CN111518948B - 逆转录多交叉置换扩增结合纳米生物传感检测SARS-CoV-2的方法 - Google Patents

逆转录多交叉置换扩增结合纳米生物传感检测SARS-CoV-2的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种逆转录多交叉置换扩增结合纳米生物传感检测SARS‑CoV‑2的方法，所述方法针对SARS‑CoV‑2的开放阅读框1a/b(F1ab)片段和N基因两个靶标，使用独特设计的多交叉置换扩增引物，并在多交叉置换扩增中的F1ab序列交叉引物CP1的5’端标记地高辛半抗原，在N基因交叉引物CP1的5’端标记荧光素FITC半抗原，所述方法针对新型冠状病毒F1ab片段及N基因扩增的产物能被高分子纳米生物传感器可视化检测。所述方法便捷、快速、敏感、特异，适宜于新型冠状病毒的特异检测。

Description

逆转录多交叉置换扩增结合纳米生物传感检测SARS-CoV-2的 方法
技术领域
本发明公开了一种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的检测方法，属于微生物学领域。
背景技术
新型冠状病毒是引起严重急性呼吸综合征(severe acute respiratorysyndrome)病毒性肺炎的病原体，，2020年1月12日，世界卫生组织将将这种病毒命名为2019新型冠状病毒(2019-novel coronavirus)，后来被更名为为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)。本次出现的病毒肺炎被命名为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)，简称“新冠肺炎”。
冠状病毒(coronavirus,CoVs)是一大类病毒，因电子显微镜观察发现病毒包膜上有类似日冕的棘突而被命名为冠状病毒，可感染哺乳动物及鸟类，导致多种疾病。已知的人类冠状病毒共有6种，其中4种冠状病毒在人群中较为常见，致病性较低，一般仅引起类似普通感冒的轻微呼吸道症状。另外2种冠状病毒包括严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS冠状病毒)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS冠状病毒)可引起严重的呼吸系统疾病。SARS-CoV-2归类于网巢病毒目冠状病毒科，归属于B属，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径50-200nm，为单链正股RNA病毒。S蛋白是病毒的主要蛋白之一，其编码基因用于病毒分型，而N蛋白包裹病毒基因组，可作为诊断抗原。中国疾病预防控制中制定的《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》中采取的检测方法是针对新型冠状病毒基因组中开放读码框1a/b(open reading frame 1ab，ORF1ab)和核壳蛋白(nucleocapsid protein，N)两个靶标分别设计一套引物，采用常规检的实时荧光RT-PCR对疑似病例标本中的新型冠状病毒核酸进行检测。该方法在疫情的病原体检测中发挥了重要作用，全国各省实验室几乎都参照指南现有的该方法对疑似病例进行实验室确诊和高危人群的病毒核酸筛查。然而，该方法存在以下不足：(1)需要昂贵的荧光定量RT-PCR仪器，一般的实验室不能满足仪器设备要求；(2)该方法从提取核酸到出具报告需要4至5个小时，影响应急检测效率；(3)该方法检出结果阴性也不能排除新型冠状病毒感染，存在因技术本身敏感性不足导致假阴性的可能性。此外，如何实现早期检测，尽早识别发病早期病例或处于潜伏期尚未发病的病毒携带者是值得重视的问题。最近个别地区出现了经历4-5次的荧光RT-PCR检测才出现核酸阳性的发热病例，该情况很有可能是因RT-PCR检测方法灵敏度不够所致。基于以上不足，国家自然科学基金委及部分省市相关机构已相继向社会征集新型冠状病毒快速和早期检测技术，望能达到满足当前和今后新型冠状病毒肺炎病例的实验室检测需求。
