CN104946744B - 一种多交叉置换扩增核苷酸片段的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多交叉置换扩增核苷酸片段的方法及应用，所述方法提供一对交叉引物、一对置换引物，以及3～6条扩增引物恒温扩增目的基因片段并进行可视化检测、电泳检测或实时浊度检测。本方法便捷、快速、敏感、特异，适宜于各种核苷酸片段检测。

Description

一种多交叉置换扩增核苷酸片段的方法及应用
技术领域
本发明公开了一种多交叉置换恒温扩增技术，属于分子生物学领域。
背景技术
在现代生物学和医学领域，核酸扩增是一种不可缺少的技术，广泛运用于基础研究、临床诊断、考古研究、流行病研究、转基因研究等领域。在已经发展的核酸扩增技术中，PCR是第一个被建立的体外核酸扩增技术，具有划时代意义，现已被广泛运用于生物相关领域。然而，PCR进行核酸扩增时，受实验室的条件限制，依赖于复杂昂贵的热循环仪器。此外，PCR产物的检测比较复杂，需要一套复杂的流程及设备。这些劣势限制了该技术的广泛应用，尤其在经济落后的地区及快速诊断领域。因此，对于生物相关研究领域而言，非常有必要发展一个简单、快速、敏感的核酸扩增方法。
为了克服PCR扩增技术的劣势，应运而生了许多恒温扩增技术。较PCR技术而言，恒温扩增技术不依赖于热循环扩增设备，反应速度快，敏感性好。有利于实现快速扩增，便捷检测及现场诊断。到目前为止，已发展的恒温扩增技术有10种，应用较为广泛的有滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖的恒温扩增(HDA)、环介导恒温扩增(LAMP)、交叉扩增(CPA)等。然而，这些恒温技术实现核酸扩增需要多种酶同时工作，依赖于昂贵的试剂，复杂的操作步骤。因此这些方法的实用性、便捷性、可操作性有待于提高，尤其是在快速诊断领域及欠发达地区。
为了克服PCR技术及现有恒温扩增技术的劣势，实现便捷、快速、敏感及特异的扩增核酸序列，在生物、农业、医学等领域，有必要发展一种操作简单、经济实用、反应快速、特异性强的核酸扩增技术。
另外一方面，单增李斯特菌是广泛存在于环境中的革兰氏阳性、有运动能力、兼性胞内寄生短杆菌，是重要的食源性人兽共患病原菌，能够引起人类严重感染。李斯特菌病的易感者主要为免疫力低下人群和免疫缺陷人群，前者包括老年人、新生儿和孕妇；后者为肿瘤患者、艾滋病患者和器官移植受体等。人类李斯特菌病的主要临床症状为发热性胃肠炎、败血症、脑膜炎、孕妇流产、死产等，该菌可穿越肠道屏障、血脑屏障和胎盘屏障。单增李斯特菌病在人类的感染率虽不高，但该病因其死亡率极高而受到广泛关注，成为欧美国家重大公共卫生问题之一。国内尚无由单增李斯特菌引起食物中毒暴发的报道，实际存在与否不明，散发病例在多个省市都有报道。因此，为了给予临床病人准确快速的治疗和单增李斯特菌的流行病学调查，研发一个省时、省力和特异性较高的单增李斯特菌检测方法成为必要。
目前对于单增李斯特菌分离鉴定主要依赖于传统的增菌培养和生化鉴定，该方法耗时大约5到7天，包括二次增菌，选择性培养及后续的生化鉴定，其劣势在于耗时耗力，生化结果的判读依赖于人的主观判断，导致结果重复性差，易错判。随着核酸诊断技术的快速发展，一些以PCR为基础的诊断技术(如普通PCR技术，荧光PCR技术)被用于单增李斯特菌的快速诊断，然而这些方法依赖于昂贵的仪器设备，需要后续的电泳操作，昂贵的探针合成，以及熟练的操作人员。对于一些落后的实验室无法进行，限制了这些技术的运用。因而，急需发展一种简单、快速、灵敏和特异的诊断技术用于单增李斯特菌检测。
发明内容
基于现有技术存在的问题，本发明建立了一种新的核酸扩增技术，命名为多交叉置换扩增(Multiple Cross Displacement Amplification，MCDA)。MCDA在恒温条件下实现核酸扩增，仅使用一种恒温置换酶、扩增速度快、反应灵敏、特异性高。因此，MCDA作为一种新的核酸扩增技术，能够广泛的用于生物相关领域，实现核酸的快速扩增及分子诊断分析。
