CN111139289A - 基于哑铃环模板的恒温滚环扩增方法 - Google Patents

基于哑铃环模板的恒温滚环扩增方法 Download PDF

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CN111139289A CN201911360205.XA CN201911360205A CN111139289A CN 111139289 A CN111139289 A CN 111139289A CN 201911360205 A CN201911360205 A CN 201911360205A CN 111139289 A CN111139289 A CN 111139289A
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安然
梁兴国
刘梦琴
周广庆
张伯颖
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Abstract

本发明属于核酸扩增技术领域，具体涉及一种基于哑铃环模板的恒温滚环扩增方法，包括如下步骤：(1)制备哑铃环状DNA作为模板，所述哑铃环状DNA整体对称，两端为大小相等的环部区域，中间为完全互补的茎部区域；(2)将步骤(1)制备得到的模板加入到反应体系中进行超分支滚环扩增反应，反应得到的扩增产物自身形成二级结构。该基于哑铃环模板的恒温滚环扩增方法操作简单，在恒温条件下即可实现核酸扩增反应，在避免非特异性扩增的同时保证其高效扩增，提高扩增效率。

Description

基于哑铃环模板的恒温滚环扩增方法
技术领域
本发明属于核酸扩增技术领域，具体涉及一种基于哑铃环模板的恒温滚环扩增方法。
背景技术
滚环扩增技术(RCA)起源于上世纪九十年代，最初是使用单个引物进行扩增的线性滚环扩增方法(LRCA)，随后发展出了使用一对引物的超分支滚环扩增方法(HRCA)，以及在HRCA基础上引入切刻内切酶的PG-RCA、NRCA等扩增技术。发展至今，RCA已经成为最常用的等温扩增技术之一，其应用领域涉及药学、微生物检测、临床医学等。同样作为等温扩增技术，RCA在批量检测、现场检测方面比PCR更具有优势，在食品领域也有较高的应用价值，例如可通过RCA扩增食品内标物，建立食品溯源相关的检测技术等。
相较于LRCA技术而言，HRCA扩增效率更快、灵敏度更高，广泛应用于各检测技术及纳米领域中。但是，目前在使用HRCA扩增方法进行扩增时，很容易产生非特异性扩增或者发生扩增产物彼此互补的现象；非特异性扩增易产生和滚环扩增类似的假阳性结果，给检测带来极大的不便；而扩增产物彼此互补，会使引物难以结合到模板上进行指数扩增，导致扩增效率降低。出现上述问题是因为常规HRCA所用模板通常为二级结构极少的单环，其扩增产物单链部分刚性较弱，因此很容易彼此缠绕结合形成稳定的DNA双螺旋，占据引物结合位点，使游离的引物难以结合到扩增产物上，从而降低扩增效率。
因此，急需建立一种更高效的超分支滚环扩增方法，在避免非特异性扩增的同时保证其扩增效率，如果能通过改变模板二级结构，获得单链刚性较强不易彼此结合且保留引物结合位点的扩增产物，将能够极大提高HRCA的扩增效率。
发明内容
针对现有的HRCA扩增产物彼此结合占据引物结合位点的问题，本发明提出了一种基于哑铃环模板的恒温滚环扩增方法，为二代超分支滚环扩增方法，设计了一种新型哑铃环模板，利用哑铃环模板解决HRCA扩增时的自身产物互补的问题，在扩增模板内部引入发夹结构，环区部分的单链用于结合引物；该模板的扩增产物自身形成重复的茎环结构，保留了引物结合位点，从而在避免非特异性扩增的同时保证其扩增效率。
本发明的技术方案是：
基于哑铃环模板的恒温滚环扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备哑铃环状DNA作为模板，所述哑铃环状DNA整体对称，两端为大小相等的环部区域，中间为完全互补的茎部区域；
