CN113046453B

CN113046453B - 一种基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术检测dna点突变的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN113046453B
Application number: CN202110312647.8A
Authority: CN
Inventors: 张童; 隋国栋; 赵望; 赵伟; 戴瑞雪; 刘思秀
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2021-03-24
Filing date: 2021-03-24
Publication date: 2023-02-03
Anticipated expiration: 2041-03-24
Also published as: CN113046453A

Abstract

本发明公开了一种基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术检测DNA点突变的方法及试剂盒。本方法首先将锁式探针和DNA模板连接形成带有茎环结构的长串联重复序列片段，然后将该产物和茎环引物、滚环引物、等温扩增引物混合在一起，构造双茎环扩增元件进行指数扩增，达到信号的指数放大。其中，锁式探针包括正常型锁式探针和突变型锁式探针，将突变位点设计在突变型锁式探针的3’末端，可以很好的区分突变模板和正常模板。本发明通过采用SYBR I来进行实时荧光检测，信号明显，实现了双链点突变的快速检测，且具有很高的灵敏度和准确性，给与临床指导用药带来益处。

Description

一种基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术检测DNA点突变的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术，通过组合锁式探针和茎环引物，通过连接反应和扩增反应两步法从而检测双链DNA点突变，适合特异性点突变的检测。

背景技术

点突变是基因突变的一种主要形式，特定点突变常会引起蛋白编码的错误，从而翻译出错误的蛋白质，这在某些疾病和病原微生物诊断中具有重要意义。如肺癌EGFR基因T790M突变使一代靶向药物特罗凯和易瑞沙失去作用，只有三代药物泰瑞莎起作用。

肺炎支原体是一种介于病毒和细菌之间的微生物，在5-20岁年龄段人中最常见，可通过气溶胶微粒的形式传播，造成肺外各系统改变，目前医院中常见的检测手段主要是胶体金法。肺炎支原体23s rRNA结构域V区A2063G突变是肺炎支原体最常见的突变位点，该突变位点常常伴随着14环和15环抗生素失效，目前临床上诊断该耐药主要是药敏法，大约需要一至两天时间。如果不能很好的检测这些点突变，这些DNA点突变在临床上都会给与指导用药带来很大的麻烦，会造成药物无效以及耽误治疗黄金时间。根据常见点突变的检测结果可以在第一时间给与相应病情的病人更好的治疗方案。目前常用的点突变检测方法主要是基于电泳的方法和基于PCR扩增的方法。电泳方法操作要求可能更高，时间较长，不利于在医院推广。基于核酸的扩增方法操作简单，可通过制成试剂盒进行操作，集成化能更高。核酸扩增检测点突变的方法使用较多的有BEAMing PCR以及ARMS扩增阻滞系统。BEAMing PCR是首先通过磁珠加上引物，然后进行油包水PCR，收集磁珠，通过对突变模板和正常模板设计不同的探针，杂交后读取荧光，从而判读出突变比例。这种方法结果准确，操作要求高，适合伴随诊断。ARMS扩增阻滞系统是在突变位点设计一条引物，使其3’端末端和突变位点互补，这样可以很好的区分开来正常模板和突变模板，其技术的核心是特异性引物的筛选。这种方法操作相对简单，但对模板序列要求较高，结果准确率不是很高。

上述方法都需要繁锁的步骤、复杂的仪器设备以及长时间的诊断步骤，因此亟需一种操作简便、高效快捷、低成本的DNA点突变检测方法，以解决上述问题。

锁式探针检测是锁式探针的5’端和3’端会分别和模板链互补，通过连接酶或者扩增酶来补齐缺口，形成完整环状单链，其5’端和3’端连接臂对于序列的要求不高，且模板序列的碱基长度可控范围大。添加环上引物和第二链引物可以分别进行线性扩增和指数扩增，或者是进行多线性和指数扩增是一种很好的检测方法。茎环结构是环引物扩增的核心元件，可以作为很多扩增方法的媒介。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术检测DNA点突变的方法及试剂盒，以解决现有技术中步骤繁琐、仪器复杂且检测时间长的问题。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供一种基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术检测DNA点突变的方法，具体包括以下：