一方面，本发明首先提供了一种扩增目的基因片段并对扩增结果进行检测的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)自所述目的基因片段的3’端起，设定第一任意序列F1s，第二任意序列P1s，自所述目的基因片段的5’端起，设定第三任意序列F2，第四任意序列P2，在所述第二任意序列P1s的5’端设定第五任意序列C1，和/或在所述第四任意序列P2的3’端设定第六任意序列C2s；
(2)提供置换引物F1，所述引物F1含有与序列F1s互补的序列，提供交叉引物CP1，所述引物CP1自5’端依次含有序列C1和与序列P1s互补的序列P1，提供置换引物F2，所述引物含有序列F2，提供交叉引物CP2，所述引物CP2自5’端依次含有序列C2s互补的序列C2和序列P2；
(3)提供扩增引物，所述扩增引物包括含有序列C1的扩增引物C1，和/或含有与序列C2s互补的扩增引物C2；
(4)在链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物存在下，使用目的基因片段作为模板恒温扩增DNA；
(5)检测步骤(4)的扩增结果。
在一个优选的技术方案中，只在目的片段的一端提供扩增引物，本发明将其命名为单-多交叉置换扩增(S-MCDA)，其中，在步骤(1)中所述序列C1的3’端和5’端分别设定第七任意序列D1和第八任意序列R1，步骤(3)所述的扩增引物还包括含有序列D1的扩增引物D1和含有序列R1的扩增引物R1；该技术方案被命名为单-1-多交叉置换扩增(S1-MCDA)；或者
在步骤(1)中序列C2s的5’端和3’端分别设定第九任意序列D2s和第十任意序列R2s，步骤(3)所述的扩增引物还包括含有与序列D2s互补的扩增引物D2和含有与序列R2s互补的扩增引物R2。该技术方案是上述技术方案的一个替换技术方案，本发明将其命名为单-2-多交叉置换扩增(S2-MCDA)。
在一个更为优选的技术方案中，在目的片段的两端都提供扩增引物，本发明将其命名为双-多交叉置换扩增(D-MCDA)，其中，在步骤(1)序列C1的3’端和5’端分别设定第七任意序列D1和第八任意序列R1,在序列C2s的5’端和3’端分别设定第九任意序列D2s和第十任意序列R2s，步骤(3)所述的扩增引物还包括含有序列D1的扩增引物D1、含有序列R1的扩增引物R1、含有与序列D2s互补的扩增引物D2和含有与序列R2s互补的扩增引物R2。
优选地，步骤(4)中所述扩增是在60～67℃中进行的。
更为优选地，步骤(4)中所述扩增是在63℃中进行的。
优选地，步骤(4)中所述链移位型聚合酶为Bst DNA聚合酶、所述解链温度调节剂为甜菜碱。
优选地，步骤(5)所述的检测为可视染料检测、电泳检测或实时浊度检测。MCDA扩增之后，三种主流的检测方法被用于MCDA扩增判读。首先，MCDA产物可以通过琼脂糖凝胶电泳后检测扩增子，由于产物中包含了不同大小的扩增片段，因此阳性扩增产物的电泳图呈特异性阶梯状，阴性反应不出现任何条带。其次，实时浊度检测也被用于检测MCDA扩增。更为简单的方法是在反应混合物中加入可视染料(如FD试剂，朗普荧光可视试剂)，阳性反应管的颜色从浅灰色变为绿色，阴性反应管则保持原来的浅灰色。
另一方面，本发明提供了上述方法在检测单增李斯特菌中的非诊断目的的应用，在一个优选技术方案中，所述应用可以是所谓的单-多交叉置换扩增(S-MCDA)。在一个具体实施方案中，所述交叉引物CP1的序列如SEQ ID NO:1所示，所述交叉引物CP2的序列如SEQID NO:2所示，所述置换引物F1的序列如SEQ ID NO:3所示，所述置换引物F2的序列如SEQID NO:4所示，所述扩增引物D1的序列如SEQ ID NO:5所示，所述扩增引物C1的序列如SEQID NO:6所示，所述扩增引物R1的序列如SEQ ID NO:7所示。该技术方案即所谓的单-1-多交叉置换扩增(S1-MCDA)。