近年来，为了解决PCR相关检测技术的不足，基于恒温扩增的核酸检测技术如滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖的恒温扩增(HDA)、交叉扩增(CPA)、环介导恒温扩增(LAMP)等技术先后出现。然而，此类恒温技术实现核酸扩增需要多种酶同时工作，依赖于昂贵的试剂，且操作步骤复杂，其实用性、便捷性和可操作性有待提高。2015年，一种被称为“多交叉置换扩增(Multiple Cross Displacement Amplification；MCDA)”的新型恒温核酸扩增检测技术被研制成功。MCDA技术针对病原体基因组的靶基因或靶序列的不同区域设计10条引物(包括2条置换引物F1和F2，2条交叉引物CP1和CP2，6条扩增引物C1，D1，R1，C2，D2和R2)，同时识别病原体基因组靶序列的10个特定区域，从而保证了方法的特异性。该技术的10条引物同时连续扩增，30分钟内可将靶序列扩增至1010-1012倍，敏感性是荧光定量PCR的100倍，是传统恒温扩增技术LAMP的10倍。MCDA在58℃～70℃(任意一个温度)下实现核酸等温扩增，简单的加热设备如金属浴或普通水浴锅即可满足反应条件，不依赖于复杂昂贵的热循环仪或PCR仪器，仅需要15～30分钟即可完成扩增。扩增产物的结果判断可通过肉眼根据颜色判断，也可借助比浊仪或电泳检测扩增产物判定结果。MCDA方法自2015年面世以来，随即受到了国内外学者的关注，已被应用于细菌、病毒、真菌、螺旋体等病原微生物的检测。为了提高结果判定的客观性和简化操作程序，MCDA技术发明人结合纳米生物传感技术，研制了多交叉置换扩增-纳米生物传感(Nanoparticles-based Biosensor,LFB)检测技术(MCDA-LFB)，实现了MCDA扩增产物的可视化。因此，相比于现用的荧光RT-PCR和其他恒温扩增技术,MCDA-LFB技术在检测时效、灵敏度、特异性、结果判断和检测成本上具有明显优势。
基于MCDA-LFB技术的上述优势，本发明拟以当前正广泛流行的新型冠状病毒肺炎的病原体SARS-CoV-2检测的技术需求为导向，提供一种灵敏度高、特异性好、耗时短、成本低、操作简单的新型冠状病毒多交叉置换扩增-纳米生物传感检测技术(SARS-CoV-2-MCDA-LFB)，以弥补现有荧光RT-PCR等方法的不足，大幅度缩短检测时间和提高检测灵敏度，提高新型冠状病毒肺炎的实验室检测效率。
发明内容
基于上述目的，本发明首先提供了一种应用逆转录多交叉置换扩增结合高分子纳米生物传感检测新冠肺炎病毒F1ab序列(即前文述及的ORF1ab)和/或N基因的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)提取待检测样品的基因组；
(2)提供针对新型冠状病毒F1ab核酸片段的多交叉置换等温扩增引物，所述引物包括：序列分别如SEQ ID NO:1和2所示的置换引物F1ab-F1和F1ab-F2，序列分别如SEQ IDNO:3和4所示的交叉引物F1ab-CP1和F1ab-CP2，序列分别如SEQ ID NO:5和6所示的扩增引物F1ab-C1和F1ab-C2，序列分别如SEQ ID NO:7和8所示的扩增引物F1ab-D1和F1ab-D2，序列分别如SEQ ID NO:9和10所示的扩增引物F1ab-R1和F1ab-R2，同时提供在所述交叉引物F1ab-CP1的5’端标记第一半抗原的交叉引物F1ab-CP1*；和/或
提供针对新型冠状病毒N基因的多交叉置换等温扩增引物，所述引物包括：序列分别如SEQ ID NO:11和12所示的置换引物N-F1和N-F2，序列分别如SEQ ID NO:13和14所示的交叉引物N-CP1和N-CP2，序列分别如SEQ ID NO:15和16所示的扩增引物N-C1和N-C2，序列分别如SEQ ID NO:17和18所示的扩增引物N-D1和N-D2，序列分别如SEQ ID NO:19和20所示的扩增引物N-R1和N-R2，同时提供在所述交叉引物N-CP1的5’端标记第二半抗原的交叉引物N-CP1*；
(3)待测样品RNA在逆转录酶的作用下逆转录为cDNA；在链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物存在下，使用待检测样品的基因组的核酸作为模板恒温扩增DNA；
(4)使用高分子纳米生物传感器检测步骤(3)的扩增产物。
在一个优选的技术方案中，在所述交叉引物F1ab-CP1*的5’端标记的第一半抗原为地高辛(Dig)，在所述交叉引物N-CP1*的5’端标记的第二半抗原为荧光素(FITC)。
更为优选地，所述高分子纳米生物传感器包括一背板，在所述背板上依次设置装有样品垫、纳米标记垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，在所述硝酸纤维素膜上设置检测线1和/或检测线2、质量控制线，在纳米标记垫、检测线1和/或检测线2、质量控制线依次包被有高分子纳米粒子偶联的链霉素亲和素、抗地高辛抗体和/或抗荧光素抗体、生物素偶联的牛血清蛋白。
在一个优选的技术方案中，所述恒温扩增是在61-65℃的环境中进行的。
在一个更为优选的技术方案中，所述恒温扩增是在64℃的环境中进行的。
