CN107760763A - 一种用于茎环引物‑滚环扩增反应的茎环引物以及茎环引物‑滚环扩增的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于茎环引物‑滚环扩增反应的茎环引物以及茎环引物‑滚环扩增的应用，该茎环引物为一种具有双链茎部和单链环区的单分子链内发卡结构，通过茎环引物进行茎环引物‑滚环扩增可以对核酸分子进行检测。本发明通过在滚环扩增反应中使用茎环引物开发了一种创新性的滚环扩增方法。该滚环扩增方法在核酸检测中具有卓越和独特的优点，包括在液相和固相中的灵活性检测、高通量和高灵敏度，在容易实现的恒定反应条件下进行自控的线性或指数扩增，并且可以在溶液中均相和快速地检测靶核酸分子。本发明茎环引物‑滚环扩增方法克服了目前滚环扩增方法中的几乎所有的局限性。

Description

一种用于茎环引物-滚环扩增反应的茎环引物以及茎环引物- 滚环扩增的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于茎环引物-滚环扩增反应的茎环引物以及茎环引物-滚环扩增在核酸分子检测中的应用。

背景技术

核酸分子的检测是医学、农业、环境、战争、检疫、兽医等领域无法避免的常用生物分子检测技术，也是生命科学基础研究中非常常见且不可避免的常用生物分子检测技术。因此，为了满足这些领域中对各种目的各类核酸分子的检测需求，科学家及工程技术人员发明了各色核酸检测分析技术，如最常见的聚合酶链式反应(PCR)、各式核酸等温扩增技术(如滚环扩增技术(RCA)、LAMP、NASBA 等)、核酸杂交检测技术(如Southern blot，DNA微阵列芯片技术等)。本发明亦属于可用于上述领域的新的核酸检测分析技术之一。

在各种核酸分析中，聚合酶链反应(PCR)是最流行的扩增方法。然而，PCR 具有以下几个缺点：(1)PCR反应需要昂贵的热循环反应器。(2)PCR扩增产物相对较短。(3)PCR容易受到假阳性的影响。(4)PCR在多重核酸检测中具有有限的适用性。滚环扩增(RCA)可以克服PCR的上述缺点。因此，RCA作为等温核酸扩增技术引起了相当大的关注，并且经常用于灵敏地检测核酸，蛋白质等。 RCA是一种简单方便的技术，利用聚合酶(如Phi29，BstDNA聚合酶及T7RNA 聚合酶)和环形模板来精确产生含有大量串联重复序列的长单链DNA或RNA。

RCA包括两种扩增方式，线性RCA(1RCA)和指数RCA(eRCA)。前者通过延长环模板上的单个引物实现扩增，从而生成与环模板互补并具有大量重复序列的单链DNA。相比之下，1RCA在nM-pM水平上有较低的检测度。为了获得更广泛的应用，应提高RCA的灵敏度。随后，RCA方法被改进以提高灵敏度和扩增效率。在lRCA的基础上，通过使用多重引物发明了eRCA。根据引物的设计，有两种主要的eRCA扩增方式。一个是多个引物与相同的环形模板直接互补进行扩增。该方法的扩增效率主要取决于被环模板和引物长度所影响的引物的数量。因此，环模板和引物的长度是该方法的限制因素。另一种是超支化RCA (hbRCA)，其使用与1RCA的扩增产物互补的一个或多个引物，下一组引物与上一步扩增的新产物互补进行后续扩增。HbRCA可以在短时间内产生大量的环拷贝(10⁹或更多拷贝，90分钟)，这使其灵敏度非常显著。

RCA检测可以在溶液(液相)和固体载体(固相)中进行。液相1RCA一般通过使特定的锁式探针与其靶标退火，用连接酶环化，并用与锁式探针互补的通用引物延伸而实现。液相eRCA一般通过hbRCA，RCA产物生成多个环和使用切刻酶切割产生引物来实现。然而，主要由于需要连接反应，这些现有的各种液相 RCA不能实现均相(homogeneous)检测。RCA也适用于固相检测(称为固相RCA， spRCA)。如果RCA引物直接或间接连接在固体载体上，RCA产物将被固定在固体支持物上。由RCA反应产生的放大信号因此可以位于特定位置。

spRCA的主要优点是它将DNA的扩增和分离组合在一起，简化了检测程序。例如，在spRCA检测中，通过短暂洗涤固体载体(例如载玻片)，RCA产物容易从RCA反应溶液中分离。spRCA的另一个优点是它能够同时检测多个靶标。此外，在RCA反应后进行严格洗涤，非特异性信号应大大减少。1RCA可以轻易地在固体载体上实现，然而，作为液相1RCA，当前的固相IRCA受其低检测灵敏度(3-4 个对数微阵列)和冗长的锁式探针磷酸化和连接的限制。目前，eRCA也可以通过hbRCA在固体支持物上实现，这提高了spRCA的检测灵敏度。hbRCA的扩增效率是显著的(9-10次方)，然而，由于其放大机制包含Phi29聚合酶的链置换，大多数扩增产物作为游离分子(3)释放到溶液中，缺乏产物定位，因此大大削弱了固相上的扩增信号，从而导致不理想的检测灵敏度。因此，大多数固相RCA 检测必须使用1RCA。

目前的液相1RCA一般通过使特定的锁式探针与其靶标退火，用连接酶环化，并用与锁式探针互补的通用引物延伸而实现。液相eRCA一般通过hbRCA，RCA 产物生成多个环和使用切刻酶切割产生引物来实现。然而，由于检测中需求连接反应，现有的各种液相RCA很难实现均相检测而受限。目前的固相RCA(spRCA) 检测常采用hbRCA，但灵敏度低。本发明将使用茎环引物(stem-loop primer，SLP) 进行RCA扩增，实现在液相与固相皆可高灵敏检测目标核酸分子的新型RCA方法，且实现目标核酸在液相中的均相检测。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种用于茎环引物-滚环扩增反应的茎环引物，通过茎环引物(stem-loop primer，SLP)进行滚环扩增(RCA 扩增)为一种新型RCA方法，可以实现在液相与固相皆可高灵敏检测目标核酸分子的，且实现目标核酸在液相中的均相检测。