在另一个具体实施方案中，所述交叉引物CP1的序列如SEQ ID NO:1所示，所述交叉引物CP2的序列如SEQ ID NO:2所示，所述置换引物F1的序列如SEQ ID NO:3所示，所述置换引物F2的序列如SEQ ID NO:4所示，所述扩增引物D2的序列如SEQ ID NO:8所示，所述扩增引物C2的序列如SEQ ID NO:9所示，所述扩增引物R2的序列如SEQ ID NO:10所示。该技术方案即所谓的单-2-多交叉置换扩增(S2-MCDA)。
在一个更为优选的技术方案中，所述应用可以是所谓的双-多交叉置换扩增(D-MCDA)。在其中的一个具体实施方案中，所述交叉引物CP1的序列如SEQ ID NO:1所示，所述交叉引物CP2的序列如SEQ ID NO:2所示，所述置换引物F1的序列如SEQ ID NO:3所示，所述置换引物F2的序列如SEQ ID NO:4所示，所述扩增引物D1的序列如SEQ ID NO:5所示，所述扩增引物C1的序列如SEQ ID NO:6所示，所述扩增引物R1的序列如SEQ ID NO:7所示，所述扩增引物D2的序列如SEQ ID NO:8所示，所述扩增引物C2的序列如SEQ ID NO:9所示，所述扩增引物R2的序列如SEQ ID NO:10所示。
在本发明中，单增李斯特菌(Listeria monocytogens，LM)被用作一种模型菌，用于证明MCDA扩增技术的可行性，本发明建立针对单增李斯特菌检测的MCDA诊断技术，并提供了一种检测单增李斯特菌的试剂盒，所述试剂盒包括：
(1)自所述目的基因片段的3’端起，设定第一任意序列F1s，第二任意序列P1s，自所述目的基因片段的5’端起，设定第三任意序列F2，第四任意序列P2，在所述第二任意序列P1s的5’端设定第五任意序列C1，和/或在所述第四任意序列P2的3’端设定第六任意序列C2s时，提供置换引物F1，所述引物F1含有与序列F1s互补的序列，提供交叉引物CP1，所述引物CP1自5’端依次含有序列C1和与序列P1s互补的序列P1，提供含有序列F2的置换引物F2，提供交叉引物CP2，所述引物CP2自5’端依次含有序列C2s互补的序列C2和序列P2；
(2)提供扩增引物，所述扩增引物包括含有序列C1的扩增引物C1，和/或含有与序列C2s互补的扩增引物C2；
(3)链移位型聚合酶、解链温度调节剂、恒温扩增缓冲液。
在一个优选的技术方案中，本发明提供了应用S-MCDA技术进行检测的试剂盒，其中，在所述序列C1的3’端和5’端分别设定第七任意序列D1和第八任意序列R1，步骤(3)所述的扩增引物还包括含有序列D1的扩增引物D1和含有序列R1的扩增引物R1。
在另一个可替换的技术方案中，在所述序列C2s的5’端和3’端分别设定第九任意序列D2s和第十任意序列R2s，所述扩增引物还包括含有与序列D2s互补的扩增引物D2和含有与序列R2s互补的扩增引物R2。
在一个更为优选的技术方案中，本发明提供了应用D-MCDA技术进行检测的试剂盒。其中，在所述序列C1的3’端和5’端分别设定第七任意序列D1和第八任意序列R1,在序列C2s的5’端和3’端分别设定第九任意序列D2s和第十任意序列R2s，所述扩增引物还包括含有序列D1的扩增引物D1、含有序列R1的扩增引物R1、含有与序列D2s互补的扩增引物D2和含有与序列R2s互补的扩增引物R2。
本发明公开的多交叉置换扩增方法具有便捷、快速、敏感、特异的优点。
首先，本发明提供的扩增方法可以在很短时间内完成整个MCDA扩增，能够高效、快速地扩增靶序列。