其次，本发明还提供了一组用于恒温扩增新型冠状病毒的引物，所述引物包括：序列分别如SEQ ID NO:1和2所示的置换引物F1ab-F1和F1ab-F2，序列分别如SEQ ID NO:3和4所示的交叉引物F1ab-CP1和F1ab-CP2，序列分别如SEQ ID NO:5和6所示的扩增引物F1ab-C1和F1ab-C2，序列分别如SEQ ID NO:7和8所示的扩增引物F1ab-D1和F1ab-D2，序列分别如SEQ ID NO:9和10所示的扩增引物F1ab-R1和F1ab-R2，以及在所述交叉引物F1ab-CP1的5’端标记第一半抗原的交叉引物F1ab-CP1*；和/或
序列分别如SEQ ID NO:11和12所示的置换引物N-F1和N-F2，序列分别如SEQ IDNO:13和14所示的交叉引物N-CP1和N-CP2，序列分别如SEQ ID NO:15和16所示的扩增引物N-C1和N-C2，序列分别如SEQ ID NO:17和18所示的扩增引物N-D1和N-D2，序列分别如SEQID NO:19和20所示的扩增引物N-R1和N-R2，以及在所述交叉引物N-CP1的5’端标记第二半抗原的交叉引物N-CP1*。
在一个优选的技术方案中，在所述交叉引物F1ab-CP1*的5’端标记的第一半抗原为地高辛(Dig)，在所述交叉引物N-CP1*的5’端标记的第二半抗原为荧光素(FITC)。
最后，本发明还提供了一种含有上述引物的微生物检测试剂盒。
在一个优选的技术方案中，所述试剂盒还包括链移位型聚合酶(Bst)、解链温度调节剂和高分子纳米生物传感器。
本发明提供的多交叉扩增结合纳米生物传感检测的目的基因为SARS-CoV2的F1ab序列和N基因两个靶标，该方法具有优异的检测灵敏度，其检测下限为5个拷贝，而且也具有较快的检测速度，仅需35分钟，即可获得能供可视化LFB检测的扩增产物。
以病原体(冠状病毒HKU1、甲型H1N1流感病毒、甲型H1N2流感病毒、甲型H5流感病毒、甲型H5N8流感病毒、甲型H4N6流感病毒、甲型H7N9流感病毒、B型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人类腺病毒、寨卡病毒、柯萨奇病毒(CAV16)、人类肠道病毒(EV71)、猪圆环病毒II、猪瘟病毒、莱利斯塔德病毒、支原体、衣原体、嗜肺军团菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、曼氏不动杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、福氏志贺菌、李斯特菌、猪链球菌、蜡样芽胞杆菌、产毒素大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎链球菌、副溶血性弧菌、热带假丝酵母、新生隐球菌和白假丝酵母菌)为模板评价SARS-CoV-2-MCDA-LFB技术的特异性。结果表明，SARS-CoV-2-MCDA-LFB技术能准确的鉴别SARS-CoV-2，说明SARS-CoV-2-MCDA-LFB方法的特异性良好，证明本发明提供的用于MCDA的引物序列具有优异的特异性和扩增效果。
附图说明
图1.MCDA-LFB操作流程示意图；
图2.MCDA-LFB扩增示意图；
图3.MCDA-LFB检测示意图；
图4.MCDA-LFB引物设计的位置和方向示意图；
图5.MCDA-LFB确诊结果图谱；
图6.MCDA-LFB检测F1ab序列最佳反应温度测试结果图谱；
图7.MCDA-LFB检测N基因最佳反应温度测试结果图谱；
图8.MCDA-LFB检测F1ab序列的灵敏度测试结果图谱；
图9.MCDA-LFB检测N基因的灵敏度测试结果图谱；
图10.MCDA-LFB同时检测F1ab序列和N基因灵敏度测试结果图谱；
图11.MCDA-LFB对新冠肺炎恢复期病人的标本检测结果图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明权利要求限定的保护范围构成任何限制。
本发明MCDA-LFB方法的具体操作流程如图1所示。所述流程包括样品收集、模板准备、RT-MCDA反应和结果输出4个部分。
1.MCDA-LFB扩增原理
MCDA的扩增原理见中国发明专利申请20151028765.X，本发明引用该专利文献的说明书内容作为本发明说明书的组成部分。本发明选取新型冠状病毒的F1ab片段和N基因两个靶标作为MCDA扩增的靶序列/基因，同时评价单独扩增F1ab序列或N基因以及同时扩增F1ab序列和N基因以建立MCDA扩增检测新型冠状病毒的方法。
(1)通过MCDA扩增构建可检测产物
F1ab和N基因两个靶标的MCDA反应体系分别包括10条引物，识别靶序列的10个区域，包括2条交叉内引物，即CP1和CP2(Cross Primer，CP)，2条置换引物，即F1和F2，6条扩增引物，即D1，C1，R1，D2，C2和R2。为了构建可检测产物，在针对F1ab序列扩增引物Fab1-CP1的5’端标记地高辛(Dig),在针对N基因序列扩增引物的N-CP1的5’端标记荧光素(FITC)，原理示意图见附图2。图2中，Dig代表地高辛，FITC代表荧光素，Biotin代表生物素，dNTP代表脱氧核糖核苷三磷酸、BST2.0代表链移位型聚合酶。