本发明还提供基于该茎环引物的茎环引物-滚环扩增的应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一种用于茎环引物-滚环扩增反应的茎环引物，其特征在于，所述茎环引物为一种具有双链茎部(stem)和单链环(loop)区的单分子链内发卡结构；在分子结构上类似分子信标。

其中，所述单链环区可与核酸分子杂交，杂交导致其双链茎部解链，暴露出3′端单链区；该单链区再与滚环模板杂交，从而启动茎环引物-滚环扩增反应。

其中，所述茎环引物包括第一茎环引物分子(SLP1)和第二茎环引物分子 (SLP2)，线性滚环扩增只使用第一茎环引物分子，指数滚环扩增使用第一茎环引物分子和第二茎环引物分子。

作为优选，SLP1分子的单链环区可与核酸分子杂交，杂交导致其双链茎部解链，暴露出3′端单链区；该单链区再与滚环模板杂交，从而启动线性RCA扩增反应(SLP-1RCA)。

更进一步地，SLP2分子的单链环区可与SLP1-RCA扩增产物杂交，杂交导致其双链茎部解链，暴露出3′端单链区；该单链区再与滚环模板杂交，从而启动指数RCA扩增反应(SLP-eRCA)。

作为优选，所述第一茎环引物分子可直接固定在固相表面既作为滚环扩增引物或作为捕获探针，此时第一茎环引物分子与靶核酸分子的杂交可直接打开第一茎环引物分子的茎部，暴露其3′端单链区，启动茎环引物-滚环扩增反应。

作为优选，所述第二茎环引物分子用荧光共振能量转移荧光基团标记，制备为分子信标第二茎环引物分子，用于茎环引物-滚环扩增的检测。

基于本发明所述的茎环引物的茎环引物-滚环扩增在核酸分子检测中的应用。

其中，所述核酸分子检测包括在液相中茎环引物-滚环扩增检测核酸分子和在固相表面上茎环引物-滚环扩增检测核酸分子。

进一步地，所述茎环引物-滚环扩增包括茎环引物-滚环线性扩增或茎环引物 -滚环指数扩增来检测核酸分子。

其中，所述液相中检测核酸分子的具体过程为：将茎环引物-滚环扩增反应组分包括茎环引物、滚环模板、具有链置换功能的DNA聚合酶、缓冲液、四种单核苷酸、待检核酸样品及水，在试管内混合组成茎环引物-滚环扩增反应体系，在所加DNA聚合酶的适宜反应温度下孵育适当时间育，完成茎环引物-滚环扩增 (SLP-RCA)。

其中，所述固相表面检测核酸分子的过程为：首先将捕获探针分子(可与待检核酸分子特异性杂交)固定在固相介质表面；之后将待检核酸样品与固定在固相表面的捕获分子杂交，使得待检核酸分子被捕获探针捕获在固相表面；最后将茎环引物-滚环扩增反应液包括茎环引物、滚环模板、具有连置换功能的DNA聚合酶、缓冲液及四种单核苷酸覆盖带有捕获分子的固相表面，在所加DNA聚合酶的适宜反应温度下孵育，完成茎环引物-滚环扩增(SLP-RCA)。

进一步地，所述在液相中茎环引物-滚环扩增的产物通过凝胶电泳、实时荧光定量监测或目测进行报告。

进一步地，所述在固相表面上茎环引物-滚环扩增的产物通过荧光检测、目测进行报告。

更进一步地，所述在液相中茎环引物-滚环扩增的产物的凝胶电泳检测指琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；所述实时荧光定量监测是指在茎环引物-滚环扩增反应添加核酸荧光染料(如SybrGreen等)，或可与茎环引物-滚环扩增产物特异性杂交的分子信标等，用荧光定量PCR仪等荧光检测仪器实时动态观察茎环引物-滚环扩增反应进行检测；所述目测是指在茎环引物-滚环扩增反应完成后向反应液中加入可肉眼检测的显色物质(如SybrGreen、hydroxylnaphthol blue、纳米金等)等，用肉眼直接观察或借助放大镜、显微镜等观察完成检测。

更进一步地，所述在固相表面上茎环引物-滚环扩增的产物的荧光检测是指在茎环引物-滚环扩增反应添加荧光标记的单核苷酸(如Cy3-dCTP等)，茎环引物-滚环扩增反应后用荧光显微镜、基因芯片扫描仪及其他荧光成像仪器检测；或指在茎环引物-滚环扩增反应添加生物素标记的单核苷酸(如Biotin-dUTP等)，茎环引物-滚环扩增反应后将扩增产物与荧光标记的链霉亲和素反应，最后用荧光显微镜、基因芯片扫描仪及其他荧光成像仪器观测；所述目测是指在茎环引物 -滚环扩增反应完成后向反应液中加入可肉眼检测的显色物质(如SybrGreen、 hydroxylnaphthol blue、纳米金等)等，用肉眼直接观察或借助放大镜、显微镜等观察完成检测。

在本发明中，建立了一种新的核酸检测技术，巧妙设计和应用茎环引物 (SLP)到RCA反应中。该技术能够以1RCA和eRCA形式检测靶核酸分子。在1RCA检测中，RCA反应仅使用第一SLP(命名为SLP1)。将SLP1的环和茎序列设计为分别与靶分子和滚环(RC)特异性互补。在RCA反应中，当SLP1 的环与靶分子杂交时，其茎被打开并暴露出3'末端与RC退火。因此，SLP1的 3'端充当引物并启动1RCA。在eRCA检测中，RCA反应使用了两个SLP，即 SLP1和SLP2。SLP1与SLP-1RCA中使用的相同，而SLP2的环和茎序列分别与SLP1的RCA产物和RC特异性互补。在RCA反应中，当SLP-1RCA启动SLP1 时，SLP2的环将与SLP-1RCA产物杂交。在这种情况下，SLP2的茎被打开，暴露的3'末端与RC退火。因此，SLP2的3'端充当引物并启动eRCA。显然，SLP1 和SLP2的构象变化分别触发SLP-1RCA和SLP-eRCA。本发明中分别使用一个 SLP(SLP1)和两个SLP(SLP1和SLP2)作为SLP-1RCA和SLP-eRCA命名了 SLP-RCA。这项研究表明SLP-1RCA和SLP-eRCA检测均可在液相和固相中实现。