其次，本发明提供的MCDA与普通PCR扩增技术的敏感性比较，D-MCDA的检测下限为62.5fg/反应管，而PCR扩增技术的检测下限为25pg/反应管，因此，D-MCDA技术比PCR方法敏感400倍。
S-MCDA(S1-MCDA和S2-MCDA)的检测下限为125fg/反应管，而PCR扩增技术的检测下限为25pg/反应管，因此，S-MCDA技术比PCR方法敏感200倍。
第三，本发明提供的扩增方法具有很高的扩增特异性。
在标准反应条件下，运用MCDA技术检测25种其他常见致病菌和机会致病菌时未出现非特异性扩增(见表2)，阳性扩增仅出现在单增李斯特菌，其他非单增李斯特菌不出现阳性结果，说明该检测体系的特异性良好。
附图说明
图1.多交叉置换扩增技术原理示意图；
图2.多交叉置换扩增技术引物设计位置示意图；
图3.多交叉置换扩增结果判读图；
图4.多交叉置换扩增随温度变化的动态曲线图；
图5.多交叉置换扩增随温度变化的电泳图；
图6.多交叉置换扩增的灵敏度评价结果图；
图7.普通PCR扩增的灵敏度评价结果图；
图8.S-MCDA扩增结果判读图；
图9.S-MCDA扩增灵敏度评价结果图；
图10.多交叉置换扩增的特异性评价结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
1.本发明所公开的MCDA的扩增原理
MCDA反应体系包括10条引物，识别靶序列的10个区域，包括2条交叉内引物，即CP1和CP2(Cross Primer，CP)，2条置换引物，即F1和F2，6条扩增引物，即D1、C1、R1、D2、C2和R2。CP1包含C1区域的序列和P1，即5′-Cl-P1；CP2包含C2(C2s区域的互补序列)和P2，即5′-C2-P2。两条交叉引物CP1和CP2是介导MCDA扩增的主要引物；置换引物F1和F2在MCDA反应中发挥置换作用；六条扩增引物D1、C1、R1、D2、C2和R2能够加速MCDA反应，增加MCDA产物量及增强MCDA技术的特异性。
如图1所示，MCDA扩增反应包括两个过程，即扩增引物介导的循环扩增和交叉引物介导的置换扩增。在既定的反应温度下，双链DNA在处于半解离和半结合的动态平衡状态中，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。首先在Bst DNA聚合酶的作用下，以CP1引物P1区段的3′末端为起点，与对应的DNA互补序列P1s配对，启动链置换DNA合成。F1引物与P1s前端F1s序列互补，以3′末端为起点，通过链置换活性DNA聚合酶的作用，首先置换出CP1引物合成的DNA链，同时合成自身DNA。最终F1引物合成而得的DNA链与模板DNA形成双链。然而由交叉引物CP1先合成的DNA链被F1引物进行链置换产生一单链，该单链的D1s、C1s、R1s、P2s、F2s区域能够依次与扩增引物D1、C1、R1、交叉引物CP2及置换引物F2结合，并发挥链置换扩增作用(步骤1、2)。C1引物扩增并置换D1的扩增链，生成短片段C1s-D1产物，该产物能够与C1和CP1引物结合，启动链置换扩增，使短片段C1s-D1产物累积(步骤3)。R1引物扩增并置换C1的扩增链，生成短片段C1s-C1产物，该产物含有互补的两个区域(C1s和C1)，从而形成一个单链单茎环结构(步骤4)。该结构可以与CP1引物结合，启动扩增反应，形成的短片段双链产物在反应温度下解链两条单链，形成的单链通过两个互补区域产生两个单链单茎环结构，单链单环结构可与引物CP1、D1、C1结合，启动新一轮的置换扩增，这样产生了以单链单茎环结构为基础的循环置换扩增，导致C1s和C1产物的积累(循环1)。R1引物形成的扩增片段可被交叉引物CP2的扩增片段置换，产生短链产物C1s-R1，该产物可以发生类似于C1引物介导的扩增反应，启动R1引物介导的扩增循环，导致C1s-R1产物积累(循环2)。