필요로 한다. 소정의 DNA 단편의 원거리 말단들이 서로 인접하도록 함으로써 환을 생성시키는 것과 연관된 문제점은 1980년대 이후 당업계에서 널리 확립되었다. 예를 들면, DNA 단편의 말단들을 함께 연결시켜 환을 생성시키는 것과 연관된 한가지 문제점은 "분자내" 연결 이벤트(즉, 동일 DNA 단편의 DNA 환) 및 "분자간" 연결 이벤트(즉, 연쇄체라 지칭되는 2개 이상의 DAN 단편의 결합) 간의 경쟁 반응이다. DNA 단편의 말단들을 함께 연결시켜 환을 생성시키는 것과 연관된 다른 문제점은 분자내 환을 생성시키는데 있어 합당한 효율을 달성하기 위해 보다 큰 DNA 단편이 보다 작은 DNA 단편과 비교해 추가로 희석되어야 한다는 점이다.
대형 DNA 환(즉, 5 내지 7kb 이상인, 생어(Sanger) 서열분석에서 사용되는 대형-삽입 클론)의 생성과 차세대 서열분석의 고처리율 복제 또는 증폭 성질을 겸비한 획기적인 방법이 당업계에서 요구된다. 본 발명의 특정 실시형태는 DNA 환을 크기-독립적 방식으로 생성시킴으로써, 대형 DNA 단편으로부터 DNA 환을 생성할 때의 크기 제한을 극복한다. 본 발명의 다른 실시형태는 다수의 게놈 과학 적용에서 유용한 대형-삽입 주형의 생성 및 복제 또는 증폭에 의해 크기-독립적 DNA 환을 혼입시킴으로써, 직접 1kb 초과의 주형을 증폭할 때의 크기 제한을 극복한다. 본 발명은 또한 서열분석 적용을 위한 다수의 카피를 생성시키기 위한 회전환 복제 및 회전환 증폭에서 덤벨 환(dumbbell circle) 및 개선된 방법을 사용하는 보다 간단한 대형-삽입 주형의 제조 작업흐름을 제공함으로써, 현재 방법의 조사자 노력의 복잡성 및 관련 고비용을 극복한다. 본 발명의 특정 실시형태는 또한 범용 프라이머 서열에 의존하는 보다 간단한 주형 제조 작업흐름을 제공함으로써, 이종 핵산 서열의 다양한 세트의 유전자형 분석 및 서열분석 적용을 위해 개개의 대립유전자-식별 프라이머를 요구한다는 제한을 극복한다.
개요
본 발명의 하나의 실시형태는 적어도 하나의 DNA 분자의 복제 방법이다. 상기 방법은 적어도 하나의 DNA 분자를 단편화하여 적어도 하나의 단편화된 DNA 분자를 형성시키는 단계; 하나 이상의 헤어핀 구조를 상기 적어도 하나의 단편화된 DNA 분자의 각 말단에 연결시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머는 하나의 기질(substrate)에 부착되어 있는, 단계; 및 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉된 상기 적어도 하나의 덤벨 주형상에서 회전환 복제를 수행하여 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 형성시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태는 적어도 하나의 DNA 분자의 복제 방법이다. 상기 방법은 적어도 하나의 DNA 분자를 단편화하여 적어도 하나의 단편화된 DNA 분자를 형성시키는 단계; 하나 이상의 헤어핀 구조를 상기 적어도 하나의 단편화된 DNA 분자의 각 말단에 연결시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 임의의 비연결된 헤어핀 구조 및 임의의 비연결된 단편화된 핵산 분자를 엑소뉴클레아제로 처리하여 상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 정제하는 단계; 상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머는 적어도 하나의 기질에 부착되어 있는, 단계; 및 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉된 상기 적어도 하나의 덤벨 주형상에서 회전환 복제를 수행하여 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 형성시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태는 적어도 하나의 DNA 분자의 증폭 방법이다. 상기 방법은 적어도 하나의 DNA 분자를 단편화시켜 적어도 하나의 단편화된 DNA 분자를 형성시키는 단계; 하나 이상의 헤어핀 구조를 상기 적어도 하나의 단편화된 DNA 분자의 각 말단에 연결시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머는 적어도 하나의 기질에 부착되어 있는, 단계; 및 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉된 상기 적어도 하나의 덤벨 주형상에서 회전환 증폭을 수행하여 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 형성시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태는 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형의 검출 방법이다. 상기 방법은 적어도 하나의 DNA 분자를 단편화시켜 적어도 하나의 단편화된 DNA 분자를 형성시키는 단계; 하나 이상의 헤어핀 구조를 상기 적어도 하나의 단편화된 DNA 분자의 각 말단에 연결시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머는 적어도 하나의 기질에 부착되어 있는, 단계; 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉된 상기 적어도 하나의 덤벨 주형상에서 회전환 복제를 수행하여 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 및 상기 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 검출하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 검출하는 단계는 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형의 서열분석으로 이루어진다.
본 발명의 다른 실시형태는 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형의 검출 방법이다. 상기 방법은 적어도 하나의 DNA 분자를 단편화시켜 적어도 하나의 단편화된 DNA 분자를 형성시키는 단계; 하나 이상의 헤어핀 구조를 상기 적어도 하나의 단편화된 DNA 분자의 각 말단에 연결시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 임의의 비연결된 헤어핀 구조 및 임의의 비연결된 단편화된 핵산 분자를 엑소뉴클레아제로 처리하여 상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 정제하는 단계; 상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머는 적어도 하나의 기질에 부착되어 있는, 단계; 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉된 상기 적어도 하나의 덤벨 주형상에서 회전환 복제를 수행하여 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 및 상기 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 검출하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 검출하는 단계는 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형의 서열분석으로 이루어진다.
특정 실시형태에서, 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 검출하는 단계는 상기 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 올리고뉴클레오타이드 프로브와 접촉시킴을 포함한다. 특정 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 프로브는 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브이다. 특정 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 프로브는 표지된 DNA 프로브이다. 특정 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 프로브는 형광체에 부착된다.
본 발명의 다른 실시형태는 적어도 하나의 증폭된 DNA 분자의 검출 방법이다. 상기 방법은 적어도 하나의 DNA 분자를 단편화시켜 적어도 하나의 단편화된 DNA 분자를 형성시키는 단계; 하나 이상의 헤어핀 구조를 상기 적어도 하나의 단편화된 DNA 분자의 각 말단에 연결시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머는 적어도 하나의 기질에 부착되어 있는, 단계; 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉된 상기 적어도 하나의 덤벨 주형상에서 회전환 증폭을 수행하여 적어도 하나의 증폭된 DNA 분자를 형성시키는 단계; 및 적어도 하나의 증폭된 DNA 분자를 검출하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 적어도 하나의 증폭된 DNA 분자를 검출하는 단계는 적어도 하나의 증폭된 DNA 분자의 서열분석으로 이루어진다.
특정 실시형태에서, 적어도 하나의 증폭된 DNA 분자를 검출하는 단계는 상기 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 올리고뉴클레오타이드 프로브와 접촉시킴을 포함한다. 특정 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 프로브는 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브이다. 특정 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 프로브는 표지된 DNA 프로브이다. 특정 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 프로브는 형광체에 부착된다.
본 발명의 다른 실시형태는 적어도 하나의 DNA 분자의 복제 방법이다. 상기 방법은 적어도 하나의 DNA 분자를 샘플로부터 단리시키는 단계; 적어도 하나의 DNA 분자를 단편화시켜 적어도 하나의 단편화된 DNA 분자를 형성시키는 단계; 하나 이상의 헤어핀 구조를 상기 적어도 하나의 단편화된 DNA 분자의 각 말단에 연결시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머는 적어도 하나의 기질에 부착되어 있는, 단계; 및 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉된 상기 적어도 하나의 덤벨 주형상에서 회전환 복제를 수행하여 적어도 하나의 복제된 DNA 분자를 형성시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태는 적어도 하나의 DNA 분자의 증폭 방법이다. 상기 방법은 적어도 하나의 DNA 분자를 샘플로부터 단리시키는 단계; 적어도 하나의 DNA 분자를 단편화시켜 적어도 하나의 단편화된 DNA 분자를 형성시키는 단계; 하나 이상의 헤어핀 구조를 상기 적어도 하나의 단편화된 DNA 분자의 각 말단에 연결시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머는 적어도 하나의 기질에 부착되어 있는, 단계; 및 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉된 상기 적어도 하나의 덤벨 주형상에서 회전환 증폭을 수행하여 적어도 하나의 증폭된 DNA 분자를 형성시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태는 적어도 하나의 DNA 분자의 복제 방법이다. 상기 방법은 적어도 하나의 DNA 분자를 샘플로부터 단리시키는 단계; 하나 이상의 헤어핀 구조를 상기 적어도 하나의 DNA 분자의 각 말단에 연결시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머는 적어도 하나의 기질에 부착되어 있는, 단계; 및 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉된 상기 적어도 하나의 덤벨 주형상에서 회전환 복제를 수행하여 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 형성시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태는 적어도 하나의 DNA 분자의 증폭 방법이다. 상기 방법은 적어도 하나의 DNA 분자를 샘플로부터 단리시키는 단계; 하나 이상의 헤어핀 구조를 상기 적어도 하나의 DNA 분자의 각 말단에 연결시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머는 적어도 하나의 기질에 부착되어 있는, 단계; 및 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉된 상기 적어도 하나의 덤벨 주형상에서 회전환 증폭을 수행하여 적어도 하나의 증폭된 DNA 분자를 형성시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태는 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형의 검출 방법이다. 상기 방법은 적어도 하나의 핵산 분자를 단편화시켜 적어도 하나의 단편화된 핵산 분자를 형성시키는 단계; 하나 이상의 헤어핀 구조를 상기 적어도 하나의 단편화된 핵산 분자의 각 말단에 연결시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 임의의 비연결된 헤어핀 구조 및 임의의 비연결된 단편화된 핵산 분자를 엑소뉴클레아제로 처리하여 상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 정제하는 단계; 상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 적어도 2개의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머는 적어도 하나의 기질에 부착되어 있는, 단계; 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉된 상기 적어도 하나의 덤벨 주형상에서 회전환 증폭을 수행하여 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 및 상기 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태는 적어도 하나의 핵산 분자의 증폭 방법이다. 상기 방법은 적어도 하나의 핵산 분자를 샘플로부터 단리시키는 단계; 하나 이상의 헤어핀 구조를 상기 적어도 하나의 핵산 분자의 각 말단에 연결시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 임의의 비연결된 헤어핀 구조 및 임의의 비연결된 단편화된 핵산 분자를 엑소뉴클레아제로 처리하여 상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 정제하는 단계; 상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 적어도 2개의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머는 적어도 하나의 기질에 부착되어 있는, 단계; 및 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉된 상기 적어도 하나의 덤벨 주형상에서 회전환 증폭을 수행하여 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 형성시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 실시형태는 또한, 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드; 헤어핀 구조를 샘플로부터의 적어도 하나의 핵산 분자에 연결시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키기 위한 리가제; 임의의 비연결된 헤어핀 구조 및 임의의 비연결된 핵산 분자를 분해시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 정제하기 위한 엑소뉴클레아제; 및 적어도 하나의 덤벨 주형을 복제하여 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 형성시키기 위한 폴리머라제 및 적어도 하나의 덤벨 주형의 한 영역에 실질적으로 상보적인 적어도 하나의 프라이머를 함유하는 키트를 포함한다.
본 발명의 특정 실시형태는 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드; 헤어핀 구조를 샘플로부터의 적어도 하나의 핵산 분자에 연결시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키기 위한 리가제; 임의의 비연결된 헤어핀 구조 및 임의의 비연결된 핵산 분자를 분해시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 정제하기 위한 엑소뉴클레아제; 및 적어도 하나의 덤벨 주형을 복제하여 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 형성시키기 위한 레플리솜 및 적어도 하나의 덤벨 주형의 한 영역에 실질적으로 상보적인 적어도 하나의 프라이머를 함유하는 키트를 포함한다.
본 발명의 특정 실시형태는 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드; 헤어핀 구조를 샘플로부터의 적어도 하나의 핵산 분자에 연결시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키기 위한 리가제; 임의의 비연결된 헤어핀 구조 및 임의의 비연결된 핵산 분자를 분해시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 정제하기 위한 엑소뉴클레아제; 및 적어도 하나의 덤벨 주형을 증폭시켜 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 형성시키기 위한 폴리머라제 및 적어도 하나의 덤벨 주형의 적어도 2개의 영역에 실질적으로 상보적인 적어도 2개의 프라이머를 함유하는 키트를 포함한다.
본 발명의 특정 실시형태는 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드; 헤어핀 구조를 샘플로부터의 적어도 하나의 핵산 분자에 연결시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키기 위한 리가제; 임의의 비연결된 헤어핀 구조 및 임의의 비연결된 핵산 분자를 분해시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 정제하기 위한 엑소뉴클레아제; 및 적어도 하나의 덤벨 주형을 증폭시켜 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 형성시키기 위한 레플리솜 및 적어도 하나의 덤벨 주형의 적어도 2개의 영역에 실질적으로 상보적인 적어도 2개의 프라이머를 함유하는 키트를 포함한다.
본 발명의 특질 및 이점 뿐만 아니라 명백해질 수 있는 다른 것들이 보다 상세히 이해될 수 있는 방식으로, 본 발명의 실시형태는 본 명세서의 일부분을 형성하는 첨부된 도면에 예시되어 있는 실시형태를 참조로 하여 보다 상세히 설명될 수 있다. 그러나, 도면은 본 발명의 다양한 실시형태를 단지 예시할 뿐이며, 따라서 다른 효과적 실시형태도 마찬가지로 포함할 수 있으므로 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다는 것 또한 주지되어야 한다.
도 1은 본 발명의 실시형태에 따른 덤벨 주형의 예시적 회전환 복제 방법의 도식이다.
도 2는 본 발명의 실시형태에 따른 덤벨 주형으로부터 생성된 회전환 생성물의 아가로스 겔 분석의 영상이다.
도 3은 본 발명의 실시형태에 따른 덤벨 주형의 예시적 회전환 복제 방법의 도식이다.
도 4는 본 발명의 실시형태에 따라 생성된 덤벨 주형 및 이의 회전환 생성물의 아가로스 겔 분석의 영상이다.
도 5는 본 발명의 실시형태에 따라 생성된 덤벨 주형 및 이의 회전환 생성물의 아가로스 겔 분석의 영상이다.
도 6은 본 발명의 실시형태에 따라 생성된 덤벨 주형의 아가로스 겔 분석의 영상이다.
도 7은 본 발명의 실시형태에 따라 생성된 덤벨 주형의 아가로스 겔 분석의 영상이다.
도 8은 본 발명의 실시형태에 따라 생성된 회전환 생성물의 아가로스 겔 분석의 영상이다.
도 9는 본 발명의 실시형태에 따라 생성된 회전환 생성물의 아가로스 겔 분석의 영상이다.
도 10은 본 발명의 실시형태에 따른, 형광에 의한 헤어핀 구조 검출을 입증하는 그래프이다.
도 11a 및 11b는 본 발명의 특정 실시형태에 따른 예시적 장치의 영상이다.
본 발명의 실시형태를 상세히 설명하기에 앞서, 본 발명의 실시형태의 맥락에서 사용되는 몇몇 용어들을 정의할 것이다. 이러한 용어들 이외에, 다른 용어들은 필요에 따라 본 명세서의 다른 곳에서 정의된다. 본원에서 명백히 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 기술 용어들은 당업계에서 인정된 의미를 가질 것이다.
본 발명을 보다 용이하게 이해하도록 하기 위해, 본원에서 사용되는 용어들의 의미는 다양한 용어들의 통상의 용법 및 하기 제공된 명료한 정의를 고려하여 본 명세서의 맥락으로부터 명백해질 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "포함하다 또는 포함하는(comprise or comprising)", "함유하다 또는 함유하는(contain or containing)", "포괄하다 또는 포괄하는(include or including)" 및 "와 같은(such as)" 이란 용어들은 열린 비제한적 의미로 사용된다.
"증폭된 덤벨 주형(Amplified dumbbell template)"은 회전환 증폭의 결과로서 표적 서열의 다수의 카피를 야기하는 하나 이상의 헤어핀 구조를 함유하는 핵산 분자를 의미한다.
"접촉"은 물질이 다른 물질과의 상호작용을 촉진하는 임의의 방식에 의해 도입되는 과정을 의미한다. 예를 들면, 제한 없이, 덤벨 주형은 하나 이상의 하이브리드화 과정을 촉진하는 하나 이상의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉되어, 회전환 복제 또는 회전환 증폭에 참여할 수 있는 하나 이상의 이중 가닥 이중체(duplex) 영역을 형성시킬 수 있다.
"핵산 분자를 검출하다"란, 관심대상의 핵산의 존재를 결정할 수 있거나 핵산 서열에 관한 보다 상세한 정보, 참조 서열과 비교할 때 핵산 서열의 변경 또는 핵산 서열의 하나 이상의 카피의 존재 또는 부재를 결정할 수 있는 분석 방법을 사용하는 것을 의미한다.
"덤벨 주형"은 하나 이상의 헤어핀 구조를 갖는, 구조적으로 선형이고 위상적으로 환상인 시험관내 복제 가능(competent) 또는 시험관내 증폭 가능 핵산 분자를 의미한다. 변성되거나 실질적으로 변성될 경우, 덤벨 주형은 환상의 단일 가닥 핵산 분자로서 존재한다. 덤벨 주형은 생체내 복제 가능한 환상의 이중 가닥 DNA, 예를 들면, 제한 없이 클로닝 벡터 기술의 도움으로 생성되는 플라스미드, 코스미드, 포스미드, 세균 인공 염색체 및 효모 인공 염색체와는 별개의 것이다. 적절한 숙주 세포에서 독립적으로 복제하는 이러한 환상의 이중 가닥 DNA와 달리, 덤벨 주형은 이러한 숙주 세포에서의 증식 복제를 필요로 하지 않는다.
"단편화된 핵산 분자(들)의 말단(들)"은 연결 반응에 참여할 수 있거나 참여할 수 있도록 만들어질 하나 이상의 말단 뉴클레오타이드 잔기를 의미한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 핵산 분자는, 하나 이상의 헤어핀 구조를 이 핵산 분자의 각 말단에 부착시키는 연결 반응을 할 수 있거나 이러한 연결 반응을 할 수 있도록 만들어질 기능적 말단을 함유할 수 있다. 예를 들면, 제한 없이, 5'-말단 뉴클레오타이드는 포스페이트 그룹을 함유하고 3'-말단 뉴클레오타이드는 하이드록실 그룹을 함유한다.
"단편화된 핵산 분자"는 단편화 과정으로부터 야기되는 임의의 보다 작은 핵산 분자가 되는 임의의 보다 큰 핵산 분자를 의미한다.
"단편화"는 화학적 또는 생화학적 제제를 이용하는 서열-비의존적 방식(즉, 무작위적) 또는 서열-특이적 방식의 핵산 분자 파괴를 의미한다. 예를 들면, 핵산은, DNase I, 엔도뉴클레아제 V 또는 트랜스포사제를 사용하는 효소적 방법에 의해 전단, 초음파처리 또는 분무와 같은 물리적 방법(후자는 핵산 용액을 작은 구멍을 통해 통과시킨다)을 사용하거나 기계적 힘, 예를 들면, 제한 없이 음향 방법 및 특히 적응성 집중된 음향 방법을 사용하여 무작위적으로 단편화시킬 수 있다. 무작위적 핵산 단편은 무작위적 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 제조할 수 있다. 핵산은 또한 예를 들면, 제한 없이, 제한 엔도뉴클레아제 및 다중 PCR(multiplex PCR)을 사용하여 서열-특이적 방법에 의해서 단편화시킬 수 있다. 보다 큰 핵산 분자 또는 분자들의 단편화 과정으로부터 유래된 단편들의 집합은 라이브러리로서 지칭된다.
"헤어핀 구조"는 핵산 분자 내의 2개 이상의 부분적 서열이 서로에 대해 상보적이거나 실질적으로 상보적이여서 부분적으로 이중가닥인 영역과 하나 이상의 내부 단일가닥 영역을 형성하게 되는 핵산 분자를 의미한다. 헤어핀 구조는 또한 2개 이상의 핵산 분자가 링커에 의해 함께 결합되고 2개 이상의 핵산 분자의 2개 이상의 부분적 서열이 서로에 대해 상보적이거나 실질적으로 상보적이여서 부분적으로 이중가닥인 영역과 하나 이상의 내부 단일가닥 영역을 형성하게 되는 2개 이상의 핵산 분자를 함유할 수 있다.
