CN102618627A

CN102618627A - 核酸恒温扩增反应内参检测系统及试剂盒

Info

Publication number: CN102618627A
Application number: CN2011100323911A
Authority: CN
Inventors: 尤其敏; 徐高连; 胡林; 钟华燕; 李波; 范倻; 马玉霞
Original assignee: YOUSIDA BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd HANGZHOU
Current assignee: Hangzhou Yousida Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2011-01-30
Filing date: 2011-01-30
Publication date: 2012-08-01
Anticipated expiration: 2031-01-30
Also published as: CN102618627B

Abstract

本发明设计一种内参检测系统，具体地讲，涉及一种核酸恒温扩增反应内参检测系统、含有该内参检测系统试剂盒，及其应用。所述内参检测系统用于检测核酸恒温扩增反应中的假阴性反应，包括具有发夹式结构的模板DNA、特异性的引物1和特异性的引物2，其中，特异性的引物1与发夹式结构中的环上的序列互补，特异性的引物2与发夹式结构中茎部的3’末端序列互补。本发明还涉及一种核酸恒温扩增反应内参检测系统的试剂盒，该试剂盒包括由链置换功能的DNA聚合酶介导的核酸恒温扩增体系和内参检测系统。本发明的内参检测系统设计精巧，反应灵敏，适用于大规模的推广使用。

Description

核酸恒温扩增反应内参检测系统及试剂盒

技术领域

本发明设计一种内参检测系统，具体的讲，涉及一种核酸恒温扩增反应内参检测系统、含有该内参检测系统试剂盒，及其应用。

背景技术

近年来，全球流行病趋势表明，各种难培养和不能培养的病原微生物正成为感染性疾病的主要根源。常规的病原菌检测方法(如培养鉴定)由于其自身的不足之处，已不适应现在临床检测的要求。但随着分子生物学技术特别是核酸扩增技术的发展，大大提高了对病原菌检测和鉴定的能力。

核酸扩增技术指通过在体外，特异的大量扩增某微生物特有的序列片段，再通过各种检测手段以达到检测病原体的目的。由于其操作简单、快速，因此在临床诊断中得到越来越广泛的应用。但是核酸扩增中的假阳性和假阴性的问题一直是关注的焦点。同时由于造成假阳性的因素相对比较单一，因此假阳性并不是困惑检验工作的主要原因。但核酸扩增中的假阴性问题在检验工作中仍很严重，并且经常被人为的忽略掉，严重的影响了核酸扩增技术的使用。造成核酸扩增假阴性的原因是复杂的，也是多样的。主要有：

1.仪器本身的质量问题。仪器设计原理上的差异和经常出现的质量问题(如：温控不准等)给临床带来了诸如非特异性扩增(假阳性)、扩增效率下降(假阴性)等问题。

2.离心机问题。离心机的质量或使用不正确等，例如有效半径的长短导致离心效果的差异，致使样本DNA分离无法有效的分离，并最终导致的假阴性；由于高速离心机高速旋转与空气摩擦会产生大量的热，致使扩增反应体系的改变所导致的假阴性等。

3.核酸提取过程：在提取过程中所采用的试剂和操作，造成标本DNA没有被提取出来，或在加样过程中吸入了一些抑制物等均会使得扩增无法进行，出现假阴性的结果。

4.试剂运输和保存环境的不均一，也会导致假阴性的结果。

荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative PCR，FQ-PCR)技术以其灵敏度高，速度快，特异性强等优点，是目前最为广泛使用的核酸检测技术。虽然FQ-PCR有着简便，快速，灵敏的优势，但是其检测需要昂贵的仪器；同时为了能进行更准确的定量，FQ-PCR一般采用“外标法+过程监测”的方式，因此也就无法排除假阴性的结果。