交叉引物CP2的扩增片段被上游的置换引物F2扩增置换，该产物为单链，可以依次与扩增引物D2、C2、R2结合，启动类似于扩增引物D1、C1、R1的循环扩增反应，导致短片段产物的累积(步骤6、7)。CP2单链产物通过3′末端的C1s区段和C1区段互补，发生自我碱基配对，在一端形成茎环状结构，以茎环的3′端开始合成自我互补链，置换R2扩增片段产物。同时，交叉引物CP1同该单链茎环区域杂交结合，以CP1引物的3′端为起点，合成互补链，在此过程中茎环结构被打开。解离出的核酸产物一端双链，一端为单链，在单链一端上会形成茎环结构。在茎环结构上存在单链形式P2s区域，交叉引物CP2能够与其杂交，启动新一轮置换扩增(步骤6、8)，经过相同的过程，又形成茎环结构(步骤9、10、11)。通过此过程，结果在同一条链上互补序列周而复始形成大小不一的结构。因此，MCDA可以特异、高效、快速的扩增靶序列，在很短时间内完成整个MCDA扩增。
2.本发明S-MCDA(单-多交叉置换扩增)的扩增原理
根据MCDA的设计原理，可以将MCDA分为两套Single-MCDA扩增反应(S1-MCDA和S2-MCDA)，即S1-MCDA扩增体系中只包含一组扩增引物D1、C1和R1，而S2-MCDA扩增体系中仅包含另一组扩增引物D2、C2和R2。因此，S1-MCDA扩增体系包含的引物为2条置换引物F1和F2，2条交叉引物CP1和CP2，3条扩增引物D1、C1和R1；S2-MCDA扩增体系包含的引物为2条置换引物F1和F2，2条交叉引物CP1和CP2，3条扩增引物D2、C2和R2。S-MCDA识别靶序列的8个区域，保证了S-MCDA的高度特异性，其扩增体系包括了7条工作引物，同时保证了反应的快速性及灵敏性。通过S-MCDA设计，对于一些保守性较差的靶序列，无法设计出一套完整的MCDA扩增引物，可以在设计时减掉3条扩增引物，设计对序列保守要求低的S-MCDA扩增引物，从而实现靶序列的便捷、快速、敏感、特异扩增。
3.本发明中所涉及的试剂
Loopamp Kit(Eiken Chemical Co.Ltd.,Tokyo,Japan)购于日本荣研公司。DNA提取试剂盒(QIAamp DNA minikits；Qiagen,Hilden,Germany)购于德国Qiagen公司。PCR反应体系混合物MIX(Taq DNA聚合酶，dNTP和缓冲液)购于北京康为世纪生物科技有限公司。DL50 DNA Marker购于宝生物工程(大连)有限公司。其余试剂均为市售分型纯产品。
4.本发明实验中使用的主要仪器
恒温实时浊度仪LA-320C(Eiken Chemical Co.,Ltd,Japan)购于日本荣研公司。PCR仪为Sensoquest Labcycler,德国Sensoquest产品；电泳设备为北京君意东方电泳设备有限公司产品；凝胶成像系统为Bio-Rad Gel Dox XR,美国Bio-Rad产品。
5.基因组提取
单增李斯特菌及其他细菌的基因组DNA的提取使用Qiagen公司的DNA提取试剂盒(QIAamp DNA minikits；Qiagen,Hilden,Germany)，按照说明书进行操作。利用紫外分光光度计测定基因组DNA的浓度和纯度，单增李斯特菌DNA用GE缓冲液连续稀释(从25ng，2.5ng，250pg，25pg，2.5pg，250fg，125fg，62.5fg到31.25fg/微升)。各种基因组DNA均少量分装，-20℃保存备用。
连续稀释的单增李斯特菌DNA用于MCDA方法最佳温度的探索及方法灵敏度的建立。
6.引物设计
为了验证MCDA技术的可行性，一种重要的食源性微生物，单增李斯特菌被选择作为模型菌。hlyA存在于单增李斯特菌所有血清型菌株中，其特异性好，可以将单增李斯特菌与其他密切相近的菌种(如伊氏李斯特菌、威尔李斯特菌、英诺克李斯特菌)和菌属(如芽孢杆菌属)区分开。根据单增李斯特菌种特异性基因hlyA(GenBank Gene ID:53987910,Listeria monocytogenes，LM)设计MCDA扩增引物。