一种基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术检测DNA点突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，提供DNA模板以及突变型锁式探针，通过连接酶连接，获得环化产物；所述的突变型锁式探针的序列为5’连接臂-第一功能区-第二功能区-第三功能区-3’连接臂，所述的5’连接臂和3’连接臂与DNA模板互补，且DNA点突变位点设计在锁式探针的3’末端；

S2，加入滚环引物，与S1中所述的环化产物结合，进行滚环扩增，获得带有茎环结构的长串联重复序列片段；所述的滚环引物5’-3’端的序列依次为：第一功能区，以及与第二功能区反向互补序列；

S3，加入茎环引物，与S2得到的所述的带有茎环结构的长串联重复序列片段结合，延伸得到双茎环结构产物；所述的茎环引物包含3’突出端，且3’突出端的序列与所述的第三功能区相同；

S4，利用环介导等温扩增技术扩增S3得到的所述的双茎环结构产物，并进行检测分析。

优选地，所述的方法还包括对所述DNA模板的质量进行检测，具体包括：提供正常型锁式探针，进行步骤S1、S2、S3、S4，对得到的扩增产物进行检测；所述的正常型锁式探针的序列为5’连接臂-第一功能区-第二功能区-第三功能区-3’连接臂，其中5’连接臂和3’连接臂设计在DNA模板的非突变位点区且与该区互补，所述的第一功能区-第二功能区-第三功能区与所述的突变型探针的该些序列相同。

优选地，所述的正常型锁式探针和突变型锁式探针的5’连接臂长度为10-20bp，3’连接臂长度为15-25bp，第一功能区长度为10-20bp，第二功能区长度为15-30bp，第三功能区长度为20-40bp。

优选地，所述的S1反应条件为：65℃、10min或95℃、5min预加热，95℃、30s到65℃，5min共10个循环，再95℃、5min。

优选地，所述的S4反应过程采用荧光染色法进行检测分析。

本发明的第二个目的是提供采用上述方法检测点突变的试剂盒，该试剂盒包含：所述的突变型锁式探针、正常型锁式探针、滚环引物、茎环引物和等温扩增引物，所述的等温扩增引物和滚环引物一起用于扩增所述的双茎环结构产物，得到指数扩增产物。

优选地，所述的正常型锁式探针、突变型锁式探针的使用浓度为1nM-100nM。

优选地，所述的滚环引物的使用浓度为0.5μM-1.5μM，茎环引物的使用浓度为50nM-150nM，等温扩增引物的使用浓度为0.5μM-1.5μM。

进一步地，所述的试剂盒用于检测肺炎支原体A2063G点突变，所述的突变型锁式探针序列为：5’-CCGTCCCGTTGCGCCTAACT TTTCGACACGACACGATTTTGGAACTCTGCTCGACGGATTAAAATAATACAGTCTGCCCACAACCTTTTAAGCTTCACGGGGTCTTC-3’；所述的正常型锁式探针序列为：5’-CCCATATACATCACCTTACGTTTTCGACACGACACGATTTTGGAACTCTGCTCGACGGATTAAAATAATACAGTCTGCCCACAACCTTTTCAGCACTGGG CAGGTGTCAC-3’。

相对于现有技术，本发明的有益效果是：

1.本发明的方法可以适配很多仪器，操作简单，整个流程可在1h内解决，配合孔板可以进行高通量检测，大大提高检测效率。

2.本发明提供的锁式探针不需要同位素或者荧光基团标记，只需要用SYBR GreenI进行实时监控，操作简便，可以通过实时观察荧光曲线来判断反应情况。

3.本发明提供的锁式探针和茎环引物序列特异性强，检测准确率高。

4.本发明提供的方法和试剂盒，对于待检测的样品，可以是提取的核酸，也可以是PCR产物；目标序列可长可短，变化范围大，检测的目标序列可以短至50个碱基长度。

5.本发明提供的两种锁式探针，除了和模板结合区不同外，其余序列都相同，可以检测正常型肺炎支原体和A2063G突变型支原体，不需要多余的操作步骤，可以分管同时进行，提高检测效率。