目前，NAIA技术由于其操作简单，仪器要求低等各种优点正为科学家们研究的重点，也成为分子诊断行业发展中的关键。目前的NAIA技术主要包括滚环扩增技术(Rolling CircleAmplification，RCA)；转录酶扩增技术(Transcription Mediated Amplification，TMA)；依赖核酸序列扩增技术(Nucleic Acid Sequence Based Amplification，NASBA)；链置换扩增技术(strand displacement amplification，SDA)；环介导的恒温扩增技术(Loop-Mediated IsothermalAmplification，LAMP)；解链酶扩增技术(Helicase Dependent Amplification，HDA)；交叉引物扩增技术(Crossing Primering Amplification，CPA)。这些NAIA系统大部分均由链置换功能的DNA聚合酶介导的核酸扩增，例如LAMP，HAD，CPA是由Bst DNA聚合酶介导的；RCA和SDA由Klenow大片段DNA聚合酶介导，而在这些NAIA技术中均无相应的反应内参检测系统。为了解决这些由具有链置换功能的DNA聚合酶介导的核酸恒温扩增过程中出现的假阴性问题，我们设计了相应的内参检测系统。

发明内容

本发明的首要发明目的在于提出一种核酸恒温扩增反应内参检测系统。

本发明的第二发明目的在于提出含有该核酸恒温扩增反应内参检测系统的试剂盒。

本发明的第三发明目的在于提出该试剂盒的应用。

为了完成本发明的第一发明目的，采用的技术方案为：

本发明涉及一种核酸恒温扩增反应内参检测系统，所述内参检测系统用于检测核酸恒温扩增反应中的假阴性反应，包括具有发夹式结构的模板DNA、特异性的引物1和特异性的引物2，其中，特异性的引物1与发夹式结构中的环上的序列互补，特异性的引物2与发夹式结构中茎部的3’末端序列互补。

其中，本发明所述的内参反应检测系统的第一优选技术方案为：所述内参系统中具有发夹式结构的模板DNA、特异性的引物1和特异性的引物2在检测过程中的反应步骤为：

(1)所述模板DNA形成发夹式结构，特异性引物1与发夹式单链结构中的环上序列互补，在DNA聚合酶的作用下进行延伸，进而打开发夹式结构，形成直链；特异性引物2与成为直链的模板DNA互补结合，并在DNA聚合酶的作用下进行延伸，其延伸产物由于DNA聚合酶的链置换功能而剥离，形成由特异性引物1延伸产生的DNA单链，同时，模板DNA形成一条双链DNA产物I；

(2)双链DNA产物I形成两个发夹式单链结构，发夹式单链结构重复步骤(1)的反应；形成循环过程1；

(3)发夹式单链结构的茎部打开形成直链，特异性引物2与直链的3’端互补结合，并在DNA聚合酶的作用下形成双链DNA产物I；双链DNA产物I可再形成两个发夹式单链结构，再打开茎部；形成循环过程2；

(4)步骤(1)中产生的由特异性引物1延伸的DNA单链与引物P2结合，并在DNA聚合酶的作用下形成双链DNA产物II。

本发明所述的内参反应检测系统的第二优选技术方案为：所述的具有发夹式结构的模板DNA的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中的至少55个核苷酸序列，优选具有SEQID NO：1所示核苷酸序列中的至少58个核苷酸序列，更优选具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中的至少60个核苷酸序列，最优选具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中的至少63个核苷酸序列。

本发明所述的内参反应检测系统的第三优选技术方案为：所述的特异性引物1的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示核苷酸序列中的至少15个核苷酸序列，优选具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列中的至少18个核苷酸序列，更优选具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列中的至少18个核苷酸序列，最优选具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列中的至少20个核苷酸序列.

本发明所述的内参反应检测系统的第四优选技术方案为：所述的特异性引物2的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示核苷酸序列中的至少15个核苷酸序列，优选具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列中的至少18个核苷酸序列，更优选具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列中的至少18个核苷酸序列，最优选具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列中的至少19个核苷酸序列。

其中，

SEQ ID NO：1：5’-ACTGGACGAGCTGATTTACGAAGGTTGCTCAAGTGACTTTCCACGTAAATCAGCTCGTCCAGT-3’

SEQ ID NO：2：5’ACTGGACGAGCTGATTTACG-3’

SEQ ID NO：3：5’-GTCACTTGAGCAACCTCTC-3’