利用引物设计软件PrimerExplorer V4(Eiken Chemical)(http://primerexplorer.jp/e/)和引物设计软件Primer Premier 5.0设计MCDA引物，并将获得的特异性引物在NCBI数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行序列比对分析，以排除引物与其他物种序列可能存在的非特异性匹配，最终获得优化后的一套完整MCDA扩增引物。引物设计的位置和方向见图2，序列见表1。
表1.用于本发明的多交叉置换扩增引物
实施例1:
MCDA反应体系：交叉引物CP1和CP2的浓度为60pmol，置换引物F1和F2的浓度为10pmol，扩增引物R1、R2、D1和D2的浓度为30pmol，扩增引物C1和C2的浓度为20pmol，10mM的Betain，6mM的MgSO4，1mM的dNTP，12.5μL的10×Bst DNA聚合酶缓冲液，10U的链置换DNA聚合酶，1μL的模板，补加去离子水至25μl。整个反应恒温在64℃1小时，80℃5min终止反应。
结果判定：
可视颜色变化法：MCDA在合成DNA的同时产生大量的焦磷酸根离子，该离子能够夺取与钙黄绿素结合的锰离子，使钙黄绿素恢复游离状态而发荧光。该发光混合物能够与反应中产生的镁离子结合，使荧光得到增强。可以通过荧光目视检测颜色变化判读结果，阳性反应管从浅灰色变为绿色，阴性反应保持浅灰色不变，见图3A，1为阳性，2为阴性。
电泳检测法：由于MCDA的扩增产物包含了许多大小不一的短片段及一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，电泳后在凝胶上显现不同大小区带组成的阶梯状图谱，见图3B。
通过可视荧光目视法和电泳检测法判读MCDA扩增结果，阳性反应出现了预期的结果，而阴性反应管未出现任何的反应产物，说明本研究所设计的MCDA方法可行，用于靶序列扩增检测。
测定MCDA技术的最佳反应温度
在标准反应体系条件下，加入单增李斯特菌DNA模板及所设计的对应的MCDA引物，其模板浓度为250pg/μl。反应在恒温条件下进行(60～67℃)，结果运用实时浊度仪进行检测，在不同的温度下得到不同的动态曲线图。阳性反应出现典型的动态曲线，且阳性扩增大于阈值，阴性反应不出现动态曲线(见图4)，图4A图到H图分别表示MCDA反应在60℃到67℃的扩增动态曲线。61～65℃被推荐作为MCDA技术的最佳反应温度。本发明中的后续验证选择63℃作为恒温条件进行MCDA扩增。此外，不同温度下MCDA的扩增产物被用于琼脂糖凝胶电泳进行检测。阳性反应出现典型的阶梯状图谱，阴性反应不出现任何扩增条带(见图5)，图5A图到H图分别表示MCDA反应在60℃到67℃的扩增电泳图谱，泳道1表示阳性扩增，泳道2表示阴性扩增。
MCDA扩增检测的灵敏度
运用连续稀释好的单增李斯特基因组DNA进行MCDA扩增反应后结果显示：MCDA的检测范围为2.5ng～62.5fg，当反应体系中基因组模板量降低至62.5fg以下时，MCDA扩增反应不出现阳性扩增，见图6。图6A运用实时浊度仪读取MCDA扩增结果，阳性扩增大于阈值0.1，阴性扩增不出现扩增曲线；图6B通过可视法显示MCDA扩增结果，阳性反应管呈现绿色，阴性反应管保持原来的颜色不变，呈现浅灰色；图6C通过琼脂糖凝胶电泳显示结果，图中泳道M为DNA分子量marker DL100；泳道2到9分别是模板量为2.5ng～31.25fg的基因组DNA；阳性扩增出现典型的阶梯状图谱，阴性扩增不出现任何扩增条带；根据图6的判读结果，MCDA扩增反应的检测下限为62.5fg/反应。