"핵산 분자의 단리"는 핵산 분자가 샘플로부터 수득되도록 하는 과정을 의미한다.
"연결제"는 천연 핵산 골격 구조, 변형된 핵산 골격 구조 및 이들의 두 골격 구조의 조합을 야기하는, 효소적 제제, 예를 들면, 제한 없이 DNA 또는 RNA 리가제 또는 화학적 제제, 예를 들면, 제한 없이 수용성 카보디이미드 또는 브롬화시아노겐을 사용하는 축합 반응 뿐만 아니라 자동화 DNA 합성 기술과 연관된 표준 관행에 의한 2개 이상의 핵산 분자의 공유결합을 의미한다. 천연 핵산 골격 구조는, 예를 들면, 제한 없이 뉴클레오타이드 잔기들 간의 하나 이상의 표준 포스포디에스테르 연결로 구성된다. 변형된 핵산 골격 구조는, 예를 들면, 제한 없이 비-브릿징 산소원자의 질소원자로의 치환(즉, 포스포르아미데이트 연결) 또는 황 원자로의 치환(즉, 포스포로티오에이트 연결), 브릿징 산소원자의 황원자로의 치환(즉, 포스포로티올레이트), 포스포디에스테르 결합의 펩타이드 결합으로의 치환(즉, 펩타이드 핵산 또는 PNA)과 같은 하나 이상의 변형된 포스포디에스테르 연결, 또는 리보스 당의 2'-산소와 4'-탄소 간에 추가 결합을 갖는 하나 이상의 추가 공유결합의 형성(즉, 잠김 핵산(locked nucleic acid) 또는 LNA)으로 구성된다. 변형된 연결은 모두 한가지 유형의 변형 또는 2가지 이상의 변형 유형의 임의의 조합의 것일 수 있고, 추가로 하나 이상의 표준 포스포디에스테르 연결을 포함할 수 있다.
"링커"는 2개의 다른 핵산 분자들 간에 공유결합된 분자 브릿지로서 작용하는 하나 이상의 이가 그룹(연결 구성원)을 의미한다. 링커는 하나 이상의 연결 구성원 및 하나 이상의 유형의 연결 구성원을 함유할 수 있다. 예시적 연결 구성원은 -C(O)NH-, -C(O)O-, -NH-, -S-, -S(O)n-(여기서, n은 0, 1 또는 2이다), -O-, -OP(O)(OH)O-, -OP(O)(O-)O-, 알칸디일, 알켄디일, 알킨디일, 아렌디일, 헤테로아렌디일 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 링커는 펜던트 측쇄 또는 펜던트 작용 그룹(또는 둘 다)를 갖는다. 펜던트 모이어티는 친수성 변형제(modifier)(즉, 링커의 수용해도 특성을 증가시키는 화학 그룹), 예를 들면, 제한 없이 -SO3H, -SO3 -, CO2H 또는 CO2 -와 같은 가용화 그룹일 수 있다.
"핵산 분자"는 표준 정규 염기, 과변형된 염기, 비천연 염기 또는 이들 염기들의 임의의 조합을 포함하는 단일가닥 또는 이중가닥 핵산 분자를 의미한다. 예를 들면, 제한 없이 핵산 분자는 4가지의 정규 DNA 염기 - 아데닌, 사이토신, 구아닌 및 티민 또는 4가지의 정규 RNA 염기 - 아데닌, 사이토신, 구아닌 및 우라실을 함유한다. 우라실은 뉴클레오사이드가 2'-데옥시리보스 그룹을 함유할 경우 티민 대신에 대체될 수 있다. 핵산 분자는 RNA로부터 DNA로 및 DNA로부터 RNA로 변형될 수 있다. 예를 들면, 제한 없이 mRNA는 역전사효소를 사용하여 DNA(cDNA)에 상보적으로 생성시킬 수 있고, DNA는 RNA 폴리머라제를 사용하여 RNA로 생성시킬 수 있다. 핵산 분자는 또한 하나 이상의 과변형된 염기, 예를 들면, 제한 없이, 5-하이드록시메틸우라실, 5-하이드록시우라실, α-푸트레시닐티민, 5-하이드록시메틸사이토신, 5-하이드록시사이토신, 5-메틸사이토신, N 4-메틸사이토신, 2-아미노아데닌, α-카바모일메틸아데닌, N 6-메틸아데닌, 이노신, 크산틴, 하이포크산틴, 2,6-디아민푸린 및 N 7-메틸구아닌을 함유할 수 있다. 핵산 분자는 또한 하나 이상의 비천연 염기, 예를 들면, 제한 없이, 7-데아자-7-하이드록시메틸아데닌, 7-데아자-7-하이드록시메틸구아닌, 이소사이토신(이소C), 5-메틸이소사이토신 및 이소구아닌(이소G)을 함유할 수 있다. 오직 정규, 과변형된, 비천연 염기 또는 이들 염기의 임의의 조합만을 함유하는 핵산 분자는, 예를 들면, 제한 없이 뉴클레오타이드 잔기들 간의 각 연결이 표준 포스포디에스테르 연결로 구성될 수 있고 또한 하나 이상의 변형된 연결, 예를 들면, 제한 없이 비-브릿징 산소원자의 질소원자로의 치환(즉, 포스포르아미데이트 연결), 황 원자로의 치환(즉, 포스포로티오에이트 연결) 또는 알킬 또는 아릴 그룹으로의 치환(즉, 알킬 또는 아릴 포스포네이트), 브릿징 산소원자의 황원자로의 치환(즉, 포스포로티올레이트), 포스포디에스테르 결합의 펩타이드 결합으로의 치환(즉, 펩타이드 핵산 또는 PNA) 또는 리보스 당의 2'-산소와 4'-탄소 간에 추가 결합을 갖는 하나 이상의 추가 공유결합의 형성(즉, 잠김 핵산 또는 LNA)을 함유할 수 있다. "2'-데옥시리보핵산 분자"란 용어는 "핵산 분자"란 용어와 동일한 것을 의미하나, 2'-데옥시리보스 그룹의 2'-탄소원자가 적어도 하나의 수소원자를 함유한다는 제약이 있다. "리보핵산 분자"란 용어는 "핵산 분자"란 용어와 동일한 것을 의미하나, 리보스 그룹의 2'-탄소원자가 적어도 하나의 하이드록실 그룹을 갖는다는 제약이 있다.
"핵산 서열"은 핵산 분자에 존재하는 정규 염기, 과변형된 염기, 비천연 염기 또는 이들 염기의 임의의 조합의 순서를 의미한다.
"수행"은 화학적 또는 생화학적 반응이 일어나서 목적하는 생성물을 수득할 수 있도록 하는 모든 필수적 성분, 시약 및 조건을 제공하는 것을 의미한다.
"정제"는 소정의 혼합물의 목적하는 성분들로부터 실질적으로 모든 원치않는 성분들을 분리시키는 것을 의미한다. 예를 들면, 제한 없이 덤벨 주형의 정제는 임의의 소정의 크기 범위에 대해 성공적으로 연결되지 않아 덤벨 주형을 형성하지 않은 원치않는 핵산 분자를 제거하는 방법을 지칭한다.
"복제된 덤벨 주형"은 회전환 복제의 결과로서 표적 서열의 다수 카피를 야기하는 하나 이상의 헤어핀 구조를 함유하는 하나의 핵산 분자를 의미한다.
"회전환 증폭" 또는 "RCA"는 출발 핵산 분자의 보다 많은 카피를 제조하기 위해 본래 덤벨 주형 이외에도 카피된 핵산 분자들이 후속적 증폭 라운드에서 주형으로서 작용하는, 하나 이상의 프라이머를 사용하는 생화학적 과정을 의미한다.
"회전환 복제" 또는 "RCR"은 출발 핵산 분자의 보다 많은 카피를 제조하기 위해 카피된 핵산 분자들이 후속적 복제 라운드에서 주형으로서 작용하지 않는, 하나 이상의 프라이머를 사용하는 생화학적 과정을 의미한다. 특정 실시형태에서, 덤벨 주형이 양(+)의 가닥일 경우, 회전환 복제는 보다 많은 음(-)의 가닥 카피를 생성시킨다. 특정 실시형태에서, 덤벨 주형이 음(-)의 가닥일 경우, 회전환 복제는 보다 많은 양(+)의 가닥 카피를 생성시킨다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 복제는 출발 핵산 분자의 보다 많은 카피를 제조하기 위해 후속적 증폭 라운드에서 카피된 핵산을 사용하는 증폭과는 별개의 것이다.
"샘플"은 관심대상의 핵산 분자를 함유하는 생물학적 샘플 또는 합성에 의해 생성된 공급원으로부터 수득된 물질을 의미한다. 특정 실시형태에서, 샘플은 데이터 또는 정보를 얻고자 하는 목적하는 핵산을 함유하는 생물학적 물질이다. 샘플은 표적 핵산 분자를 함유하는 것으로 의심되는 적어도 하나의 세포, 태아 세포, 세포 배양물, 조직 표본, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 소변, 누액, 질 분비물, 땀, 림프액, 뇌척수액, 점막 분비물, 복막액, 복수액, 대변, 신체 삼출물, 제대혈, 융모막 융모, 양수, 배아 조직, 다세포 배아, 용해물, 추출물, 용액 또는 반응 혼합물을 포함할 수 있다. 샘플은 또한 비-사람 영장류, 설치류 및 기타 포유동물, 바이러스, 세균 및 진균을 포함하는 병원성 종과 같은 비-사람 공급원을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 샘플은 또한 혈액, 물, 공기, 토양, 식품 중에서의 사람 및 비-사람 종 뿐만 아니라 병원성 종의 검출 및 어떠한 사전 지식도 없는 샘플 중의 모든 유기체의 동정을 위한 환경적 공급원으로부터의 단리를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 샘플은 분해되는 핵산 분자를 함유할 수 있다. 핵산 분자는 전단력과 같은 물리적 힘, 열 또는 자외선광과 같은 가혹한 환경, 임상 또는 법의학적 분석에서 이용될 수 있는 것과 같은 화학적 분해 과정, 미생물 또는 수명으로 인한 생물학적 분해 과정, 정제 또는 단리 기술 또는 이들의 조합에의 노출로부터 초래되는 닉(nick), 갈라진틈(break) 또는 변형을 가질 수 있다.
"서열분석"은 복제된 덤벨 주형 또는 증폭된 덤벨 주형으로부터의 뉴클레오타이드의 순서를 동정할 수 있는 임의의 생화학적 방법을 의미한다.
"실질적으로 상보적인 프라이머"는, 비록 이중체 영역 내의 핵산 서열의 하나 이상의 염기가 다른 핵산 서열과 염기-쌍(들)을 형성하지 않더라도, 다른 핵산 분자와 함께 안정한 이중가닥 이중체를 형성하는 핵산 분자를 의미한다.
단일가닥 및 이중가닥 핵산 분자의 기본 구조는 염기쌍 상호작용에 의해 좌우된다. 예를 들면, 2개의 대향 가닥상의 상보적인 또는 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드들 간의 염기쌍 형성은 이 2개의 가닥이 서로를 휘감아서 이중-헬릭스 구조를 형성하도록 할 것이다. 이것은 2개 이상의 핵산 분자 가닥의 상보적인 뉴클레오타이드들의 분자간 염기쌍 형성으로 지칭된다. "뉴클레오타이드"란 용어는 본 발명에서 당, 염기 및 하나 이상의 포스페이트 그룹으로 구성된 단위로서 광범위하게 정의되며, 여기서, 당은, 예를 들면, 제한 없이 리보스, 리보스 그룹의 하나 이상의 원자에 부착된 추가 화학 그룹을 갖는 변형된 리보스, 2'-데옥시리보스 또는 2'-데옥시리보스 그룹의 하나 이상의 원자에 부착된 추가 화학 그룹을 갖는 변형된 2'-데옥시리보스로 구성되며, 염기는, 예를 들면, 제한 없이 상기 핵산 분자 정의에서 기재한 바와 같은 정규 염기, 과변형된 염기 또는 비-천연 염기로 구성된다. 상보적인 뉴클레오타이드 또는 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드의 염기쌍 형성은 또한 동일한 DNA 가닥 분자상에서도 일어날 수 있으며, 상보적인 뉴클레오타이드 또는 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드의 분자내 염기쌍 형성으로서 지칭된다.
헤어핀 구조는 스템-루프(stem-loop) 구조를 형성할 수 있는 소정의 핵산 분자의 상보적인 뉴클레오타이드 또는 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드의 분자내 염기쌍 형성에 의해 형성될 수 있다. 헤어핀 구조의 스템 부분은 이중가닥 헬릭스 스트레치를 형성하는 상보적인 뉴클레오타이드 또는 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열의 하이브리드화에 의해 형성된다. 헤어핀 구조의 루프 영역은 쌍을 이루어지 않은 뉴클레오타이드 서열 스트레치의 결과이다. 헤어핀 구조의 안정성은 스템 영역의 길이, 핵산 서열 조성 및 염기쌍 상보성 또는 실질적 상보성 정도에 의존한다. 예를 들면, 5개의 상보적인 뉴클레오타이드의 스트레치는 3개의 상보적인 뉴클레오타이드의 스트레치보다 더 안정한 것으로 간주될 수 있거나, 주로 구아닌과 사이토신으로 구성된 상보적인 뉴클레오타이드의 스트레치는 주로 아데닌과 티민(DNA) 또는 우라실(RNA)로 구성된 상보적인 뉴클레오타이드의 스트레치보다 안정한 것으로 간주될 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드는 이중가닥 스템 영역의 안정성을 변경하기 위해 이들 천연 염기를 대체할 수 있으며, 이의 예는 이노신, 크산틴, 하이포크산틴, 2,6-디아민푸린, N 6-메틸아데닌, 5-메틸사이토신, 7-데아자푸린, 5-하이드록시실메틸피리미딘을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 변형된 뉴클레오타이드는 또한 RNA 종에서 발견되는 수많은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 천연발생 스템-루프 구조는 전달 RNA(tRNA), 프리-마이크로RNA(pre-microRNA), 리보자임 및 이들의 등가물과 같은 RNA 종에서 주로 발견된다.
핵산 헤어핀 구조는 합성 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 방법을 사용하여 의도된 디자인으로 생성시킬 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 DNA 서열분석 및 PCR용 프라이머로서, 스크리닝 및 검출 실험용 프로브로서 및 클로닝 목적용 링커 또는 어댑터로서 광범위하게 사용된다. 15개 내지 25개 뉴클레오타이드의 범위의 짧은 올리고뉴클레오타이드는 정제 없이 직접 사용될 수 있다. 단계적 수율이 100% 미만일 때, 보다 긴 올리고뉴클레오타이드는 n-1, n-2 등 생성물로서도 공지된 불량 올리고뉴클레오타이드 분획을 제거하기 위해 고성능 액체 크로마토그래피 또는 HPLC 또는 분취용 겔 전기영동에 의한 정제를 필요로 한다. 특정 실시형태에서, 핵산 헤어핀는 대략적으로 약 100개 염기이다.
실험의 성질에 따라서, 소정의 헤어핀 구조는, 본원에 논의된 바와 같은 하나 이상의 과변형된 또는 비-천연 염기 및/또는 하나 이상의 골격 연결을 치환시키거나 7-데아자-7-하이드록시푸린, 이소C 및 이소G 또는 이들의 등가물과 같은 다른 합성 염기를 포함시키는 것 뿐만 아니라 예를 들면, 제한 없이 RNA-DNA,PNA)-DNA, PNA-RNA, PNA-PNA, LNA-DNA, LNA-RNA, LNA-LNA 이중가닥 이중체를 생성시킴으로써 이중가닥 이중체의 목적하는 안정도를 함유하도록 디자인할 수 있다. 합성적으로 디자인된 헤어핀 구조는 몇몇 분자생물학 기술에서, 예를 들면, 제한 없이, 헤어핀을 DNA 단편의 각 말단에 연결시키고 관심대상의 서열을 동정하기 위한 프로브로서 모이어티를 검출하고 선형 단편으로부터 위상적 환상 DNA 분자를 생성시킴으로써 DNA 폴리머라제를 위한 프라이밍 부위로서 유용하다. 특정 실시형태에서, 연결제를 사용하는 하나 이상의 단편화된 핵산 분자의 말단에의 효과적 연결을 촉진하기 위해, 하나 이상의 헤어핀 구조의 5'-말단을 예를 들면, 제한 없이 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제를 사용하여 인산화시킬 것이다.
특정 실시형태에서, 증폭된 또는 복제된 덤벨 주형은 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 검출할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 프로브는 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브일 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 프로브는 표지된 DNA 프로브일 수 있다. 특정 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드 프로브는 형광체, 발색단, 방사성 동위원소, 효소 또는 발광 화합물 또는 이들의 조합 중 하나 이상에 부착될 수 있다.
특정 헤어핀 구조는 올리고뉴클레오타이드 프로브로서도 사용되었다. 분자 비컨(molecular beacon)으로서도 공지된 특정 DNA 프로브는 서로에 대해 상보적인 2개의 말단과 함께 내부 프로브 서열을 함유하도록 디자인된 올리고뉴클레오타이드이다. 적절한 조건 하에, 말단들은 함께 하이브리드화하여 스템-루프 구조를 형성한다. 프로브 서열은 분자 비컨의 루프 부분 내에 함유되고 스템 암(stem arm)과 무관한다. 스템상의 한쪽 말단에 형광 염료가 부착되고 스템의 나머지 말단에 비형광성 소광(quenching) 모이어티 또는 "소광제(quencher)"가 부착된다. 스템-루프 입체배치에서, 하이브리드화된 암은 형광성 염료와 소광제가 인접하도록 유지시켜 형광 염료 시그널이 잘 이해된 형광공명 에너지 전이(FRET) 과정에 의해 소광되도록 한다. 루프 구조 내의 프로브 서열이 이의 목표 표적 서열을 찾아내어 하이브리드화할 경우, 스템 구조는 보다 길고 보다 안정한 프로브-표적 이중체를 위해 파괴된다. 프로브 하이브리드화는 형광 염료와 소광제의 분리를 초래하고(즉, 이때 인접성이 상실된다), 여기서, 염료는 검출제의 적절한 여기 공급원에 노출될 경우 형광성일 수 있다. 분자 비컨은 대립형질 차이를 판별하기 위해 실시간-PCR과 같은 수많은 분자생물학 기술에서 사용되었다.
특정 실시형태에서, 헤어핀 구조는, 후속적으로 결합되어 단일 헤어핀 구조를 형성하는 2개 이상의 핵산 분자에 의해 생성시킬 수 있다. 2개 이상의 핵산 분자를 연결 시약을 사용하여 함께 결합시켜 헤어핀 구조를 형성할 수 있다. 또한, 2개 이상의 핵산 분자를 링커를 사용하여 화학적으로 결합시켜 헤어핀 구조를 형성시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 연결제를 사용하는 하나 이상의 단편화된 핵산 분자의 말단에의 효과적 연결을 촉진하기 위해, 하나 이상의 헤어핀 구조의 5'-말단을 예를 들면, 제한 없이 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제를 사용하여 인산화시킬 것이다.
특정 실시형태에서, 기능상 중요한 정보는 헤어핀 구조의 스템 영역에 존재할 수 있다. 특정 실시형태에서, 기능상 중요한 정보는 헤어핀 구조의 루프 영역에 존재할 수 있다. 기능상 중요한 정보는 예를 들면, 제한 없이 시험관내 복제, 시험관내 증폭, 고유한 식별(즉, 바코드) 및 검출을 위해 필수적인 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 기능상 중요한 정보가 헤어핀 구조의 스템 영역에 존재할 경우, 스템 영역의 길이는 4개 또는 6개 염기쌍만큼 짧을 수 있다. 특정 실시형태에서, 기능상 중요한 정보가 헤어핀 구조의 스템 영역에 존재할 경우, 루프 영역의 길이는 1개 또는 2개 염기만큼 짧을 수 있다.