本发明所述的内参反应检测系统的第五优选技术方案为：采用荧光定量方法和核酸检测试纸条的方法对内参扩增产物进行检测。

本发明所述的内参反应检测系统的第六优选技术方案为：采用核酸检测试纸条对内参扩增产物进行检测，特异性的引物1和特异性的引物2上分别连接有抗原或半抗原A、抗原或半抗原B，核酸检测试纸条上设置有与引物2上标记的抗原或半抗原B特异性结合的抗体形成的检测线。

为完成本发明的第二发明目的，采用的技术方案为：

本发明涉及一种核酸恒温扩增反应内参检测系统的试剂盒，所述的试剂盒包括由链置换功能的DNA聚合酶介导的核酸恒温扩增体系和内参检测系统，其中内参检测系统包括发夹式结构的模板DNA、特异性引物1和特异性引物2，特异性的引物1与发夹式结构中的环上序列互补，特异性的引物2与发夹式结构中茎部的3’末端序列互补，所述特异性的引物1和特异性的引物2上分别标记有抗原A、抗原B。

本发明的核酸恒温扩增反应内参检测系统的试剂盒的第一优选技术方案为：所述的链置换功能的DNA聚合酶选自Bst DNA聚合酶、Klenow大片段DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶。

本发明的核酸恒温扩增反应内参检测系统的试剂盒的第二优选技术方案为：所述的抗原A、抗原B独立的选自：生物素、地高辛或荧光染料，所述荧光染料选自Cy3、Cy5、Tetramethylrhodamine、AlexaFluor、Rhodamine、Fam或FitC，优选生物素或地高辛。

本发明的核酸恒温扩增反应内参检测系统的试剂盒的第三优选技术方案为：所述试剂盒中，所述的核酸恒温扩增体系为交叉引物扩增反应体系，包括：正向外围引物、反向外围引物、正向标记探针，反向标记探针、扩增反向引物、扩增正向引物。

本发明还涉及核酸恒温扩增反应内参检测系统在具有链置换功能的DNA聚合酶介导的核酸扩增检测中检测假阴性反应中的应用。其中，假阴性反应抑制物主要包括一些蛋白变性剂、较高的离子浓度、极端的pH等。

所述的核酸恒温扩增反应包括滚环扩增反应、转录酶扩增反应、依赖核酸序列扩增反应、链置换扩增反应、环介导的恒温扩增反应、解链酶扩增反应、交叉引物扩增反应。

下面对本发明的技术方案作进一步的详细描述：

本发明是指在不影响由具有链置换功能DNA聚合酶参与的核酸恒温扩增(Nuclei AcidIsothermal Amplification，NAIA)的前提下，在NAIA体系中加入人工合成能自身形成发夹式结构的寡核苷酸链和两条特异性的引物，并由此三个寡核苷酸链介导的内参扩增检测过程，用于监控NAIA是否有扩增抑制物存在而影响扩增系统正常运行。本发明体系在常见的由链置换功能的DNA聚合酶介导NAIA体系中的各种组分外，如具有链置换功能的DNA聚合酶、dNTP、各种离子等，额外的加入了人工合成的发夹式结构的模板DNA，以及特异性引物1(P1)和特异性引物2(P2)。特异性引物1与发夹式结构中的环上序列互补；特异性引物2与发夹式结构中茎部的3’末端序列互补。本内参检测原理主要如附图1所述：

本内控检测系统主要包括以下几个步骤：

1.模板DNA形成发夹式结构(结构1)；P1与发夹式结构中的环上序列互补，并在DNA聚合酶的作用下进行延伸，从而打开发夹式结构，使其成为一条直链(结构3)，由此起始内参反应的核酸扩增过程；

2.引物P2与成为直链的模板DNA互补结合(结构4)，并在DNA聚合酶的作用下进行延伸。其延伸产物由于DNA聚合酶的链置换功能，而剥离由P1延伸产生的DNA单链(结构6)，并与模板DNA形成一条双链DNA产物I(结构5)；

3.双链DNA产物I(结构5)中，任意一条单链的5’端序列均与其自身的3’端序列互补；根据分子热力学原理，使得双链的结构5能形成两个发夹式结构的单链(结构1和结构7)。一旦结构5解链形成两条发夹式单链，那么其中的发夹式单链(结构1)可参到步骤1中，实现内参扩增反应中扩增循环过程1；