(2)生物传检测器(LFB)检测扩增产物
如附图3之A所示，高分子纳米生物传感器包括一背板，在所述背板上依次装有样品垫、纳米结合垫、硝酸纤维素膜(反应区)及末端吸水垫，在所述硝酸纤维素膜上依次设置检测线1(TL1)、检测线2(TL2)及检测控制线(CL)，在纳米结合垫、检测线1、检测线2及控制线区域依次包被有亲和素化的聚合物纳米粒子(Streptavidin coated polymernanoparticles,SA-DNPs,129nm)、抗地高辛抗体(anti-Dig)、抗荧光素抗体(anti-FITC)及生物素偶联的牛血清蛋白。图3中，1指示样品垫，2指示纳米结合垫，3指示检测线1，4指示检测线2，5指示硝酸纤维素膜(反应区)，6指示检测控制线，7指示末端吸水垫，8指示背板。
结合附图3之B简述LFB检测原理如下：
将SARS-CoV-2-MCDA产物直接滴加到LFB的样品垫区域，然后将100ul的检测缓冲液加到样品垫区域，MCDA产物在虹吸作用下，从下往上运动(从样品垫向吸水垫方向运动)。当MCDA产物达到纳米结合垫后，双标产物的一端(即生物素标记端)与高分子纳米粒子偶联的链霉素亲和素反应。当产物继续运动至硝酸纤维素膜区域(反应区)，双标产物的另一端(即半抗原标记端)与检测线1和检测线2区域的抗体结合，将双标产物固定在检测线区域。随着产物在检测线区域的积累，通过另一端的高分子纳米粒子偶联的链霉素亲和素进行显色反应，从而对MCDA产物进行可视化检测。此外，过剩的高分子纳米粒子偶联的链霉素亲和素可与检测控制线区域的B-BSA(高分子纳米粒子偶联的链霉素亲和素)结合，进行直接显色反应，判断LFB的功能是否正常。图3中，anti-Dig表示抗地高辛抗体，anti-FITC表示抗荧光素抗体，Biotin代表生物素，BSA代表牛血清蛋白，B-BSA或Biotin-BSA代表生物素偶联的牛血清蛋白，DPNs代表聚合物纳米粒子，SA代表链霉素亲和素，SA-DPNs代表链霉素亲和素-聚合物纳米粒子。
LFB结果的判读(图3之C)：仅仅CL区域出现红色条带，表示阴性对照，没有阳性产物；CL及检测线区域TL1和/或TL2出现红色条带，表示针对靶标的检测为阳性结果；当LFB不出现红线条带时，表示LFB失效；当测试线TL1或TL2出现红色条带时，CL无红色条带,代表结果不可行，需要重新检测。图5之A为F1ab序列检测结果(1为阳性对、2和3为阴性、4为空白对照)，图5之B为N基因检测结果(1为阳性对、2和3为阴性、4为空白对照)，图5之C为F1ab和N基因双靶标检测结果(1为阳性对、2和3为阴性、4为空白对照)。
2.本发明中实施例所涉及的试剂和仪器：
本发明中实施例所涉及的试剂：抗地高辛抗体(anti-Dig)、抗荧光素抗体(anti-FITC)，高分子纳米粒子偶联的链霉素亲和素(SA-NP)及生物素偶联的牛血清蛋白(B-BSA)购于北京海泰正元生物科技有限公司。背板，纳米垫，金标垫，纤维膜及吸水垫购于上海Jie-Yi公司。逆转录酶购置于北京擎科生物科技有限公司。恒温扩增试剂盒(IsothermalAmplification Kit)，生物素偶联的三磷酸脱氧腺苷(Biotion-14-dATP)和生物素偶联的三磷酸脱胞苷(Biotion-14-dTP)购于北京海泰正元生物科技有限公司(Beijing HaiTai-Zhenyuan Co.Ltd.,Beijing,China)。DNA提取试剂盒(QIAamp DNA minikits；Qiagen,Hilden,Germany)购于德国Qiagen公司。其余试剂均为市售分型纯产品。
本发明实验中使用的主要仪器：电泳设备为Bio-Rad公司产品；凝胶成像系统为Bio-Rad Gel Dox XR,美国Bio-Rad产品。
3.本发明中实施例所涉及的方法和菌毒株
基因组提取：含新型冠状病毒F1ab序列和N基因序列的质粒DNA采用Qiagen公司的质粒DNA提取试剂盒(QIAamp DNA minikits；Qiagen,Hilden,Germany)，其他病毒基因组的基因组提取采用Qiagen公司的病毒基因组提取试剂盒(QIAamp DNA minikits；Qiagen,Hilden,Germany)，细菌和真菌的基因组DNA的提取使用Qiagen公司的DNA和真菌提取试剂盒(QIAamp DNA minikits；Qiagen,Hilden,Germany)，按照说明书进行操作。利用紫外分光光度计测定基因组DNA的浓度和纯度，质粒DNA用GE缓冲液连续稀释(从5×104拷贝，5×103拷贝、5×102拷贝、5×102拷贝、5×101拷贝、5×100拷贝、5×10-1拷贝、5×10-2拷贝)。各种基因组DNA均少量分装，-20℃保存备用。