메이트-쌍(mate-pair) 주형 라이브러리는, 2-kb와 같은 소정의 크기에 대해 선별된 전단된 게놈 DNA를 환화시켜 이미 서로 원거리에 있는 말단들을 인접하도록 함으로써 제조한다. 이어서, 환을 기계적 또는 물리적 수단에 의해 선형 DNA 단편으로 절단한다. 접합 단편으로서 지칭되는, 연결된 원거리 말단을 함유하는 이러한 DNA 단편을 사용하여 메이트-쌍 주형을 생성시킨다. "접합 단편"은 보다 큰 DNA 분자의 원거리 말단과 함께 선별 마커를 함유하는 DNA 분자이며, 먼저 DNA 환을 제조하고 이 DNA 환을 단편화시키고 선별 마커를 함유하는 단편을 선별함으로써 생성되었다.
예를 들면, 제한 없이, 환의 생성 방법은 고분자량 게놈 DNA를 Mbo I와 같은 제한 엔도뉴클레아제로 부분적으로 분해시키는 것을 수반한다. 기타 공지된 4-, 6- 또는 8-염기 "커터" 또는 등가물이 사용될 수도 있다. 소형 선별 마커와 조합된 매우 낮은 농도의 DNA 단편들을 함께 연결시켜 공유 DNA 환을 생성시킨다. 이에 따라, 환상 DNA 단편의 원거리 말단 둘 다에 의해 플랭킹된(flanked) 선별 마커를 갖는 환상 DNA 분자가 생성된다. 접합 단편의 라이브러리는 DNA 환을 EcoRI와 같은 상이한 제한 엔도뉴클레아제로 분해시킨 다음, 이러한 원거리 말단에 의해 플랭킹된 마커 단편을 선별하여 생성시킨다. 접합 단편 라이브러리는 유전자 및 물리적 맵핑 실험 뿐만 아니라 서열분석 적용에서 사용된다.
보다 일반적 관점에서, "분자간" 연결 이벤트(즉, 연쇄체로서 지칭되는 2개 이상의 핵산 분자의 결합)보다 "분자내" 연결 이벤트(즉, 동일 핵산 분자의 DNA 환)를 선호하는 연결 단편들의 비를 최적화할 때 몇몇 인자들이 고려되어야 한다. 상기 비는 2개의 매개변수에 의해 좌우된다: 동일 분자의 다른 말단이 경험한 한 분자의 한 말단의 유효 국소 몰 농도(j) 및 모든 다른 DNA 분자들의 말단들의 몰 농도(i). 매개변수 j는 하기 제이콥슨-스톡마이어(Jacobson-Stockmayer) 방정식으로부터 결정될 수 있다:
j = 3.55 x 10-8 M/kb3 /2(여기서, kb는 핵산 분자의 길이(킬로베이스-쌍(kpb) 단위)이다). 소정의 연결 반응에서, 분자내 이벤트의 비율은 j/(i+j)의 비에 의해 결정된다. 즉, 분자내 환을 생성시키는데 있어 합당한 효율을 달성하기 위해, 보다 큰 핵산 분자는 보다 작은 핵산 분자와 비교해 추가 희석되어야한다. 선별 마커가 분자내 연결 동안 합당한 가능성으로 혼입되도록 하기 위해, 이의 몰 농도는 대략 j와 동등해야 한다. 그러나, 심지어 매우 희석된 연결 조건하에서도, 분자간 연결 종을 형성할 가능성이 여전히 존재하여 2개 이상의 핵산 분자의 분자내 환과 선형 연쇄체의 혼합물이 생성될 것이다. (a) 보다 작은 핵산 분자로 파괴하지 않으면서 매우 큰 핵산 분자를 생성시키고 취급하고, (b) 접합 단편이 증대되도록 적절한 선별 마커를 동정하고 (c) 완전한 대표적 핵산 라이브러리를 생성시키는데 있어서 다량의 출발 핵산 물질을 필요로 하는 것을 포함하여 큰 환상 핵산 분자를 생성시키는 것과 연관된 몇가지 기술적 문제들이 있다. 당업계에는 펄스장 겔 전기영동과 같은 큰 핵산 분자를 취급하기 위한 익히 확립된 방법이 존재하며, 바이오틴/아비딘 또는 스트렙타비딘 시스템과 같은 접합 단편의 선별을 개선하기 위한 대안전 전략들이 사용되었다. 그러나, 다량의 출발 핵산 물질의 필요와 관련된 문제는 적절하게 다루어지지 않았다. 따라서, 분자내 연결 이벤트의 전략에 의해 핵산 환을 생성시키는 것은, 수술 과정 동안 수득된 생검 샘플 또는 전혈, 혈장 또는 혈청으로부터 수득된 유리 순환 DNA과 같은 제한된 양으로 발생하는 귀중한 생물학적 샘플의 분석을 고려할 때 거의 적용될 수 없다.
핵산을 샘플로부터 단리시키는 수많은 방법들이 있다. 일단 분리되면, 하나 이상의 핵산 분자는 단편화 과정에 의해 예를 들면, 제한 없이 서열-비특이적 또는 서열-특이적 방식으로 보다 작은 단편으로 파괴될 수 있다. 서열-비특이적 또는 무작위적 단편화 과정은 소정의 관심대상 게놈에 따른 단편화된 핵산 분자의 균일한 또는 실질적으로 균일한 분포를 산출할 것으로 예상된다. 예를 들면, 제한 없이, 1,000,000개의 단편화된 핵산 분자는 동일 크기의 1,000개 위치(즉, 윈도우(windows))에 대해 맵핑될 수 있고, 이때 각 윈도우는 총 1,000개의 맵핑된 단편화된 핵산 분자를 갖는다. 특정 실시형태에서, 소정의 관심대상 게놈을 따른 단편화된 핵산 분자의 균일한 또는 실질적으로 균일한 분포로부터 수득된 데이터는 다른 데이터 유형(예를 들면, 제한 없이 조사 중인 게놈의 소정의 영역의 GC 함량)보다 특정 데이터 유형을 선호하는 편향을 나타낼 수 있다. 특정 실시형태에서, 핵산 분자는 이중가닥 DNA를 비특이적으로 단편화시키는 DNase I를 사용하여 효소적으로 단편화시킨다. 단편화 생성물은 상이한 크기의 5'-인산화된 디-, 트리- 및 올리고뉴클레오타이드이다. DNase I는 Mn2+, Mg2+ 및 Ca2+를 함유하지만 완충액 중에 다른 염은 갖지 않는 완충액 중에서 최적의 활성을 갖는다. DNase I를 이용한 단편화는 전형적으로 Mn2 + 기반 완충액의 존재 하에 사용될 때 평활 말단(blunt-ended) 이중가닥 DNA 단편이 우세한 이중가닥 DNA의 무작위적 분해를 초래한다. 심지어 Mn2 + 기반 완충액 조건의 사용 하에서도, 단편화된 핵산 분자는 단편화된 이중체의 다른 핵산 가닥의 말단을 넘어 뻗어있는, 미지 서열의 하나 이상의 단일가닥 뉴클레오타이드의 5'-돌출 말단(본원에서 "5-말단 오버행(overhang)"으로서 지칭됨) 및 단편화된 이중체의 다른 핵산 가닥의 말단을 넘어 뻗어있는, 미지 서열의 하나 이상의 단일가닥 뉴클레오타이드의 3'-말단 돌출 말단(본원에서 "3-말단 오버행"으로서 지칭됨)을 함유할 수 있다. DNase I 분해 후의 라이브러리의 단편 크기 범위는 몇가지 인자들, 예를 들면, 제한 없이 (i) 반응에서 사용된 DNase I의 양(유닛), (ii) 반응 온도 및 (iii) 반응 시간에 의존한다.
특정 실시형태에서, 핵산 분자는 물리적 또는 기계적 수단을 사용하여 서열-비특이적 방식으로 단편화시킨다. 예를 들면, 제한 없이, 핵산 분자는 이중가닥 핵산 분자를 보다 작은 단편으로 전단하는 분무를 사용하여 단편화시킬 수 있다. 분무 후의 라이브러리의 단편 크기 범위는 몇가지 인자들, 예를 들면, 제한 없이 (i) 분무기에 가해지는 압력 및 (ii) 전단 과정의 시간에 의존한다. 전단된 단편 라이브러리는 평활 말단, 5'-말단 오버행 및 3'-말단 오버행을 포함하는 각종 말단 유형을 함유한다. 무작위적 단편화 방법을 사용하여 단편화된 하나 이상의 핵산 분자의 말단을, 직접 연결제를 사용하여 어댑터에 연결시켜 덤벨 주형을 형성시킬 수 있거나, 덤벨 주형을 연결시킬 수 있도록 만들 수 있다(하기 참조).
샘플로부터 단리된 핵산 분자는 또한 서열-특이적 단편화 과정에 의해 예를 들면, 제한 없이 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 보다 작은 단편으로 파괴시킬 수도 있다. 서열-특이적 단편화 과정은 소정의 관심대상 게놈을 따른 단편화된 핵산 분자의 불균일한 또는 실질적으로 불균일한 분포를 산출할 것으로 예상된다. 전체 게놈 연구의 경우, 게놈 영역의 중요할 수 있는 일부 분획히 낮은 빈도의 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 가질 것으로 예상될 수 있기 때문에, 서열-특이적 단편화 과정은 최적이 아닐 수 있다. 절단 부위의 분포는 소정의 단편화 과정을 위해 사용되는 제한 엔도뉴클레아제의 유형 및 개수에 의존한다. 절단 부위의 빈도가 낮은 영역은 게놈 정보의 과소 표시를 초래할 것이다. 서열-특이적 단편화 과정을 사용할 때의 몇가지 이점, 예를 들면, 제한 없이, 관심대상 게놈의 서브세트의 표적화가 있으며, 이는 노력, 비용 및 데이터 비용을 감소시키고, 단편화된 핵산 분자의 말단은 평활 말단 또는 한정된 5'-말단 오버행 핵산 서열 및 한정된 3'말단 오버행 핵산 서열로서 정의될 것이다. 한정된 핵산 서열을 갖는 돌출 말단은 "점착성(sticky) 말단"으로서 지칭된다. 특정 실시형태에서, 각 말단이 상이한 점착성 말단 서열을 갖는 보다 작은 단편을 생성시키기 위해 2가지 이상의 제한 엔도뉴클레아제가 사용될 수 있다. 예를 들면, 제한 없이, 단리된 핵산 분자를 2가지의 제한 엔도뉴클레아제(즉, EcoRI 및 BamHI)로 분해시키며, 이는 3가지 상이한 점착성 말단 유형(즉, 5'-AATT의 동일한 5'-오버행 서열[EcoRI] 또는 5'-GATC의 5'-오버행 서열[BamHI]을 함유하는 양 말단 또는 상이한 점착성 말단을 함유하는 양 말단(즉, 5'-AATT의 5'-오버행 서열을 갖는 한쪽 말단 및 5'-GATC의 5'-오버행 서열을 갖는 나머지 말단))을 초래할 것이다. 5'-AATT의 상보적 점착성 말단을 갖는 하나의 헤어핀 구조를 연결제를 사용하여 EcoRI 점착성 말단을 함유하는 단편에 결합시킬 수 있고, 5'-GATC의 상보적인 점착성 말단을 갖는 상이한 헤어핀 구조를 연결제를 사용하여 BamHI 점착성 말단을 함유하는 단편에 결합시킬 수 있다. 상이한 헤어핀 구조을 함유하는 덤벨 주형은 상이한 헤어핀 구조에 대한 상보적인 서열을 함유하는 친화성 지지체를 사용하여 증대시킬 수 있고, 상세한 설명은 실시예를 참고한다.
또한, 샘플로부터 단리된 핵산 분자는 예를 들면, 제한 없이 다중 PCR을 사용하는 서열-특이적 단편화 과정에 의해 보다 작은 단편으로 생성될 수 있다. 예를 들면, 제한 없이, 2가지 이상의 PCR 프라이머 세트는 핵산 분자를 포함하는 2가지 이상의 표적 영역을 특이적으로 증폭시키도록 디자인될 수 있다. 프라이머를 포함하는 표적-특이적 핵산 서열을 디자인하는 것 이외에도, 기능상 중요한 정보를 갖는 추가의 핵산 서열은 예를 들면, 제한 없이 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위 및 고유한 식별(즉, 바코드)을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 전방향 PCR 프라이머는 1개의 소정의 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 함유할 수 있고, 하나 이상의 역방향 PCR 프라이머는 1개의 상이한 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 함유할 수 있다. 증폭된 PCR 생성물을 각각 절단 부위를 인식하여 절단하는 상응하는 제한 엔도뉴클레아제와 접촉시키면, 이 증폭된 PCR 생성물의 말단들은 예측가능한 방식의 2개의 헤어핀 구조의 부착을 위해 사용될 수 있는 상이한 점착성 말단을 함유할 수 있다. 예를 들면, 제한 없이, 표적-특이적 핵산 서열 이외에도, 모든 전방향 PCR 프라이머는 EcoRI 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 함유하고, 모든 역방향 PCR 프라이머는 BamHI 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 함유한다. 2가지 이상의 PCR 프라이머 세트를 사용한 다중 PCR 후에, 증폭된 PCR 생성물을 EcoRI 및 BamHI로 제한 엔도뉴클레아제 분해시키면 5'-AATT의 5'-오버행 서열을 갖는 전방향 프라이머 말단 및 5'-GATC의 5'-오버행 서열을 갖는 역방향 프라이머 말단이 생성될 것이다. 5'-AATT의 상보적인 점착성 말단을 갖는 한가지 헤어핀 구조는 연결제를 사용하여 오직 전방향 프라이머 말단에만 결합시킬 수 있고, 5'-GATC의 상보적인 점착성 말단을 갖는 상이한 헤어핀 구조는 연결제를 사용하여 오직 역방향 프라이머 말단에만 결합시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플로부터 단리된 핵산 분자는 이러한 단리된 핵산 분자가 덤벨 주형을 생성할 정도로 충분히 단편화될 수 있기 때문에 어떠한 단편화 과정도 필요로 하지 않을 수 있다. 예를 들면, 제한 없이 임신한 여성 또는 암 환자로부터 수득된 전혈로부터의 혈청 또는 혈장으로부터 단리된 핵산 분자는 덤벨 주형을 생성시키기 위해 추가의 단편화가 필요하지 않을 수 있도록 생체내에서 충분히 단편화될 수 있다. 특정 실시형태에서, 샘플은 암 환자로부터 수득될 수 있다. 특정 실시형태에서, 샘플은 임신한 개체로부터 수득될 수 있다. 특정 실시형태에서, 샘플은 병리학 표본으로부터 수득될 수 있다. 특정 실시형태에서, 샘플은 포르말린-고정된 파라핀-포매된(FFPE) 표본으로부터 수득될 수 있다. 특정 실시형태에서, 샘플은 환경적 샘플로부터 수득될 수 있다. 특정 실시형태에서, 핵산 분자는 100 bp 내지 100 kbp 범위의 길이일 수 있다.
핵산 분자의 단리된 생체내 단편화된 라이브러리는 평활 말단, 5'-말단 오버행 및 3'-말단 오버행을 포함하는 각종 말단 유형을 함유한다. 단편화된 핵산 분자의 말단들을 직접 연결제를 사용하여 어댑터에 연결시켜 연결된 덤벨 주형을 형성시킬 수 있거나, 단편화된 핵산 분자의 말단들을 먼저 가공하여 말단들이 연결 덤벨 주형을 형성할 수 있도록 할 수 있다(하기 참조).
평활 말단을 함유하는 단편화된 핵산 분자의 퍼센트는 예를 들면, 제한 없이 3'-엑소뉴클레아제 활성을 나타내는 폴리머라제를 사용함으로써 연마 방법을 사용하여 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 제한 없이 이러한 폴리머라제는 T4 DNA 폴리머라제, 클레나우(Klenow) DNA 폴리머라제 또는 Pfu DNA 폴리머라제를 포함할 수 있다. 이러한 DNA 폴리머라제들의 3'-엑소뉴클레아제 활성은 3'-말단 오버행으로부터 미지의 또는 공지의 서열의 하나 이상의 단일가닥 뉴클레오타이드를 제거하여 평활 말단화된 단편화된 핵산 분자를 생성함으로써 작용한다. 5'-말단 오버행을 상보적인 뉴클레오타이드를 매립된(recessed) 3'-말단 가닥으로 효소적으로 혼입시켜 평활 말단화하여 평활 말단화된 단편화된 핵산 분자를 생성시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 연결제를 사용하는 덤벨 주형의 하나 이상의 헤어핀 구조의 말단에의 효과적 생성을 촉진하기 위해, 하나 이상의 단편화된 핵산 분자의 5'-말단을 예를 들면, 제한 없이 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제를 사용하여 인산화시킬 수 있다.
특정 실시형태에서, 단편화된 핵산 분자의 평활 말단화 및 인산화 후, 이중가닥 올리고뉴클레오타이드 어댑터는 기능상 중요한 정보, 예를 들면, 제한 없이 복제, 증폭 및/또는 고유 식별(즉, 바코드) 서열을 도입할 뿐만 아니라 임의의 소정의 점착성 말단 서열을 제공하도록 디자인할 수 있다. 후자 서열은 연결제 및 상보적인 점착성 말단 서열을 갖는 5'-인산화된 헤어핀 구조를 사용하는 덤벨 주형의 효과적 생성을 촉진하는데 유용할 수 있다. 특정 실시형태에서, 트랜스포사제와 트랜스포존 복합체는 하나 이상의 핵산 분자를 단편화하고 동시에 기능상 중요한 정보, 예를 들면, 제한 없이, 복제, 증폭 및/또는 고유 식별(즉, 바코드) 서열을 삽입하는데 있어 뿐만 아니라 삽입 지점에서 점착성 말단 서열을 생성할 수 있는 임의의 소정의 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 제공하는데 있어 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 단편화된 핵산 분자의 말단은 다른 수단에 의해, 예를 들면, 제한 없이 2'-데옥시아데노신(dA) 뉴클레오타이드를 평활 말단화된 단편화된 핵산 분자의 3'-말단에 부가하여 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 제한 없이 클레나우 3'-엑소 마이너스 DNA 폴리머라제 및 Taq DNA 폴리머라제와 같이 3'-엑소뉴클레아제 활성이 결여된 DNA 폴리머라제는 2'-데옥시아데노신 트리포스페이트를 평활 말단화된 단편화된 핵산 분자의 3'-말단에 부가하여 하나의 2'-데옥시아데노신 모노포스페이트 뉴클레오타이드를 갖는 3'-말단 오버행을 생성할 수 있다. dA-테일링(tailing) 방법도 또한 연결제 및 하나의 2'-티미딘 모노포스페이트 뉴클레오타이드의 상보적인 3'-말단 오버행을 갖는 5'-인산화된 헤어핀 구조를 사용하는 효과적 덤벨 주형 작제를 촉진한다. 특정 실시형태에서, 평활 말단화된 단편화된 핵산 분자를 또한 연결제를 사용하여 덤벨 주형을 생성시키는데 직접 사용하여, 상응하는 평활 말단을 갖는 5'-인산화된 헤어핀 구조를 결합시킬 수 있다.
제한된 양의 귀중한 생물학적 샘플의 분석을 고려할 때 거의 적용될 수 없는 분자내 연결 이벤트 전략에 의해 핵산 환을 생성시키는 현재 방법과 달리, 핵산 환 생성시의 효율은 본 발명의 방법에 의해 크게 개선된다. 예를 들면, 제한 없이 분자내 연결 이벤트 전략에 의해 핵산 환을 생성시키는 것은 수십 ㎍의 출발 물질을 필요로 하지만, 목적하는 핵산 환을 생성시키는데 있어서 일(1)% 미만의 대략적 효율을 산출한다. 분자내 연결 전략과 연관된 문제는 해당 방법이 핵산 분자의 크기에 의존하고 연결 효율에 반비례하기 때문에 더 심각해진다. 즉, 반응 조건이 핵산 분자의 길이에 비례하는 희석 농도를 점점 더 좌우하기 때문에, 보다 큰 크기의 핵산 분자는 분자내 연결 방식에 의해 보다 적은 환을 생성한다. 반면에, 본 발명에 기재된 덤벨 주형을 생성시키는 방법은 본 방법이 분자내 연결 접근법에 의존하지 않기 때문에 매우 효율적이다. 반대로, 덤벨 주형의 생성은 분자간 이벤트에 의해 수행되며, 여기서, 핵산 분자를 헤어핀 구조에 결합시킬 때의 연결 효율은 매우 효율적이 될 수 있다. 헤어핀 구조의 농도가 핵산 분자의 농도보다 충분히 높을(즉, 100배) 때, 연결 반응은 진행되어 완료되거나 실질적으로 거의 완료될 수 있다. 또한, 1,000bp 크기의 덤벨 주형이 5,000bp 크기 또는 10,000bp 크기 또는 심지어 100,000 bp 크기 또는 심지어 100,000 bp보다 큰 크기의 덤벨 주형만큼 효과적으로 생성될 수 있으므로, 연결 반응은 하나 이상의 핵산 분자의 크기와 독립적이거나 실질적으로 독립적이다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 7.5 및 10.0kb로 크기 증가하는 이중-헤어핀 덤벨 주형을 게놈 DNA로부터 작제할 수 있다. 특정 실시형태에서, 덤벨 주형은 후속적으로 균질한 반응 용액 중에서 회전환 기작을 사용하여 복제 또는 증폭시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 덤벨 주형은 또한, 하나 이상의 복제된 덤벨 주형 또는 증폭된 덤벨 주형이 핵산 분자를 검출하기 위해 공간적으로 및 스펙트럼에 의해 분석될 수 있도록 덤벨 주형을 제한 희석액 중의 기질로 도입시킴으로써, 하나 이상의 고체상 결합된 프라이머를 사용하여 불균질 반응 용액 중에서 회전환 기작을 사용하여 복제 또는 증폭시킬 수 있다.