4.同样根据分子热力学原理，发夹式单链(结构7)的茎部结构也处于张开和闭合的一个动态平衡；茎部一旦打开形成直链(结构8)，引物P2可与其3’端互补结合，并在DNA聚合酶的作用下形成双链DNA产物I(结构5)；

5.双链DNA产物I(结构5)将参与到步骤3的各种反应中，进而实现内参扩增反应中扩增循环过程2；

6.DNA单链(结构6)将引物P2结合，并在DNA聚合酶的作用下形成双链DNA产物II(结构11)。

其中，本发明采用了阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)PRKase序列(Genebank：X58149)的部分序列作为具有发夹式结构的模板DNA，并人工合成了一个发夹式结构和两条引物。因此这个序列基本上可应用于所有利用链置换功能DNA聚合酶参与的核酸恒温扩增反应。

所述的具有发夹式结构的模板DNA的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中的至少61个核苷酸序列，优选具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中的至少62个核苷酸序列，最优选具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中的至少63个核苷酸序列；

所述的特异性引物1的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示核苷酸序列中的18个核苷酸序列，更优选具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列中的至少19个核苷酸序列，最优选具有SEQ IDNO：2所示核苷酸序列中的至少20个核苷酸序列；

所述的特异性引物2的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示核苷酸序列中的17个核苷酸序列，更优选具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列中的至少18个核苷酸序列，最优选具有SEQ IDNO：3所示核苷酸序列中的至少19个核苷酸序列。

本发明中的具有发夹式结构的模板DNA、特异性引物1、特异性引物2在实际应用于不同的系统时，其核苷酸序列有时需要进行微小的调整，如：维持三者的Tm不变、减少目的系统中探针于P1、P2之间的非特异性结合，避免造成假阳性的可能；所以本发明中所应用的3个三个寡核苷酸链的核苷酸序列在SEQ ID NO：1～3的基础上需要做一些微小的调整，如替换、取代若干个核苷酸序列，这种改动对于本领域的技术人员来说是显而易见的，所以本发明不仅保护SEQ ID NO：1～3的核苷酸序列，还保护以SEQ ID NO：1～3为基础，经过调整的核苷酸序列。

本发明的核酸恒温扩增反应内参检测系统的反应条件为60～65℃，40～80分钟；优选62～64℃，55～65分钟；最优选63℃，60分钟。

本发明的核酸恒温扩增反应内参检测系统的试剂盒的反应体系包括链置换功能的DNA聚合酶介导的交叉引物扩增反应体系和内参检测系统，

其中，内参检测系统包括发夹式结构的模板DNA、特异性引物1和特异性引物2；交叉引物扩增反应体系包括：正向外围引物、反向外围引物、正向标记探针，反向标记探针、扩增反向引物、扩增正向引物。

其反应体系为：

内参反应体系中：

发夹式结构的模板DNA：0.2～0.4纳摩，优选0.4纳摩；

5’端带抗原或半抗原标记的特异性引物1：0.2～0.4微摩，优选0.4微摩；

5’端带抗原或半抗原标记特异性探2：0.2～0.4微摩，优选0.4微摩；

交叉引物扩增反应体系中：

正向外围引物：0.01～0.05微摩，优选0.05微摩；

反向外围引物：0.01～0.05微摩，优选0.05微摩；

正向5’端带抗原或半抗原标记的探针：0.1～0.3微摩，优选0.3微摩：

反向5’端带抗原或半抗原标记的探针：0.1～0.3微摩，优选0.3微摩：

扩增反向引物：0.1～0.5微摩；优选0.5微摩：

扩增正向引物：0.1～0.5微摩；优选0.5微摩：

反应体系组成：

dNTP：0.2～0.6毫摩，优选0.6毫摩；

(NH₄)₂SO₄：5～10毫摩，优选10毫摩；

KCl：5～10毫摩，优选10毫摩；

Tris-HCL(PH 8.8，25℃)：10～20毫摩，优选20毫摩；

Triton-100：0.05～0.2％，优选0.1％；

MgSO₄：1～5毫摩，优选5毫摩；

Bst DNA聚合酶：4～8单位，优选8单位；

总体积为10～20微升，优选20微升。

本发明采用的核酸试纸条可采用专利申请号为200610109620.4的全封闭核酸防污染检测装置，该检测装置具有全封闭检测、特异性强、操作简单快速、扩增后检测不需要任何仪器设备。该装置使核酸扩增检测和分析均在封闭状态完成，最大限度降低常规扩增法中交叉污染的危险。该试剂盒操作简单、时间短，同时也减低了检测成本，使检测结果更加快速、可靠。其装置中的试纸条的原理在申请人的另一项专利申请200610003429.1中的进行了叙述。