本发明的技术可以在液相和固相中通过线性或指数扩增(称为SLP-1RCA 和SLP-eRCA)检测靶核酸分子(DNA或RNA)。固相SLP-eRCA检测需四个步骤：(1)将捕获探针(CP)共价固定在固体支持物上制备为CP阵列；(2) CP阵列与DNA样品杂交；(3)用含有SLP1和SLP2的RCA反应孵育CP阵列； (4)CP阵列成像。液相SLP-eRCA检测只需一个步骤：进行含有DNA样品、 SLP1和SLP2的实时RCA反应。液相和固相检测采用通用滚环和SLP2。SLP1 针对靶标。当进行固相SLP-1RCA和液相SLP-1RCA检测时，检测步骤与上面的SLP-eRCA检测相同，只是在茎环引物-滚环扩增反应中只加SLP1，不加SLP2。

本发明通过在液相和固体表面上检测合成的寡核苷酸、不同人乳头瘤病毒 (HPV)及宫颈癌细胞中的HPV DNA，证明该技术可行，且克服了当前RCA 方法的一些局限性。因此，本发明建立了一种检测核酸分子的RCA新技术。

有益效果：与现有技术相比本发明具有如下优点：

本发明通过茎环引物(stem-loop primer，SLP)进行滚环扩增(RCA扩增) 为一种新型RCA方法，可以实现在液相与固相皆可高灵敏检测目标核酸分子的，且实现目标核酸在液相中的均相检测。本发明通过检测化学合成的寡核苷酸和人乳头瘤病毒(HPV)几种基因型的L1DNA片段，完全验证了SLP-1RCA和SLP-eRCA技术。证明了SLP-1RCA和SLP-eRCA可以在液相和固相中特异和定量地检测这些靶核酸分子。尤其，SLP-eRCA在液相和固相检测中都显示出高灵敏度。这些成功的原理验证性检测表明，本发明通过在RCA反应中使用茎环引物开发了一种创新性的RCA技术。该RCA技术在核酸检测中具有卓越和独特的优点，包括在液相和固相中的灵活性检测、高通量和高灵敏度，在容易实现的恒定反应条件下进行自控的线性或指数扩增，并且可以在溶液中均相和快速地检测靶核酸分子。这种新颖的RCA技术，即茎环引物-滚环扩增克服了目前RCA 方法中的几乎所有的局限性。

附图说明

图1为用SLP-eRCA检测核酸分子的流程示意图；本发明中，当进行 SLP-1RCA检测时，在SLP-eRCA检测反应中只加SLP1，不加SLP2即可；仅有SLP1参与的SLP-RCA反应即为SLP-1RCA；

图2为化学合成寡核苷酸的液相SLP-eRCA检测结果图；其中A为用GelRed 染色的琼脂糖凝胶电泳检测RCA产物；其中B为SLP-RCA反应及其组分：靶 (target)，靶寡核苷酸(TO，表1)，靶7.5pmol，SLP1和SLP2(表1)1.25pmol； 1，SLP-eRCA；3，SLP-1RCA；2、4、5，阴性对照；其中C为SLP-RCA在琼脂糖凝胶中的定量积分光密度(OD)；其中D为用GelRed染色的琼脂糖凝胶电泳检测SLP-RCA产物；其中E为SLP-RCA反应及其组分：靶，靶寡核苷酸(TO)； 1，SLP-1RCA；2-9，SLP-eRCA；其中F为SLP-RCA产物在琼脂糖凝胶中的定量积分OD；

图3为化学合成寡核苷酸的液相SLP-eRCA检测结果图；其中A为用 SLP-eRCA和SLP-1RCA实时检测靶寡核苷酸(TO，表1)；其中B为SLP-RCA 反应及其在图A中的组分：1，SLP-eRCA；2，SLP-1RCA；3-5，阴性对照；其中C为用SLP-eRCA在液相中实时定量检测靶寡核苷酸(TO，表1)；其中D为 C中的SLP-RCA反应及其组成部分；

图4为化学合成寡核苷酸的固相SLP-eRCA检测结果图；其中A和B为用 SLP-1RCA反应1小时定量检测靶寡核苷酸(TO，表1)；其中C和D为使用 SLP-eRCA反应1小时定量检测TO；其中E为用SLP-eRCA运行4小时定量检测TO；A，C和E代表阵列的NIRF图像。其中B和D为阵列的量化信号强度；通过在载玻片上一式三份点样寡核苷酸TO-CP(靶寡核苷酸的捕获探针)、PC (阳性对照)和NC(阴性对照)(TO-CP、PC及NC的序列见表1)来形成阵列，将阵列与不同量的TO(25、5、1、0.2、0.04和0fmol)(A和C)或TO(200， 40和8fmol)杂交(E)，然后将阵列进行包含SLP1的SLP-1RCA反应(A)或包含SLP1和SLP2(C和E)的SLP-eRCA反应；

图5为HPV DNA的固相SLP-eRCA检测结果图。其中A为先用SLP-eRCA 检测两种高危型HPV(HPV16和HPV18)，通过在玻片上一式三份地点样寡核苷酸HPV16-CP、HPV18-CP、PC和NC(表1)来形成阵列，阵列分别与HPV16 (1)，HPV18(2)或HPV16和HPV18(3)的DNA杂交，然后将阵列进行含有HPV16-SLP1，HPV18-SLP1和SLP2的SLP-RCA反应；其中B和C为用 SLP-eRCA检测6种不同的HPV，通过在载玻片上一式三份地点样寡核苷酸 HPV6-CP、HPV11-CP、HPV16-CP、HPV18-CP、HPV33-CP、HPV35-CP、PC 和NC(表1)阵列分别与HPV6(1)、HPV16(2)、HPV33(3)、HPV11(4)、 HPV18(5)和HPV35(6)的DNA杂交，然后阵列进行包含6种不同HPV(表 1)的SLP1和通用SLP2的SLP-RCA反应；其中D为用SLP-eRCA定量检测 HPV16和HPV18，阵列制备过程与A类似.阵列分别与各种量的HPV16和HPV18 DNA(120、60、30、15、7.5和3.75fmol)杂交，然后将阵列进行含有HPV16-SLP1， HPV18-SLP1和SLP2的SLP-RCA反应；A、B和D代表阵列的NIRF图像；C 为列中HPV-CP的布局；E为D中阵列的量化信号强度；