특정 실시형태에서, 덤벨 주형은 하나 이상의 헤어핀 구조를 함유하는 양(+)의 가닥 핵산 분자이다. 특정 실시형태에서, 덤벨 주형은 또한, 하나의 헤어핀 구조가 단일가닥 핵산 분자를 헤어핀 구조의 다른 말단으로 신장시키고 카피하는 프라이머로서 작용할 수 있어 단일가닥 핵산 분자의 각 말단이 헤어핀 구조에 연결됨으로써 형성될 수 있다. 연결 단계 후, 덤벨 주형이 형성된다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 선형 이중가닥 영역은 예를 들면, 제한 없이 열, 화학적 또는 효소적 수단에 의해 용융될 수 있고, 덤벨 주형은 완전히 개방된 단일가닥 환으로 변환될 수 있다. 특정 실시형태에서, 덤벨 주형은 고유한 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위를 함유하는 상이한 핵산 서열을 갖는 2가지의 상이한 헤어핀 구조를 사용하여 생성시킬 수 있다. 이러한 환상 주형을 회전환 기작을 사용하여 복제하여 표적 서열의 다수의 카피를 생성시킬 수 있다. RCR 단계 후, 선형 연쇄체를 적절한 제한 엔도뉴클레아제를 이용하여 분해시켜 표적 서열의 단량체 단위를 생산할 수 있고, 이어서 이들의 말단들을 함께 연결시켜 환상 표적 서열의 다수의 카피를 생성할 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 덤벨 주형은 관심대상 유전자의 RNA 분자의 전사에서 사용될 수 있다. 하나 이상의 RNA 프로모터 서열을 함유하는 덤벨 주형이 생성되고, 이렇게 폐쇄된 단일가닥 핵산 환은 관심대상 유전자의 RNA 분자의 시험관내 전사를 위한 주형으로서 사용된다.
특정 실시형태에서, 엑소뉴클레아제는, 성공적으로 연결되지 않아 덤벨 주형을 형성하지 않은 원치않는 핵산 분자를 제거하는데 사용될 수 있다. 이러한 원치않는 핵산 분자는 평활 말단화된 5'-돌출 말단 및/또는 3'-돌출 말단의 형태일 수 있는 하나 이상의 5'-말단 또는 3'-말단을 가질 수 있거나 단일가닥 형태로 존재할 수 있다. 이러한 원치않는 핵산 분자는 비단편화된 및 단편화된 핵산 분자, 헤어핀 구조로 형성되지 않을 수 있는 올리고뉴클레오타이드 및 비연결된 헤어핀 구조를 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 엑소뉴클레아제 III(엑소 III으로도 지칭됨)은 이중가닥 DNA의 3'-하이드록시실 말단으로부터 모노뉴클레오타이드의 단계적 제거를 촉매한다. 각 결합 이벤트 동안 제한된 수의 뉴클레오타이드가 제거되어 DNA 분자 집단 내의 조직화된 점진적 결실이 초래된다. 엑소 III이 이중가닥 DNA 내의 닉에도 작용하여 단일가닥 갭(gap)을 생성하지만, 엑소 III의 바람직한 기질은 평활 말단 또는 5'-돌출 말단을 함유하는 핵산 분자이다. 엑소 III은 단일가닥 DNA상에서 활성적이 아니고 이에 따라 3'-돌출 말단은 절단에 대해 내성이다. 내성 정도는 신장 길이의 의존하며, 4개 염기 이상의 긴 신장은 본질적으로 절단에 대해 내성이다. 이러한 특성을 활용하여, 하나의 내성(3'-돌출 말단) 및 하나의 감수성(평활 말단 또는 5-돌출 말단) 말단을 갖는 선형 분자로부터 단방향성 결실을 생성시킬 수 있다. 엑소뉴클레아제 III 활성은 부분적으로 나선 구조에 의존하며 서열 의존성(C>A=T>G)을 나타낸다. 온도, 염 농도 및 효소 대 DNA의 비는 효소 활성에 크게 영향을 주어 반응 조건이 특정한 적용에 맞게 조정되는 것을 필요로 한다. 엑소뉴클레아제 VII(엑소 VII으로도 지칭됨)은 단일가닥 DNA을 5'→3' 및 3'→5' 방향 둘 다로 절단한다. 상기 효소는 선형 또는 환상 이중가닥 DNA에서는 활성적이지 않다. 덤벨 주형을 생성시킬 때, 완료된 PCR 반응 및 연결후 반응으로부터 단일가닥 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 헤어핀을 제거하는 것이 유용하다. 엑소뉴클레아제 VII에 의한 단일가닥 DNA 분해는 금속-독립적이다. 엑소 III 및 엑소 VII은 성공적으로 연결되지 않아 덤벨 주형을 형성하지 않은 원치않는 핵산 분자를 제거하는데 함께 사용될 수 있다.
기질은 임의의 물질, 예를 들면, 제한 없이 고체 물질, 반고체 물질(즉, [i] 고체 지지체와 겔 또는 매트릭스 물질의 복합물 또는 [ii] 선형 또는 가교결합된 폴리아크릴아미드, 셀룰로스, 가교결합된 아가로스 및 폴리에틸렌 글리콜) 또는 유체 또는 액체 물질로 구성될 수 있다. 기질은 또한 임의의 치수 및 모양, 예를 들면, 제한 없이 정사각형, 사다리꼴, 구형, 타원체, 관상형, 펠렛형, 막대형 또는 팔면체 모양을 갖는 임의의 물질로 구성될 수 있다. 기질은 본 발명과 양립할 수 있는 특성을 함유해야 한다(즉, 복제, 증폭 또는 검출 과정에 대해 최소한의 간섭을 나타내야 한다). 특정 실시형태에서, 기질은 비다공성이다. 특정 실시형태에서, 기질은 하이드로겔과 같은 친수성 다공성 매트릭스로 구성될 수 있다. 특정 실시형태에서, 고체 물질은, 예를 들면, 제한 없이 유리 물질(즉, 보로실리케이트, 공극 제어된 유리, 용융 실리카 또는 게르마늄-도핑된 실리카), 규소, 지르코니아, 이산화티탄, 중합체성 물질(즉, 폴리스티렌, 가교결합된 폴리스티렌, 폴리아크릴레이트, 폴리메틸아크릴레이트, 폴리디메틸실록산, 폴리에틸렌, 폴리플루오로에틸렌, 폴리에틸렌옥시, 폴리프로필렌, 폴리아크릴아미드, 나일론과 같은 폴리아미드, 덱스트란, 가교결합된 덱스트란, 라텍스, 사이클릭 올레핀 중합체, 사이클릭, 올레핀 공중합체 뿐만 아니라 이들의 기타 공중합체 및 그라프트) 또는 금속성 물질을 포함한다. 고체 기질은, 예를 들면, 제한 없이 하나 이상의 막, 평평한 표면, 실질적으로 평평한 표면, 비평면 표면, 마이크로티터 플레이트, 구형 비이드, 비-구형 비이드, 광섬유, 구형 비이드를 함유하는 광섬유, 비-구형 비이드를 함유하는 광섬유, 반도체 장치, 구형 비이드를 함유하는 반도체 장치, 비-구형 비이드를 함유하는 반도체 장치, 구형 비이드를 함유하는 하나 이상의 웰을 갖는 슬라이드, 비-구형 비이드를 함유하는 하나 이상의 웰을 갖는 슬라이드, 필터, 검사 스트립, 슬라이드, 커버 슬립 또는 시험관으로 구성될 수 있다. 특정 실시형태에서, 반고체 물질은 예를 들면, 제한 없이, 선형 또는 가교결합된 폴리아크릴아미드, 셀룰로스, 가교결합된 아가로스 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
하나 이상의 프라이머는 어떠한 적합한 수단에 의해서도 기질에 부착될 수 있다. 특정 실시형태에서, 기질에 하나 이상의 프라이머의 부착은, 예를 들면, 제한 없이 공유결합, 수소결합(즉, 이로 인해 프라이머가 기질에 공유 부착된 다른 상보적인 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화하고 여전히 복제 가능 또는 증폭 가능 기능을 제공한다), 반데르발스 힘, 물리적 흡착, 소수성 상호작용, 이온성 상호작용 또는 친화성 상호작용(즉, 바이오틴/스트렙타비딘 또는 항원/항체와 같은 결합 쌍)에 의해 매개된다. 특정 실시형태에서, 결합 쌍의 한 구성원은 기질에 부착되고, 결합 쌍의 나머지 구성원은 하나 이상의 프라이머에 부착된다. 기질에 하나 이상의 프라이머의 부착은 결합 쌍의 두 구성원의 상호작용을 통해 발생한다.
하나 이상의 프라이머가 기질에 부착되는 순서는 광범위하게 "프라이머 어레이"로서 정의되는 임의의 배열의 것일 수 있다. 예를 들면, 제한 없이, 무작위적 어레이, 패턴화된 어레이의 무작위적 분류 또는 순서화된 어레이로 패턴화된 공지된 것. 회전환 기작에 의해 덤벨 주형을 복제하는 프라이머 어레이는 "복제된 덤벨 주형 어레이"로서 광범위하게 정의된다. 회전환 기작에 의해 덤벨 주형을 증폭시키는 프라이머 어레이는 "증폭된 덤벨 주형 어레이"로서 광범위하게 정의된다. 디자인에 의해, 패턴화된 어레이 및 순서화된 어레이는 핵산 분자를 검출하기 위해 공간적으로 및 스펙트럼에 의해 분석될 수 있는 복제된 덤벨 주형 어레이 또는 증폭된 덤벨 주형 어레이를 제공할 것으로 예상된다. 무작위적 어레이의 특정 실시형태에서, 하나 이상의 프라이머는 기질에 공유결합되어 평평한 표면 또는 실질적으로 평평한 표면상에 고정된 프라이머의 고밀도 론(lawn)을 형성할 수 있다. 하나 이상의 프라이머는 임의의 수단에 의해, 예를 들면, 제한 없이, 용액, 에멀젼, 에어로졸, 증기 또는 건조 제제를 낙하, 분무, 도말 또는 확산시키는 것을 수반하는 방법에 의해 부착될 수 있다. 덤벨 주형을 제한 희석 방식으로 기질상으로 도입시킴으로써, 하나 이상의 프라이머는 덤벨 주형과 접촉하여 폴리머라제의 존재하에 회전환 기작을 가능하게 함으로써, 핵산 분자를 검출하기 위해 공간적으로 및 스펙트럼에 의해 분석될 수 있는 하나 이상의 복제된 덤벨 주형(즉, 복제된 덤벨 주형 어레이) 또는 증폭된 덤벨 주형(즉, 증폭된 덤벨 주형 어레이)을 생성할 것이다. 패턴화된 어레이의 무작위적 분류의 특정 실시형태에서, 하나 이상의 프라이머는 기질에 공유결합되어 하나 이상의 구형 또는 비-구형 비이드상에 고밀도의 고정된 프라이머를 형성할 수 있다. 덤벨 주형을 수중유 에멀젼 시스템을 사용하여 제한 희석액 중의 기질상으로 도입시킴으로써, 하나 이상의 프라이머는 덤벨 주형과 접촉하여 회전환 기작을 가능하게 함으로써 하나 이상의 복제된 덤벨 주형 또는 증폭된 덤벨 주형을 생성할 것이다. 특정 실시형태에서, 단일 분자의 푸아송(Poisson) 분포 통계학에 기초하여 덤벨 주형을 복제 또는 증폭시키지 못한 비이드를 제거하기 위해, 복제된 덤벨 주형화된 비이드 또는 증폭된 덤벨 주형화된 비이드를 증대시킬 수 있다. 이어서, 증대시킨 또는 증대시키지 않은 복제된 덤벨 주형화된 비이드 또는 증폭된 덤벨 주형화된 비이드는 평평한 또는 실질적으로 평평한 슬라이드 기질, 광섬유 기질, 또는 웰, 함몰부 또는 기타 컨테이너, 용기, 특질 또는 위치를 함유하는 반도체 장치 기질상에 순서화된 패턴으로 무작위적으로 분포될 수 있다. 패턴화된 어레이의 무작위적 분류의 다른 특정 실시형태에서, 표면상의 하나 이상의 조립식 친수성 특질(즉, 스폿)은 기질에 대한 하나 이상의 프라이머의 공유결합을 위해 소수성 표면으로 둘러싸일 수 있다. 예를 들면, 제한 없이, 패턴화된 어레이는 약 300nm 스폿의 격자 패턴 어레이를 갖는, 생성된 포토리소그래피 에칭된, 표면 개질된 규소 기질일 수 있다. 덤벨 주형을 제한 희석 방식으로 기질상으로 도입시킴으로써, 프라이머는 덤벨 주형과 접촉하여 회전환 기작을 가능하게 함으로써 하나 이상의 복제된 덤벨 주형 또는 증폭된 덤벨 주형을 생성할 것이다. 특정 실시형태에서, 단지 하나의 복제된 덤벨 주형 또는 증폭된 덤벨 주형만을 수용하기 위해 조립식 친수성 스판은 작게 만들어질 수 있다. 푸아송 통계에 기초한 단일 분자의 분포는 상당 부분이 주형 스폿이 없도록 만들기 때문에, 회전환 과정 후, 분포, 접촉 및 회전환의 추가 라운드를 이용하여 기질상의 복제된 덤벨 주형 또는 증폭된 덤벨 주형의 밀도를 증가시킬 수 있다. 순서화된 어레이로 패턴화된 "공지된 것"의 특정 실시형태에서, 하나 이상의 공지된 프라이머는 프린팅될 수 있거나(즉, 스폿팅된 어레이) 기질상의 어드레스가능한 위치에서 원위치(in situ) 제조될 수 있다. 덤벨 주형을 제한 희석 방식으로 패턴화된 기질상으로 도입시킴으로써, 하나 이상의 프라이머는 덤벨 주형과 접촉하여 회전환 기작을 가능하게 함으로써 하나 이상의 복제된 덤벨 주형 또는 증폭된 덤벨 주형을 생성할 것이다.
폴리머라제 연쇄 반응("PCR")은 소량의 핵산 분자를 특이적으로 증폭시켜 관심대상 표적 서열의 수백개 내지 수백만개 카피를 생성시키기 위해 사용된다. 일반적으로 말하면, PCR은 이중체 가닥을 변성 또는 용융시키기 위한 반복된 가열, 프라이머를 하이브리드화하기 위한 냉각 및 이어서 시험관내(즉, 유기체의 외부)에서 주형 서열을 증폭시키기 위한 다시 한번의 가열(통상적으로 DNA 폴리머라제에 대해서는 최적의 온도이지만 변성 온도 미만의 온도)을 수반한다. DNA 폴리머라제는 단일가닥 주형으로부터 상보적인 가닥을 카피 또는 합성한다. 이러한 효소 반응이 일어나도록 하기 위해, DNA의 부분적으로 이중가닥인 부분이 요구된다. 전형적으로, 프라이머는 단일가닥 주형의 상보적인 영역에 하이브리드화한다. DNA 폴리머라제는 5'에서 3' 방향으로 초기 가닥을 합성하여 이중가닥 DNA를 생성한다. 다중 PCR은 다수의 표적 영역이 동시에 증폭되도록 하고 X-연관 장애에서 암호화 엑손 결실(들)을 검출하는데 사용되었다(상기 엑손들은 메신저 RNA(mRNA)로 전사되어 하나 이상의 단백질로 번역되는 유전자 서열이다); 이러한 X-연관 장애는 뒤시엔느 근위축증(Duchenne muscular dystrophy) 및 렛슈-니한 증후군(Lesch-Nyhan syndrome)을 포함한다. 대안으로서, PCR을 사용하여 출발 물질에 존재하는 핵산의 전체 풀을 증폭시켜, 핵산의 임의의 소정의 서브세트의 증폭은 야기할 수 있지만, 이의 표적화된 증대는 야기하지 않을 수 있다. 이것은 공통의 서열 또는 어댑터를 단편의 말단에 연결시키고, 상기 단편을 변성시키고 그 서열이 공통의 어댑터에 상보적인 공통의 프라이머를 하이브리드화하고 DNA 단편을 카피하여 상기 단편을 증폭시킴으로써 달성된다. 이러한 유형의 PCR은 "범용 PCR"로서 지칭된다.
ΦX174, M13, 람다 및 일부 바이러스와 같은 박테리오파아지(또는 파아지)는 이의 각각의 게놈을 "회전환" 기작에 의해 복제할 수 있다. 전체 게놈은 환상 주형으로부터 카피함으로써 재생된다. PCR과 달리, 회전환 기작은 등온적으로(즉, 가열 또는 냉각 사이클이 필요하지 않다) 수행될 수 있다.
회전환 접근법은 관심대상의 핵산 분자를 복제하거나(즉, 오직 본래 덤벨 주형만을 카피하는 하나 이상의 프라이머를 사용하는) 증폭시키는(즉, 본래 덤벨 주형 뿐만 아니라 덤벨 주형의 카피 둘 다를 카피하는 2가지 이상의 프라이머를 사용하는) 시험관내 방법으로서 사용되었다. 예를 들면, 크기가 34 내지 52개 염기의 범위인 환상 합성 올리고뉴클레오타이드는 이. 콜라이(E. coli) Pol I DNA 폴리머라제 및 단일 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하는 회전환 기작을 사용하여 복제되었다. 유사한 크기 환을 사용하는 회전환 기작은 이. 콜라이 Pol I, 클레나우 DNA 폴리머라제, 및 T4 DNA 폴리머라제를 포함하는 몇몇 폴리머라제를 이용하여 26 내지 74개 염기의 범위였다.
특정 실시형태에서, DNA 환은 "패드락(padlock) 프로브"로서 생성될 수 있다. 패드락 접근법의 주된 단점은 환상 핵산 분자를 생성할 때의 크기 제한이며, 예를 들면, 제한 없이 46-뉴클레오타이드 환은 CFTR G542X 유전자좌를 표적화하는데 사용된다. 이러한 패드락 환은 φ29 DNA 폴리머라제, Bst DNA 폴리머라제 및 Vent(엑소-) DNA 폴리머라제와 같은 DNA 폴리머라제를 사용하여 단 몇초만에 수백개의 표적 카피를 생성시킬 때 유용할 수 있다. 특정 실시형태에서, 패드락 환은 회전환 증폭 기작에서 2가지의 프라이머를 사용할 수 있고, 이는 주형 환(즉, 음(-) 가닥)을 카피할 수 있도록 할 뿐만 아니라 새롭게 합성된 양(+)의 가닥(들)을 카피할 수 있도록 한다. 2가지의 상이한 46-뉴클레오타이드 패드락 환을 사용하는 RCA 방법은 유전자형 분석 적용, 예를 들면, 제한 없이 CFTR G542X 유전자좌에 대한 야생형 서열 및 돌연변이체 서열의 검출을 위해 사용될 수 있다. 유전자형 분석을 위한 RCA 패드락 방법의 다른 단점은 각 돌연변이 좌위가 검정되기 위해서 개개의 대립유전자-식별 프라이머를 요구한다는 점이다.