核酸试纸条是目前比较简便的核酸扩增检测装置，专利申请200610003429.1公开了一种核酸薄膜层析快速检测方法及其试纸条及其用途。该专利申请公开了一种特异性核酸序列的检测方法，该方法将一种特异性抗体A吸附于有色颗粒，在颗粒表面形成抗体包被；将另一种特异性抗体-无色抗B抗体固定于膜上形成检测线；待测核酸进行扩增时，将所使用的探针或是引物用A抗原或B抗原标记，形成扩增物、探针、引物、抗原A、抗原B的复合物，将该复合物与吸附有色颗粒的抗体A结合，得到的该有色颗粒复合物在溶液中通过毛细血管现象眼纤维膜向上流动只抗体B检测条时，与线条上的抗体B结合，从而滞留在检测线上，形成肉眼可见的有色线条。该试纸条包括在带有不干胶的衬垫上按顺序有样品垫、有色颗粒结合物垫和吸水滤纸垫，上述各部分在相邻处部分重叠，纤维膜上还设有检测线和质控线，其中有色颗粒结合物垫上的有色颗粒有抗A抗体包被，检测线上有抗B抗体包被，质控线上有抗A抗体，有色颗粒选自胶体金颗粒、乳胶颗粒。其中，本发明在内参检测系统中的特异性引物上标记有抗原A、抗原B。例如，将特异性引物P1的5’端标记上生物素(Biotin)，特异性引物P2的5’端标记上地高辛(DIG)。扩增后，试纸条上的检测线(C-线)将出现两种情况：

1.结构11上的Biotin首先与颗粒表面的亲和素结合，形成带DIG标记有色颗粒复合物。该复合物在溶液中通过毛细现象沿纤维膜向上流动。遇到固定于膜上的抗DIG抗体线条(C-线)时，复合物上的DIG将与C-线上的抗DIG结合，因此可在C-线上形成一条红色线条。此为阳性。

2.在恒温扩增反应时，如果反应中存在反应的抑制物时，那么内参系统就无法有效的进行扩增，也就不能形成带DIG标记有色颗粒复合物。因此有色颗粒将不能与膜上的C-线结合而越过此线，不也就无法形成有色线条。此为阴性。因此如果核酸试纸条的C-线上无条带出现说明反应扩增中存在反应扩增抑制物。

本发明的内参检测系统可以以试纸条为平台，也可以应用于其他的检测系统，例如荧光定量PCR检测等。

在利用本发明的恒温扩增对传染病的病原体进行检测时，如果反应体系中存在反应抑制物，例如存在某些蛋白变性剂，或反应体系中离子浓度较高，或者存在极端的PH等，从而使扩增反应不能正常进行，从而得到了假阴性的结果，会贻误传染病的诊断，造成很严重的后果。因此，本发明提出了一种恒温反应的内参系统，当反应体系中存在抑制物时，内参系统和检测系统都不能后正常扩增，从而提示工作人员得到的结果为假阴性结果，应该重新建立体系进行检测；当体系内不存在抑制物时，内参系统正常扩整，在试纸条上显示出特定条带，从而使工作人员得知，该恒温扩增反应正常进行，得到的检测结果为可信的结果。

本发明的恒温扩增反应体系设计巧妙，利用了发夹式结构的模板DNA在反应体系中存在形成的双链可解构成两个单链的动态平衡，扩增出由特异性引物1和特异性引物2同时引导的双链结构，从而通过引物1和引物2上标记的抗原和半抗原和检测试纸条上的对应的抗体、半抗体的结合，从而显示扩增反应正常进行。