(2)将步骤(1)制备得到的模板加入到反应体系中进行超分支滚环扩增反应，反应得到的扩增产物自身形成二级结构；扩增产物自身形成的二级结构降低与其他互补产物结合的可能，为引物结合保留位点，从而实现高效扩增。
上述恒温扩增方法的作用原理及过程如下：
在环形模板自身内部设计了互补序列，使两端形成大小相等的单链环部区域以结合引物，相比于常规HRCA，这种二级结构的设计会使结合引物的区域变为较小的环，导致环的刚性变强，对扩增刚开始时的引物结合存在一定阻碍；
当第一条引物结合之后，随着扩增的进行，模板本身的二级结构被打开，开始和常规扩增一样生成串联重复的模板互补序列；
随后，其扩增产物中也存在互补部分并会优先形成自身的茎环结构，降低与其他扩增产物互补的几率；
自身形成的二级结构为引物结合保留了位点，随着扩增的进行，扩增的产物始终为引物保留结合位点，使指数扩增继续进行下去，达到提高反应效率的目的。
进一步的，所述哑铃环状DNA的长度为50～200nt。
进一步的，所述哑铃环状DNA的长度为80～120nt。
较短的DNA链具有一定的刚性，很难形成环状DNA；较长的DNA链则容易在合成时出现错误。本发明选择哑铃环状DNA的长度为50～200nt，优选长度为80～120nt。长度为80～120nt的DNA链能够精准合成并容易成环，且能够设计出较为稳定的茎部以及刚性较强的单链环部，适用于本发明中恒温扩增方法的扩增模板。
进行扩增时，引物位置可设计在模板的各个部位，优选环部；从而使得引物能够快速与环部单链结合从而进行滚环扩增。
进一步的，所述步骤(2)的反应体系包括两条DNA引物、限制性内切酶以及具有链置换作用的DNA聚合酶。
进一步的，所述DNA聚合酶为phi 29DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Vent(exo-)DNA聚合酶中的任一种；也可以选用其他具有链置换作用的DNA聚合酶，只要该DNA聚合酶具有链置换作用即可。
进一步的，所述步骤(1)中哑铃环状DNA的制备方法为环化方式，所述环化方式包括酶法连接、化学合成。哑铃环模板的制备不仅限于本说明书中提供的这两种方式，只要能制备出哑铃环，都可以用于二代超分支滚环扩增方法。
进一步的，所述步骤(1)还包括哑铃环状DNA的纯化，该纯化步骤包括但不限于采用Exo I和EXO III、切胶回收、HPLC方式对哑铃环状DNA进行纯化；此处纯化能够除去环化过程中产生的副产物、剩余底物等物质，以纯化和富集环状DNA。
进一步的，所述模板的浓度为10-3～1nM。
进一步的，所述扩增方法的温度范围为聚合酶最适温度范围；该温度范围内更适合聚合酶发挥活性，进行高效扩增。
本发明的有益效果：
(1)本发明所提供的哑铃环模板，在模板内部引入发夹结构，环区部分的单链用于结合引物；该模板的扩增产物自身形成重复的茎环结构，得到的产物单链部分较少且刚性较强，难以缠绕成双螺旋，从而降低与其他互补产物结合的可能，保留引物结合位点，在避免非特异性扩增的同时提高扩增效率。
(2)本发明所提供的扩增方法操作步骤简单，在恒温条件下即可实现核酸扩增反应；扩增产物的茎环部分存在大量单链，便于结合更多单链DNA引物，能够实现核酸的快速高效扩增。
附图说明
图1为实施例1提供的基于哑铃环模板的恒温扩增结果图；其中，图1A为二代超分支滚环扩增使用的哑铃环模板连接结果图，图1B为哑铃环模板纯化结果图，图1C为不同环模板浓度下的扩增结果图，图1D为二代超分支滚环扩增使用的哑铃环模板二级结构示意图，其中下划线部分为与引物序列相同或互补部分；
图2为实施例2提供的VentR(exo-)DNA聚合酶进行二代超分支滚环扩增。其中，图2A为不同环模板浓度下二代超分支滚环扩增结果，图2B为本部分环模板二级结构示意图，其中下划线部分为与引物序列相同或互补部分；
图3A为实施例3当引物被设计在茎部时不同环模板浓度下二代超分支滚环扩增的结果；
图3B为本部分环模板二级结构示意图，其中下划线部分为与引物序列相同或互补部分；
图4为二代超分支滚环扩增(A)与常规超分支滚环扩增(B)方法示意图；