运用连续稀释好的单增李斯特菌基因组DNA进行普通PCR扩增后显示：当反应体系中基因组模板量降低至25pg以下时，普通PCR扩增后电泳图上未出现目的条带，见图7。图中泳道M为DNA分子量marker DL50；泳道2到9分别是模板量为25ng～62.5fg的基因组DNA。
通过MCDA与普通PCR扩增技术的敏感性比较，MCDA的检测下限为62.5fg/反应管，而PCR扩增技术的检测下限为25pg/反应管，因此，MCDA技术比PCR方法敏感400倍。
实施例2:
S1(S2-)-MCDA反应体系：交叉引物CP1和CP2的浓度为60pmol，置换引物F1和F2的浓度为10pmol，扩增引物R1(或R2)和D1(或D2)的浓度为30pmol，扩增引物C1(或C2)的浓度为20pmol，10mM的Betain，6mM的MgSO4，1mM的dNTP，12.5μL的10×Bst DNA聚合酶缓冲液，10U的链置换DNA聚合酶，1μL的模板，补加去离子水至25μl。整个反应恒温在64℃1小时，80℃5min终止反应。
结果判定：
可视颜色变化法：S1-MCDA和S2-MCDA在合成DNA的同时也产生大量的焦磷酸根离子，该离子能够夺取与钙黄绿素结合的锰离子，使钙黄绿素恢复游离状态而发荧光。该发光混合物能够与反应中产生的镁离子结合，使荧光得到增强。可以通过荧光目视检测颜色变化判读结果，阳性反应管从浅灰色变为绿色，阴性反应保持浅灰色不变，见图8。图8A为S1-MCDA扩增，图8C为S2-MCDA扩增。
电泳检测法：由于S-MCDA的扩增产物也包含了许多大小不一的短片段及一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，电泳后在凝胶上显现不同大小区带组成的阶梯状图谱，见图8。图8B为S1-MCDA扩增，图8D为S2-MCDA扩增。图中泳道M为DNA分子量marker DL100；泳道2为S-MCDA阳性扩增，泳道3为阴性对照。
S-MCDA扩增检测的灵敏度
运用连续稀释好的单增李斯特菌基因组DNA进行S-MCDA扩增反应后结果显示：S-MCDA的检测范围为2.5ng～125fg，当反应体系中基因组模板量降低至125fg以下时，S-MCDA扩增反应不出现阳性扩增，见图9。图9A和9B分别为S1-MCDA、S2-MCDA扩增的实时浊度读取结果；图9C和图9D分别为S1-MCDA、S2-MCDA扩增的可视法显示结果；图9E和图9F分别为S1-MCDA、S2-MCDA扩增的琼脂糖凝胶电泳显示结果，图中泳道M为DNA分子量marker DL100；泳道2到9分别是模板量为2.5ng～31.25fg的基因组DNA；根据判读的结果，S1-MCDA和S2-MCDA扩增反应的检测下限都为125fg/反应。
通过S-MCDA与普通PCR扩增技术的敏感性比较，S-MCDA的检测下限为125fg/反应管，而PCR扩增技术的检测下限为25pg/反应管，因此，S-MCDA技术比PCR方法敏感200倍。
实施例3：MCDA扩增体系的检测特异性
在标准反应条件下，运用MCDA技术检测单增李斯特菌12个血清型及25种其他常见致病菌和机会致病菌时未出现非特异性扩增(见表2)，结果见图10。图10A应用可视检测进行结果判读，反应管1-12显示为阳性结果，对应的模板为单增李斯特菌的12个血清型，反应管13-34显示为阴性结果，对应的模板为非单增李斯特菌模板；图10B应用琼脂糖凝胶电泳进行结果判读，泳道1-12显示为阳性结果，对应的模板为单增李斯特菌的12个血清型，泳道13-34显示为阴性结果，对应的模板为非单增李斯特菌模板；由图10判读结果可知，阳性扩增仅出现在单增李斯特菌，其他非单增李斯特菌不出现阳性结果，说明该检测体系的特异性良好。
表2.本发明中所应用的菌株
注:aU,未鉴定血清型；bATCC,美国菌种保藏中心；NCTC,英国典型微生物保藏中心；ICDC,中国疾病预防控制中心传染病预防控制所。