회전환 증폭은 크기가 5 내지 7kb의 범위인, DNA 환으로서 플라스미드 및 파아지와 같은 종래의 클로닝 공급원을 사용하는 용액 기반 주형 제조를 위해 무작위적 육량체(즉, 2개보다 많은 프라이머) 및 φ29 DNA 폴리머라제를 사용하는 생거(Sanger) 서열분석 적용에서 사용되었다. DNA 환의 생성시에 종래의 클로닝 접근법을 사용할 때의 단점은 이러한 DNA 환을 적절한 세포 숙주를 통해서 증식시키는 것이 요구된다는 점이다. 본 발명의 덤벨 주형은 이러한 한계를 극복한다. 키메릭 DNA 주형을 사용한 회전환 복제는 연결에 의한 서열분석 방법에서 사용되었다. 주형 제조 방법은 분자내 연결 접근법에 의해 크기가 대략 300bp인 소형 DNA 환을 생성시키기 위해 복잡한 일련의 방향성 어댑터 연결 및 II형 제한 효소 분해를 사용하였으며, 상기 DNA 환을 단일 프라이머 및 φ29 DNA 폴리머라제를 사용하여 용액에서 복제하여 "DNA 나노볼"을 생성시킨다. 이어서, 상기 나노볼을 패턴화된 기질에 흡착시켜 이의 연결에 의한 서열분석 방법을 수행한다. 나노볼 방법의 주요 한계는 키메릭 주형 환에서 이용될 수 있는 게놈 DNA 서열의 양이 적고(즉, 76-bp가 실제 표적 서열이고 나머지 222-bp는 어댑터 서열이다) 분자내 연결을 요구한다는 점이다. 본 발명은 회전환 기작으로 복제 또는 증폭될 수 있는 덤벨 주형을 사용하는 보다 간단한 작업흐름을 제공함으로써, 분자내 연결 접근법에 의해 소형 환상 주형을 작제하는 복잡한 방법의 한계를 극복한다.
회전환 기작에서 유용한 폴리머라제 및 역전사효소는 일반적으로 핵산 합성 동안 효소가 만나게 되는 "하류" 핵산 가닥을 변위시키는 능력인 가닥-변위의 특성을 나타낸다. 이러한 가닥-변위 효소는 또한 5'-엑소뉴클레아제 활성이 부족하다. 회전환 복제 또는 회전환 증폭에는 임의의 가닥-변위 폴리머라제 또는 역전사효소, 예를 들면, 제한 없이, φ29 DNA 폴리머라제, 이. 콜라이 Pol I, 클레나우 DNA 폴리머라제, Bst DNA 폴리머라제(대형 단편), Bsm DNA 폴리머라제(대형 단편), Bsu DNA 폴리머라제(대형 단편), Vent(엑소-) DNA 폴리머라제, T7(엑소-) DNA 폴리머라제(T7 시쿼나제(Sequenase)) 또는 TopoTaq(Taq DNA 폴리머라제 및 토포이소머라제 V의 키메릭 단백질) 뿐만 아니라 이러한 DNA 폴리머라제들의 돌연변이체 버젼, T7 RNA 폴리머라제, T3 RNA 폴리머라제 또는 SP6 RNA 폴리머라제 뿐만 아니라 이러한 RNA 폴리머라제들의 돌연변이체 버젼, 또는 조류 골수아세포증 바이러스 역전사효소 또는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 역전사효소 뿐만 아니라 이러한 역전사효소들의 돌연변이체 버젼, 예를 들면, ThermoScript 역전사효소, SuperScript 역전사효소 또는 PrimeScript 역전사효소가 사용될 수 있다. 가닥-변위 폴리머라제 및 역전사효소 이외에, 부속 단백질은 회전환 기작의 강건성, 충실도 및/또는 진행도를 증가시킴으로써 핵산 합성 동안 하류 핵산 가닥의 변위를 더욱 증강시킬 수 있다. 가닥-변위 부속 단백질은 어떠한 유형의 것이라도 될 수 있으며, 예를 들면, 제한 없이 헬리카제, 단일가닥 결합 단백질, 토포이소머라제, 역 자이라제 및 부속 단백질을 작극하는 기타 단백질, 예를 들면, 제한 없이 이. 콜라이 MutL 단백질 또는 티오레독신을 포함한다. DNA 헬리카제는 DNA 복제 동안 2개의 상보적인 또는 실질적으로 상보적인 DNA 가닥을 분리시키거나 푸는데 유용하다. 헬리카제는 핵산 분자를 5'에서 3' 방향(예를 들면, 제한 없이 박테리오파아지 T7 유전자 4 헬리카제, DnaB 헬리카제 및 Rho 헬리카제) 및 3'에서 5' 방향(예를 들면, 제한 없이 이. 콜라이 UvrD 헬리카제, PcrA, Rep 및 C형 간염 바이러스의 NS3 RNA 헬리카제)의 두 방향 모두로 풀 수 있다. 헬리카제는 어떠한 공급원으로부터도 수득될 수 있으며, 예를 들면, 제한 없이, 이. 콜라이 헬리카제(즉, I, II [UvrD], III 및 IV, Rep, DnaB, PriA 및 PcrA), 박테리오파아지 T4 gp41, 박테리오파아지 T7 유전자 4 헬리카제, SV40 Large T 항원, Rho 헬리카제, 효모 RAD 헬리카제, 티. 텡콘젠시스(T. tengcongensis)로부터의 열안정성 UvrD 헬리카제 및 C형 간염 바이러스의 NS3 RNA 헬리카제 뿐만 아니라 이들 및 기타 헬리카제의 돌연변이체 버젼을 포함한다. 단일가닥 결합 단백질은 단일가닥 DNA를 큰 친화도로 이중가닥 DNA에 결합시킨다. 이러한 단백질들은 협력하여 결합하여, 단일가닥 영역의 침입을 돕고 이에 따라 이중체 구조를 탈안정화시킨다. 예를 들면, 제한 없이, 단일가닥 결합 단백질은 2차 구조를 제거함으로써 헬릭스-탈안정화 활성을 나타낼 수 있고 하이브리드화된 핵산 분자를 변위시킬 수 있다. 단일가닥 결합 단백질은 어떠한 공급원으로부터 수득될 수있으며, 예를 들면, 제한 없이, 박테리오파아지 T4 유전자 32 단백질, RB 49 유전자 32 단백질, 이. 콜라이 단일가닥 결합 단백질, φ29 단일가닥 결합 단백질 또는 박테리오파아지 T7 유전자 2.5 뿐만 아니라 이들 및 기타 단일가닥 결합 단백질의 돌연변이체 버젼, 예를 들면, 박테리오파아지 T7 유전자 2.5 F232L을 포함한다.
덤벨 주형은 phi29 폴리머라제와 같은 매우 전진적인 가닥-변위 폴리머라제를 사용하여 회전환 복제시킬 수 있다. 회전환 복제는 두 단계로 수행될 수 있다. 첫째, 크기-선별된 덤벨 주형을 온도, 염, 완충액 및 pH와 같은 인자, 세제 및 유기 용매를 포함하는 적절한 "하이브리드화 조건"하에 덤벨 상보적인 프라이머와 하이브리드화되도록 한다. 소 혈청 알부민(BSA) 또는 덴하르트 시약과 같은 차단제를 하이브리드화 조건의 일부분으로서 사용할 수 있다. 둘째, 적절한 폴리머라제 또는 레플리솜과 뉴클레오타이드 혼합물을 첫번째 반응 혼합물에 제공하여 증폭된 또는 복제된 덤벨 주형을 생성한다. 하이브리드화 및 증폭 또는 복제 조건은 덤벨 주형의 스템 영역의 길이 및 서열 조성, 하이브리드화 조건, 본원에서 사용되는 특정한 폴리머라제 또는 레플리솜 및 반응 온도를 포함하나 이들로 제한되지 않는 몇몇 인자들에 기초하여 최적화된다. 특정 실시형태에서, 반응 온도는 약 10℃ 내지 35℃이다. 다른 실시형태에서, 반응 온도는 약 15℃ 내지 30℃일 수 있다. 다른 실시형태에서, 반응 온도는 약 20℃ 내지 25℃일 수 있다. 특정 실시형태에서, 온도는 선별된 시간 간격으로 증가된다. 예를 들면, 제한 없이, 반응은 10℃에서 5분 동안 유지되고 이어서 15℃에서 5분 동안, 20에서 5분 동안, 이어서 25℃에서 5분 동안 및 30℃에서 5분 동안 유지된다.
"레플리솜"이라 지칭되는 복제 복합체는 복제된 덤벨 주형 또는 증폭된 덤벨 주형의 보다 많은 카피를 제조하고/하거나 보다 큰 덤벨 주형(즉, >1 kb, >5 kb, >10 kb 및 >50 kb 크기)를 복제하거나 증폭시킴으로써 회전환 방법을 증강시키기 위해 시험관내에서 형성될 수 있다. 헬리카제, 단일가닥 결합 단백질, 토포이소머라제 및 역 가이라제를 포함하는 가닥-변위 부속 단백질은 임의의 조합의 가닥-변위 폴리머라제와 역전사효소로 구성되어 덤벨 주형의 회전환 방법을 위한 복제 가능 또는 증폭 가능 레플리솜 복합체를 생성할 수 있다. 특정 실시형태에서, 적절한 반응 조건 하에 φ29 DNA 폴리머라제와 φ29 단일가닥 결합 단백질의 조합은 회전환 기작의 연장을 몇 배 증강시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 헬리카제와 단일가닥 결합 단백질의 조직화된 활성에 의존하는 폴리머라제 또는 역전사효소의 조합은 덤벨 주형을 복제하거나 10kb 이상의 덤벨 주형을 증폭시키기 위해 회전환 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 제한 없이 10kb 플라스미드는 레플리솜 복합체를 형성함으로써 T7 시쿼나제, T7 헬리카제 및 T7 단일가닥 결합 단백질의 조직화된 활성을 사용하여 증폭시킬 수 있다.
본 발명의 특정 실시형태는 매우 점진적인 고체상 PCR 시스템을 이용하는 10kb 크기의 이중-헤어핀 덤벨의 효율적 생성을 포함한다. 특정 양상에서, 고유하게 선별가능한 방법-특이적 이중-헤어핀 덤벨 주형은 크기 독립적 및 조밀하게 분포되는 방식(즉, 10±1kb)으로 생성되어 신생 조립체에 대한 유익한 하류 생물정보학이 처리되도록 한다. 덤벨 주형은 이러한 작제물들이 단순한 작업흐름으로 효과적으로(즉, 분자간 대 분자내 연결) 제조되기 때문에 다량의 출발 게놈 DNA의 필요성을 제거한다. 이것은 통상적으로는 미량으로 수득되는 임상 샘플을 사용할 때 중요한 고려사항이다. 본 발명의 실시형태는 또한 NGS 기술에서 기술적 돌파구를 대표하는 이용가능한 폴리머라제에 의해 정해진 현재의 크기 제약을 완화시키는 고체상 RCR의 개발 및 최적화를 제공한다. 이러한 획기적인 대형 주형 고밀도 어레이는 조사, 임상 및 진단 적용을 위한 복잡한, 신규 및 질환 게놈의 진정한 신생 조립을 가능하게 할 것이고, 또한 보다 포괄적인 시스템 생물학 연구를 허용하여 게놈 전체 DNA-DNA, DNARNA 및 DNA-단백질 상호작용을 조사할 수 있도록 할 것이다.
기질에 부착된 복제된 덤벨 주형 및 증폭된 덤벨 주형(즉, 복제된 덤벨 주형 어레이 또는 증폭된 덤벨 주형 어레이)는 예를 들면, 제한 없이 핵산 서열분석의 모든 양상(즉, 전체 게놈 드 노보 서열분석(de novo sequencing); 서열 변이체 검출, 구조 변이체 검출을 위한 전체 게놈 재서열분석, 분자 하플로타입의 페이즈 결정 및/또는 이수성 검출을 위한 분자적 계수; 서열 변이체 검출, 구조 변이체 검출, 분자 하플로타입의 페이즈 결정을 위한 유전자 패널, 전체 엑솜 또는 염색체 영역의 표적화된 서열 분석 및/또는 이수성 검출을 위한 분자적 계수; 뿐만 아니라 RNA-seq, Chip-seq, 메틸-seq 등과 같은 기타 표적화된 서열분석 방법; 모든 유형의 서열분석 활성은 본원에서 "서열분석"으로서 광범위하게 정의된다)을 포함하는 많은 상이한 목적을 위해 유용할 수 있다. 복제된 덤벨 주형 어레이 및 증폭된 덤벨 주형 어레이는 또한 핵산-핵산 결합 상호작용, 핵산-단백질 결합 상호작용(즉, 단백질-DNA 친화성을 정량적으로 측정하는 형광 리간드 상호작용 프로파일링)을 연구하기 위한 핵산 분자 어레이 및 핵산 구조/기능 관계를 연구하기 위한 핵산 분자 발현 어레이(즉, 2'-데옥시리보핵산 분자를 리보핵산 분자로 전사시킴, 본원에서 "리보핵산 주형 어레이"로서 정의됨)을 생성시키기 위해 유용할 수 있다. 특정 실시형태에서, 구조/기능 어레이는 소형 분자 저해제 또는 활성화제 또는 핵산 치료제, 예를 들면, 제한 없이, 리보핵산 주형 어레이의 하나 이상의 구조/기능 관계를 동요시킬 수 있을 뿐만 아니라 핵산-핵산 결합 상호작용 및 핵산-단백질 결합 상호작용을 검출할 수 있는 치료학적 안티센스 RNA, 리보자임, 압타머 및 소형 간섭 RNA의 효과를 시험하기 위해 유용할 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 리보핵산 주형 어레이는 본원에서 "단백질 어레이"로서 정의되는 이의 상응하는 아미노산 서열로 추가 번역될 수 있으며, 이는 예를 들면, 제한 없이 단백질-핵산 결합 상호작용 및 단백질-단백질 결합 상호작용을 연구하기 위해, 하나 이상의 연관 단백질 수용체에 특이적인 리간드(특히, 오르펀 리간드(orphan ligand))를 스크리닝하기 위해, 소형 분자 저해제 또는 활성화제 또는 핵산 치료제, 예를 들면, 제한 없이, 단백질 어레이의 하나 이상의 구조/기능 관계를 동요시킬 수 있는 치료학적 안티센스 RNA, 리보자임, 압타머 및 소형 간섭 RNA에 대한 약물 스크리닝을 위해 유용할 수 있다.
특정 실시형태에서, 복제된 덤벨 주형 어레이 및 증폭된 덤벨 주형 어레이는 단일 목적 용도, 예를 들면, 제한 없이, 전체 게놈 드 노보 서열분석에 이어서 서열-특이적 핵산-단백질 모티프의 동정을 위한 핵산-단백질 결합 상호작용의 검출을 넘어서는 추가의 정보를 제공함으로써 단지 한가지 목적 그 이상을 위해 유용할 수 있다. 700bp 이하의 단편을 증폭시키는 고체상 방법에 의존하는 DNA 어레이보다 유리한 본 발명의 이점은 적어도 1kb 초과 또는 바람직하게는 5kb 초과 또는 보다 바람직하게는 10 kb 및 가장 바람직하게는 50 kb의 대형 핵산 분자의 복제 또는 증폭이다. 주형 크기가 증가하는 복제된 덤벨 주형 어레이 및 증폭된 덤벨 주형 어레이는 핵산 분자를 따라서 2가지 이상의 핵산-단백질 결합 상호작용 이벤트의 협조적인 장기적 상호작용과 같은 추가의 정보를 제공할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 실시형태가 도시되어 있는 첨부된 도면을 참조로 하여 충분히 설명될 것이다. 그러나, 이러한 발명들은 많은 상이한 형태로 구현될 수 있으며 본원에 제시된 예시적 실시형태로 제한되는 것으로 해석되지 않아야 한다; 오히려, 이들 실시형태는 본 기술내용이 철저하고 완벽해질 수 있고 당업계의 숙련가들에게 본 발명의 범주가 충분히 전달될 수 있도록 제공된다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 덤벨 주형을 통한 환상 DNA 분자의 효과적 생산은 고체상 회전환 복제와 조합되어, 전술한 많은 상이한 목적들과 양립할 수 있는, 클론성 복제된, 대형-삽입체(10kb 크기) 복제된 덤벨 주형을 생성시켰다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 덤벨 주형을 통한 환상 DNA 분자의 효과적 생산은 고체상 회전환 증폭과 조합되어, 전술한 많은 상이한 목적들과 양립할 수 있는, 클론성 증폭된, 대형-삽입체(10kb 크기) 증폭된 덤벨 주형을 생성시켰다. 덤벨 주형은 효과적으로 생성되며 단편화된 핵산 분자 크기와 독립적이여서 현재의 차세대 서열분석 방법의 주요 한계를 극복한다. 덤벨 주형을 사용하는 회전환 복제 방법 또는 회전환 증폭 방법은 에멀젼 PCR 및 고체상 증폭과 같은 기타 고체상 증폭 방법에서 관찰된 단편화된 핵산 분자 크기의 주요 한계를 극복한다.
본 발명의 하나의 실시형태는 적어도 하나의 덤벨 주형의 복제 방법이며, 상기 방법은 적어도 하나의 핵산 분자를 단편화시켜 적어도 하나의 단편화된 핵산 분자를 형성시키는 단계; 연결제를 사용하여 하나 이상의 헤어핀 구조를 상기 적어도 하나의 단편화된 핵산 분자의 각 말단에 결합시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머는 적어도 하나의 기질에 부착되어 있는, 단계; 및 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉된 상기 적어도 하나의 덤벨 주형상에서 회전환 복제를 수행하여 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 형성시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태는 적어도 하나의 덤벨 주형의 증폭 방법이며, 상기 방법은 적어도 하나의 핵산 분자를 단편화시켜 적어도 하나의 단편화된 핵산 분자를 형성시키는 단계; 연결제를 사용하여 하나 이상의 헤어핀 구조를 상기 적어도 하나의 단편화된 핵산 분자의 각 말단에 결합시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 적어도 2개의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉시키고, 여기서, 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머는 적어도 하나의 기질에 부착되어 있는, 단계; 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉된 상기 적어도 하나의 덤벨 주형상에서 회전환 증폭을 수행하여 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 형성시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태는 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형의 검출 방법이며, 상기 방법은 적어도 하나의 핵산 분자를 단편화시켜 적어도 하나의 단편화된 핵산 분자를 형성시키는 단계; 연결제를 사용하여 하나 이상의 헤어핀 구조를 상기 적어도 하나의 단편화된 핵산 분자의 각 말단에 결합시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉시키고, 여기서, 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머는 적어도 하나의 기질에 부착되어 있는, 단계; 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉된 상기 적어도 하나의 덤벨 주형상에서 회전환 복제를 수행하여 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 및 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 검출하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 검출하는 단계는 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 서열분석하는 것으로 이루어진다.
본 발명의 다른 실시형태는 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형의 검출 방법이며, 상기 방법은 적어도 하나의 핵산 분자를 단편화시켜 적어도 하나의 단편화된 핵산 분자를 형성시키는 단계; 연결제를 사용하여 하나 이상의 헤어핀 구조를 상기 적어도 하나의 단편화된 핵산 분자의 각 말단에 결합시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 적어도 2개의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉시키고, 여기서, 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머는 적어도 하나의 기질에 부착되어 있는, 단계; 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉된 상기 적어도 하나의 덤벨 주형상에서 회전환 증폭을 수행하여 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 및 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 검출하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 검출하는 단계는 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 서열분석하는 것으로 이루어진다.