连续稀释的新型冠状病毒F1ab序列和N基因序列的质粒DNA用于MCDA扩增的最佳温度的探索及扩增体系的建立。以常见的病原体核酸为模板评价SARS-CoV-2-MCDA-LFB技术的特异性。菌毒株信息见表1。
表1，本发明中所使用病毒和菌毒株基因组
4.本发明实施例所涉及的引物设计
为了验证、评价MCDA-LFB技术及建立针对SARS-CoV-2的快速、敏感和特异的MCDA-LFB检测体系。本发明分别针对SARS-CoV-2的F1ab序列和N基因序列设计了MCDA扩增引物，该两套不仅用于单独扩增F1ab序列或N基因，还要同时用于扩增F1ab序列和N基因，旨在验证MCDA-LFB技术的可行性、敏感性、特异性及可靠性。引物设计示意图见图4，其中F1ab序列的MCDA引物序列扩增SARS-CoV-2毒株Wuhan-Hu-1(GenBank MN908947)基因组开放阅读框1a/b序列的第13354至13583号碱基片段，N基因的MCDA引物序列扩增SARS-CoV-2毒株Wuhan-Hu-1(GenBank MN908947)N基因序列的第28781至29047号碱基片段。引物序列及修饰见表2。
表2针对F1ab和N基因设计的引物序列及修饰
a在引物F1ab-CP1的5’端标记地高辛，即为引物F1ab-CP1*，在引物N-CP1的5’端标记荧光素，即为引物N-CP1*；b mer，monomeric unit(单体单元)；c nt，nucleotide(核苷酸)。
实施例1.MCDA-LFB扩增的可行性
标准的MCDA反应体系：交叉引物CP1和CP1*的浓度为30pmol，交叉引物CP2的浓度为60pmol,置换引物F1和F2的浓度为10pmol，扩增引物R1，R2，D1和D2的浓度为30pmol，扩增引物C1和C2的浓度为20pmol，10mM的Betain，6mM的MgSO4，0.1mM的Biotin-14-dATP和Biotin-14-dCTP,1.4mM的dNTP，12.5μL的10×Bst DNA聚合酶缓冲液，10U的链置换DNA聚合酶，1μL的模板，补加去离子水至25μl。整个反应恒温在64℃35分钟。
MCDA扩增之后，MCDA产物可以通过LFB对其进行检测，阳性在检测区域出现两条红色条带(TL和CL)，阴性仅仅出现一条红色条带(CL)。由于针对SARS-CoV-2的F1ab设计的MCDA引物标记的半抗原为Dig(地高辛)。因此，当TL1和CL出现红色条带时表示为SARS-CoV-2病毒F1ab序列检测阳性(图5之A泳道1)。通过LFB检测法判读MCDA扩增结果，阳性反应出现了预期的结果，而阴性反应和空白对照仅出现CL红色条带，验证了本研究所设计的MCDA-LFB技术及F1ab序列的MCDA引物可行，能够用于目的靶序列的检测。
由于针对SARS-CoV-2的N基因设计的MCDA引物标记的半抗原为荧光素(FITC)。因此，当TL2和CL出现红色条带时表示为SARS-CoV-2病毒N基因检测阳性(图5之B泳道1)。通过LFB检测法判读MCDA扩增结果，阳性反应出现了预期的结果，而阴性反应和空白对照仅出现CL红色条带，验证了本研究所设计的LFB，MCDA-LFB技术及N基因的MCDA引物可行，能够用于目的靶序列的检测。
实施例2.多重MCDA-LFB扩增的可行性
多重MCDA反应体系：交叉引物F1ab-CP1和F1ab-CP1*的浓度为10pmol，交叉引物F1ab-CP2的浓度为30pmol,置换引物F1ab-F1和F1ab-F2的浓度为5pmol,扩增引物F1ab-R1、F1ab-R2、F1ab-D1和F1ab-D2的浓度为15pmol，扩增引物F1ab-C1和F1ab-C2的浓度为10pmol，交叉引物N-CP1和N-CP1*的浓度为10pmol，交叉引物N-CP2的浓度为30pmol,置换引物N-F1和N-F2的浓度为5pmol,扩增引物N-R1、N-R2、N-D1和N-D2的浓度为15pmol，扩增引物N-C1和N-C2的浓度为10pmol，10mM的Betain，6mM的MgSO4，0.1mM的Biotin-14-dATP和Biotin-14-dCTP,1.4mM的dNTP，12.5μL的10×Bst DNA聚合酶缓冲液，10U的链置换DNA聚合酶，1μL的模板，补加去离子水至25μl。整个反应恒温在64℃35分钟。
为了实现双靶标检测，将针对SARS-CoV-2的F1ab设计的MCDA引物(地高辛标记)和针对N基因设计的MCDA引物(FITC标记)，按照优化后的混合体系同时对F1ab和N基因进行扩增。因此，产物检测时当TL1和TL2及CL出现红色条带时表示为SARS-CoV-2病毒F1ab和N基因同时阳性(图5之C，泳道1)。当靠上的TL1和CL出现条带时为F1ab阳性，当TL2和CL出现条带时为N阳性