附图说明

图1为本发明提供的检测方法扩增原理示意图；

图2为本发明提供的检测方法中与模板结合的锁式探针结构示意图；

图3为本发明提供的检测方法检测临床样本的实时荧光曲线图；

图4为本发明提供的检测方法检测临床样本的扩增结果电泳图；

图5为本发明提供的检测方法检测2号临床样本的灵敏度的实时荧光曲线图；

图6为本发明提供的检测方法检测临床样本的特异性的实时荧光曲线图，其中，2：2号阳性样本；Sa：金黄色葡萄球菌；Kp：肺炎克雷伯菌；Pa：铜绿假单胞菌；Sp：肺炎链球菌；Ab：鲍曼不动杆菌。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。在本发明的描述中，需要说明的是，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

本发明提供了一种基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术检测DNA点突变的方法，其扩增原理示意图如图1所示，结合图1和图2，详细说明本发明的技术方案，包括以下：

(1)根据待检测模板设计锁式探针，该锁式探针包括突变型锁式探针和正常型锁式，正常型探针用于检测模板质量即是否含有病原微生物，突变型探针用于检测待测模板是否产生突变。两种类型锁式探针的结构为5’连接臂-第一功能区-第二功能区-第三功能区-3’连接臂，符号“-”表示序列间的连接，其中5’连接臂和3’连接臂与模板DNA序列互补且互补区之间无碱基间隔，同时根据DNA模板的突变情况，将突变位点设计在突变型锁式探针的3’末端，正常型锁式探针的5’连接臂和3’连接臂设计在DNA模板的非突变位点区。因此将待检测DNA样品与锁式探针混合后，锁式探针的5’连接臂和3’连接臂与模板DNA序列互补，通过连接酶的作用，得到环化产物，即环化的锁式探针。

另外，所述的第一功能区、第二功能区、第三功能区三部分不要和模板DNA序列有大量非特异性结合片段，最好是远缘序列；优选地，突变型探针和正常型锁式探针的5’连接臂长度为10-20bp，3’连接臂长度为15-25bp，第一功能区长度为10-20bp，第二功能区长度为15-30bp，第三功能区长度为20-40bp。

(2)加入滚环引物，所述滚环引物的5’-3’端的序列依次为：第一功能区，以及与第二功能区反向互补序列。滚环引物的第二功能区反向互补序列会与锁式探针的第二功能区结合，起着滚环扩增起始位点的作用，其Tm值在56℃-59℃，碱基长度为15-30bp；滚环引物沿着锁式探针扩增，产生的片段中第一功能区互补序列与该片段5’端的第一功能区(即原滚环引物的第一功能区)序列互补，其Tm值在56℃-59℃，形成茎环结构，产生带有茎环结构的长串联重复序列片段结合。

(3)加入茎环引物，所述的茎环引物包含3’突出端，且3’突出端的序列与所述的第三功能区序列相同。所述的带有茎环结构的长串联重复序列片段包含若干第三功能区互补序列，即茎环引物与该长串联重复序列片段有若干结合区(结合序列的Tm值在56℃-59℃)，以扩增产生一系列双茎环结构产物，即双茎环扩增元件，为后续等温扩增反应的模板。

(4)设计并加入等温扩增引物，以双茎环扩增元件为模板，利用环介导的等温扩增技术，所述的等温扩增引物、滚环引物依靠一种高活性链置换DNA聚合酶，使得链置换DNA合成在不停地自我循环，得到指数扩增产物。

从图1反应原理可以看出整个反应的关键在于锁式探针入侵双链模板以及双茎环扩增元件的构造。

根据上述方法，针对肺炎支原体主要突变位点A2063G以及正常型(NR_077056.1)序列(见序列6和序列7)设计了一种用于检测肺炎支原体A2063G点突变的试剂盒，该试剂盒包含：

突变型探针，见序列1，具体序列为：5’-CCGTCCCGTTGCGCCTAAC TTTTCGACACG ACACGATTTTGGAACTCTGCTCGACGGATTAAAATAAT ACAGTCTGCCCACAACCTTTTA AGCTTCACGGGGTCTTC-3’；

正常型探针，见序列2，具体序列为：5’-CCCATATACA TCACCTTACG TTTTCGACACGACACGATTTTGGAACTCTGCTCGACGGATTAAAATAAT ACAGTCTGCCCACAACCTTTT CAGCACTGGGCAGGTGTCAC-3’；