본 발명의 다른 실시형태는 적어도 하나의 덤벨 주형의 복제 방법이며, 상기 방법은 적어도 하나의 핵산 분자를 샘플로부터 단리시키는 단계; 적어도 하나의 핵산 분자를 단편화시켜 적어도 하나의 단편화된 핵산 분자를 형성시키는 단계; 연결제를 사용하여 하나 이상의 헤어핀 구조를 상기 적어도 하나의 단편화된 핵산 분자의 각 말단에 결합시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉시키고, 여기서, 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머는 적어도 하나의 기질에 부착되어 있는, 단계; 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉된 상기 적어도 하나의 덤벨 주형상에서 회전환 복제를 수행하여 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 형성시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태는 적어도 하나의 덤벨 주형의 증폭 방법이며, 상기 방법은 적어도 하나의 핵산 분자를 샘플로부터 단리시키는 단계; 적어도 하나의 핵산 분자를 단편화시켜 적어도 하나의 단편화된 핵산 분자를 형성시키는 단계; 연결제를 사용하여 하나 이상의 헤어핀 구조를 상기 적어도 하나의 단편화된 핵산 분자의 각 말단에 결합시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 적어도 2개의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉시키고, 여기서, 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머는 적어도 하나의 기질에 부착되어 있는, 단계; 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉된 상기 적어도 하나의 덤벨 주형상에서 회전환 증폭을 수행하여 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 형성시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태는 적어도 하나의 핵산 분자의 복제 방법이며, 상기 방법은 적어도 하나의 핵산 분자를 샘플로부터 단리시키는 단계; 연결제를 사용하여 하나 이상의 헤어핀 구조를 상기 적어도 하나의 핵산 분자의 각 말단에 결합시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉시키고, 여기서, 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머는 적어도 하나의 기질에 부착되어 있는, 단계; 및 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉된 상기 적어도 하나의 덤벨 주형상에서 회전환 복제를 수행하여 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 형성시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태는 적어도 하나의 핵산 분자의 증폭 방법이며, 상기 방법은 적어도 하나의 핵산 분자를 샘플로부터 단리시키는 단계; 연결제를 사용하여 하나 이상의 헤어핀 구조를 상기 적어도 하나의 핵산 분자의 각 말단에 결합시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 적어도 2개의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉시키고, 여기서, 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머는 적어도 하나의 기질에 부착되어 있는, 단계; 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉된 상기 적어도 하나의 덤벨 주형상에서 회전환 증폭을 수행하여 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 형성시키는 단계를 포함한다.
실시형태들은 본원에서 실시형태들을 강조하면서 설명되었지만, 첨부된 청구범위에서, 본원에서 구체적으로 기재된 것 이외의 실시형태가 실시될 수도 있다는 것이 이해되어야 한다. 본 발명이 이의 형태 중 오직 몇 가지로만 제시되었다 해도, 당업계의 숙련가들에게 본 발명이 이렇게 제한되지 않고 본 발명의 범주에서 벗어남이 없이 다양하게 변화될 수 있다는 것이 자명하다. 따라서, 첨부된 청구항의 취지 및 넓은 범위 내에 속하는 이러한 모든 대안, 변형 및 변경을 포괄하고자 한다.
당업계의 숙련가들은 본 발명의 취지 및 범주에서 벗어남이 없이 본 발명의 실시 방법에 많은 변화 및 변형이 가해질 수 있다는 것을 인지할 것이다. 도면 및 명세서에서 본 발명의 실시형태가 개시되었으며, 특정한 용어들이 사용되었지만, 이러한 용어들은 포괄적 및 서술적 의미로만 사용되며 제한하는 것을 목적으로 하지 않으며, 본 발명의 범주는 하기 청구범위에 제시되어 있다. 본 발명은 예시된 실시형태들을 참조로 하여 상당히 자세히 설명되었다. 그러나, 다양한 변형 및 변화가 본 명세서에서 설명된 바와 같은 본 발명의 취지 및 범주 내에서 이루어질 수 있음이 명백할 것이다. 게다가, 첫째 및 둘째와 같은 순서를 지칭하는 용어는 예시적 의미로 이해되어야 하며 제한적 의미로 이해되지 않아야 한다. 예를 들면, 당업계의 숙련가들은 특정 단계들이 단일 단계로 합쳐질 수 있다는 것을 인지할 것이다.
실시예
하기 실시예는 본 조성물 및 방법을 추가로 예시한다.
실시예 1
2가지의 상이한 헤어핀 구조를 함유하는 덤벨 주형의 크기 독립성이 입증되었다. 샘플 DNA, pUC18 벡터를 프라이머 세트(즉, 전방향: 5'-GGA TCC GAA TTC GCT GAA GCC AGT TAC CTT CG(서열 번호 1) 및 역방향: 5'-GGA TCC GAA TTC AGC CCT CCC GTA TCG TAG TT(서열 번호 2))를 이용하여 증폭시켜 425 염기쌍 생성물을 산출하였다. 각 프라이머의 5'-말단은 BamHI 및 EcoRI 제한 효소 부위 둘 다를 함유하였다. 이어서, PCR 생성물을 EcoRI로 분해시켜 5'-AATT 오버행을 만들고 QIAquick PCR 정제 키트로 정제하였다. 헤어핀 구조 1(5'-AATT GCGAG TTG CGA GTT GTA AAA CGA CGG CCA GT CTCGC(서열 번호 3))을 50℃까지 가열하고 이어서 냉각시켜 올리고뉴클레오타이드가 밑줄친 서열에서 자가-어닐링되도록 하여 5'-AATT 오버행을 생성시킴으로써 형성시켰다. 루프 구조는 M13 범용 프라이머 서열을 함유하였다. 헤어핀 구조 1 및 pUC18 PCR 생성물을 각각 10:1 몰비로 합하고, 37℃에서 40분 동안 5유닛 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제로 처리하고, 16℃에서 30분 동안 400 점착성 말단 유닛의 T4 DNA 리가제를 이용하여 연결시킨 다음, 65℃에서 10분 동안 불활성화시켜 덤벨 주형을 형성시켰다. 변성되었을 때, 덤벨 주형은 단일가닥 환이 되었다. 덤벨 주형을 QIAquick PCR 정화 키트로 정제하여 과량의 비연결된 헤어핀 구조를 제거하였다.
도 1에 도시된 M13 프라이머의 역 상보체(RC)를 사용하여 덤벨 주형상에서 회전환 복제를 수행하였다. 여기서, 2μM의 M13-RC 프라이머(5'-ACT GGC CGT CGT TTT ACA A(서열 번호 4)) 및 M13 대조군 프라이머(5'-TTG TAA AAC GAC GGC CAGT(서열 번호 5))를 20㎕ 반응물 중의 200μM dNTP 및 200㎍/mL BSA를 함유한 φ29 반응 완충액 중에서 5분 동안 94℃에서 가열하고 1분 동안 57℃까지 냉각시켜 약 10ng의 pUC18 덤벨 주형에 개별적으로 어닐링시켰다. 반응물을 30℃까지 추가 냉각시켰고, 이때 10유닛의 φ29 DNA 폴리머라제를 프라이밍된 덤벨 주형에 부가하고 30분 동안 인큐베이팅(incubating)한 다음, 65℃에서 10분 동안 열-불활성화시켰다. 대조군으로서, 정상적 M13 범용 서열분석 프라이머를 별개의 회전환 복제 혼합물로서 인큐베이팅하였다. 이어서, 복제된 덤벨 주형을 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, M13-RCR 생성물(레인 2)은 고분자량 생성물(웰 내의 상부 밴드)을 산출한 반면에, M13 대조군은 가시적 회전환 복제 생성물을 산출하지 않았다. 레인 2의 결과는 회전환 복제 방법이 고분자량 덤벨 주형을 생성하였음을 명백히 보여준다.
상기 제시된 방법은 헤어핀 구조를 단편화된 핵산 분자의 말단에 부착시키는 단지 한가지 방식에 불과하다. 예를 들면, 제한 없이, "T"-오버행을 갖는 헤어핀 구조 2(5'-T GCGAG TTG CGA GTT GTA AAA CGA CGG CCA GT CTCGC(서열 번호 6))와 같은 헤어핀 구조는 또한 TA-클로닝 및 평활 말단 연결에 의해 부착될 수 있다. 425bp pUC18 PCR 증폭물(amplicon)을 또한 NEBNext dA-테일링 키트로 처리하여 DNA 단편의 3'-말단에 "dA" 잔기를 부착시킬 수 있다. 이어서, pUC18 증폭물 및 헤어핀 구조 2를 전술한 방법을 사용하여 인산화시키고 함께 연결시켜 덤벨 주형을 생성할 수 있다. 이러한 접근법은 전체 게놈 샘플을 위한 대다수의 차세대 서열분석 라이브러리 제작 방법에 통합되어 있다.
실시예 2
게놈 DNA도 또한 출발 샘플로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 제한 없이, HapMap 샘플 NA18507로부터 정제된 게놈 DNA를 코리엘 세포 보관소(Coriell Cell Repositories)로부터 수득하고 표준 차세대 서열분석 방법(즉, 코바리스(Covaris) E210R 장치를 이용함)을 사용하여 전단시킨 다음, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 7.5 및 10.0kb로 크기 증가하는 단편에 대해 크기-선별하였다. 전술한 것과 유사하게, DNA 샘플을 단편화시켜 상이한 크기의 DNA 단편들을 생성시키고, 단편의 출발 번호를 정량하고, 동일한 조건을 사용하여 hpA/hpB를 연결시키고, hpA-단편-hpB 덤벨 주형을 증대시킬 수 있다. 농축 인자는, 이중-표지된 형광 현미경검사를 사용하여 공동국소화된 형광 시그널을 계수하고 이 수를 형광 시그널의 총 수와 비교함으로써 결정할 수 있다. 니콘 이클립스(Nikon Eclipse) 현미경 분석 도구는 강도 측정, 다중 형광 시그널의 공동국소화 및 코어 패키지 품목에 포함된 기타의 것들을 포함하는 다수의 분석을 수행할 수 있다.
본 실시예에서, 500ng의 정상 사람 게놈 DNA(Millipore)를 희석 제한 효소 반응에서 EcoR1로 분해시킨 다음, 65℃에서 불활성화시켰다. 어느 한 말단에 5'-AATT 오버행을 함유하는 이러한 단편들을 안정하고 고유한 헤어핀 구조, HP1에 연결시켰다. HP1(5'-AATT GCGAG TTG CGA GTT GTA AAA CGA CGG CCA GT CTCGC(서열 번호 3))은, 고염 완충액에서 95℃까지 가열시키고 이어서 빙상에서 빠르게 냉각시켜 상기 올리고뉴클레오타이드가 밑줄 친 서열에서 자가-어닐링되도록 하여 5'-AATT 오버행을 생성함으로써 형성시켰다. HP1 및 분해된 게놈 DNA를 각각 10:1 몰비로 합하고 16℃에서 30분 동안 400 점착성 말단 유닛의 T4 DNA 리가제로 연결시킨 다음, 65℃에서 10분 동안 불활성화시켜 덤벨 주형을 형성시켰다(도 3 참조). 희석된 분해 및 HP1 연결은 크기가 대략 20kb 내지 1kb의 범위인 덤벨 주형 DNA 자국을 생성시켰다. 덤벨 주형을 겔 정제하여 과량의 비연결된 및 자가-연결된 HP1 어댑터를 제거하고 크기 선별하여 3가지 상이한 단편 크기 10-6 kb, 6-3 kb 및 3-2 kb를 단리시켰다.
HP1의 루프 구조는 M13 범용 프라이머 서열을 함유하였다. RCR(즉, 하나의 프라이머를 사용함)을 M13 프라이머의 역 상보체를 사용하여 덤벨 주형상에서 수행하였다(도 3 참조). 여기서, 2μM의 M13-RC 프라이머 및 M13 대조군 프라이머(제시하지 않음)를 20㎕ 반응물 중의 200μM dNTP 및 200㎍/mL BSA를 함유한 φ29 반응 완충액 중에서 5분 동안 94℃에서 가열하고 2분 동안 45℃까지 냉각시켜 약 10ng의 크기-선별된 게놈 DNA 덤벨 주형에 개별적으로 어닐링시켰다. 반응물을 30℃까지 추가 냉각시켰고, 이때 10유닛의 φ29 DNA 폴리머라제를 프라이밍된 환에 부가하고 60분 동안 인큐베이팅한 다음, 65℃에서 10분 동안 열-불활성화시켰다. 출발 및 종결 물질을 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, EcoR1 분해된 HP1 연결된 게놈 DNA를 레인 1의 웰에 로딩시켰다. 크기 선별되고 정제된 덤벨 주형을 레인 2, 3 및 4의 웰에 로딩시켰다. 레인 5, 6 및 7에 로딩된 RCR 생성물은 겔 전기영동 후에 웰내에 잔류하는 고정성 복합체인 것으로 보인다. 예상된 M13-RC RCR 생성물은 고분자량 생성물(도 4의 레인 5, 6 및 7의 웰 내의 상부 밴드)을 산출한 반면, M13 대조군은 가시적 RCR 생성물을 산출하지 않았다(제시하지 않음). 도 4의 레인 5, 6 및 7의 결과는 덤벨 주형을 이용한 RCR 방법이 고분자량 DNA를 생성시켰음을 명백히 보여준다.
실시예 3
복제 덤벨 주형을 또한 대형의 단편화된 dA-테일링된 게놈 DNA로부터 생성시켰다. 여기서, 헤어핀을 TA-클로닝 및 평활 말단 연결에 의해 부착시켰다. TA-클로닝 접근법은 대다수의 현재 NGS 플랫폼에 잘 통합되어 있다. 본 발명자들은 "T"-오버행을 갖는 헤어핀 2 (HP2)(5'-/Phos-CTTTTTCTTTCTTTTCT GGGTTGCGTCTGTTCGTCT AGAAAAGAAAGAAAAAG T(서열 번호 7))를 디자인하였다. 사람 게놈 DNA(500ng)를 코바리스 G-튜브를 사용하여 단편화시켜, 도 5의 레인 1 및 2에 도시된 바와 같은 조밀하게 한정된 단편 길이 집단을 달성하였다. 이어서, 상기 게놈 DNA를 NEBNext Ultra DNA Library Prep 키트의 말단-제조 모듈(End-Preparation Module)을 사용하여 말단-수복시키고 dA-테일링하였다. HP2를 HP1와 유사하게 자가-어닐링시키고 Blunt/TA 리가제 마스터 믹스(5:1 몰비)를 사용하여 수복된 게놈 DNA에 연결시켰다. 과량의 HP2 및 비연결된 게놈 DNA를 엑소뉴클레아제 III 및 VII를 이용하여 제거하였다.
생성된 덤벨 주형을 Qiaex ii 비이드를 사용하여 정제하고, RCR 반응을 고유한 프라이머(5'-AAAAAAA CAGACGCAACCC(서열 번호 8))를 사용하여 이전에 기재된 반응과 유사하게 사용하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 2가지의 단편화된 게놈 DNA 집단은 코바리스 G-튜브(레인 1 및 2)의 고도로 조정가능한 단편화 성능을 나타낸다. 말단-수복된, dA-테일링된 HP2 연결된 단편으로부터 생성된 RCR 생성물은 겔 전기영동 후에 웰내에 잔류하는 고도로 고정성인 복합체로서 유지된다(레인 3 및 4).
실시예 4
다른 실험에서, 약 20㎕의 고분자량 정상 사람 게놈 DNA(gDNA)(100ng/㎕)를 130㎕ HPLC 등급 H2O와 합하고, 총 150㎕를 코바리스 G-튜브로 피펫팅하여 부가하였다. 상기 튜브를 먼저 5600RCF(즉, 상대적 원심력)에서 1분 동안 원심분리한 다음, G-튜브의 방향을 역전시키고 5600RCF에서 1분 동안 원심분리하였다. 이로써 도 6의 레인 2에 도시된 바와 같은 게놈 DNA의 약 8 내지 10kb 단편이 생성되었다.
게놈 DNA 샘플을 또한 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)(NEB) 프래그먼타제(fragmentase), 뉴클레아제 및 제한 효소를 사용하는 효소적 단편화; 작은 게이지 바늘을 통한 바늘 전단과 같은 기계력을 사용하는 단편화, 초음파처리, 포인트-싱크 전단, 분무, 음파 단편화 및 트랜스포솜 매개 단편화를 포함하나 이들로 제한되지 않는 당업계에 공지된 몇가지 방법을 사용하여 단편화시킬 수 있다.
이어서, 단편화된 DNA의 말단을, 돌출된 5'-말단 및 3'-말단에서의 뉴클레오타이드 제거 또는 혼입, 5' 인산화 및 dA-테일링과 같은 몇가지 수단 중 하나를 사용하여 적절한 어댑터와 연결시키기 위해 제조하였다. 상기 제조한 바와 같은 H2O 중의 약 55.5㎕의 단편화된 gDNA를 6.5㎕의 10x 말단-수복 완충액(NEB) 및 3㎕의 말단-제조 효소 믹스(NEB)와 합하고 서모사이클러 마이크로튜브로 분취해 넣었다. 그 다음, 상기 반응 혼합물을 20℃에서 30분 동안 인큐베이팅한 다음, 65℃에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 반응물을 반응 튜브를 빙상에 또는 4℃에 위치시켜 다음 단계를 위해 냉각시키고 제조하였다.
헤어핀 어댑터를 선형 올리고뉴클레오타이드로부터 생성시켰다. 동결건조된 어댑터를 HPLC H2O에 100μM로 재구성하였다. 다음 성분들을 마이크로 원심관 내에서 합하였다: 10㎕의 100μM 어댑터 스톡, 5㎕의 10x 말단-수복 완충액(NEB), 1㎕ 의 500 mM NaCl 및 34㎕의 HPLC H2O. 혼합물을 95℃에서 15분 동안 인큐베이팅한 다음, 4℃로 즉시 옮겼다.
헤어핀 어댑터를 단편화된 말단-수복된 gDNA의 각 말단에 부착시켜 덤벨 주형을 생성시켰다. 다음 성분들을 합하여 샘플 반응 혼합물을 형성시켰다: 전술한 바와 같은 수복된-말단을 갖는 65㎕의 단편화된 gDNA, 전술한 바와 같이 제조된 3㎕의 20μM 어댑터, 15㎕의 Blunt/TA 연결 마스터 믹스(NEB) 및 3㎕의 HPLC H2O. 상기 연결 반응을 20℃에서 1 내지 16시간 동안 진행되도록 한 다음, 4℃로 즉시 옮겼다.
비연결된 어댑터 및 단편화된 DNA를 엑소뉴클레아제로 분해시켰다. 다음 성분들을 합하여 샘플 반응 혼합물을 형성시켰다: 1㎕의 10x 엑소뉴클레아제 VII 완충액(NEB), 1㎕의 엑소뉴클레아제 VII, 1㎕의 엑소뉴클레아제 III 및 7㎕의 HPLC H2O. 상기 혼합물을 덤벨 주형, 비연결된 어댑터 및 유리 말단을 갖는 단편화된 DNA를 함유하는 연결 반응 혼합물에 부가하였다. 생성된 반응 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅한 다음, 95℃에서 10분 동안 인큐베이팅하고; 이어서 4℃로 다시 옮겼다.
도 6은 전술한 바와 같이 제조된 DNA 생성물의 아가로스 겔 분석의 일례이다. 레인 1은 비단편화된 게놈 DNA를 나타내고; 레인 2는 코바리스 G-튜브에서 단편화 후의 단편화된 DNA를 나타내고; 레인 3은 어댑터를 1㎍의 단편화된 DNA에 연결시킨 후 형성된 생성물을 나타내고; 레인 4는 어댑터를 500ng의 단편화된 DNA에 연결시킨 후 형성된 생성물을 나타내고; 레인 5는 어떠한 어댑터도 없는 연결 반응에서 1㎍의 단편화된 DNA 후의 생성물을 나타내고; 레인 6은 단편화된 DNA 없이 오직 어댑터만을 이용한 연결 반응 후 형성된 생성물을 나타내고; 레인 7은 어댑터를 1㎍의 단편화된 DNA에 연결시켜 수득된 생성물의 엑소뉴클레아제 분해 후 형성된 생성물을 나타내고; 레인 8은 어댑터를 500ng의 단편화된 DNA에 연결시켜 수득된 생성물을 엑소 III 및 엑소 VII로 엑소뉴클레아제 분해시킨 후 형성된 생성물을 나타내고; 레인 9는 어떠한 어댑터도 이용하지 않은 연결 반응에서 단편화된 DNA를 엑소 III 및 엑소 VII로 엑소뉴클레아제 분해시킨 후 형성된 생성물을 나타낸다. 레인 10은 단편화된 DNA 없이 어댑터만을 이용한 연결 반응으로부터 수득된 생성물을 엑소 III 및 엑소 VII로 엑소뉴클레아제 분해시킨 후 형성된 생성물을 나타낸다. 레인 11은 연결되지 않은 단편화된 게놈 DNA 및 어댑터의 분해 대조군을 나타낸다.
