CN107167602B - 多交叉恒温扩增结合金纳米生物传感检测霍乱弧菌的方法 - Google Patents

多交叉恒温扩增结合金纳米生物传感检测霍乱弧菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多交叉扩增结合金纳米生物传感检测霍乱弧菌的方法，所述方法在多交叉置换扩增中的交叉引物CP1或CP2的5’端标记生物素，在扩增引物C1或C2的5’端标记半抗原，所述方法针对霍乱弧菌的ompW基因的扩增产物能被金纳米生物传感器可视化检测。所述方法便捷、快速、敏感、特异，适宜于各种核苷酸片段检测。

Description

多交叉恒温扩增结合金纳米生物传感检测霍乱弧菌的方法
技术领域
本发明公开了一种霍乱弧菌的检测方法，属于微生物学领域。
背景技术
霍乱弧菌(Vibrio cholerae)是一种革兰氏阴性菌，呈丝状、弧状或杆状，有菌毛、单鞭毛，部分有荚膜。该病原体是重要的食源性和水源性疾病的病原体，广泛存在于河口、海湾及近岸海域的海水环境中。霍乱弧菌常分离自水体(河水、井水及海水)、水产品及临床标本，引起食源性或水源性的烈性肠道传染病。霍乱发病急，传染性强，病死率高，属于国际检疫传染病。霍乱弧菌曾在世界上引起多次大流行，主要表现为剧烈的呕吐、腹泻及失水。霍乱弧菌共分为139个血清型，其中O1群和O139群可引起霍乱。非O1非O139群菌株常被认为是环境中的正常菌群。近年来，不断有非O1非O139群菌株引起的霍乱散发或暴发的报道。因此，为了给予临床病人快速准确的治疗，开展水产品监测以及霍乱弧菌的流行病学调查，研发一个省时、省力、特异性较高，能够同时检测和鉴定霍乱弧菌的方法成为必要。
目前对于霍乱弧菌的检测主要依赖于传统的增菌培养和生化鉴定，该方法耗时大约3到7天，包括增菌及后续的生化鉴定。传统的分离鉴定方法耗时耗力，生化结果的判读依赖于人的主观判断，导致结果重复性差，易错判。随着核酸检测技术的快速发展，一些以PCR为基础的检测技术(如普通PCR技术，荧光定量PCR技术)被用于霍乱弧菌的快速检测，然而这些方法依赖于昂贵的仪器设备，需要后续的电泳操作，昂贵的探针合成，以及熟练的操作人员。对于一些落后的实验室无法进行，限制了这些技术的运用。目前运用这些技术检测霍乱弧菌的PCR和 Real-time PCR方法，检测灵敏度差，检测过程耗时较长，不利于快速检测和应急检测。
为了克服PCR扩增技术的劣势，近年来发展了许多恒温扩增技术。恒温扩增技术相对PCR技术而言，不依赖于热循环扩增设备，反应速度快，敏感性好。因此，恒温扩增技术有利于实现快速扩增，便捷检测及现场检测。到目前为止，已发展的恒温扩增技术有10余种，应用较为广泛的有滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖的恒温扩增 (HDA)、环介导恒温扩增(LAMP)、交叉扩增(CPA)等。然而，这些恒温技术实现核酸扩增需要多种酶同时工作，依赖于昂贵的试剂，复杂的操作步骤，因此这些方法的实用性、便捷性、可操作性有待于提高，尤其是在快速检测领域及欠发达地区。为了克服PCR技术及现有恒温扩增技术的劣势，实现便捷、快速、敏感及特异的扩增核酸序列，发明人近期已经建立了一种新的核酸扩增技术，命名为多交叉置换扩增 (Multiple Cross Displacement Amplification，MCDA)，相关内容公开于 CN104946744A，该专利文件作为现有技术文件构成本申请说明书的一个部分。
MCDA在恒温条件下实现核酸扩增，仅使用一种恒温置换酶、扩增速度快、反应灵敏、特异性高。为了使该技术在生物、医药及卫生领域应用更广泛、更经济。近期，发明人以MCDA为基础，将MCDA技术与纳米生物检测技术相结合，开发了依赖MCDA技术、实现快速，敏感检测的纳米生物传感技术，该技术被命名为多交叉恒温扩增结合金纳米生物传感的核酸检测技术(Multiple Cross Displacement Amplification label-based goldNanoparticles Lateral Flow Biosensor,MCDA-LFB)，相关内容公开于CN201610872509.4、CN201610942289.8、CN201610982015.1，这些专利文件作为现有技术文件构成本申请说明书的一个部分。