图6为用液相SLP-eRCA检测HPV DNA结果图，通过实时荧光定量检测液相SLP-eRCA反应；A-F用液相SLP-eRCA检测6种不同的HPV亚型，在检测每种亚型时，6个SLP-RCA反应管都含有SLP2和分别含有六种HPV-SLP1，将目标HPV质粒DNA加入到这6个管中，用实时PCR监测管中荧光信号；(G和 H)HPV16和HPV18质粒DNA的定量检测，用包含SLP2和HPV16-SLP1(A)或HPV18-SLP1(B)的液相SLP-eRCA反应检测各种量的HPV质粒DNA；

图7为用液相SLP-eRCA(lpSLP-eRCA)检测HPV DNA的结果图，通过实时荧光定量检测液相SLP-eRCA反应；其中A为将HPV16质粒DNA以不同质量混合在HepG2基因组DNA中的检测结果；检测反应中含有HPV16-lpSLP1 和SLP2；B为将HPV18质粒DNA以不同质量混合在HepG2基因组DNA中的检测结果；检测反应中含有HPV18-lpSLP1和SLP2；C为检测HeLa细胞基因组DNA中的HPV18DNA结果；检测反应中含有HPV18-lpSLP1和SLP2；含有HepG2基因组DNA(402ng)的反应作为阴性对照；

图8为用mbSLP-eRCA检测质粒HPV DNA结果图；其中A为用 mbSLP-eRCA检测6种不同HPV亚型，检测每种亚型时，建立6个含有 mbSLP2与一种HPVs-lpSLP的SLP-RCA反应，向每个反应加入目标HPV质粒DNA进行检测；B为对混入肝癌细胞HepG2基因组DNA(gDNA)的HPV16和HPV18质粒DNA进行定量检测，每个检测反应中均混入相同量的HepG2 gDNA(208ng)，用含有mbSLP2和HPV16-lpSLP1或HPV18-lpSLP1的 mbSLP-eRCA反应检测不同剂量的HPV16或HPV18质粒DNA；

图9为用mbSLP-eRCA检测宫颈癌细胞基因组DNA(gDNA)中的HPV DNA结果图；A和B为检测HeLa和SiHa细胞中的HPV18L1或HPV16E6基因，用含有mbSLP2与HPV18-lpSLP1或HPV16-E6-lpSLP1的mbSLP-eRCA反应检测不同剂量的HeLa或SiHa gDNA，一个含有肝癌细胞HepG2gDNA的 mbSLP-eRCA反应作为检测HPV18L1与HPV16E6基因的阴性对照；C为检测C-33A细胞中的HPV18L1与HPV16E6基因。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1制备茎环和滚环

在本发明中，所有寡核苷酸(表1中SEQ ID NO.1-29)由Sangon(上海，中国)化学合成。茎环引物(SLP，包括SLP1和SLP2)通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)纯化。SLP溶解在Tris-Mg²⁺溶液(20mM Tris-HCl，pH 8.0,3mM MgCl₂) 中至终浓度为2.5μM。SLP溶液在水浴锅(Julabo)中95℃孵育5分钟，然后自然冷却至55℃并保持1小时，最后自然冷却至室温。制备的SLP保存在4℃下使用。 Oligo RC(5'-磷酸化修饰)和RC link通过高效液相色谱(HPLC)纯化。将Oligo RC(50μM)和RC link(100μM)分别溶于TEN缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.0, 100mM NaCl，1mM EDTA)中。将RC和RC link同体积混合，在95℃下加热5 分钟，然后缓慢冷却至室温。该混合物(2μL)在由14U/μLT4DNA连接酶(Takara) 和1×T4缓冲液(Takara)组成的50μL反应体系中37℃反应30分钟。然后65℃温育5分钟失活T4DNA连接酶。再加入2μL Exo I(5U/μL，Takara)和1μL Exo III (200U/μL，Takara)，37℃温育过夜以降解游离和杂交的RC link。将混合物在 80℃加热20分钟失活Exo I和Exo III。

实施例2制备含有HPV亚型L1片段的质粒

本文所用携带HPV L1片段的质粒由东南大学王进科课题组实验室构建。这些质粒由pMD19质粒和HPV亚型的L1片段重组而成，包括最常见的高危型的 HPV16、HPV18、HPV33和HPV35，以及低危型的HPV11和HPV6。为了制备本发明中质粒DNA，将构建的质粒转化到大肠杆菌DH5α中，并用AxyPrep质粒DNA 纯化小量制备试剂盒(Axygen Biosciences)提取质粒DNA。质粒DNA用琼脂糖凝胶电泳检测，并用NanoDrop 2000分光光度计(ThermoScientific)定量。根据质粒的质量和分子量计算质粒的摩尔质量。

实施例3SLP-eRCA检测过程

从图1上可以看到SLP-eRCA检测核酸分子的原理。固相上的SLP-eRCA检测由四个步骤组成：(1)阵列制备：氨基修饰的CP共价固定在醛基修饰的载玻片上形成CP阵列；(2)样品杂交：CP阵列与待检测的DNA样品杂交；(3)SLP-RCA 反应：用含有SLP1，SLP2和生物素-dUTP的反应液在CP阵列上进行SLP-RCA反应；(4)NIRF成像：用由近红外荧光染料标记的链霉亲和素结合CP阵列并用 NIRF成像仪(Odyssey)生成图像。液相中的SLP-eRCA检测可以一步完成，即进行含有DNA样品、SLP1，SLP2和SybGreen的实时SLP-RCA反应。