DNA 샘플을 또한 농축시켜 염을 제거하고 엑소뉴클레아제 내성 덤벨 주형을 농축시켰다. 엑소뉴클레아제 분해 후 반응 혼합물의 용적을 약 4㎕ HPLC H2O를 이용하여 100㎕ 용액으로 조정하였다. pH 5.2의 약 10㎕의 3M 나트륨 아세테이트 및 5㎕ 글리코겐(20mg/mL)을 상기 용액에 부가한 다음, 115㎕의 냉 100% 이소프로판올을 부가하였다. 상기 반응 혼합물을 -20℃에서 1시간을 초과하여 냉각시키고 실온에서 20분 동안 10RCF로 원심분리하였다. 상청액을 흡인하고, 침전물을 70% 에탄올로 세척하였다. 최종 침전물을 약 15분 동안 건조되도록 한 다음, 30㎕의 10μM Tris-HCl(pH 8.0)에 재현탁시켰다.
도 7은 전술한 바와 같이 제조된 DNA 생성물의 아가로스 겔 분석의 일례이다. 레인 1은 어댑터 10.1을 단편화된 DNA에 연결시키고 후속적으로 에탄올 침전시킨 후 형성된 생성물을 나타내고; 레인 2는 어댑터 2.1을 단편화된 DNA에 연결시키고 후속적으로 에탄올 침전시킨 후 형성된 생성물을 나타내고; 레인 3은 단편화된 DNA를 어댑터를 이용하지 않고 연결 반응시키고 후속적으로 에탄올 침전시킨 후 형성된 생성물을 나타내고; 레인 4는 단편화된 DNA 없이 오직 어댑터 10.1만을 연결 반응시키고 후속적으로 에탄올 침전시킨 후 생성물이 형성되지 않았음을 나타내고; 레인 5는 단편화된 DNA 없이 오직 어댑터 2.1만을 연결 반응시키고 후속적으로 에탄올 침전시킨 후 생성물이 형성되지 않았음을 나타내고; 레인 6은 단편화된 DNA 및 어댑터 없이 연결 반응시키고 후속적으로 에탄올 침전시킨 후 생성물이 형성되지 않았음을 나타낸다.
덤벨 주형을 또한 크기 선별하였다. 어댑터-어댑터 연결된 생성물과 같은 임의의 원치않는 생성물의 잔재를 최소화하기 위해 목적하는 크기의 엑소뉴클레아제 내성 덤벨 주형을 아가로스 겔 전기영동에 의해 단리시켰다. 0.8%(중량/용적) 1x TAE 아가로스 겔을 제조하였다. 적당량의 DNA 로딩 염료로 농축된 덤벨 주형을 제조하였고, 약 20㎕의 농축된 덤벨 주형을 아가로스 겔로 로딩시켰다. 생성물의 분리를 위해 충분한 시간 후에, 겔을 SybrSafe 겔 염색제로 염색시키고 라이트 박스에서 가시화하였다. 멸균 메스를 사용하여 목적하는 크기 범위의 덤벨 주형을 함유하는 겔 절편을 절제하였다. 덤벨 주형을 Qiaex ii 단리 프로토콜을 사용하여 단리시키고 30㎕ H2O에 재현탁시켰다.
이어서, 덤벨 주형을 고도의 점진적 가닥-변위 폴리머라제를 사용하여 회전환 복제하였다. 첫번째 반응 혼합물은 다음 성분들로 설정하였다: 5㎕의 크기-선별된 덤벨 주형, 1.5㎕의 10x phi29 폴리머라제 완충액(NEB), 1㎕의 덤벨 상보적 프라이머, 0.5㎕의 소 혈청 알부민(BSA) - 100mg/mL 및 7㎕의 HPLC H2O. 반응 혼합물을 95℃에서 10분 동안 인큐베이팅하고 5분 동안 45℃까지 냉각시킨 다음, 20℃까지 추가 냉각시켰다. 두번째 반응 혼합물은 다음 성분들로 설정하였다: 1㎕의 10x phi29 폴리머라제 완충액(NEB), 5㎕의 10 mM dNTP 믹스, 0.5㎕의 phi29 폴리머라제 및 3.5㎕의 HPLC H2O. 전술한 바와 같이 처리한 후 첫번째 반응 혼합물 및 두번째 반응 혼합물을 합하고 25℃에서 1 내지 4시간 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 생성된 혼합물을 20분 동안 65℃까지 가열하여 폴리머라제를 불활성화시켰다.
이어서, 회전환 복제 생성물을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 이의 고분자량으로 인해, 이들 회전환 복제 생성물은 웰 내에 존재하였고 전기영동 후 겔로 진입하지 않았다. 특정 추가의 조기 종결 생성물도 가시적이었다.
도 8은 도 6에서 분석된 생성물의 회전환 복제에 의해 생성된 DNA 생성물의 아가로스 겔 분석의 일례이다. 레인 1은 도 6의 레인 7로부터 절제된 생성물의 비효율적 회전환 반응을 나타낸다. 레인 2는 겔 전기영동 후 웰 내에 잔류하는 고도의 고정성 복합체로서 도 6의 레인 8로부터 절제된 생성물의 회전환 복제 후 수득된 회전환 생성물을 나타낸다. 레인 3은 도 6의 레인 9로부터 절제된 생성물의 회전환 복제 후에 회전환 생성물이 수득되지 않았음을 나타낸다. 레인 4는 도 6의 레인 10으로부터 절제된 생성물의 회전환 복제 후에 회전환 생성물이 수득되지 않았음을 나타낸다. 레인 5는 DNA가 존재하지 않은 회전환 반응으로부터 회전환 생성물이 수득되지 않았음을 나타낸다. 레인 6은 단편화된 DNA 생성물을 이용한 회전환 반응으로부터 회전환 생성물이 수득되지 않았음을 나타내며, 이는 단편화된 DNA로부터 무작위적 프라이밍이 없음을 나타낸다.
도 9는 도 7에서 분석된 생성물의 회전환 복제에 의해 생성된 DNA 생성물의 아가로스 겔 분석의 일례이다. 레인 1은 도 7의 레인 1에서 분석된 크기-선별된 생성물의 회전환 복제 후 수득된 회전환 생성물을 나타낸다. 겔 전기영동 후 웰 내에 잔류하는 고정성 복합체는 성공적 RCR 생성물의 지표이다. 레인 2는 도 7의 레인 2에서 분석된 크기 선별된 생성물의 회전환 복제 후에 수득된 회전환 생성물을 나타낸다. 레인 3은 도 7의 레인 3에서 분석된 크기 선별된 생성물의 회전환 복제 후에 수득된 회전환 생성물을 나타낸다. 레인 4는 도 7의 레인 4에서 분석된 크기 선별된 생성물의 회전환 복제 후에 회전환 생성물이 수득되지 않았음을 나타낸다. 레인 5는 도 7의 레인 5에서 분석된 크기 선별된 생성물의 회전환 복제 후에 회전환 생성물이 수득되지 않았음을 나타낸다. 레인 6은 도 7의 레인 6에서 분석된 크기 선별된 생성물의 회전환 복제 후에 회전환 생성물이 수득되지 않았음을 나타낸다. 레인 7, 8 및 9는 단편화된 DNA가 연결 없는 회전환 반응에 공급된 대조 반응(레인 7), 단편화된 DNA가 프라이머 없는 회전환 반응에 공급된 대조 반응(레인 8) 및 단편화된 DNA가 연결 없는 회전환 반응에 공급되지 않은 대조 반응(레인 9)에서 회전환 생성물이 수득되지 않았음을 나타낸다.
실시예 5
회전환 복제 생성물은 덤벨 주형의 헤어핀 서열의 상보적 영역을 향해 유도되는 분자 프로브 또는 비컨을 사용해서도 검출될 수 있다. 이러한 방법의 실행가능성을 입증하기 위해, H3 헤어핀 어댑터의 역가측정 시리즈를 0μM 내지 5μM의 범위의 농도로 생성시켰다. 10μM H3 헤어핀의 스톡 용액을 연속적으로 희석시켜 2x 시험 농도를 달성하였다. 헤어핀 어댑터 3(H3)은 하기 서열을 갖는다:
5'PO4-AATTG CGAGC TATGA CCATG ATTAC GCCAC TGGCC GTCGT TTTAC AACTC GC(서열 번호 9)
예를 들면, 10μM 스톡을 절반으로 희석시켜 5μM 시험 샘플을 달성하였고, 5μM 스톡을 절반으로 희석시켜 2.5μM 시험 샘플을 달성하였고, 이렇게 계속해서 반복하였다. 이는 2배(2x)의 실제 시험 농도를 나타낸다. 이어서, 약 5㎕의 2x H3 어댑터 농도를 1㎕의 NEB phi29 반응 완충액 10x, 1㎕의 200μ 비컨 2 및 3㎕의 HPLC H2O와 합하였다. 분자 비컨 2는 하기 서열을 갖고, "5,6-FAM"은 5-FAM 이성체와 6-FAM 이성체의 혼합물이며, "IABkFQ"는 IowaBlack 소광제이다:
5'-/5,6-FAM/CGGAGTTGCGAGTTGTAAAACGACGGCCAGTCTCCG/3-IABkFQ(서열 번호 10)
이러한 반응 혼합물을 설정하는데 있어서, 시험 샘플 중의 H3 농도를 최종 1x 측정된 농도까지 감소시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 핫 플레이트에서 98℃까지 가열하고, 10분 동안 상기 온도에서 유지시킨 다음, 벤치탑에서 천천히 냉각시켰다. 모든 반응 및 열순환 단계는 비컨으로부터의 시그널 손실을 방지하기 위해 소등 및 주석박이 씌워진 반응 튜브를 이용하여 수행하였다. 일단 실온으로 냉각되면, 반응물을 Molecular Devices SpectraMax Gemini XPS 형광 마이크로플레이트 리더에서 판독할 준비를 시켰다. 구체적으로는, SpectraDrop 마이크로플레이트 슬라이드를 사용하여 매우 작은 용적의 측정을 용이하게 하였다. 각 역가측정 반응물로부터 약 2㎕를 미세용적 슬라이드에 로딩하였다. 일단 기계에 삽입되면, 다음 프로그램을 실온에서 수행하였다:
여기 파장: 495 nm
방출 파장: 520 nm
6 플래쉬/판독
미처리(raw) 데이터를 모으고 도 10에 도시된 바와 같이 처리하였다. 배경 형광을 제거하여 정규화하기 위해 0μM에 대한 RLU(상대적 발광 단위) 판독을 모든 샘플로부터 공제하였다.
Figure 112016110613788-pct00001
실시예 6
실험은 단편 길이 크기와 독립적인 덤벨 주형의 제조 효율성을 측정하도록 디자인할 수 있다. 현재의 대형-단편 NGS 라이브러리 작제 방법의 주요 한계는 긴 DNA 단편의 말단을 환화시켜 메이트-쌍 주형을 생성시키는 것이다. 이상적으로, 덤벨 주형을 생성시키는 효율적 능력은 크기 독립적이어야 한다. 이러한 덤벨 주형들은 예를 들면 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 7.5 또는 10.0kb를 포함하나 이들로 제한되지 않는 다양한 크기일 수 있다. 이러한 단편 크기는 먼저 동일한 게놈 영역을 표적화하는 사람 BAC DNA를 사용하여 프라이머를 디자인하여 PCR로 생성시킬 수 있다. 이러한 접근법은 실시간 PCR을 사용하여 상이한 크기의 덤벨 주형의 카피수를 정량할 수 있도록 할 것이다. 일례로서, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies) 맞춤제작 TaqMan 검정 웹사이트를 사용하여 디자인한 TCF7L2 rs7903146 대립유전자에 대한 실시간 PCR 시약을 생성시켰다. 5'-프라이머 서열은 5'-CCT CAA ACC TAG CAC AGC TGT TAT(서열 번호 11)였고, 3'-프라이머 서열은 5'-TGA AAA CTA AGG GTG CCT CAT ACG(서열 번호 12)였고, 프로브 서열은 5'-CTT TTT AGA TA[C/T] TAT ATA ATT TAA(서열 번호 13)였다. 다른 예로서, 상이한 크기 단편을 생성할 수 있고, 증폭물의 출발 번호를 정량할 수 있고, 동일한 조건을 사용하여 헤어핀 구조 2를 연결시킬 수 있고 이어서 실시간 PCR을 사용하여 덤벨 주형 카피수를 정량할 수 있다.
다른 실험에서는, 정의된 단편 집단을 주로 2가지 방법, 코바리스 G-튜브 및 NEB 프랜그먼타제를 통해서 생성시킬 수 있다. 덤벨 주형의 제조 및 단리는 본원에 기재된 TA-클로닝 방법에 따를 것이다. 헤어핀 서열과 하이브리드화하는 분자 비컨은, 형광 플레이트 리더를 사용하여 상이한 크기의 덤벨 주형의 개수를 정량하는데 사용할 수 있다. 이러한 실험들은 덤벨 주형이 출발 게놈 DNA 샘플의 단편 크기와 독립적으로 효율적으로 생성될 수 있음을 입증한다. 게다가, 분자 비컨은 RCR 생성물 및 반응 효율을 정량하는데도 사용될 수 있다.
실시예 7
NGS 쌍 형성된-말단 서열분석 플랫폼에서 덤벨 주형의 효과적 삽입은 DNA 주형의 각 말단상의 고유한 프라이머 또는 헤어핀의 존재를 필요로 한다. 이것은 표준 말단 수복/dA-테일링 방법에 이어서 각각 고유한 범용 복제/서열분석 프라이밍 및 분자 비컨 부위를 함유하는 2가지의 고유한 헤어핀 올리고뉴클레오타이드(즉, hpA 및 hpB)의 연결을 통해 달성될 것이다. 헤어핀 연결 후, 본 발명자들은 25% hpA-단편-hpA, 50% hpA-단편-hpB 및 25% hpB-단편-hpB로 구성된 집단을 예상하였다. 목적하는 형태인 hpA-단편-hpB를 먼저 연결 생성물을 헤어핀 A의 역 상보체를 함유하여 hpA-단편-hpA 및 hpA-단편-hpB 주형은 포획하지만 hpB-단편-hpB 주형은 포획하지 않는 컬럼에 통과시킴으로써 포획-프로브 크로마토그래피에 의해 증대될 수 있다. 용출 후, 부분적으로 증대된 샘플을 헤어핀 B의 역 상보체를 함유하여 hpA-단편-hpB는 포획하지만 hpA단편-hpA 주형은 포획하지 않는 제2 컬럼상으로 통과시킨다. 이러한 이중-헤어핀 접근법은 상기 약술된 유사한 접근법을 사용하여 입증될 것이다; 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 7.5 및 10.0kb에 집중된 고유한 크기의 DNA 단편들의 집단을 생성시키고, 크기 선별하고, 정제하고, 말단-수복하고, dA-테일링할 것이다. 이어서, 이것을 hpA 및 hpB 헤어핀에 연결시키고 이중-표지할 것이고, hpA-단편-hpB 덤벨 주형은 전술한 기술을 사용하여 증대시킬 것이다. 용액-기반 분자 비컨을 사용하여 덤벨 주형 크기에 대한 복제 카피수의 의존성을 평가하기 위해 φ29 DNA 폴리머라제 및 T7 레플리솜 시스템을 사용한 초기 실험이 사용될 것이다.
실시예 8
회전환 증폭에 대한 조건은 10kb 덤벨 주형의 적어도 1,000배 복제가 뒷받침될 수 있을 정도로 적절한 DNA 폴리머라제, 복제 인자 및 반응 조건을 포함하도록 최적화시킬 수 있다. 1,000개 카피의 복제 배수가 일루미나 cBot 기기에서 달성된 클론성 증폭된 짧은 주형의 개수와 동등하고 이에 따라 유사한 수준의 형광 시그널이 서열분석 진행 동안 측정될 것이라 예상할 수 있기 때문에, 1,000개 카피의 복제 배수가 표적이 된다. 시판되는 DNA 폴리머라제(φ29, LongAmp, Bst, Bst 2.0, Q5 및 T7 DNA 폴리머라제) 뿐만 아니라 적어도 12가지의 비상업적 사유 계열 A, B 및 D DNA 폴리머라제를 포함하는 DNA 폴리머라제의 패널이 긴 합성을 위해 채용될 수 있다. 또한, 복제 부속 인자의 패널도 복제 인핸서로서 사용될 수 있다. DNA 폴리머라제 진행도를 증가시키는 진행도 클램프(processivity clamp) 및 클램프 로더 복합체(clamp loader complex), 단일가닥 DNA 영역을 안정화시키는 단일가닥 결합 단백질, DNA 폴리머라제 앞의 이중가닥 DNA를 분리시키는 헬리카제, 플랩(flap) DNA 구조를 분해하기 위한 플랩 엔도뉴클레아제 및 DNA 닉을 봉쇄하는 DNA 리가제를 포함하나 이들로 제한되지 않는 부속 단백질을 부가하여 목적하는 회전환 생성물의 생산 효율을 증가시킬 수 있다. 이러한 인자들은 동일한 계열 내의 DNA 폴리머라제와 교환될 수 있고 적절한 DNA 폴리머라제 파트너와 함께 시험될 수 있다. 예를 들면, 아키온 써모코커스 종(Thermococcus sp.) 9°N으로부터의 중심 부속 인자는 계열 B DNA 폴리머라제와 함께 사용될 수 있는 한편, 계열 A DNA 폴리머라제는 이. 콜라이 부속 인자와 함께 시험될 수 있다. 복제된 덤벨 주형 DNA를 측정하기 위해 정량적 PCR이 사용될 것이다. qPCR 프로브는 본원에 기재된 바와 같이 생성된 2kb 및 10kb 덤벨 주형의 헤어핀 영역을 표적으로 할 수 있다. 프라이밍된 덤벨 주형의 복제시, 프로브는 합성된 헤어핀 영역의 각 절편에 결합할 수 있다. 따라서, 희석된 헤어핀 주형의 표준 시리즈와 비교하여 카피수를 나타내기 위해 프로브 강도를 사용할 수 있다(도 11). qPCR 이외에, 증폭 생성물의 길이는 알칼리성 아가로스 겔 전기영동에 의해 모니터링될 수 있다. 알칼리성 아가로스 겔 전기영동은 DNA를 단일 가닥으로 분리시키고 전체 복제 생성물 길이를 정확하게 측정한다.
실시예 9
일례로서, 회전환 복제용으로 작용화된 최적 강도의 프라이머를 맞춤 디자인된 플로우셀의 유리 표면에 부착시킨다. 두 유리 슬라이드 사이에 샌드위치된 맞춤식 절단 접착성 가스켓을 도 11a에 도시된 바와 같이 디자인하였다. 레플리콘을 커버슬립의 바닥면에 부착시킨다. 유리 커버슬립은 나노포트 부품으로 체결된 입구/출구 포트를 갖는다. 여기서, 상기 가스켓은 마이크로채널을 갖는 3M 양면 테이프이이며 표준 현미경 슬라이드의 상부에 놓여진다. 이러한 디자인은 필수적인 광학적, 화학적 및 기계적 특성을 사용 용이성, 제조 속도, 단순성 및 비용 효율과 같은 실제적 필요사항과 짝을 이루게 한다.
도 11b에 도시된 바와 같이, 플로우셀 디자인은 130㎛ 두께의 3M 양면 접착성 필름 가스켓을 표준 1mm 두께 25 x 75mm 보로실리케이트 유리 슬라이드(VWR)와 25 x 75mm #1.5H 보로실리케이트 커버슬립(Schott Nexterion) 사이에 샌드위치시켜 형성시킨 마이크로채널로 구성된다. 미세유체 채널 가스켓 층을 레이저-커터(Universal X-660)를 사용하여 3M 양면 접착성 테이프로부터 절단해내고, 입구/출구 구멍을 상부 커버슬립 층을 통해 샌드-블라스팅하였다. 접착성 가스켓을 유리 슬라이드의 상부에 위치시킨 다음, 커버슬립을 가스켓의 상부에 위치시켜 채널을 밀봉하였다. 생성된 채널은 130㎛ 깊이, 3mm 너비 및 4cm 길이의 직사각형 횡단면을 갖는다. 나노포트 고정체(IDEX Health & Science)를 사용하여 플루오셀 내의 용액과 시약을 교환하기 위한 수단으로서 100㎛ ID PEEK 튜빙을 입구 및 출구 포트에 연결시켰다.