图5C为对比例提供的二代超分支滚环扩增与常规滚环扩增结果图；图5A为二代超分支滚环扩增使用的哑铃环模板二级结构示意图，图5B为常规超分支滚环扩增使用的环模板二级结构示意图，其中下划线部分为与引物序列相同或互补部分；
图6为试验例1提供的二代超分支滚环扩增方法通用性验证，其中，图6A为不同环部长度的模板环二代超分支滚环扩增结果；图6B为不同茎部长度的模板环二代超分支滚环扩增结果；图6C为与T1-Loop 25同样二级结构结构但不同序列的模板环二代超分支滚环扩增结果，图6D为该序列模板环的二级结构，其中下划线部分为与引物序列相同或互补部分；
图7为试验例2酶切法验证扩增产物结构的结果；其中，图7A为MboI的酶切位点；图7B为AciI的酶切位点；图7C为扩增产物分别经过两种酶酶切后的产物电泳图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下，所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：基于哑铃环模板的恒温滚环扩增方法的构建
单链DNA原料：
T1-Loop 25-1：
TGCACTCATCCTTATGATTCAGCCGCCTCTTCTTGAGTGCAGTGATCTCA
T1-Loop 25-2：
GTAGGTTGCCCTTACTTCGTCAGCCACTTACTTCAACCTACTGAGATCAC
P1-T1-Loop 25:
5’-TGGCTGACGAAGT-3’
P2-T1-Loop 25:
5’-TATGATTCAGCCG-3’
1)利用Nanodrop 2000测定单链DNA(简称：ssDNA)在A260 nm处的吸光值并分析出序列浓度，将DNA序列稀释至100μM。
2)制备哑铃环模板：将磷酸化后的序列与相应稀释后的序列(该过程需要体系中含有一定离子浓度，可适量加入相应的连接反应Buffer)置入PCR仪中，94℃反应3min使DNA链完全变性打开，再以0.1℃/s的速率降至室温，以此使DNA链形成发夹，反应结束后立即加入到连接反应体系中。连接体系包括：DNA链(T1-Loop 25-1和T1-Loop 25-2)各1μM，TaqDNA连接酶6U，TaqDNA连接酶缓冲液1×(20mM Tris-HCl(pH 7.6@25℃)，25mM KAc，10Mm Mg(Ac)2，10mM DTT，1mM NAD和0.1％Triton X-100)，去离子水补齐至10μL。55℃反应4h。
3)纯化模板环：将连接后的DNA环用外切酶去除未连接的单链。酶切体系：DNA链0.5μM，Exonuclease I 5U，Exonuclease III 40U，Exonuclease I Buffer 0.5×(33.5mMglycine-KOH(pH 9.5at 25℃),3.35mM MgCl2，0.5mM DTT)，Exonuclease III Buffer 0.5×(33mM Tris-HCl(pH 8.0at 30℃)，0.33mM MgCl2)，去离子水补齐至10μL。37℃反应1h，75℃灭活20min。
4)二代HRCA扩增：将纯化后的模板环稀释至不同浓度，取1μL加入到HRCA体系中，体系中还包括：引物各5μM，phi 29DNA聚合酶3U，phi 29DNA聚合酶缓冲液1×(50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM(NH4)2SO4，4mM DTT，pH 7.5@25℃)，BSA200μg/mL，dNTPs 0.2mM，去离子水补齐至10μL。35℃反应4h。
5)凝胶电泳进行扩增产物分析：12％变性聚丙烯酰胺凝胶(含8M尿素)电泳分析哑铃环模板制备及纯化结果，1％琼脂糖电泳分析HRCA扩增产物，设置电压100V，电泳时间1h，电泳结果通过Gel Red染色观察，并通过Image Lab软件，根据条带亮度，对产物进行定量分析。由图1A和图1B可知，已制备得到较纯的哑铃环模板，并将其应用于二代HRCA扩增中，扩增结果如图1C所示，当哑铃环模板为100nt(其中茎部为25bp，环部为25nt)时，可在模板浓度为10-2nM时成功检测到扩增产物。