滚环引物，见序列3，具体序列为：5’-CGACACGACACGAAAAAAATCCGTCGAGCAGAGTTCC-3’；

茎环引物，见序列4，具体序列为：5’-ATCGTCGTGACTGTTTTCCCTAACCCTAACCCTAACCCTTTTCAGTCACGACGATTTTTTAATACAGTCTGCCCACAACC-3’；

等温扩增引物，见序列5，具体序列为：5’-ATCGTCGTGACTGTTTTCCC TAACCCTAACCCTAACCC-3’；

并提供了该试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

步骤1，提取样本DNA；

步骤2，将样本DNA与正常型锁式探针、突变型锁式探针以及连接反应试剂进行混合，反应体系：样本DNA、1nM-100nM正常型锁式探针或突变型锁式探针、20mM Tris-HCl、25mM CH₃COOK、10mM Mg(CH₃COOH)₂、10mM DTT、0.1％Triton X-100、1mM NAD、12U Taq DNA连接酶以及无核酸酶水，反应条件为65℃、10min，也可为：95℃、5min预加热，95℃、30s到65℃、5min共10个循环，再95℃、5min，该连接反应体系建议5-10μl，模板的起始量建议为ng级别；另外，可在连接反应体系中添加单链结合蛋白和PEG 4000来提高锁式探针连接双链模板的效果；

步骤3，将步骤2产物与滚环引物、茎环引物、等温扩增引物以及扩增反应试剂进行混合，反应体系：步骤2产物、8U Bst DNA聚合酶、1mM dNTP混合物、20mM Tris-HCl、10mM(NH₄)₂SO₄、50mM KCl、0.1％Tween 20、2mM MgSO₄、0.5μM-1.5μM滚环引物、0.5μM-1.5μM等温扩增引物以及50nM-150nM茎环引物，置于荧光PCR仪内，65℃反应45min，每1min读取一次荧光，检测通道为SYBR Green通道，该扩增反应体系建议30-50μl；另外，可在扩增反应体系中添加二甲基亚砜、单链结合蛋白、海藻糖和PEG8000来改变荧光曲线到达平衡点的时间；

步骤4，反应结束后，根据突变型锁式探针和正常型锁式探针的荧光信号判断是否存在正常型病原微生物以及是否存在突变。

实施例

本实施例通过检测疑似肺炎支原体感染临床样本的实验评价本发明提供的方法及试剂盒的实际使用效果，下面将结合附图与实施例详细说明。

一、实验过程

1.提取样本DNA

8例疑似肺炎支原体感染临床样本痰液通利用Qiagen公司的DNeasy Blood&Tissue Kit DNA提取试剂盒提取样本基因组DNA，具体操作如下：

(1)往痰液中加入600μl PBS，样本需要预先融化；

(2)加入20μl Proteinase K；

(3)加入200μl Buffer AL，涡旋5s；

(4)56℃水浴10min；

(5)加入无水乙醇200μl，涡旋15s，此步骤可能会出现絮状沉淀；

(6)将上一步所得混合物加入QIAmp Mini吸附柱中，10000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

(7)加入500μl Buffer Buffer AW1，10000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；

(8)加入500μl Buffer Buffer AW2，10000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；

(9)吸附柱放回收集管中，10000rpm离心2min，倒掉废液。开盖，将吸附柱室静置3min；

(10)将吸附柱转入灭过菌的离心管中，向吸附膜中部滴加200μl Buffer AE或去离子水(TE会影响部分后续实验)，室温放置5min，10000rpm离心2min，将液体再一次加入吸附柱离心，将DNA溶液收集到新的离心管中；

(12)提取到的基因组DNA产物测浓度和纯度，纯度达到要求后，储存在-20℃备用。

2.连接反应

首先取2μl提取好的样本DNA加入10μl连接体系：正常型锁式探针10nM或突变型锁式探针10nM，1×Taq DNA连接酶buffer(NEB)，Taq DNA连接酶10U，65℃反应10min。