尽管MCDA-LFB已经用于一些微生物基因的检测，但是鉴于存在于微生物中的具体基因存在着广泛的同源性和交叉反应性，因此，将该方法用于某种特定基因的检测仍然存在着实质性的问题，在扩增靶基因，以及扩增区域和引物设计上仍然存在着极大的不确定性，因此也导致了后续的检测方法难以得到广泛的应用。目前针对霍乱弧菌就缺乏一种有效的MCDA-LFB检测方法，使得MCDA-LFB的高效特异性扩增难以在霍乱弧菌的体外非诊断目的检测中得到应用，也制约了霍乱弧菌体外非诊断目的检测的进一步发展。因此本发明的目的就是将MCDA-LFB技术用于霍乱弧菌的检测，旨在建立针对霍乱弧菌病原体的快速、敏感和特异的MCDA-LFB检测体系。
发明内容
基于上述发明目的，本发明首先提供了一种应用多交叉扩增结合金纳米生物传感检测目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)提取待检测样品的基因组；
(2)提供置换引物F1和F2，所述置换引物F1的序列如SEQ ID NO:1所示，所述置换引物F2的序列如SEQ ID NO:2所示；提供交叉引物CP1和CP2，所述交叉引物CP1的序列如SEQID NO:3所示，所述交叉引物CP2的序列如SEQ ID NO:5所示；同时提供在交叉引物CP1或CP2的5’端标记有生物素的交叉引物CP1*或CP2*；提供扩增引物C1 和C2，D1和D2，R1和R2，引物C1的序列如SEQ ID NO:6所示，引物C2的序列如SEQ ID NO:8所示；引物D1的序列如SEQID NO:9所示，引物D2的序列如SEQ ID NO:10所示，引物R1的序列如SEQ ID NO:11 所示，引物R2的序列如SEQ ID NO:12所示；同时提供在所述扩增引物 C1或C2的5’端标记半抗原的扩增引物C1*或C2*，本发明设计的上述引物是针对霍乱弧菌的ompW基因设计的；
(4)在链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物存在下，使用待检测样品的基因组核酸作为模板恒温扩增DNA；
(5)使用金纳米生物传感器检测步骤(4)的扩增产物。
在一个优选的技术方案中，在所述扩增引物C1*或C2*的5’端所标记的半抗原为荧光素。
更为优选地，在交叉引物CP1*的5’端标记生物素，在所述扩增引物 C1*的5’端标记荧光素。
在一个更为优选的技术方案中，所述金纳米生物传感器包括一背板，在所述背板上依次设置装有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，在所述硝酸纤维素膜上依次设置检测线及控制线，在金标垫、检测线及控制线区域依次包被有金纳米粒子偶联的链霉素亲和素、抗荧光素抗体及生物素偶联的牛血清蛋白。
在一个优选的技术方案中，所述恒温扩增是在61-64℃的环境中进行的。
在一个更为优选的技术方案中，所述恒温扩增是在63℃的环境中进行的。
在一个优选的技术方案中，所述目的基因为霍乱弧菌的ompW基因。
优选地，在所述交叉引物CP1的5’端标记有生物素的所述交叉引物 CP1*的序列如SEQ ID NO:4所示，在所述引物C1的5’端标记有荧光素的引物C1*的序列如SEQ ID NO:7所示。
本发明在另一方面还提供了一组用于恒温扩增霍乱弧菌ompW基因的引物序列，其特征在于，所述序列包括：如SEQ ID NO:1所示的置换引物F1，如SEQ ID NO:2所示的置换引物F2，如SEQ ID NO:3所示的交叉引物CP1，如SEQ ID NO:5所示的交叉引物CP2，如SEQ IDNO:6 所示的扩增引物C1，如SEQ ID NO:8所示的扩增引物C2，如SEQ ID NO:9 所示的扩增引物D1，如SEQ ID NO:10所示的扩增引物D2，如SEQ ID NO:11所示的扩增引物R1，如SEQ IDNO:12所示的扩增引物R2，同时提供在交叉引物CP1或CP2的5’端标记有生物素的交叉引物CP1*或 CP2*，以及在所述扩增引物C1或C2的5’端标记半抗原的扩增引物C1* 或C2*。
在一个优选的技术方案中，在交叉引物CP1*的5’端标记生物素，在扩增引物C1*的5’端标记有荧光素(FITC)。
本发明提供的多交叉扩增结合金纳米生物传感检测的目的基因为霍乱弧菌的ompW，该方法具有优异的检测灵敏度，其检测范围为10ng～10 fg，而且也具有较快的检测速度，仅需30分钟，即可获得能供可视化LFB 检测的扩增产物。
以常见的致病菌及条件致病菌DNA(霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、单增李斯特菌、沙门菌、志贺菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌、蜡样芽胞杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌等)为模板评价V.cholerae-MCDA-LFB技术的特异性 (菌株信息详见表2)。V.cholerae-MCDA-LFB技术能准确的鉴别霍乱弧菌，说明MCDA-LFB方法的特异性良好，也证明本发明提供的用于MCDA的引物序列具有优异的特异性和扩增效果。