实施例4用液相SLP-eRCA检测合成寡核苷酸

方法：

液相SLP-eRCA反应通过电泳和实时荧光两种方式检测。在电泳检测中， SLP-RCA反应体系(10μL)包含0.1μM RC模板，2×BSA(HYK)，0.5mM dNTP， 1×phi29DNA聚合酶缓冲液，4U phi29DNA聚合酶(HYK)，1.25pmol SLP1， 1.25pmol SLP2，靶寡核苷酸。在30℃下孵育4小时。将反应物与10×上样缓冲液混合，并在0.5×TBE缓冲液中在70V下用2％琼脂糖凝胶运行50分钟。在实时检测中，SLP-RCA反应(10μL)含有0.1μM RC模板，2×BSA(HYK)，0.5mMdNTP， 1×phi29DNA聚合酶缓冲液，4U phi29DNA聚合酶(HYK)，1.25pmolSLP1， 1.25pmolSLP2，1×SybrGreen I，1.5μM报告寡核苷酸(RO，表1)和各种量的靶寡核苷酸(参见附图2、附图3)。报告寡核苷酸与RCA产物杂交后能够结合 SybrGreen I。然后在实时PCR装置(StepOne Plus，ABI)上开始SLP-RCA反应，反应温度30℃，并以30s的间隔(作为循环)定期收集荧光信号。

结果：

为了验证SLP-eRCA的可行性，首先将SLP-eRCA与液相中的1RCA进行比较。进行五个平行的SLP-RCA反应，包括一个SLP-eRCA反应(加入SLP1和SLP2) (反应1)，一个1RCA反应(只加入SLP1)(反应3)和三个阴性对照反应(反应2、4、5)(图2A-C)(阴性对照反应中缺少一种反应组分，不发生扩增反应；其中反应2缺少靶寡核苷酸；反应5缺少SLP1；反应4是反应3的对照，缺少靶寡核苷酸；图2B显示了各反应的反应组分)。用琼脂糖凝胶电泳检测反应产物(图 2A-C)。RCA产物的定量积分光密度(OD)显示SLP-eRCA显示出最高的扩增效率，其显著高于SLP-1RCA。然而，阴性对照反应没有显示扩增。这些结果表明，在SLP-eRCA中发生了有SLP2参与的SLP-RCA反应。

接下来研究了SLP-eRCA是否可以定量检测靶核酸分子。为此，用SLP1和 SLP2同时与各种量的靶寡核苷酸(TO)进行一系列SLP-eRCA反应。结果表明， SLP-eRCA可定量检测液相中的靶核酸分子(图2D-F)。SLP1进行的SLP-1RCA 和使用的最大量TO的SLP-eRCA对比后再次表明SLP-eRCA具有比SLP-1RCA更高的扩增效率。在空白对照SLP-eRCA(无靶寡核苷酸)中没有扩增。在该定量检测中，SLP-eRCA对TOs的定量检测范围在20pmol至0.3125pmol之间。

然后研究了液相SLP-eRCA是否可以通过实时SLP-RCA反应进行动态监测。为此，在SLP-RCA反应中加入荧光分子SybrGreen I用于标记RCA产物。此外，考虑到SybrGreen I的双链DNA(dsDNA)结合偏好，我们设计了与SLP的扩增产物互补的报告寡核苷酸(RO；表1)并加入到SLP-RCA反应中。如所预期的，荧光信号随着液相SLP-eRCA反应的进行而逐渐增加(图3A和3B)。同时，也以相同的方式监测仅具有SLP1的SLP-1RCA。结果表明，SLP-eRCA反应的信号比 SLP-1RCA的信号高得多。然而，几个阴性对照SLP-RCA反应没有显示信号。这些结果表明液相SLP-eRCA检测可以作为实时RCA反应进行动态监测。

为了进一步研究这种实时方法是否可以定量检测靶DNA，用液相SLP-eRCA 检测各种量的靶寡核苷酸(TO；表1)。结果表明，荧光信号强度与在SLP-eRCA 反应中加入的靶寡核苷酸(0.5至0.0625pmol)的量成比例(图3C和3D)，表明靶DNA可以通过SLP-eRCA进行实时定量检测。

实施例5用固相SLP-eRCA检测合成的寡核苷酸

方法：

阵列制备：将氨基修饰的寡核苷酸作为捕获探针(CP)(表1)，以10μM 的浓度溶解在无菌水中并在4℃下储存。用50％点样溶液(CapitalBio)将寡核苷酸稀释至2μM的终浓度，并用点样仪AD1500(BioDot)将稀释好的CP以35nL的恒定体积点在醛基修饰的载玻片(CapitalBio)上。将点样后的载玻片置于保湿盒中37℃温育过夜。然后将载玻片依次用水洗涤2分钟，0.2％SDS洗涤2分钟，水洗涤2分钟。最后，将载玻片在0.15％(w/v)NaBH₄中反应5分钟，并用水洗涤三次。在载玻片离心机(Labnet)中离心干燥载玻片并4℃保存。

检测方法：将RC模板(2μL)，SLP1(1μL)和靶与50℃预热的杂交溶液 (12.5μL)(6×SCC，0.5％SDS，5×Denhardt溶液和100μg/μL鲱鱼精DNA)混合。将混合物加入到CP阵列中。用盖玻片覆盖CP阵列，并在杂交炉(Robbins Scientific)中50℃温育1小时。含有CP阵列的载玻片用无菌水洗涤2分钟并离心甩干。将包含聚合酶(HYK)，缓冲液(HYK)，0.6mM dNTP， 0.012mM生物素-dUTP(Fermentas)，0.1μM SLP2和0.1μM RC的RCA反应液 (25μL)加入到CP阵列上。CP阵列用盖玻片覆盖并在保湿盒(ArrayIT)中30℃孵育1小时。将载玻片用无菌水洗涤2分钟。然后将载玻片依次与含有1％封闭试剂(Roche)的马来酸缓冲液和含有1:15000稀释的IRDye 800CW-链霉抗生物素蛋白(Licor)的马来酸缓冲液在室温下孵育1小时。最后，将载玻片在无菌水中洗涤10分钟并离心甩干。使用Odyssey红外成像系统(Licor)在800nm(分辨率： 42μm；预设：膜；质量：中等；聚焦偏移：3mm；强度：6.0)的通道使载玻片成像。信号强度在Odyssey红外成像系统的操作软件上进行定量。