3.扩增反应及荧光检测

将上述10μl连接产物加入30μl扩增体系：1×Bst buffer(NEB)，dNTPs1mM，镁离子5mM，5×SYBR Green I，茎环引物100nM，滚环引物0.8μM，等温扩增引物0.8μM，Bst DNA聚合酶8U，65℃反应45min，每1min读取荧光一次，荧光通道选择SYBR Green通道，根据原始数据绘制荧光曲线，分析模板突变情况。

二、结果与讨论

1.荧光曲线分析

如图3所示，左图为正常型锁式探针检测临床样本的实时荧光曲线图荧光曲线图，右图为突变型锁式探针检测临床样本的实时荧光曲线图，结果显示八例样本中，六例样本呈肺炎支原体阳性，其中五例样本为A2063G突变，一例样本未检出A2063G突变，这和临床结果是一致的，临床结果显示有五例样本14环和15环抗生素耐药，一例不耐药，说明本发明提供的检测方法及试剂盒检测准确率高。

2.扩增产物电泳图分析

如图4所示，将8例疑似肺炎支原体感染临床样本的扩增产物进行电泳分析，其中Maker左边的为正常型锁式探针检测的8例样本，Maker右边的为突变型锁式探针检测的8例样本，结果胶图显示阳性扩增荧光曲线为梯度条带，条带特征和滚环扩增特征一致，和临床结果以及实时荧光结果一致，再一次证明本发明提供的检测方法及试剂盒检测的高准确率。

3.灵敏度分析

以2号阳性样本进行定量，然后定量至3ng/μl，梯度稀释至300pg/μl，30pg/μl，3pg/μl，300fg/μl，30fg/μl进行连接扩增，检测正常型锁式探针和A2063G突变型锁式探针灵敏度，结果如图5所示，两种类型探针的灵敏度在3pg/μl左右，表明本发明方法提供的探针灵敏度高。

4.特异性分析

以2号阳性样本和呼吸道常见病原微生物：金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌以及鲍曼不动杆菌1ng样本考察正常型锁式探针和A2063G突变型锁式探针的特异性，结果如图6所示，两种类型探针只检出肺炎支原体，说明本方法的两种类型探针都有很强的特异性。

综上所述，本发明提供的基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术，可以达到指数放大的扩增信号，还可以同时检测正常型肺炎支原体和A2063G突变型肺炎支原体，且操作简便，无需复杂的仪器，全程可以控制在1h内，最终达到高灵敏、高特异、快捷且低成本的检测。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

序列表

<110> 复旦大学

<120> 一种基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术检测DNA点突变的方法及试剂盒

<141> 2021-03-24

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 107

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccgtcccgtt gcgcctaact tttcgacacg acacgatttt ggaactctgc tcgacggatt 60

aaaataatac agtctgccca caacctttta agcttcacgg ggtcttc 107

<210> 2

<211> 110

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cccatataca tcaccttacg ttttcgacac gacacgattt tggaactctg ctcgacggat 60

taaaataata cagtctgccc acaacctttt cagcactggg caggtgtcac 110

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgacacgaca cgaaaaaaat ccgtcgagca gagttcc 37

<210> 4

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atcgtcgtga ctgttttccc taaccctaac cctaaccctt ttcagtcacg acgatttttt 60

aatacagtct gcccacaacc 80

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atcgtcgtga ctgttttccc taaccctaac cctaaccc 38

<210> 6

<211> 480

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tatgccaaac cgtaaggtga tgtatatggg gtgacacctg cccagtgctg gaaggttaaa 60

gaaggaggtt agcgcaagcg aagcttttaa ctgaagcccc agtgaacggc ggccgtaact 120

ataacggtcc taaggtagcg aaattcctag tcgggtaaat tccgtcccgc ttgaatggtg 180

taaccatctc ttgactgtct cggctataga ctcggtgaaa tccaggtacg ggtgaagaca 240

cccgttaggc gcaacgggac gggaagaccc cgtgaagctt tactgtagct taatattgat 300

caggacatta tcatgtagag aataggtagg agcaatcgat gcaagttcgc taggacttgt 360

tgatgcgaaa ggtggaatac tacccttggt tgtgtgctgt tctaattggt aactgttatc 420

cagtttcaag acagtgttag gtgggcagtt tgactggggc ggtcgcctcc taaaaggtaa 480

<210> 7

<211> 480

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tatgccaaac cgtaaggtga tgtatatggg gtgacacctg cccagtgctg gaaggttaaa 60