通过LFB检测法判读MCDA扩增结果，阳性反应出现了预期的结果，而阴性反应和空白对照仅出现CL红色条带，验证了本研究所设计的两套MCDA引物应用于多重MCDA-LFB技术同时扩增F1ab片段和N基因的可行，能够用于目的靶序列的检测(见图5之C)
实施例3.测定MCDA技术的最佳反应温度
在标准反应体系条件下，加入针对SARS-CoV-2病毒F1ab质粒和N质粒模板及所设计的对应的MCDA引物，其模板浓度为5000拷贝。反应在恒温条件下进行(60-67℃)，结果运用实时浊度仪进行检测，在不同的温度下得到不同的动态曲线图，见图6(F1ab序列扩增)和图7(N基因序列扩增)。64-65℃被推荐作为MCDA引物的的最佳反应温度。本发明中的后续验证选择64℃作为恒温条件进行MCDA扩增。图6和7表示针对F1ab和N基因序列设计的检测SARS-CoV-2病毒的MCDA引物温度动态曲线图。
实施例4.MCDA-LFB检测单一靶标的灵敏度
运用连续稀释好的提取自SARS-CoV-2病毒F1ab序列和N基因质粒的DNA进行标准的MCDA扩增反应后，运用LFB检测显示：MCDA-LFB的检测范围为5×104～5×100拷贝。LFB在TL1/TL2和CL区域出现红色线(图8之A和图9之A)。当反应体系中基因组模板量降低至5×100拷贝以下时，LFB仅在CL区域出现红色线，表示阴性结果。
为了进一步验证MCDA-LFB检测SARS-CoV-2的敏感性，采用实时浊度仪用于分析MCDA扩增(图8之B和图9之B)。运用SARS-CoV-2病毒F1ab序列和N基因质粒的DNA进行标准的MCDA扩增反应后，运用实时浊度仪进行结果判定，检测显示：SARS-CoV-2病毒F1ab序列和N基因的MCDA的检测范围为5×104～5×100拷贝/反应，阳性扩增浊度曲线被观察到(图8之B和图9之B)。当反应体系中基因组模板量降低至5×100拷贝以下时，不出现阳性扩增浊度曲线，表示阴性结果。LFB的分析结果与实时浊度的分析结果一致，然而，实时浊度依赖昂贵的实时浊度仪。
实施例5.MCDA-LFB检测双靶标的灵敏度
运用连续稀释好的提取自SARS-CoV-2病毒F1ab序列和N基因质粒的DNA进行多重MCDA扩增反应后，运用LFB检测显示：MCDA-LFB的检测范围为5×104～5×100拷贝。LFB在TL1，TL2和CL区域出现红色线(图10之A)。当反应体系中基因组模板量降低至5×100拷贝以下时，LFB仅在CL区域出现红色线，表示阴性结果。多重MCDA-LFB的检测与标准MCDA-LFB的检测结果一致。
为了进一步验证MCDA-LFB检测SARS-CoV-2的敏感性，采用实时浊度仪用于分析MCDA扩增(图10之B)。运用SARS-CoV-2病毒F1ab序列和N基因质粒的DNA进行标准的MCDA扩增反应后，运用实时浊度仪进行结果判定，检测显示：SARS-CoV-2病毒F1ab序列和N基因的MCDA的检测范围为5×104～5×100拷贝/反应，阳性扩增浊度曲线被观察到(图10之B)。当反应体系中基因组模板量降低至5×100以下时，不出现阳性扩增浊度曲线，表示阴性结果(图10之B6-B8)。LFB的分析结果与实时浊度的分析结果一致，然而，实时浊度只能判定结果是否发生，不能进行多重检测，且依赖昂贵的实时浊度仪。
实施例6.测定MCDA-LFB技术的特异性
以病原体(冠状病毒HKU1、甲型H1N1流感病毒、甲型H1N2流感病毒、甲型H5流感病毒、甲型H5N8流感病毒、甲型H4N6流感病毒、甲型H7N9流感病毒、B型流感病毒、呼吸道合胞病毒、人类腺病毒、寨卡病毒、柯萨奇病毒(CAV16)、人类肠道病毒(EV71)、猪圆环病毒II、猪瘟病毒、莱利斯塔德病毒、支原体、衣原体、嗜肺军团菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、脑膜炎奈瑟菌、曼氏不动杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、福氏志贺菌、李斯特菌、猪链球菌、蜡样芽胞杆菌、产毒素大肠杆菌、沙门氏菌、肺炎链球菌、副溶血性弧菌、热带假丝酵母、新生隐球菌和白假丝酵母菌)为模板评价SARS-CoV-2-MCDA-LFB技术的特异性。结果表明，SARS-CoV-2-MCDA-LFB技术能准确地鉴别SARS-CoV-2，说明SARS-CoV-2-MCDA-LFB方法的特异性良好，也证明本发明提供的用于MCDA的引物序列具有优异的特异性和扩增效果。本发明用到的病原体核酸模板见表1。
实施例7.MCDA-LFB技术的应用