附图说明
图1.MCDA-LFB引物设计的位置和方向示意图；
图2A.MCDA引物验证及可视颜色变化法检测结果图谱；
图2B.MCDA引物验证及电泳法检测结果图谱；
图2C.MCDA引物验证及LFB法检测结果图谱；
图3.标准MCDA-LFB最佳反应温度测试结果图谱；
图4A.MCDA检测霍乱弧菌的灵敏度LFB法检测结果图谱；
图4B.MCDA检测霍乱弧菌的灵敏度浊度法检测结果图谱；
图4C.MCDA检测霍乱弧菌的灵敏度可视颜色变化法检测结果图谱；
图4D.MCDA检测霍乱弧菌的灵敏度电泳法检测结果图谱；
图5.MCDA-LFB技术的最佳反应时间测试结果图谱；
图6.MCDA-LFB技术的特异性检测评价图谱
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
1.MCDA-LFB扩增原和检测原理
(1)通过MCDA扩增构建可检测产物
中国发明专利申请(CN104946744A、CN201610872509.4、 CN201610942289.8、CN201610982015.1)已经详细公开了MCDA-LFB 扩增原理，在此通过引用将其纳入本发明的公开内容之中。概括而言， MCDA反应体系包括10条引物，识别靶序列的10个区域，包括2条交叉内引物，即CP1和CP2(Cross Primer，CP)，2条置换引物，即F1和 F2，6条扩增引物，即D1、C1、R1、D2、C2和R2。为了构建可检测产物，交叉引物CP1或CP2在5’端标记生物素(Biotin),扩增引物C1或 C2在5’端标记荧光素(FITC)，新标记的引物被命名为CP1*、CP2*、C1*和C2*。CP1*包含Cl和P1，即5′-Cl-P1；CP2包含C2和P2，即5′-C2-P2。两条交叉引物CP1和CP2是介导MCDA扩增的主要引物；置换引物F1 和F2在MCDA反应中发挥置换作用，置换交叉引物CP1和CP2；六条扩增引物D1、C1、R1、D2、C2和R2能够加速MCDA反应及增加MCDA 产物量。随着MCDA扩增的进行，大量的双标产物被形成，CP1*5’端标记生物素，C1*5’端标记荧光素。该双标的产物能被金纳米生物传感器检测，从而进行可视检测(也可利用CP2*和C2*引物构建可检测产物)。
(2)生物传检测器(LFB)的设计
生物检测器(LFB)的设计见在先专利的描述(详见专利 CN201610872509.4、CN201610942289.8、CN201610982015.1)，在本发明中，为了使LFB检测靶序列最优化，本发明对LFB进行了简单的修饰，主要体现在各标记物的浓度。LFB共包含五个部分，背板、样品垫、金标垫、纤维膜及吸水垫。首先将样品垫、金标垫、纤维膜及吸水垫依次组装在背板上。然后将SA-G(40nm,金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)， anti-FITC(抗荧光素抗体)及B-BSA(生物素偶联的牛血清蛋白)分别包被在金标垫、检测线(Test Line，TL)及质控线(ControlLine，CL)，待干燥后备用。
LFB的检测原理：将V.cholerae-MCDA产物直接滴加到LFB的样品垫区，然后将120μl的检测缓冲液加到样品垫区域，MCDA扩增产物在虹吸作用下，从下往上运动(从样品垫向吸水垫方向运动)。当MCDA 产物达到金标垫后，双标产物的一端(即生物素标记端)与SA-G(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)反应。当产物继续运动，双标产物的另一端(即荧光素标记端)与检测线区域的抗体结合，将双标产物固定在检测线区域。随着产物在检测线区域的积累，通过另一端的SA-G(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)进行显色反应，从而对MCDA产物进行可视化检测。此外，过剩的SA-G(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)可与 CL(质控线)区域的B-BSA(生物素偶联的牛血清蛋白)，进行直接显色反应，判断LFB的功能是否正常。
LFB结果的判读(图2C)：仅在CL区域出现红色条带，表示阴性对照，没有阳性产物(图2C2、C3、C4)；CL及检测线区域出现红色条带，表示针对靶标的检测为阳性结果(图2C1)；当LFB不出现红线条带时，表示LFB失效；仅当测试线出现红色条带时，CL无红色条带,代表结果不可行，需要重新检测。