사전 합성된 올리고뉴클레오타이드는 화학적 전략을 사용하여 유리 표면에 부착시킬 수 있다. 이전의 연구가 특정 커플링 전략이 하이브리드화 및 고체상 PCR 적용의 성능에 영향을 줄 수 있다는 것을 제시한 바, 최적의 지지 화학을 동정하는 것은 중요하다. 일례로서, 3-아미노프로필트리에톡시실란과 같은 실란 시약을 이용한 유리 표면의 작용화가 첫번째 단계이다. 많은 화학적 커플링 전략은 아미노-변형된 올리고뉴클레오타이드를 수반한다. 이러한 말단-작용 그룹을 출발점으로서 사용하는 것은 유리 표면에의 올리고뉴클레오타이드의 부착에 대해 상이한 중간체 커플링제를 평가하는 체계적 접근법을 사용할 수 있도록 한다. 예를 들면, 제한 없이, 시아누르산 클로라이드 활성화 방법이 올리고뉴클레오타이드 서열 5'-NH2-TTTTTTTTTTTTGTAAAACGACGGCCAGT(서열 번호 14)를 커버슬립 표면에 부착시키는데 사용되었다. 기타 예는 몇몇 기타 활성화 화학, 예를 들면, 1,4-페닐렌 디이소티오시아네이트 및 디카복실산 반응을 사용할 수 있다. 모든 이러한 활성화 전략들은 유사하게 우수한 하이브리드화 데이터를 산출한다. 본 발명의 실시형태는 상이한 길이의 폴리(dT)n 링커(즉, n = 0, 10, 20)를 포함한다.
일례로서, 광역 LED 광원을 사용하고 가시 및 근적외선 영역에 걸쳐있는 상이한 형광 염료로 유연성을 제공하는 니콘 이클립스 FN1 현미경을 사용할 수 있다. 일례로서, dA-테일링 방법과 헤어핀 구조 3(5'-T CGCGAG
Figure 112016110757495-pct00002
Figure 112016110757495-pct00003
CTCGCG(서열 번호 15))을 사용하여 pUC18 덤벨 주형을 생성시켰다. 분자 비컨 2(5'-FAM-CGGAG
Figure 112016110757495-pct00004
CTCCG-IowaBlack(서열 번호 16))는 전술한 플로우셀에서 고체상 회전환 복제 반응을 검정하도록 디자인되었다. 밑줄 친 서열은 이중가닥 스템 영역을 나타내고, 첫번째 상자 안의 서열은 프로브 서열을 나타내고, 두번째 상자 안의 서열은 고정된 M13 프라이머 서열에 결합할 수 있는 프라이머 서열을 나타낸다. 분자 비컨은 낮은 배경 형광을 산출하므로, 표면-결합된 레플리콘을 생성시키는 충분한 회전환 복제가 있다면 우수한 시그널 대 노이즈 비(SNR)가 생성될 것이다. 0.5-kb 덤벨 주형의 희석율을 경험적으로 결정하여 시야(FOV)당 25 내지 50k의 레플리콘 밀도를 표적으로 할 수 있다.
특정 예에서, 표면 효과는 일부 반응을 억제할 수 있고, 폴리비닐피롤리돈 또는 고분자량 PEG와 같은 부동태화제의 사용을 필요로 할 수 있다. 특정 예에서, 낮은 수율, 포스포로티올레이트 프라이머는, φ29 DNA 폴리머라제가 단일가닥 DNA에 대한 현저한 엑소뉴클레아제 활성을 나타낼 수 있기 때문에, 사용될 수 있다.
실시예 10
이전의 실시예로부터 모아진 시약 및 조건을 단편화된 사람 게놈 DNA에 적용하여, 10 kb 덤벨 주형으로부터 클론성 복제된 NGS 호환가능한 클러스터를 생성시키는 강력한 능력을 입증할 수 있다. 특정 예에서, 10-kb 덤벨 주형은 표적 서열의 1,000개 카피를 산출할 수 있다. φ29, Bst 및 Vent(엑소-) DNA 폴리머라제를 포함하나 이들로 제한되지 않는 몇몇 DNA 폴리머라제는 회전환 복제 방법에서 효과적으로 작용한다. 최근에, 돌연변이체 φ29 DNA 폴리머라제는 DNA 합성 수율을 수배 증가시키는 것으로 동정되었으며 시그니스사(Sygnis, Inc)로부터 시판되고 있다. 특정 예에서, 레플리솜 복합체를 T7 시쿼나제, T7 헬리카제 및 T7 단일가닥 결합 단백질의 조직화된 활성을 사용하여 10kb 덤벨 주형을 복제하는데 사용할 수 있다. 특정 예에서, 덤벨 주형(0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 7.5 및 10.0kb의 크기 증분)을 용액 검정을 위해 사용할 수 있고 TCF7L2에 대한 실시간 PCR 시험을 사용하여 분석할 수 있다. 특정 예에서, 회전환 복제 방법의 효율 및 정확성을 개선시키기 위해, 예를 들면 기타 헬리카제, 단일가닥 결합 단백질, 티오레독신, 토포이소머라제, 역 가이라제 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 부속 단백질을 포함시킬 수 있다.
특정 예에서, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 7.5 또는 10.0kb의 덤벨 주형을 헤어핀 구조 3을 사용하여 제조하고 용액-기반 실시간 PCR 검정에서 동정된 몇가지 최적의 조건을 이용하여 시험하였다. 회전환 복제 방법 후, 복제된 덤벨 주형을 분자 비컨 2로 프로빙(probing)하고 형광 현미경으로 분석하여 복제된 덤벨 주형의 시그널 강도를 측정할 수 있다. 특정 예에서, 회전환 복제는 HapMap 샘플 NA18507로부터 단리된 실제의 주형으로서 이중-헤어핀 덤벨 주형을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 실시형태는 또한 본원에 기재된 방법을 실시하고 조성물을 제조하기 위한 키트로서 포장된 하나 이상의 헤어핀 구조, 효소, 기타 뉴클레오타이드 및 단백질 시약을 포함할 수 있다. 방법을 실시하고 본원에 기재된 바와 같은 회전 환 생성물의 존재를 검출하는데 있어 사용하기 위한 시약은 개별적으로 제공될 수 있거나 키트 형태로 함께 포장될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 방법의 다양한 단계들을 수행하기 위해 하나 이상의 프라이머, 하나 이상의 표지된 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 연관된 효소를 포함하는 키트를 제조할 수 있다. 키트는 또한 덤벨 주형을 정제하기 위해 하나 이상의 친화성 표지된 헤어핀 구조 및 상응하는 고체 지지체(들)의 포장된 조합을 포함할 수 있다. 키트의 용기 내 시약들의 배열은 수반된 특정한 시약들에 의존할 것이다. 각 시약은 개별적 용기내에 포장될 수 있지만, 다양한 조합이 또한 가능할 수 있다. 본 발명의 실시형태는 또한 하나 이상의 헤어핀 구조를 형성하는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드, 리가제, 보조인자, 부속 인자 및 적절한 완충액을 포함하는 연결을 위한 성분들의 세트, 및 실질적으로 상보적인 프라이머, 본원에 기재된 다양한 단계들을 수행하는 효소, 부속 인자 및 적절한 완충액을 포함하는 복제를 위한 성분들의 세트를 함유하는 키트를 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 실시형태는 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드; 헤어핀 구조를 샘플로부터의 적어도 하나의 핵산 분자에 연결시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성하기 위한 첫번째 성분 세트(여기서, 상기 첫번째 성분 세트는 리가제, 보조인자, 리가제-적절한 완충액 및 이들의 조합 중 하나 이상을 함유한다); 임의의 비연결된 헤어핀 구조 및 임의의 비연결된 핵산 분자를 분해시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 정제하기 위한 두번째 성분 세트(여기서, 상기 두번째 성분 세트는 엑소뉴클레아제, 엑소뉴클레아제-적절한 완충액 및 이들의 조합 중 하나 이상을 함유한다); 및 적어도 하나의 덤벨 주형을 복제하여 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 형성하기 위한 세번째 성분 세트(여기서, 세번째 성분 세트는 폴리머라제 또는 레플리솜, 뉴클레오타이드, 부속 인자 및 적어도 하나의 덤벨 주형의 한 영역에 실질적으로 상보적인 적어도 하나의 프라이머를 함유한다)를 함유하는 키트를 포함한다.
본 발명의 실시형태는 또한 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드; 헤어핀 구조를 샘플로부터의 적어도 하나의 핵산 분자에 연결시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성하기 위한 리가제; 임의의 비연결된 헤어핀 구조 및 임의의 비연결된 핵산 분자를 분해시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 정제하기 위한 엑소뉴클레아제; 및 적어도 하나의 덤벨 주형을 복제하여 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 형성하기 위한 폴리머라제 및 적어도 하나의 덤벨 주형의 한 영역에 실질적으로 상보적인 적어도 하나의 프라이머를 함유하는 키트를 포함한다.
본 발명의 특정 실시형태는 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드; 헤어핀 구조를 샘플로부터의 적어도 하나의 핵산 분자에 연결시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성하기 위한 리가제; 임의의 비연결된 헤어핀 구조 및 임의의 비연결된 핵산 분자를 분해시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 정제하기 위한 엑소뉴클레아제; 적어도 하나의 덤벨 주형을 복제하여 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 형성하기 위한 레플리솜 및 적어도 하나의 덤벨 주형의 한 영역에 실질적으로 상보적인 적어도 하나의 프라이머를 함유하는 키트를 포함한다.
본 발명의 특정 실시형태는 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드; 헤어핀 구조를 샘플로부터의 적어도 하나의 핵산 분자에 연결시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성하기 위한 리가제; 임의의 비연결된 헤어핀 구조 및 임의의 비연결된 핵산 분자를 분해시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 정제하기 위한 엑소뉴클레아제; 및 적어도 하나의 덤벨 주형을 증폭시켜 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 형성하기 위한 폴리머라제 및 적어도 하나의 덤벨 주형의 적어도 2개 영역에 실질적으로 상보적인 적어도 2개의 프라이머를 함유하는 키트를 포함한다.
본 발명의 특정 실시형태는 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드; 헤어핀 구조를 샘플로부터의 적어도 하나의 핵산 분자에 연결시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성하기 위한 리가제; 임의의 비연결된 헤어핀 구조 및 임의의 비연결된 핵산 분자를 분해시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 정제하기 위한 엑소뉴클레아제; 및 적어도 하나의 덤벨 주형을 증폭시켜 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 형성하기 위한 레플리솜 및 하나의 덤벨 주형의 적어도 2개 영역에 실질적으로 상보적인 적어도 2개의 프라이머를 함유하는 키트를 포함한다.
게다가, 본 발명의 실시형태가 본 발명의 특정 청구항의 주제를 형성하는 본원에 기술된 본 발명의 특질 및 이점의 견지에서 보다 잘 이해될 수 있도록 상기에서 본 발명의 특정 목적, 특질 및 기술적 이점이 광범위하게 약술되었으며 본 발명이 상세히 설명되었다. 개시된 개념 및 구체적 실시형태는 본 발명의 동일한 목적을 수행하기 위해 다른 구조를 변형 또는 디자인하기 위한 기반으로서 용이하게 사용될 수 있다는 것이 인지되어야 한다. 이러한 동등한 구성은 첨부된 청구범위에 제시된 바와 같이 본 발명으로부터 벗어나지 않는다는 것도 인지되어야 한다. 본 발명의 조직화 및 조작 방법 둘 다와 관련하여 본 발명의 특징인 것으로 사료되는 신규 특질은 추가 목적 및 이점과 함께, 첨부된 도면과 연관하여 고려될 때 상기 설명으로부터 더 잘 이해된다. 그러나, 이러한 설명 및 도면이 단지 예시와 설명의 목적으로만 제공되며 본 발명의 한계를 정하기 위한 의도는 아니라는 것이 명백히 이해될 것이다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명의 취지 및 범주 내에서 다양한 변형 및 변화가 이루어질 수 있다는 것은 당업계의 숙련가들에게 자명할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> REDVAULT BIOSCIENCES LP <120> SYSTEMS AND METHODS FOR CLONAL REPLICATION AND AMPLIFICATION OF NUCLEIC ACID MOLECULES FOR GENOMIC AND THERAPEUTIC APPLICATIONS <130> REDV.P0004WO <140> PCT/US2015/025492 <141> 2015-04-11 <150> US 61/978,823 <151> 2014-04-11 <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 1 ggatccgaat tcgctgaagc cagttacctt cg 32 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 2 ggatccgaat tcagccctcc cgtatcgtag tt 32 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 3 aattgcgagt tgcgagttgt aaaacgacgg ccagtctcgc 40 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 4 actggccgtc gttttacaa 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 5 ttgtaaaacg acggccagt 19 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 6 tgcgagttgc gagttgtaaa acgacggcca gtctcgc 37 <210> 7 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 7 ctttttcttt cttttctggg ttgcgtctgt tcgtctagaa aagaaagaaa aagt 54 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 8 aaaaaaacag acgcaaccc 19 <210> 9 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 9 aattgcgagc tatgaccatg attacgccac tggccgtcgt tttacaactc gc 52 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 10 cggagttgcg agttgtaaaa cgacggccag tctccg 36 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 11 cctcaaacct agcacagctg ttat 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 12 tgaaaactaa gggtgcctca tacg 24 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 13 ctttttagat acttatataa tttaa 25 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 14 tttttttttt ttgtaaaacg acggccagt 29 <210> 15 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 15 tcgcgagcta tgaccatgat tacgccactg gccgtcgttt tacaactcgc g 51 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 16 cggagctatg accatgatta cgccctccg 29

Claims (24)

  1. 적어도 하나의 핵산 분자의 복제 방법으로서, 상기 방법이:
    적어도 하나의 핵산 분자를 단편화시켜 5kb 초과의 최소 길이를 갖는 적어도 하나의 단편화된 핵산 분자를 형성시키는 단계;
    하나 이상의 헤어핀 구조를 상기 적어도 하나의 단편화된 핵산 분자의 각 말단에 연결시켜 적어도 하나의 덤벨(dumbbell) 주형을 형성시키는 단계;
    상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머는 적어도 하나의 기질(substrate)에 부착되어 있는, 단계;
    상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉된 상기 적어도 하나의 덤벨 주형상에서 회전환 복제(rolling circle replication)를 수행하여 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 및
    상기 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 차세대 서열분석(next-generation sequencing) 방법으로 서열분석하는 단계
    를 포함하는, 적어도 하나의 핵산 분자의 복제 방법.
  2. 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형의 검출 방법으로서, 상기 방법이:
    적어도 하나의 핵산 분자를 단편화시켜 5kb 초과의 최소 길이를 갖는 적어도 하나의 단편화된 핵산 분자를 형성시키는 단계;
    하나 이상의 헤어핀 구조를 상기 적어도 하나의 단편화된 핵산 분자의 각 말단에 연결시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키는 단계;
    상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머는 적어도 하나의 기질에 부착되어 있는, 단계;
    상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉된 상기 적어도 하나의 덤벨 주형상에서 회전환 복제를 수행하여 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 및
    상기 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 검출하는 단계로서, 여기서, 상기 검출하는 단계는 상기 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 차세대 서열분석 방법으로 서열분석하는 것을 포함하는, 단계
    를 포함하는, 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형의 검출 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 검출하는 단계가 상기 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 DNA 프로브와 접촉시킴을 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 DNA 프로브가 형광체(fluorophore)에 부착되어 있는, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    적어도 하나의 핵산 분자를 샘플로부터 단리시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  6. 적어도 하나의 핵산 분자의 복제 방법으로서, 상기 방법이:
    5kb 초과의 최소 길이를 갖는 적어도 하나의 핵산 분자를 샘플로부터 단리시키는 단계;
    하나 이상의 헤어핀 구조를 상기 적어도 하나의 핵산 분자의 각 말단에 연결시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키는 단계;
    상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머는 적어도 하나의 기질에 부착되어 있는, 단계;
    상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉된 상기 적어도 하나의 덤벨 주형상에서 회전환 복제를 수행하여 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 및
    상기 적어도 하나의 복제된 덤벨 주형을 차세대 서열분석 방법으로 서열분석하는 단계
    를 포함하는, 적어도 하나의 핵산 분자의 복제 방법.
  7. 적어도 하나의 핵산 분자의 증폭 방법으로서, 상기 방법이:
    적어도 하나의 핵산 분자를 단편화시켜 5kb 초과의 최소 길이를 갖는 적어도 하나의 단편화된 핵산 분자를 형성시키는 단계;
    하나 이상의 헤어핀 구조를 상기 적어도 하나의 단편화된 핵산 분자의 각 말단에 연결시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키는 단계;
    상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머는 적어도 하나의 기질에 부착되어 있는, 단계;
    상기 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉된 상기 적어도 하나의 덤벨 주형상에서 회전환 증폭을 수행하여 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 및
    상기 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 차세대 서열분석 방법으로 서열분석하는 단계
    를 포함하는, 적어도 하나의 핵산 분자의 증폭 방법.
  8. 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형의 검출 방법으로서, 상기 방법이:
    적어도 하나의 핵산 분자를 단편화시켜 5kb 초과의 최소 길이를 갖는 적어도 하나의 단편화된 핵산 분자를 형성시키는 단계;
    하나 이상의 헤어핀 구조를 상기 적어도 하나의 단편화된 핵산 분자의 각 말단에 연결시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키는 단계;
    상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 적어도 2개의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머는 적어도 하나의 기질에 부착되어 있는, 단계;
    적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉된 상기 적어도 하나의 덤벨 주형상에서 회전환 증폭을 수행하여 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 및
    상기 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 차세대 서열분석 방법으로 서열분석하는 것을 포함하는, 상기 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 검출하는 단계
    를 포함하는, 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형의 검출 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 검출하는 단계가 상기 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 DNA 프로브와 접촉시킴을 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 DNA 프로브가 형광체에 부착되어 있는, 방법.
  11. 적어도 하나의 핵산 분자의 증폭 방법으로서, 상기 방법이:
    5kb 초과의 최소 길이를 갖는 적어도 하나의 핵산 분자를 샘플로부터 단리시키는 단계;
    하나 이상의 헤어핀 구조를 상기 적어도 하나의 핵산 분자의 각 말단에 연결시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키는 단계;
    상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 적어도 2개의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머는 적어도 하나의 기질에 부착되어 있는, 단계;
    적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉된 상기 적어도 하나의 덤벨 주형상에서 회전환 증폭을 수행하여 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 및
    상기 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 차세대 서열분석 방법으로 서열분석하는 단계
    를 포함하는, 적어도 하나의 핵산 분자의 증폭 방법.
  12. 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형의 검출 방법으로서, 상기 방법이:
    적어도 하나의 핵산 분자를 단편화시켜 5kb 초과의 최소 길이를 갖는 적어도 하나의 단편화된 핵산 분자를 형성시키는 단계;
    하나 이상의 헤어핀 구조를 상기 적어도 하나의 단편화된 핵산 분자의 각 말단에 연결시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키는 단계;
    임의의 비연결된 헤어핀 구조 및 임의의 비연결된 단편화된 핵산 분자를 엑소뉴클레아제로 처리하여 상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 정제하는 단계;
    상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 적어도 2개의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머는 적어도 하나의 기질에 부착되어 있는, 단계;
    적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉된 상기 적어도 하나의 덤벨 주형상에서 회전환 증폭을 수행하여 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 및
    상기 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 검출하는 단계로서, 여기서, 상기 검출하는 단계는 상기 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 차세대 서열분석 방법으로 서열분석하는 것을 포함하는, 단계
    를 포함하는, 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형의 검출 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 검출하는 단계가 상기 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 DNA 프로브와 접촉시킴을 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 DNA 프로브가 형광체에 부착되어 있는, 방법.
  15. 적어도 하나의 핵산 분자의 증폭 방법으로서, 상기 방법이:
    5kb 초과의 최소 길이를 갖는 적어도 하나의 핵산 분자를 샘플로부터 단리시키는 단계;
    하나 이상의 헤어핀 구조를 상기 적어도 하나의 핵산 분자의 각 말단에 연결시켜 적어도 하나의 덤벨 주형을 형성시키는 단계;
    임의의 비연결된 헤어핀 구조 및 임의의 비연결된 핵산 분자를 엑소뉴클레아제로 처리하여 상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 정제하는 단계;
    상기 적어도 하나의 덤벨 주형을 적어도 2개의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉시키는 단계로서, 여기서, 적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머는 적어도 하나의 기질에 부착되어 있는, 단계;
    적어도 하나의 실질적으로 상보적인 프라이머와 접촉된 상기 적어도 하나의 덤벨 주형상에서 회전환 증폭을 수행하여 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 형성시키는 단계; 및
    상기 적어도 하나의 증폭된 덤벨 주형을 차세대 서열분석 방법으로 서열분석하는 단계
    를 포함하는, 적어도 하나의 핵산 분자의 증폭 방법.
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