为了评估MCDA-LFB在实际应用中的检测效果，应用采集自贵州省的54份新冠肺炎病例标本核酸制备模板，采用SASR-CoV-2MCDA-LFB对54份核酸进行检测，同时与传统的荧光rRT-PCR方法进行比较。MCDA-LFB方法从54标本核酸中检出12份阳性，传统的荧光rRT-PCR检出10份阳性，检测结果参见附图11和表3。MCDA-LFB方法检出阳性标本在覆盖传统的荧光rRT-PCR检出阳性标本的基础上，检出阳性标本数最多，检测耗时最短(60分钟以内，包模板准备15分钟、扩增35分钟、结果输出2分钟)。
表3 MCDA-LFB对新冠肺炎恢复期病人的标本检测结果
注：+标示阳性；—标示阴性
序列表
<110> 贵州省疾病预防控制中心
<120> 逆转录多交叉置换扩增结合纳米生物传感检测SARS-CoV-2的方法
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 1
acacttaaaa acacagtctg tac 23
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 2
aatttagcaa aaccagctac t 21
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 3
gaagcatggg ttcgcggagt cgtctgcggt atgtggaa 38
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 4
gtgcggcaca ggcactagta ttatcattgt agatgtcaaa agcc 44
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 5
gaagcatggg ttcgcggagt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 6
gtgcggcaca ggcactagta 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 7
tgatcacaac tacagccat 19
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 8
ctgatgtcgt atacag 16
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 9
gattgtgcat cagctgact 19
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 10
gtttgcggtg taagtgca 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 11
gcttctacgc agaaggga 18
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 12
aggcttctta gaagcctcag 20
<210> 13
<211> 42
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 13
ctactgctgc ctggagttga attcttctcg ttcctcatca cg 42
<210> 14
<211> 41
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 14
tgcttgacag attgaaccag ctgtgacagt ttggccttgt t 41
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 15
ctactgctgc ctggagttga at 22
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 16
tgcttgacag attgaaccag ct 22
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 17
tcttgaactg ttgcgacta 19
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 18
tgagagcaaa atgtctggt 19
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 19
cattctagca ggagaagtt 19
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 20
atgctgctct tgctttgct 19

Claims (10)