实施例2：VentR(exo-)DNA聚合酶进行二代HRCA扩增
扩增反应所需的DNA聚合酶选择VentR(exo-)DNA聚合酶，其中，哑铃环模板的制备与纯化步骤与实施例1一致，其余步骤如下：
单链DNA原料：
T1-Loop 25：
5’-TGCACTCATCCTTATGATTCAGCCGCCTCTTCTTGAGTGCAGTGATCTCAGTAGGTTGCCCTTACTTCGTCAGCCACTTACTTCAACCTACTGAGATCAC-3’
P8-T1-Loop 25：
5’-AGAAGAGGCGGCTGAATCATAAGGA-3’
P9-T1-Loop 25：
5’-CCCTTACTTCGTCAGCCACTTACTT-3’
1)利用Nanodrop 2000测定单链DNA(简称：ssDNA)在A260 nm处的吸光值并分析出序列浓度，将DNA序列稀释至100μM。
2)将纯化后的模板稀释至不同浓度，取1μL加入到HRCA体系中，体系中还包括：引物各5μM，VentR(exo-)DNA聚合酶4U，VentR(exo-)DNA聚合酶缓冲液1×(20mM Tris-HCl，2mMMgSO4，10mM(NH4)2SO4，10mM KCl，0.1％Triton X-100，pH 8.8@25℃)，dNTPs 0.2mM，去离子水补齐至10μL。65℃反应4h。
3)凝胶电泳进行扩增产物分析：1％琼脂糖凝胶电泳进行分析，设置电压100V，电泳时间1h，电泳结果通过Gel Red染色观察，并通过Image Lab软件，根据条带亮度，对产物进行定量分析。由图2A可知，在VentR(exo-)DNA聚合酶的作用下，T1-Loop 25在1nM处有明显的扩增产物，说明具有链置换活性的聚合酶能够进行二代超分支滚环扩增。
实施例3：当引物被设计在茎部时二代超分支滚环扩增的结果
单链DNA原料：
T1-Loop 25：
5’-TGCACTCATCCTTATGATTCAGCCGCCTCTTCTTGAGTGCAGTGATCTCAGTAGGTTGCCCTTACTTCGTCAGCCACTTACTTCAACCTACTGAGATCAC-3’
P1-T1-Loop 25:
5’-TGGCTGACGAAGT-3’
P7-T1-Loop 25:
5’-GTGCAGTGATCTCAGTAGGTTGCCCTT-3’
1)利用Nanodrop 2000测定单链DNA(简称：ssDNA)在A260 nm处的吸光值并分析出序列浓度，将DNA序列稀释至100μM。
2)将纯化后的模板稀释至不同浓度，取1μL加入到HRCA体系中，体系中还包括：引物各5μM，phi 29DNA聚合酶3U，phi 29DNA聚合酶缓冲液1×(50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM(NH4)2SO4，4mM DTT，pH 7.5@25℃)，BSA200μg/mL，dNTPs 0.2mM，去离子水补齐至10μL。35℃反应4h。
3)凝胶电泳进行扩增产物分析：1％琼脂糖电泳进行分析，设置电压100V，电泳时间1h，电泳结果通过Gel Red染色观察，并通过Image Lab软件，根据条带亮度，对产物进行定量分析。图3A可知，当引物设计在茎部时，二代超分支滚环扩增的检测限为1nM(泳道1)，与图1的10-2nM相差两个数量级，说明引物设计在茎部和环部都能够扩增，但环部更能提高扩增灵敏度。
对比例：二代超分支滚环扩增与常规超分支滚环扩增结果
单链DNA原料：
T1-Loop 25：
5’-TGCACTCATCCTTATGATTCAGCCGCCTCTTCTTGAGTGCAGTGATCTCAGTAGGTTGCCCTTACTTCGTCAGCCACTTACTTCAACCTACTGAGATCAC-3’
T-C 100:
5’-AGCAACAGCAAGGAGATACAGGAATGGGCATAGTCTTAGCAAGTCGCAGAGGAGAGATGAACAGTGAGCAAGGAAGGTACCGAGAATAGAGAGGACAGAT-3’