gaaggaggtt agcgcaagcg aagcttttaa ctgaagcccc agtgaacggc ggccgtaact 120

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taaccatctc ttgactgtct cggctataga ctcggtgaaa tccaggtacg ggtgaagaca 240

cccgttaggc gcaacgggac ggaaagaccc cgtgaagctt tactgtagct taatattgat 300

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tgatgcgaaa ggtggaatac tacccttggt tgtgtgctgt tctaattggt aactgttatc 420

cagtttcaag acagtgttag gtgggcagtt tgactggggc ggtcgcctcc taaaaggtaa 480

Claims

1.一种基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术检测DNA点突变的方法，其特征在于，所述方法用于非疾病诊断目的的检测，包括以下步骤：

S2，加入滚环引物，与S1中所述的环化产物结合，进行滚环扩增，获得带有茎环结构的长串联重复序列片段；所述的滚环引物的5’-3’端的序列依次为：第一功能区，以及与第二功能区反向互补序列；

S3，加入茎环引物，与所述的带有茎环结构的长串联重复序列片段结合，延伸得到双茎环结构产物；所述的茎环引物包含3’突出端，且3’突出端的序列与所述的第三功能区相同；

S4，利用环介导等温扩增技术扩增所述的双茎环结构产物，并进行检测分析；

其中，所述的突变型锁式探针的5’连接臂长度为10-20 bp，3’连接臂长度为15-25 bp，第一功能区长度为10-20 bp，第二功能区长度为15-30 bp，第三功能区长度为20-40 bp；所述的第一功能区、第二功能区、第三功能区三部分不要和模板DNA序列有大量非特异性结合片段。

2.如权利要求1所述的基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术检测DNA点突变的方法，其特征在于，所述的方法还包括对所述DNA模板的质量进行检测，具体包括：提供正常型锁式探针，用于替换所述的突变型锁式探针，并依次进行步骤S1、S2、S3、S4；所述的正常型锁式探针的序列为5’连接臂-所述的第一功能区-所述的第二功能区-所述的第三功能区-3’连接臂，其中，所述的正常型锁式探针的5’连接臂和3’连接臂设计在DNA模板的非突变位点区。

3.如权利要求2所述的基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术检测DNA点突变的方法，其特征在于，所述的正常型锁式探针的5’连接臂长度为10-20 bp，3’连接臂长度为15-25 bp，第一功能区长度为10-20 bp，第二功能区长度为15-30 bp，第三功能区长度为20-40bp。

4.如权利要求1所述的基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术检测DNA点突变的方法，其特征在于，所述的S1反应条件为：65°C 、10min或95°C、5min预加热，95°C、30s到65°C，5 min 共10个循环，再95°C、 5 min。

5.如权利要求1所述的基于锁式探针介导的茎环连接的扩增技术检测DNA点突变的方法，其特征在于，步骤S4采用荧光染色法进行检测分析。

6.一种采用权利要求2或3所述方法检测突变的试剂盒，其特征在于，包含：所述的突变型锁式探针、所述的正常型锁式探针、所述的滚环引物、所述的茎环引物，所述的试剂盒还包含等温扩增引物，所述的等温扩增引物和所述的滚环引物一起用于扩增所述的双茎环结构产物。

7. 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的正常型锁式探针、突变型锁式探针的使用浓度为1 nM- 100 nM。

8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的滚环引物的使用浓度为0.5 μM-1.5 μM，茎环引物的使用浓度为50 nM- 150 nM，等温扩增引物的使用浓度为0.5μM- 1.5 μM。

9.如权利要求6所述的检测突变的试剂盒，其特征在于，所述的突变为肺炎支原体A2063G点突变，所述的突变型锁式探针序列为：5’-ccgtcccgttgcgcctaacttttcgacacgacacgatttt ggaactctgctcgacggattaaaataatacagtctgcccacaaccttttaagcttcacggggtcttc-3’；

所述的正常型锁式探针序列为：5’-ccca tatacatcaccttacgttttcgacacgacacgattttggaactctgctcgacggattaaaataatacagtctgcccacaaccttttcagcactggg caggtgtcac-3’。