本发明的恒温扩增反应体系反应灵敏，灵敏度可达10^-5摩尔/毫升。检测时间短，操作简便，适用于大规模推广使用。

附图说明

图1为NAIA核酸扩增内参扩增反应原理图；

图2为为检测TB时，加入不同扩增模板的试纸条检测结果：其中1为同时加入内参模板和TB DNA的扩增结果，2为只加入TB DNA的扩增结果，3为只加入内参模板的扩增结果，4为加扩增抑制物后的CPA扩增结果；

图3为加入不同浓度TB DNA的CPA扩增试纸条检测结果：其中1～5分别为TB DNA103拷贝/微升、102拷贝/微升、101拷贝/微升、100拷贝/微升；5是阳性对照，6是阳性对照。

图4为利用LAMP检测HBV时，加入不同扩增模板的试纸条检测结果，其中，1为同时加入内参模板和HBV DNA的扩增结果，2为只加入HBV DNA的扩增结果，3为只加入内参模板的扩增结果，4为加扩增抑制物后的LAMP扩增结果。

本发明的具体实施例方式仅限于对本发明的技术方案做进一步的解释和说明，并不对本发明的内容构成限制。

具体实施方式

实施例1 本发明在利用交叉引物扩增技术进行结核分枝杆菌检测中的应用

结核病(Tuberculosis，TB)是严重危害人类健康的传染病，是阻碍国家经济和社会发展的重大问题，是我国重点控制的重大疾病之一，也是全球关注的公共卫生问题和社会问题。近年来，全球结核病疫情的回升，引起了国际社会的高度重视，世界卫生组织已将结核病作为重点控制的传染病之一，并宣布全球结核病处于紧急状态。世卫组织在结核防治报告中指出，改进检测工作，可以促进国际结核病控制努力，并应对巨大的市场需求，同时呼吁对以低收入和中等收入国家为目标的新的诊断工具进行工业投资。结核分枝杆菌的核酸检测，特别是核酸的恒温扩增检测是关注的焦点。

为了防止交叉扩增技术检测出现假阴性，在反应体系中加入本发明的内参反应体系：内参反应体系的探针和模板为：

模板序列：SEQ ID NO：1 0.4纳摩；

带Biotin标记特异性探针P1：5’端生物素标记的SEQ ID NO：2 0.4微摩；

带DIG标记特异性探针P2：5’端地高辛标记的SEQ ID NO：3 0.4微摩；

SEQ ID NO：1 5’-ACTGGACGAGCTGATTTACGAAGGTTGCTCAAGTGACTTTCCACGTAAATCA GCTCGTCCAGT-3’

5’端生物素标记的SEQ ID NO：2 5’-Biotin-ACTGGACGAGCTGATTTACG-3’

5’端地高辛标记的SEQ ID NO：3 5’-DIG-GTCACTTGAGCAACCTCTC-3’

交叉扩增反应体系的引物和探针为：

正向外围引物(0.05微摩)：SEQ ID NO：4 5’-AGGACCACGATCGCTGATC-3’；

反向外围引物(0.05微摩)：SEQ ID NO：5 5’-TGGCCATCGTGGAAGCGA-3’；

正向5’端Biotin标记探针(0.3微摩)：SEQ ID NO：6

5’-biotin-TAGCAGACCTCACCTATGTGTC

反向5’端异硫氰酸荧光素(FitC)标记探针(0.3微摩)：SEQ ID NO：7

5’-FitC-CTGGGCAGGGTTCGCCT-3’；

扩增反向引物(0.5微摩)：SEQ ID NO：8

5’-CTCGTCCAGCGCCGCTTCGGTTCGGTGACAAAGGCCACG-3’

扩增正向引物(0.5微摩)：SEQ ID NO：9

5’-GCGTCGGTGACAAAGGCCACGTTCTCGTCCAGCGCCGCTTC-3’

其他的反应：

dNTP： 0.6毫摩

(NH₄)₂SO₄ 10毫摩

KCl 10毫摩

Tris-HCL(PH 8.8，25℃) 20毫摩

Triton-100 0.1％

MgSO₄ 5毫摩

Bst DNA聚合酶： 8单位

总体积为20微升

反应程序：63℃，60分钟。

检测结果：将反应产物取4微升利用核酸试纸条进行检测，用核酸试纸条检测的结果为图2，图3。

图2所示的1～4的结果分别是：其中1为同时加入内参模板和TB DNA的扩增结果，2为只加入TB DNA的扩增结果，3为只加入内参模板的扩增结果，4为加扩增抑制物后的CPA扩增结果；结果表明只有在CPA核酸扩增反应中加入人工合成的发夹式结构后，并无扩增抑制物存在的情况下才能使得核酸试纸条上的C-线出现红色的线条。