P1-T1-Loop 25:
5’-TGGCTGACGAAGT-3’
P2-T1-Loop 25:
5’-TATGATTCAGCCG-3’
P1-T-C 100:
5’-CCATTCCTGTATC-3’
P2-T-C 100:
5’-AACAGTGAGCAAG-3’
1)利用Nanodrop 2000测定单链DNA(简称：ssDNA)在A260 nm处的吸光值并分析出序列浓度，将DNA序列稀释至100μM。
2)将纯化后的模板稀释至不同浓度，取1μL加入到HRCA体系中，体系中还包括：引物各5μM，phi 29DNA聚合酶3U，phi 29DNA聚合酶缓冲液1×(50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM(NH4)2SO4，4mM DTT，pH 7.5@25℃)，BSA200μg/mL，dNTPs 0.2mM，去离子水补齐至10μL。35℃反应4h。
3)凝胶电泳进行扩增产物分析：1％琼脂糖凝胶电泳进行分析，设置电泳100V，电泳时间1h，电泳结果通过Gel Red染色观察，并通过Image Lab软件，根据条带亮度，对产物进行定量分析。图5C中，1泳道为Ladder，1-4泳道不同环模板浓度下哑铃环状模板(T1-Loop25)的二代超分支滚环扩增结果；5-8泳道为不同环模板浓度下传统滚环扩增结果；由图5C可知，常规环状模板仅在模板浓度为1nM时(泳道5)能检出扩增产物，而且扩增产物全部在胶孔里，说明常规滚环扩增没有进行指数扩增或者指数进行了极少数的指数扩增，大多数时间仍然在进行线性扩增，因此产物越来越长，在电泳中迁移速率非常低，基本都滞留在胶孔中。而哑铃形滚环扩增则在模板浓度从1nM至0.01nM时(泳道1-3)均能检测出扩增产物，产物量随着模板浓度降低逐渐降低，同时在泳道中有弥散的产物条带，因此可以推断哑铃形模板能够进行指数扩增。通过对比可知，哑铃环模板在进行HRCA时比常规HRCA使用的模板更具有优势，可以将检测灵敏度提高数十倍以上。
试验例1：二代超分支滚环扩增方法通用性验证
单链DNA原料：
T-Loop 15:
5’-TGCACTCATTATGTAGCCGCCTTTGAGTGCAGTGATCTCAGTAGGTTGCCATCCGTACTTACTCAACCTACTGAGATCAC-3’
P1-T-Loop 15:
5’-GTAAGTACGGATG-3’
P2-T-Loop 15:
5’-TATGTAGCCGCCT-3’
T-Loop 20:
5’-TGCACTCATTTATGATTCAGCCGCCCCTTGAGTGCAGTGATCTCAGTAGGTTGCCCTTACCGTCAACTTACTTCAACCTACTGAGATCAC-3’
P1-T-Loop 20:
5’-TAAGTTGACGGTA-3’
P2-T-Loop 20
5’-TGATTCAGCCGCT-3’
T-Loop 30:
5’-CGGGAGTGCAGCAAGGAGATACACGAATGGGCATAGTCCACTCCCGTATGTGATCTCGTCTAGGATGATAAGTGAGCAAGGAAGGTACCGAGACTAGACGAGATCACATA-3’
P1-T-Loop 30:
5’-CCATTCGTGTATC-3’
P2-T-Loop 30:
5’-TGATAAGTGAGCA-3’
T1-Loop 25：
5’-TGCACTCATCCTTATGATTCAGCCGCCTCTTCTTGAGTGCAGTGATCTCAGTAGGTTGCCCTTACTTCGTCAGCCACTTACTTCAACCTACTGAGATCAC-3’
P1-T1-Loop 25:
5’-TGGCTGACGAAGT-3’
P2-T1-Loop 25:
5’-TATGATTCAGCCG-3’
T-Loop 35:
5’-CGGGAGTGAGCAACAGCAAGGAGATACACGAATGGGCATAGTCCACTCCCGTATGTGATCTCGTCTAGCGAGAGATGATAAGTGAGCAAGGAAGGTACCGAGACTAGACGAGATCACATA-3’
T2-Loop 25:
5’-AAGCGTGCACTCATCCTTATGATTCAGCCGCCTCTTCTTGAGTGCACGCTTGTGATCTCACGACGGTAGGTTGCCCTTACTTCGTCAGCCACTTACTTCAACCTACCGTCGTGAGATCAC-3’
T3-Loop 25:
5’-TGTCTCAGTCTCACTCCCGCTGTCTTCGATCTGTCGATCTGTGTCAGTGACTCTCATGACTCTCACTGTACCTCTTCACTGACACTGATCGACAGATCGA-3’
P1-T3-Loop 25：
5’-ACAGTGAGAGTAC-3’
P2-T3-Loop 25：
5’-AGTCTCACTCACT-3’
1)利用Nanodrop 2000测定单链DNA(简称：ssDNA)在A260 nm处的吸光值并分析出序列浓度，将DNA序列稀释至100μM。
2)将纯化后的模板稀释至不同浓度，取1μL加入到HRCA体系中，体系中还包括：引物各5μM，phi 29DNA聚合酶3U，phi 29DNA聚合酶缓冲液1×(50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM(NH4)2SO4，4mM DTT，pH 7.5@25℃)，BSA200μg/mL，dNTPs 0.2mM，去离子水补齐至10μL。35℃反应4h。
3)凝胶电泳进行扩增产物分析：1％琼脂糖凝胶电泳进行分析，设置电泳100V，电泳时间1h，电泳结果通过Gel Red染色观察，并通过Image Lab软件，根据条带亮度，对产物进行定量分析。图6A为不同环部长度的模板环二代超分支滚环扩增结果；L：O’RangeRuler50bp DNALadder，1-5泳道为环部为15nt时不同环模板浓度下的扩增结果，6-10泳道为环部为20nt时不同环模板浓度下的扩增结果，11-15泳道为环部为25nt时不同环模板浓度下的扩增结果，16-20泳道为环部为30nt时不同环模板浓度下的扩增结果，21-24泳道为环部为35nt时不同环模板浓度下的扩增结果；图6B为不同茎部长度的模板环二代超分支滚环扩增结果；L：O’RangeRuler 50bp DNALadder，1-5泳道为茎部为25bp时不同环模板浓度下的扩增结果，6-10泳道为茎部为35bp时不同环模板浓度下的扩增结果；
由图6A可知，环区为15nt和20nt的哑铃环模板仅在模板浓度为1nM时(泳道1、6)有少量扩增产物；25nt的哑铃环模板在0.01nM时(泳道13)可检测到的扩增产物；而30nt和35nt的哑铃环模板在1nM时(泳道16、21)有明显的扩增产物，此外，本次实验中对照组(5、10、15、20泳道)中均无扩增产物，说明不同环部长度均能有效进行二代超分支滚环扩增。
由图6B可知，25bp茎长的哑铃环模板可以在最低0.01nM浓度下(泳道2)扩增出产物，而35bp茎长的哑铃环模板能够在1pM的模板浓度下(泳道8)检出扩增产物，说明不同茎部长度均能有效进行二代超分支滚环扩增。
由图6C可知，模板序列T3-Loop 25的扩增结果与T1-Loop 25几乎一致，检测限为0.01nM(泳道1-3)，说明相同二级结构时，不同DNA序列均能进行二代超分支滚环扩增。综上所述，说明本发明通用性较好，可适用于多种二级结构模板，且不因DNA序列变化而降低扩增效率。
试验例2：酶切法验证扩增产物结构
单链DNA原料：
T1-Loop 25：
5’-TGCACTCATCCTTATGATTCAGCCGCCTCTTCTTGAGTGCAGTGATCTCAGTAGGTTGCCCTTACTTCGTCAGCCACTTACTTCAACCTACTGAGATCAC-3’
P1-T1-Loop 25:
5’-TGGCTGACGAAGT-3’
P2-T1-Loop 25:
5’-TATGATTCAGCCG-3’