1.一种非诊断目的的逆转录多交叉置换扩增结合纳米生物传感检测SARS-CoV-2的方法，所述方法包括以下步骤：
（1）提取待检测样品的基因组；
（2）提供针对新型冠状病毒F1ab核酸片段的多交叉置换等温扩增引物，包括：序列分别如SEQ ID NO: 1和2所示的置换引物F1ab-F1和F1ab-F2，序列分别如SEQ ID NO: 3和4所示的交叉引物F1ab-CP1和F1ab-CP2，序列分别如SEQ ID NO: 5和6所示的扩增引物F1ab-C1和F1ab-C2，序列分别如SEQ ID NO:7和8所示的扩增引物F1ab-D1和F1ab-D2，序列分别如SEQID NO: 9和10所示的扩增引物F1ab-R1和F1ab-R2，同时提供在所述交叉引物F1ab-CP1的5’端标记第一半抗原的交叉引物F1ab-CP1*；和
提供针对新型冠状病毒N基因的多交叉置换等温扩增引物，包括：序列分别如SEQ IDNO: 11和12所示的置换引物N-F1和N-F2，序列分别如SEQ ID NO: 13和14所示的交叉引物N-CP1和N-CP2，序列分别如SEQ ID NO: 15和16所示的扩增引物N-C1和N-C2，序列分别如SEQ ID NO: 17和18所示的扩增引物N-D1和N-D2，序列分别如SEQ ID NO: 19和20所示的扩增引物N-R1和N-R2，同时提供在所述交叉引物N-CP1的5’端标记第二半抗原的交叉引物N-CP1*；
（3）待测样品RNA在逆转录酶的作用下逆转录为cDNA；在链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物存在下，使用待检测样品的基因组的核酸作为模板恒温扩增DNA，所述链移位型聚合酶为链置换DNA聚合酶；
（4）使用高分子纳米生物传感器检测步骤（3）的扩增产物。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述交叉引物F1ab-CP1* 5’端标记的第一半抗原为地高辛。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述交叉引物 N-CP1*的5’端标记的第二半抗原为荧光素。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述高分子纳米生物传感器包括一背板，在所述背板上依次设置装有样品垫、纳米标记垫、硝酸纤维素膜及吸水垫，在所述硝酸纤维素膜上设置检测线1和检测线2、质量控制线，在纳米标记垫包被有高分子纳米粒子偶联的链霉素亲和素，在检测线1和检测线2分别包被有抗地高辛抗体和抗荧光素抗体，在质量控制线包被有生物素偶联的牛血清蛋白。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述恒温扩增是在61-65℃的环境中进行的。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述恒温扩增是在64℃的环境中进行的。
7. 一组用于恒温扩增新型冠状病毒的引物，其特征在于，所述引物包括：序列分别如SEQ ID NO: 1和2所示的置换引物F1ab-F1和F1ab-F2，序列分别如SEQ ID NO: 3和4所示的交叉引物F1ab-CP1和F1ab-CP2，序列分别如SEQ ID NO: 5和6所示的扩增引物F1ab-C1和F1ab-C2，序列分别如SEQ ID NO:7和8所示的扩增引物F1ab-D1和F1ab-D2，序列分别如SEQID NO: 9和10所示的扩增引物F1ab-R1和F1ab-R2，以及在所述交叉引物F1ab-CP1的5’端标记第一半抗原的交叉引物F1ab-CP1*；和
序列分别如SEQ ID NO: 11和12所示的置换引物N-F1和N-F2，序列分别如SEQ ID NO:13和14所示的交叉引物N-CP1和N-CP2，序列分别如SEQ ID NO: 15和16所示的扩增引物N-C1和N-C2，序列分别如SEQ ID NO: 17和18所示的扩增引物N-D1和N-D2，序列分别如SEQ IDNO: 19和20所示的扩增引物N-R1和N-R2，以及在所述交叉引物N-CP1的5’端标记第二半抗原的交叉引物N-CP1*。
8. 根据权利要求7所述的引物，其特征在于，在所述交叉引物 F1ab-CP1*的5’端标记的第一半抗原为地高辛，在交叉引物N-CP1*的5’端标记的第二半抗原为有荧光素。
9.一种含有权利要求7或8所述引物的微生物检测试剂盒。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括链移位型聚合酶、解链温度调节剂和高分子纳米生物传感器，所述链移位型聚合酶为链置换DNA聚合酶。
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