图3为加入不同浓度TB DNA的CPA扩增试纸条检测结果：其中1～5分别为TB DNA10³拷贝/微升、10²拷贝/微升、10¹拷贝/微升、10⁰拷贝/微升；5是阳性对照，6是阳性对照。从实验结果可以发现，该试剂盒可在每个反应体系中检出10个拷贝，具有很高的灵敏度，可以满足快速检测TB的要求；同时不同的TB DNA模板浓度对内参扩增反应的影响不大。

实施例2 本发明在利用LAMP技术进行乙型肝炎病毒(HBV)检测中的应用

HBV在我国的感染率约60％～70％，约有9300万携带者，严重阻碍国家经济和社会的发展，是我国重点控制的重大疾病之一，同时也是全球关注的公共卫生问题和社会问题。为了能快速有效的诊断HBV，NAIA检测技术正成为关注的焦点。

为了防止利用LAMP技术检测出现假阴性，我们根据本说明的内参检测系统，利用LAMP进行HBV检测的扩增的反应体系(包含内参反应体系)为：

内参反应体系的探针和模板为：

模板序列：SEQ ID NO：1：(0.4纳摩)

5’-ACTGGACGAGCTGATTTACGAAGGTTGCTCAAGTGACTTTCCACGTAAATCAGCTCGTCCAGT-3’

带Biotin标记特异性探针P1：5’端生物素标记的SEQ ID NO：2(0.4微摩)

5’-Biotin-ACTGGACGAGCTGATTTACG-3’

带DIG标记特异性探针P2：5’端地高辛标记的SEQ ID NO：3(0.4微摩)

5’-DIG-GTCACTTGAGCAACCTCTC-3’

LAMP增反应体系的引物和探针为：

正向外围引物(0.05微摩)：SEQ ID NO：10 5’-GGTGGTTGATGTTCCTGGA-3’；

反向外围引物(0.05微摩)：SEQ ID NO：11 5’-CAAAATTCGCAGTCCCCAAC-3’；

反向3’端异硫氰酸荧光素(FitC)标记探针(0.1微摩)：SEQ ID NO：12

5’-CAGCGATAGCCAGGACAAA-FitC-3’；

扩增反向引物(0.5微摩)：SEQ ID NO：13

5’-GATAAAACGCCGCAGACACATCCTTCCAACCTCTTGTCCTCCAA-3’

正向5’端Biotin标记的扩增正向引物(0.5微摩)：SEQ ID NO：14

5’Biotin-CCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTTGACAAACGGGCAACATACCTT-3’

体系中的其他组分：

dNTP： 0.6毫摩

(NH₄)₂SO₄ 10毫摩

KCl 10毫摩

Tris-HCL(PH 8.8，25℃) 20毫摩

Triton-100 0.1％

MgSO₄ 5毫摩

Bst DNA聚合酶： 8单位

总体积为20微升

反应程序如下：63℃，60分钟。

3)检测结果：将反应产物取4微升利用核酸试纸条进行检测，其检测结构如图4。

图4为利用LAMP检测HBV时，加入不同扩增模板的试纸条检测结果，图4所示的1-4的结果分别是：1为同时加入内参模板和HBVDNA的扩增结果，2为只加入HBVDNA的扩增结果，3为只加入内参模板的扩增结果，4为加扩增抑制物后的LAMP扩增结果；

结果表明只有在LAMP核酸扩增反应中加入人工合成的发夹式结构后，并无扩增抑制物存在的情况下才能使得核酸试纸条上的C-线出现红色的线条。

Claims

1.一种核酸恒温扩增反应内参检测系统，其特征在于，所述内参检测系统包括发夹式结构的模板DNA、特异性的引物1和特异性的引物2，其中，特异性的引物1与发夹式结构中的环上的序列互补，特异性的引物2与发夹式结构中茎部的3’末端序列互补。