2.本发明中实施例所涉及的试剂和仪器：
本发明中实施例所涉及的试剂：背板、样品垫、金标垫、纤维膜及吸水垫购于Jie-Yi公司。金纳米粒子偶联的链霉素亲和素(SA-G)、抗荧光素抗体(anti-FITC)及生物素偶联的牛血清蛋白(B-BSA)购于北京海泰正元生物科技有限公司。Loopamp Kit(EikenChemical Co.Ltd., Tokyo,Japan)购于日本荣研公司。DL50DNA Marker购于宝生物工程(大连)有限公司。DNA提取试剂盒(QIAamp DNA minikits；Qiagen,Hilden, Germany)购于德国Qiagen公司。其余试剂均为市售分析纯产品。
本发明实验中使用的主要仪器：恒温实时浊度仪LA-320C(Eiken Chemical Co.,Ltd,Japan)购于日本荣研公司。电泳设备为北京君意东方电泳设备有限公司产品；凝胶成像系统为Bio-Rad Gel Dox XR,美国 Bio-Rad产品。
3.本发明中实施例所涉及的方法
基因组提取：霍乱弧菌及其他细菌的基因组DNA的提取使用Qiagen 公司的DNA提取试剂盒(QIAamp DNA minikits；Qiagen,Hilden, Germany)，按照说明书进行操作。利用紫外分光光度计测定基因组DNA 的浓度和纯度，霍乱血弧菌的DNA用TE缓冲液连续稀释(从10ng、 10pg、10fg、1fg到0.1fg/微升)。各种基因组DNA均少量分装，-20℃保存备用。
连续稀释的霍乱弧菌DNA用于MCDA扩增的最佳温度的探索及扩增体系的建立。以常见的致病菌及条件致病菌DNA为模板评价V. cholerae-MCDA-LFB技术的特异性。菌株信息见表2。
4.引物设计
为了验证、评价MCDA-LFB技术及建立针对霍乱弧菌病原体的快速、敏感和特异的MCDA-LFB检测体系，本发明针对霍乱弧菌的特异基因ompW设计一套MCDA扩增引物，旨在验证MCDA-LFB技术的可行性、敏感性、特异性及可靠性。
ompW基因存在于所有的霍乱弧菌中，其保守性和特异性良好，可以将霍乱弧菌与其他密切相近的菌种区分开。利用引物设计软件 PrimerExplorer V4(Eiken Chemical)(http://primerexplorer.jp/e/)和引物设计软件Primer Premier 5.0设计MCDA引物，并将获得的特异性引物在 NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行序列比对分析，以排除引物与其他物种序列可能存在的非特异性匹配，最终获得优化后的MCDA扩增引物。引物设计的位置和方向见图1，序列及修饰见表1。
表1针对ompW基因设计的引物序列及修饰
aCP1*，该引物用于MCDA-LFB检测体系，在5’端标记生物素；
bC1*，该引物用于MCDA-LFB检测体系，在5’端标记荧光素；
cnt，nucleotide(核苷酸)；
dmer，monomeric unit(单体单元)。
实施例1.MCDA-LFB扩增的可行性
标准的MCDA反应体系：交叉引物CP1*和CP1的浓度为30pmol，交叉引物CP2的浓度为60pmol，置换引物F1和F2的浓度为10pmol，扩增引物R1、R2、D1和D2的浓度为30pmol，扩增引物C1*和C2的浓度为20pmol，10mM的Betain，6mM的MgSO4，1mM的dNTP，12.5 μL的2×DNA聚合酶缓冲液，10U的Bst链置换DNA聚合酶，1μL的模板，补加去离子水至25μL。整个反应恒温在63℃1小时，85℃5min 终止反应。
MCDA扩增之后，三种检测方法用于MCDA扩增判别。首先，在反应混合物中加入可视染料(如HNB试剂，萘羟基酚蓝可视试剂)，阳性反应管的颜色从紫色变为蓝色，阴性反应管则保持原来的紫色。其次， MCDA产物可以通过琼脂糖电泳后检测扩增子，由于产物中包含了不同大小的扩增片段，因此阳性扩增产物的电泳图呈特异性阶梯状，阴性反应不出现任何条带。更为直接简单的方法为通过LFB对产物进行检测。
可视颜色变化法：MCDA在合成DNA的同时产生大量的阳离子，阳离子能够改变反应管中的PH，从而使HNB颜色发生改变。因此，可以通过反应管颜色变化判读结果，阳性反应管从紫色变为蓝色，阴性反应保持紫色不变，见图2A。A1表示阳性扩增(反应管中加入10pg的霍乱弧菌模板，作为阳性对照)，A2表示阴性扩增(反应管中加入10pg 的Gram+粪肠球菌模板，作用阴性对照)，A3表示阴性扩增(反应管中加入10pg的Gram-志贺菌模板，作用阴性对照)，A4表示空白对照反应 (1微升的双蒸水代替10pg的模板，作为空白对照应)。只有阳性对照出现阳性扩增，说明针对ompW设计的检测霍乱弧菌的MCDA引物可用。