1)利用Nanodrop 2000测定单链DNA(简称：ssDNA)在A260 nm处的吸光值并分析出序列浓度，将DNA序列稀释至100μM。
2)将纯化后的模板稀释至不同浓度，取1μL加入到HRCA体系中，体系中还包括：引物各5μM，phi 29DNA聚合酶3U，phi 29DNA聚合酶缓冲液1×(50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM(NH4)2SO4，4mM DTT，pH 7.5@25℃)，BSA200μg/mL，dNTPs 0.2mM，去离子水补齐至10μL。35℃反应4h。
3)将扩增产物用MboI和AciI分别酶切，1％琼脂糖凝胶电泳进行分析，设置电泳100V，电泳时间1h，电泳结果通过Gel Red染色观察，并通过Image Lab软件，根据条带亮度，对产物进行定量分析。图7中，MboI的酶切结果比较彻底，基本上不存在较长的条带，而酶切产物分布在50bp左右；而AciI的酶切结果出现自上而下的阶梯状条带，泳道口中还存在少许大片段DNA条带。由于MboI的酶切位点在模板茎部(图7A)，因此无论是扩增出的双链还是单链产物本身形成的发夹结构均可以被切断，而RCA扩增产物是与模板互补或相同的双链，因此应当每隔50bp有一个酶切位点，这与其酶切产物在电泳图上的表现相符合。而AciI的酶切位点在环区(图7B)，只有环部经扩增形成双链才会被酶切，单链产物即使形成发夹结构其环部区域仍然是单链，无法被酶切，酶切后的产物往往带有长短不一的串联发夹结构。
此外，由于发夹的环部区域无法被酶切，可以说明扩增产物的发夹结构之间即使完全互补，其环部区域也很难形成双链结构，从侧面证明本研究的可行性。以上结果可以判断该扩增反应是按照预期的设计进行的，反应产物按照实验设计形成了串联的发夹结构，且在反应结束后仍然存在较多的串联发夹。
上述说明仅为本发明的优选实施例，并非是对本发明的限制，凡在本发明的内容范围内所做出的任何修改、等同替换、改型等，均应包含在本发明的专利保护范围之内。

Claims (9)

1.基于哑铃环模板的恒温滚环扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备哑铃环状DNA作为模板，所述哑铃环状DNA整体对称，两端为大小相等的环部区域，中间为完全互补的茎部区域；
(2)将步骤(1)制备得到的模板加入到反应体系中进行超分支滚环扩增反应，反应得到的扩增产物自身形成二级结构。
2.根据权利要求1所述的基于哑铃环模板的恒温滚环扩增方法，其特征在于，所述哑铃环状DNA的长度为50～200nt。
3.根据权利要求2所述的基于哑铃环模板的恒温滚环扩增方法，其特征在于，所述哑铃环状DNA的长度为80～120nt。
4.根据权利要求1所述的基于哑铃环模板的恒温滚环扩增方法，其特征在于，所述步骤(2)的反应体系包括两条DNA引物、限制性内切酶以及具有链置换作用的DNA聚合酶。
5.根据权利要求4所述的基于哑铃环模板的恒温滚环扩增方法，其特征在于，所述DNA聚合酶为phi 29DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶或Vent(exo-)DNA聚合酶。
6.根据权利要求1所述的基于哑铃环模板的恒温滚环扩增方法，其特征在于，所述步骤(1)中哑铃环状DNA的制备方法为环化方式，所述环化方式包括酶法连接、化学合成。
7.根据权利要求1所述的基于哑铃环模板的恒温滚环扩增方法，其特征在于，所述步骤(1)还包括哑铃环状DNA的纯化，所述纯化方式包括采用Exo I纯化、EXO III纯化、切胶回收或HPLC纯化。
8.根据权利要求1所述的基于哑铃环模板的恒温滚环扩增方法，其特征在于，所述模板的浓度为10-3～1nM。
9.根据权利要求1所述的基于哑铃环模板的恒温滚环扩增方法，其特征在于，所述扩增方法的温度范围为聚合酶最适温度范围。
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