结果：

固相检测相对于液相检测具有一些明显的优点。例如，许多高通量检测可以通过固相检测实现，例如DNA微阵列。因此，接下来研究了固相上SLP-eRCA检测的可行性。为此，设计了靶寡核苷酸(TO-CP)，阳性对照(PC)和阴性对照(NC)寡核苷酸的捕获探针，化学合成，用氨基修饰，并固定在带有醛基的载玻片上形成微阵列。PC寡核苷酸同时用生物素修饰。制备的微阵列分别与各种量的靶寡核苷酸(TO)杂交。然后将杂交的微阵列与仅含有SLP1或同时含有 SLP1和SLP2的反应液进行对应的SLP-1RCA和SLP-eRCA反应。在该步骤中，加入Biotin-dUTP用于标记所有RCA反应中的RCA产物。最后，将微阵列与近红外荧光(NIRF)染料(IRDye800CW)偶联的链霉亲和素孵育并用NIRF成像仪 (Odyssey)成像。结果表明，SLP-1RCA(图4A和4B)和SLP-eRCA(图4C和 4D)成功定量检测了目标寡核苷酸。然而，SLP-eRCA(0.04fmol)的检测灵敏度比SLP-1RCA(1fmol)高很多，表明在相同反应时间内(1h)SLP-eRCA的检测灵敏度要比SLP-1RCA高25倍。结果还显示，在所有微阵列中所有PC点得信号强度几乎相同，表明在载玻片上探针成功和均匀地进行了偶联反应。还用每个阵列中的PC点的信号来标准化相同阵列中的靶寡核苷酸的信号。在所有微阵列中， NC点不显示信号，表明SLP-1RCA和SLP-eRCA检测具有高度的特异性。

为了研究延长RCA反应时间是否可以进一步改善检测灵敏度，将相同的靶寡核苷酸的SLP-eRCA反应延长至4小时。SLP-eRCA检测灵敏度大大改善(图4E)。随着反应时间延长，SLP-eRCA检测靶寡核苷酸的量低至8amol，表明通过增加 RCA反应时间可以显著和轻易地提高固相SLP-eRCA的检测灵敏度。总之，这些结果表明，使用茎环引物(SLP)的SLP-1RCA和SLP-eRCA均可用于检测固相上的靶核酸分子，这种方法具有高通量和高灵敏度的明显优点。

实施例6用固相SLP-eRCA检测HPV质粒DNA

方法：

阵列制备：将氨基修饰的寡核苷酸作为捕获探针(CP)(表1)，以10μM 的浓度溶解在无菌水中并在4℃下储存。用50％点样溶液(CapitalBio)将寡核苷酸稀释至2μM的终浓度，并用点样仪AD1500(BioDot)将稀释好的CP以35nL的恒定体积点在醛基修饰的载玻片(CapitalBio)上。将点样后的载玻片置于保湿盒中37℃温育过夜。然后将载玻片依次用水洗涤2分钟，0.2％SDS洗涤2分钟，水洗涤2分钟。最后，将载玻片在0.15％(w/v)NaBH₄中反应5分钟，并用水洗涤三次。在载玻片离心机(Labnet)中离心干燥载玻片并4℃保存。

检测方法：所有HPV质粒在95℃变性10分钟，立即置于冰上。将各种量的变性的HPV质粒(参见图)，RC模板(2μL)和SLP1(1μL)(表1)加入到50℃预热的杂交溶液(12.5μL)(6×SCC，0.5％SDS，5×Denhardt溶液和100μg/μL 鲑鱼精子DNA)。将混合物加入到CP阵列中并在杂交孵育器中在50℃温育1小时。带有CP阵列的载玻片用无菌水洗涤两次。将包含聚合酶(HYK)，缓冲液(HYK)，0.6mM dNTP和0.012mM生物素-dUTP(Fermentas)， 0.1μM SLP2,0.1μM RC的RCA反应液(25μL)加入到CP阵列。CP阵列用盖玻片覆盖并在潮湿室中在30℃下孵育1小时。带有CP阵列的载玻片用无菌水洗涤2 分钟。然后将载玻片依次与含有1％封闭试剂(Roche)的马来酸缓冲液和含有 1:15000稀释的IRDye800CW-链霉亲和素(Licor)的马来酸缓冲液在室温下温育 1小时。最后，将载玻片在蒸馏水中洗涤两次，10分钟，旋转干燥，并用Odyssey 红外成像系统(Licor)在800nm(分辨率：42μm；预设：膜；质量：中；聚焦偏移： 3mm；强度：6.0)。信号强度用Odyssey红外成像系统的操作软件定量。

结果：

在用SLP-eRCA成功检测化学合成的寡核苷酸后，为了证明该方法是否可以用于检测其他复杂的核酸分子。为此，通过用固相SLP-eRCA检测HPV的L1 片段DNA。首先针对在中国是高危型的两个HPV(HPV16和HPV18)设计了相应的捕获探针，以及构建了含有两种HPVCP、PC和NC的DNA微阵列。然后将三个相同的微阵列分别与HPV16、HPV18或HPV16和HPV18质粒DNA 杂交。杂交后，所有微阵列与包含HPV16-SLP1、HPV18-SLP1和SLP2的反应液进行SLP-eRCA反应。所有微阵列最后与链霉亲和素-IRDye800CW结合并且 NIRF成像。结果表明，固相SLP-eRCA成功和特异性地检测到了两种HPV亚型 (图5A)。

基于上述实验，随后设计了其他四个常见的HPV亚型(高危型HPV33和 HPV35，低危型HPV6和HPV11)的捕获探针。用六种亚型的HPV CP、PC和 NC构建了DNA芯片。然后将六个相同的微阵列分别与六种不同HPV亚型的质粒DNA杂交。杂交后，所有微阵列与含有SLP2和6种不同HPVs-SLP1(表1) 的反应液进行SLP-eRCA反应。所有微阵列最后与链霉亲和素-IRDye800CW结合并NIRF成像。结果表明，通过固相SLP-eRCA成功特异性检测到每个HPV亚型(图5B和5D)。