电泳检测法：将图2A的产物进行电泳检测，由于MCDA的扩增产物包含了许多大小不一的短片段及一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，电泳后在凝胶上显现不同大小区带组成的阶梯式图谱，见图2B。通过电泳检测法判读MCDA扩增结果，阳性反应出现了预期的结果，而阴性反应和空白对照未出现任何扩增条带，进一步验证了本研究所设计的MCDA引物可行，用于靶序列扩增检测。
LFB检测：将图2A的产物进行LFB检测。由于针对霍乱弧菌检测的MCDA引物标记的半抗原为FITC(荧光素)，因此，当TL和CL出现红色条带时表示为霍乱弧菌检测阳性。通过LFB检测法判读MCDA扩增结果，阳性反应出现了预期的结果，而阴性反应和空白对照仅出现CL 红色条带，验证了本研究所设计的LFB，MCDA-LFB技术及MCDA引物可行，能够用于目的靶序列的检测(图2C)。
实施例2.测定MCDA技术的最佳反应温度
在标准反应体系条件下，加入针对霍乱弧菌DNA模板及所设计的对应的MCDA引物，其模板浓度为10pg/μl。反应在恒温条件下进行 (60-67℃)，结果运用实时浊度仪进行检测，在不同的温度下得到不同的动态曲线图，见图3。图3表示针对ompW基因序列设计的检测霍乱弧菌的MCDA引物温度动态曲线图。61-64℃(图3B-E)被推荐作为MCDA 引物的最佳反应温度。本发明中的后续验证选择63℃作为恒温条件进行 MCDA扩增。
实施例3.MCDA-LFB检测霍乱弧菌的灵敏度
运用连续稀释好的霍乱弧菌基因组DNA进行标准的MCDA扩增反应后，运用LFB检测显示：MCDA-LFB的检测范围为10ng～10fg，LFB 在TL和CL区域出现红色线(图4A1-A3)。当反应体系中基因组模板量降低至10fg以下时，LFB仅在CL区域出现红色线，表示阴性结果(图4A4-A5)。图4A运用LFB可视化读取MCDA扩增结果；图4A1到A5 表示霍乱弧菌的模板量为10ng、10pg、10fg、1fg和0.1fg，图4A6、 A7、A8分别表示粪肠球菌(10pg)、志贺菌模板(10pg)、空白对照(1 微升双蒸水)。
为了进一步验证MCDA-LFB检测霍乱弧菌的敏感性，另外3种检测方法用于MCDA扩增结果判别，进一步确认MCDA-LFB的检测灵敏度。首先，实时浊度仪用于分析MCDA扩增(图4B)。运用连续稀释好的霍乱弧菌基因组DNA进行标准的MCDA扩增反应后，运用实时浊度仪进行结果判定。检测显示：V.cholerae-MCDA的检测范围为10ng～10fg，阳性扩增浊度曲线被观察到(图4B)。当反应体系中基因组模板量降低至10fg以下时，不出现阳性扩增浊度曲线，表示阴性结果(图4B4-B5)。图4B运用实时浊度仪可视化读取MCDA扩增结果，图4B1-B5表示单增李斯特菌的模板量为10ng、10pg、10fg、1fg和0.1fg，图4B6、B7、B8分别表示粪肠球菌(10pg)、志贺菌模板(10pg)、空白对照(1 微升双蒸水)。其次，在反应混合物中预先加入可视染料(如HNB试剂, 萘羟基酚蓝)，阳性反应管的颜色从紫色变为蓝色，阴性反应管则保持原来的紫色。检测显示：V.cholerae-MCDA的检测范围为10ng～10fg，阳性扩增管变为蓝色(图4C1-C3)。当反应体系中基因组模板量降低至 10fg以下时，反应不出现蓝色，仍然为紫色，表示阴性结果(图4C4-C5)。图4C运用可视法读取MCDA扩增结果，图4C1到C5表示霍乱弧菌的模板量为10ng、10pg、10fg、1fg和0.1fg，4C6、4C7、4C8分别表示粪肠球菌(10pg)、志贺菌模板(10pg)、空白对照(1微升双蒸水)。其三，MCDA产物可以通过琼脂糖电泳后检测扩增子，由于产物中包含了不同大小的扩增片段，因此阳性扩增产物的电泳图呈特异性阶梯状，阴性反应不出现任何条带。检测显示：V.cholerae-MCDA的检测范围为 10ng～10fg，阳性反应出现阶梯条带(图4D1-D3)。当反应体系中基因组模板量降低至10fg以下时，不出现特异的阶梯条带，表示阴性结果(图4D4-D5)。图4D运用电泳法读取MCDA扩增结果，图4D1到D5表示霍乱弧菌的模板量为10ng、10pg、10fg、1fg和0.1fg，图4D6、D7、 D8分别表示粪肠球菌(10pg)、志贺菌模板(10pg)、空白对照(1微升双蒸水)。
实施例4.测定V.cholerae-MCDA-LFB技术的最佳扩增时间