2.根据权利要求1所述的核酸恒温扩增反应内参检测系统，其特征在于，所述内参系统中发夹式结构的模板DNA、特异性的引物1和特异性的引物2在检测过程中的反应步骤为：

(1)所述模板DNA形成发夹式结构，特异性引物1与发夹式单链结构中的环上序列互补，在DNA聚合酶的作用下进行延伸，进而打开发夹式结构，形成直链；特异性引物2与成为直链的模板DNA百互补结合，并在DNA聚合酶的作用下进行延伸，其延伸产物由于DNA聚合酶的链置换功能而剥离，形成由特异性引物1延伸产生的DNA单链，同时，模板DNA形成一条双链DNA产物I；

3.根据权利要求1所述的核酸恒温扩增反应内参检测系统，其特征在于，所述的具有发夹式结构的模板DNA的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中的至少55个核苷酸序列，优选具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中的至少58个核苷酸序列，更优选具有SEQ IDNO：1所示核苷酸序列中的至少60个核苷酸序列，最优选具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中的至少63个核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的核酸恒温扩增反应内参检测系统，其特征在于，所述的特异性引物1的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示核苷酸序列中的至少15个核苷酸序列，优选具有SEQID NO：2所示核苷酸序列中的至少18个核苷酸序列，更优选具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列中的至少18个核苷酸序列，最优选具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列中的至少20个核苷酸序列。

5.根据权利要求1所述的核酸恒温扩增反应内参检测系统，其特征在于，所述的特异性引物2的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示核苷酸序列中的至少15个核苷酸序列，优选具有SEQID NO：3所示核苷酸序列中的至少18个核苷酸序列，更优选具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列中的至少18个核苷酸序列，最优选具有SEQ ID NO：3所示核苷酸序列中的至少19个核苷酸序列。

6.根据权利要求1所述的核酸恒温扩增反应内参检测系统，其特征在于，采用荧光定量检测方法和核酸检测试纸条的方法对内参扩增产物进行检测。

7.根据权利要求6所述的核酸恒温扩增反应内参检测系统，其特征在于，采用核酸检测试纸条对内参扩增产物进行检测，所述特异性的引物1和特异性的引物2上分别连接有抗原或半抗原A、抗原或半抗原B，所述核酸检测试纸条上设置有与引物2上标记的抗原或半抗原B特异性结合的抗体形成的检测线。

8.一种核酸恒温扩增反应内参检测系统的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括由链置换功能的DNA聚合酶介导的核酸恒温扩增体系和内参检测系统，其中内参检测系统包括发夹式结构的模板DNA、特异性引物1和特异性引物2，特异性的引物1与发夹式结构中的环上序列互补，特异性的引物2与发夹式结构中茎部的3’末端序列互补，所述特异性的引物1和特异性的引物2上分别标记有抗原A、抗原B。

9.根据权利要求8所述的核酸恒温扩增反应内参检测系统的试剂盒，其特征在于，所述的链置换功能的DNA聚合酶选自Bst DNA聚合酶、Klenow大片段DNA聚合酶、Phi29 DNA聚合酶。

10.根据权利要求8所述的核酸恒温扩增反应内参检测系统的试剂盒，其特征在于，所述的抗原A、抗原B独立的选自：生物素、地高辛或荧光染料，所述荧光染料选自Cy3、Cy5、Tetramethylrhodamine、AlexaFluor、Rhodamine、Fam或FitC，优选生物素或地高辛。

11.根据权利要求8所述的核酸恒温扩增反应内参检测系统的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，所述的核酸恒温扩增体系为交叉引物扩增反应体系，包括：正向外围引物、反向外围引物、正向标记探针，反向标记探针、扩增反向引物、扩增正向引物。

12.权利要求1所述的核酸恒温扩增反应内参检测系统在具有链置换功能的DNA聚合酶介导的核酸恒温扩增检测中检测假阴性反应中的应用。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述的核酸恒温扩增反应包括滚环扩增反应、转录酶扩增反应、依赖核酸序列扩增反应、链置换扩增反应、环介导的恒温扩增反应、解链酶扩增反应、交叉引物扩增反应。