类似合成的寡核苷酸的定量检测，还研究了用固相SLP-eRCA定量检测HPV L1DNA。为此，用PC，NC和高风险型HPV16和HPV18的捕获探针制备了 DNA微阵列。然后将六个相同的微阵列分别与各种量的HPV16和HPV18质粒 DNA杂交。杂交后，所有微阵列与包含SLP2、HPV16-SLP1和HPV18-SLP1的反应液进行SLP-eRCA反应。所有微阵列最后与链霉亲和素-IRDye800CW结合并NIRF成像。结果表明，通过固相SLP-eRCA定量检测了这两种HPV亚型(图5E)。此外，两种HPV亚型的检测具有几乎相同的动力学参数(与R2>0.9的线性相关性)并且检测下限低至7.5fmol。总之，这些实验表明，SLP-eRCA可以在固相上高灵敏度地对HPV进行检测和分型。

实施例7用液相SLP-eRCA检测HPV质粒DNA

方法：

液相SLP-eRCA反应可通过实时荧光定量监测，类似实时PCR。为了定性检测特定HPV亚型，RCA反应(10μL)含有0.1μM RC模板，2×BSA，0.5mM dNTP， 1×phi29DNA聚合酶缓冲液，4U phi29DNA聚合酶(HYK)，1.25pmollpSLP1 (表1)，1.25pmol SLP2(表1)，1.5μM报告寡核苷酸(RO；表1)，1×SybrGreen I和0.5pmol HPV质粒DNA。为了定量检测特定HPV亚型，RCA反应(10μL) 含有0.1μM RC模板，2×BSA，0.5mM dNTP，1×phi29DNA聚合酶缓冲液，4Uphi29DNA聚合酶(HYK)，1.25pmol lpSLP1(表1)，1.25pmol SLP2,1.5μM RO，1×SybrGreenI和各种量的特定HPV质粒DNA(见图6和7)。在实时PCR装置(StepOne Plus，ABI)上30℃开始RCA反应，并以30s的间隔(作为循环)定期收集荧光信号。

结果：

为了用液相SLP-eRCA检测HPV质粒DNA。为此，制备了多组类似的6管RCA 反应。在每组中，每管都含有SLP2和6种不同的HPV SLP1之一。将RO和SybrGreen 加入到每个管中。在检测单个HPV基因型时，将该HPV质粒DNA加入到一组实验的每个管中。然后在实时PCR仪中反应，并定期读取荧光信号。结果，发现含有特异性SLP1的SLP-eRCA反应可以对每个HPV基因型进行特异性检测(图 6A-F)。此外，两种高危HPV基因型HPV16和HPV18的定量检测表明，液相 SLP-eRCA可用于定量检测HPV DNA(图6G-H)。

实施例8用分子信标SLP2液相SLP-eRCA检测HPV质粒DNA

方法：

本实验中采用一对荧光共振能量传递(FRET)标记SLP2分子(molecular beaconSLP2,mbSLP2)，将该mbSLP2用于液相SLP-eRCA检测，替代上述液相检测中使用的报告探针和SybrGreen分子，以便简化的液相SLP-eRCA检测的反应组分，并通过实时荧光定量监测检测目标核酸分子。使用mbSLP2的lpSLP-eRCA 被命名为mbSLP-eRCA。检测中用qPCR机器(如StepOne Plus，ABI)定期读取的信号。

为了定性检测特定的HPV亚型，RCA反应(10μL)含有0.1μM RC模板、 2×BSA、0.5mMdNTP、1×phi29DNA聚合酶缓冲液、4U phi29DNA聚合酶(HYK)、 1.25pmol lpSLP1、1.25pmolmbSLP2，以及0.5pmol变性HPV质粒DNA。为了定量检测特定的HPV亚型，RCA反应(10μL)含有0.1μM RC模板、2×BSA、0.5mM dNTP、1×phi29DNA聚合酶缓冲液、4U phi29DNA聚合酶(HYK)、1.25pmol lpSLP1、1.25pmol mbSLP2，以及各种变性的特定的HPV质粒DNA或208ng变性的HepG2gDNA。所有RCA反应在10℃开始5个循环，然后20℃开始5个循环，随后在30℃下进行140个循环。用qPCR机器以30秒的间隔定期读取荧光强度(被认为是一个循环)。

结果：

用分子信标SLP2(mbSLP2)液相SLP-eRCA检测HPV质粒DNA。结果显示，每种HPV亚型均可通过mbSLP-eRCA检测(图8A)。此外，通过该方法可定量检测HPV16和18(图8B)。同时发现使用mbSLP2使得液相SLP-eRCA的检测限大大提高(图8B)。通过mbSLP-eRCA检测到少至5fmol的HPV16和18分子。

实施例9用分子信标SLP2液相SLP-eRCA检测宫颈癌细胞基因组DNA中的 HPV DNA

方法：

为了定量检测宫颈癌细胞gDNA中的HPV16和HPV18DNA，建立了与实施例 8中HPV质粒DNA定量检测相同的RCA反应，其中将反应中的HPV质粒DNA替换为不同量的宫颈癌细胞HeLa、SiHa或C-33A的变性gDNA。所有RCA反应在10℃开始5个循环，然后20℃开始5个循环，随后在30℃下进行140个循环。用qPCR机器以30秒的间隔定期读取荧光强度(被认为是一个循环)。HeLa细胞用作HPV18 阳性宫颈癌细胞，SiHa细胞用作HPV16阳性宫颈癌细胞，C-33A细胞用作HPV阴性宫颈癌细胞。

结果：

gDNA检测显示，mbSLP-eRCA还可以定量和特异性检测整合在HeLa gDNA 中的HPV18DNA和整合在SiHa gDNA中的HPV16DNA(图9A和B)。然而，在 HepG2细胞(图9A和B)和HPV阴性宫颈癌细胞C-33A(图9C)的gDNA中未检测到HPV16和HPV18。结果还表明，mbSLP-eRCA显著改善了lpSLP-eRCA的检测限。

表1所用寡核苷酸

序列表

<110> 东南大学

<120> 一种用于茎环引物-滚环扩增反应的茎环引物以及茎环引物-滚环扩增的应用

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tttttttttt ttcatcatca cgcagagcat cattt 35

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tttttttttt tattcggatc gctcatcagt tctgc 35

<210> 3

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttttttttt gcactgacat caaagcagcc aggagcaaac tcttggtaca gc 52

<210> 4

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gttgctctac caattgagct acaccgctgt accaagagtt tgctcctggc tgctttgat 59