在标准反应体系条件下，加入霍乱弧菌DNA模板(连续稀释)及针对ompW基因所设计的对应的MCDA引物。运用连续稀释好的霍乱弧菌基因组DNA作为模板。反应在恒温条件下进行(63℃)，恒温时间分别 10分钟、20分钟、30分钟和40分钟。运用LFB检测显示：MCDA-LFB技术在检测霍乱弧菌时，最佳反应时间为30分钟(图5)。当MCDA体系在扩增步骤恒温30分钟时，最低检测限水平的模板能够被检出(图5C)。在图5C中，LFB检测范围为10ng～10fg，LFB在TL和CL区域出现红色线(LFB1-LFB3)。当反应体系中基因组模板量降低至10fg以下时，LFB仅在CL区域出现红色线，表示阴性结果(LFB4-LFB5)。图5 运用LFB可视化读取MCDA体系从10分钟到40分钟的扩增结果，LFB1 到LFB5表示霍乱弧菌的模板量为10ng、10pg、10fg、1fg和0.1fg， LFB6、LFB7、LFB8分别表示粪肠球菌模板(10pg)、志贺菌模板(10pg)、空白对照(1微升双蒸水)。
实施例5.测定V.cholerae-MCDA-LFB技术的特异性
以常见的致病菌及条件致病菌DNA(霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、单增李斯特菌、沙门菌、志贺菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲菌、蜡样芽胞杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌等)为模板评价V.cholerae-MCDA-LFB技术的特异性。 (菌株信息详见表2)。V.cholerae-MCDA-LFB技术能准确的鉴别霍乱弧菌，说明MCDA-LFB方法的特异性良好(见图6)。在图6中，LFB1-5 为霍乱弧菌模板，LFB 6-39为非霍乱弧菌模板，LFB 40为空白对照。结果表明，MCDA-LFB能够正确的检测靶序列。
表2.菌株信息
1ATCC，American Type Culture Collection(美国模式培养物保藏所)； ICDC，National Institute for Communicable Disease Control Disease Control andPrevention，Chinese Center for Disease Control and Prevention(中国疾病预防控制中心传染病预防控制所)。
序 列 表
<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
<120> 多交叉恒温扩增结合金纳米生物传感检测霍乱弧菌的方法
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Vibrio cholerae
<400> 1
cgggtactaa taatgcattg a 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Vibrio cholerae
<400> 2
ttttcgaaat agggcgttag 20
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> Vibrio cholerae
<400> 3
ggaaccagct atcattgagc atatagtgat ttaaaactgg acgact 46
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> Vibrio cholerae
<400> 4
ggaaccagct atcattgagc atatagtgat ttaaaactgg acgact 46
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> Vibrio cholerae
<400> 5
aacctacaaa gcaggtgcag attataacca cccgcgatga 40
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Vibrio cholerae
<400> 6
ggaaccagct atcattgagc atata 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Vibrio cholerae
<400> 7
ggaaccagct atcattgagc atata 25