Claims (8)

1.一种用于非诊断目的的扩增目的基因片段并对扩增结果进行检测的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)自所述目的基因片段的3’端起，设定第一任意序列F1s，第二任意序列P1s，自所述目的基因片段的5’端起，设定第三任意序列F2，第四任意序列P2，在所述第二任意序列P1s的5’端设定第五任意序列C1，和/或在所述第四任意序列P2的3’端设定第六任意序列C2s；
(2)提供置换引物F1，所述引物F1含有与序列F1s互补的序列，提供交叉引物CP1，所述引物CP1自5’端依次含有序列C1和与序列P1s互补的序列P1，提供置换引物F2，所述引物含有序列F2，提供交叉引物CP2，所述引物CP2自5’端依次含有序列C2s互补的序列C2和序列P2；
(3)提供扩增引物，所述扩增引物包括含有序列C1的扩增引物C1，和/或含有与序列C2s互补的扩增引物C2；
(4)在链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物存在下，使用目的基因片段作为模板恒温扩增DNA；
(5)检测步骤(4)的扩增结果。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中所述序列C1的3’端和5’端分别设定第七任意序列D1和第八任意序列R1，步骤(3)所述的扩增引物还包括含有序列D1的扩增引物D1和含有序列R1的扩增引物R1；或者
在步骤(1)中序列C2s的5’端和3’端分别设定第九任意序列D2s和第十任意序列R2s，步骤(3)所述的扩增引物还包括含有与序列D2s互补的扩增引物D2和含有与序列R2s互补的扩增引物R2。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)序列C1的3’端和5’端分别设定第七任意序列D1和第八任意序列R1,在序列C2s的5’端和3’端分别设定第九任意序列D2s和第十任意序列R2s，步骤(3)所述的扩增引物还包括含有序列D1的扩增引物D1、含有序列R1的扩增引物R1、含有与序列D2s互补的扩增引物D2和含有与序列R2s互补的扩增引物R2。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述扩增是在60～67℃中进行的。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述扩增是在63℃中进行的。
6.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述链移位型聚合酶为Bst DNA聚合酶，所述解链温度调节剂为甜菜碱。
7.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述的检测为可视染料检测、电泳检测或实时浊度检测。
8.权利要求2所述的方法在检测单增李斯特菌中的应用，其特征在于，所述交叉引物CP1的序列如SEQ ID NO:1所示，所述交叉引物CP2的序列如SEQ ID NO:2所示，所述置换引物F1的序列如SEQ ID NO:3所示，所述置换引物F2的序列如SEQ ID NO:4所示；其中，所述扩增引物包括D1、C1、R1和/或D2、C2、R2，其中引物D1的序列如SEQ ID NO:5所示，引物C1的序列如SEQ ID NO:6所示，引物R1的序列如SEQ ID NO:7所示，引物D2的序列如SEQ ID NO:8所示，引物C2的序列如SEQ ID NO:9所示，引物R2的序列如SEQ ID NO:10所示。
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