<210> 5

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtatgtctcc gggtgtagct caattggtag agcaacggca gacggagaca tac 53

<210> 6

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccgtctgcct gtgtatcttt gattcgtcag ccctgtaagg cagacgg 47

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctccgtctgc ctgtgtatct ttgattcgtc agccctgtag gcagacggag 50

<210> 8

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgttatttgt attctactgt attctgtatg tctccgtctg cctgtcacct gtgtatcttt 60

gattcgtcag ccctgtatcc 80

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcccgttatt tgtattctac tgtattctta gacc 34

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

caaataacgg gatacagggc 20

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tttttttttt tatgttaaca ccccaagcgg 30

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tttttttttt gggggtaata acagatcatc tg 32

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tttttttttt atatctactt cagaaactac 30

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tttttttttt caggtacagg agactgtgta ga 32

<210> 15

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tttttttttt cctccatctg ctagtttaca g 31

<210> 16

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tttttttttt gtaatgctaa ccaggtaaaa gc 32

<210> 17

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gtctccgtga gtatgattta caatttacag gcagacggag ac 42

<210> 18

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gtctccgtga gtttgattta cagtttacag gcagacggag ac 42

<210> 19

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gtctccgtga atatgattta cagtttacag gcagacggag ac 42

<210> 20

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gtctccgtga atatgatttg cagtttacag gcagacggag ac 42

<210> 21

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gtctccgtga atatgatcta cagtttacag gcagacggag ac 42

<210> 22

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gtctccgtga atatgattta cagtttacag gcagacggag ac 42

<210> 23

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gtctccgtta tgttaacacc ccaagcggag gcagacggag ac 42

<210> 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gtctccgtgg gtaataacag atcatctgag gcagacggag ac 42

<210> 25

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gtctccgtat atctacttca gaaactacag gcagacggag ac 42

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gtctccgtgg tacaggagac tgtgtagaag gcagacggag ac 42

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gtctccgtct ccatctgcta gtttacagag gcagacggag ac 42

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gtctccgtaa tgctaaccag gtaaaagcag gcagacggag ac 42

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gtctccgtac tttaaacatt tatcacatag gcagacggag ac 42

Claims (14)

1.一种用于茎环引物-滚环扩增反应的茎环引物，其特征在于，所述茎环引物为一种具有双链茎部和单链环区的单分子链内发卡结构。

2.根据权利里要求1所述的茎环引物，其特征在于，所述单链环区可与核酸分子杂交，杂交导致其双链茎部解链，暴露出3′端单链区；该单链区再与滚环模板杂交，从而启动茎环引物-滚环扩增反应。

3.根据权利里要求1所述的茎环引物，其特征在于，所述茎环引物包括第一茎环引物分子和第二茎环引物分子，线性滚环扩增只使用第一茎环引物分子，指数滚环扩增使用第一茎环引物分子和第二茎环引物分子。

4.根据权利里要求1所述的茎环引物，其特征在于，所述第一茎环引物分子可直接固定在固相表面既作为滚环扩增引物又作为捕获探针，此时第一茎环引物分子与靶核酸分子的杂交可直接打开第一茎环引物分子的茎部，暴露其3′端单链区，启动茎环引物-滚环扩增反应。

5.根据权利里要求1所述的茎环引物，其特征在于，所述第二茎环引物分子用荧光共振能量转移荧光基团标记，制备为分子信标第二茎环引物分子，用于茎环引物-滚环扩增的检测。

6.一种基于权利要求1所述的茎环引物的茎环引物-滚环扩增在核酸分子检测中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述核酸分子检测包括在液相中茎环引物-滚环扩增检测核酸分子和在固相表面上茎环引物-滚环扩增检测核酸分子。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述茎环引物-滚环扩增包括茎环引物-滚环线性扩增或茎环引物-滚环指数扩增来检测核酸分子。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述液相中检测核酸分子的过程为：将茎环引物-滚环扩增反应组分包括茎环引物、滚环模板、具有链置换功能的DNA聚合酶、缓冲液、四种单核苷酸、待检核酸样品及水混合组成茎环引物-滚环扩增反应体系，在所加DNA聚合酶的适宜反应温度下孵育，完成茎环引物-滚环扩增。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述固相表面检测核酸分子的过程为：首先将捕获探针分子固定在固相介质表面；之后将待检核酸样品与固定在固相表面的捕获分子杂交，使得待检核酸分子被捕获探针捕获在固相表面；最后将茎环引物-滚环扩增反应液包括茎环引物、滚环模板、具有链置换功能的DNA聚合酶、缓冲液及四种单核苷酸覆盖带有捕获分子的固相表面，在所加DNA聚合酶的适宜反应温度下孵育，完成茎环引物-滚环扩增。

11.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述在液相中茎环引物-滚环扩增的产物通过凝胶电泳、实时荧光定量监测或目测进行报告。

12.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述在固相表面上茎环引物-滚环扩增的产物通过荧光检测、目测进行报告。

13.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述在液相中茎环引物-滚环扩增的产物的凝胶电泳检测指琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；所述实时荧光定量监测是指在茎环引物-滚环扩增反应添加核酸荧光染料，或可与茎环引物-滚环扩增产物特异性杂交的分子信标，用荧光定量PCR仪等荧光检测仪器实时动态观察茎环引物-滚环扩增反应进行检测；所述目测是指在茎环引物-滚环扩增反应完成后向反应液中加入可目测检测的显色物质，用肉眼直接观察或借助放大镜、显微镜观察完成检测。

14.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述在固相表面上茎环引物-滚环扩增的产物的荧光检测是指在茎环引物-滚环扩增反应添加荧光标记的单核苷酸，茎环引物-滚环扩增反应后用荧光显微镜、基因芯片扫描仪及其他荧光成像仪器检测；或指在茎环引物-滚环扩增反应添加生物素标记的单核苷酸，茎环引物-滚环扩增反应后将扩增产物与荧光标记的链霉亲和素反应，最后用荧光显微镜、基因芯片扫描仪及其他荧光成像仪器观测；所述目测是指在茎环引物-滚环扩增反应完成后向反应液中加入可肉眼检测的显色物质，用肉眼直接观察或借助放大镜、显微镜观察完成检测。