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Vibrio cholerae
<400> 8
aacctacaaa gcaggtgcag a 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Vibrio cholerae
<400> 9
atcaaagcca acgttagcag 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Vibrio cholerae
<400> 10
acggatgttg aaatcaatcc t 21
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> Vibrio cholerae
<400> 11
taccacacat aagcgttga 19
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Vibrio cholerae
<400> 12
tgccaatatt gaaacaacgg 20

Claims (7)

1.一种多交叉恒温扩增结合金纳米生物传感检测目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：
（1）提取待检测样品的基因组；
（2） 提供置换引物F1和F2，所述置换引物F1的序列如SEQ ID NO:1所示，所述置换引物F2的序列如SEQ ID NO:2所示；提供交叉引物CP1和CP2，所述交叉引物CP1的序列如SEQ IDNO:3所示，所述交叉引物CP2的序列如SEQ ID NO:5所示；同时提供在交叉引物CP1的5’端标记有生物素的交叉引物 CP1*；提供扩增引物C1和C2，D1和D2，R1和R2，引物C1的序列如SEQID NO:6所示，引物C2的序列如SEQ ID NO:8所示；引物D1的序列如SEQ ID NO:9所示，引物D2的序列如SEQ ID NO:10所示，引物R1的序列如SEQ ID NO:11所示，引物R2的序列如SEQID NO:12所示；同时提供在所述扩增引物C1的5’端标记荧光素的扩增引物C1*；
（3）在链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物存在下，使用待检测样品的基因组核酸作为模板恒温扩增DNA；
（4）使用金纳米生物传感器检测步骤（3）的扩增产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述金纳米生物传感器包括一背板，在所述背板上依次设置装有样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，在所述硝酸纤维素膜上依次设置检测线及控制线，在金标垫、检测线及控制线区域依次包被有金纳米粒子偶联的链霉素亲和素、抗荧光素抗体及生物素偶联的牛血清蛋白。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述恒温扩增是在61-64℃的环境中进行的。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述恒温扩增是在63℃的环境中进行的。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述目的基因为霍乱弧菌的ompW基因。
6.根据权利要求5的所述的方法，其特征在于，在所述交叉引物CP1的5’端标记有生物素的所述交叉引物CP1*的序列如SEQ ID NO:4所示，在所述引物C1的5’端标记有荧光素的引物C1*的序列如SEQ ID NO:7所示。
7.一组用于恒温扩增霍乱弧菌的ompW基因的引物序列，其特征在于，所述序列包括：如SEQ ID NO:1所示的置换引物F1，如SEQ ID NO:2所示的置换引物F2，如SEQ ID NO:3所示的交叉引物CP1，如SEQ ID NO:5所示的交叉引物CP2，如SEQ ID NO:6所示的扩增引物C1，如SEQ ID NO:8所示的扩增引物C2，如SEQ ID NO:9所示的扩增引物D1，如SEQ ID NO:10所示的扩增引物D2，如SEQ ID NO:11所示的扩增引物R1，如SEQ ID NO:12所示的扩增引物R2，同时提供在交叉引物CP1的5’端标记有生物素的交叉引物 CP1*，以及在所述扩增引物C1 的5’端标记荧光素的扩增引物C1*。
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