CN113481324B - 检测新型冠状病毒及其d614g突变株的方法和试剂盒 - Google Patents

检测新型冠状病毒及其d614g突变株的方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了检测新型冠状病毒及其D614G突变株的方法和试剂盒，具体的地，本发明经过多轮筛选验证，从大量引物探针集合中获得了灵敏度高、特异性强、重复性好、抗干扰能力强，并且能够进行多重检测的引物探针集合，可以用于检测新型冠状病毒并鉴定D614G突变株。

Description

检测新型冠状病毒及其D614G突变株的方法和试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术和分子诊断领域，具体地说，本发明涉及一种新型冠状病毒及其D614G突变株实时荧光RT-PCR双重检测体系。
背景技术
新型冠状病毒是一种单股正链RNA病毒，属冠状病毒科，β冠状病毒属中的Sarbecovirus亚属。新型冠状病毒由于为单链RNA病毒，容易发生突变。病毒的突变与重组对病毒的侵染能力、繁殖能力和病毒的检测、抗体有效性均密切相关，所以对病毒的突变和重组的监视是研究病毒至关重要的一环。S蛋白是病毒的主要蛋白之一，其通过与宿主受体(ACE2)相互作用感染宿主，决定病毒的侵染对象和侵染能力。
新冠病毒S蛋白中唯一的显著变异就是非同义D614G突变(天冬氨酸D变为甘氨酸G)，该突变可显著增强病毒的感染能力，并且降低了病毒对患者恢复期血清的敏感性。携带D614G突变的新冠病毒毒株已经取代原始毒株成为了主流新冠病毒毒株。对新冠病毒突变毒株作出鉴定成为目前疫情防控的关键之一。
实时荧光RT-PCR是冠状病毒核酸检测常用方法之一，可用于实验室检查、流行病学研究、排除诊断等。该方法灵敏度高、特异性好，可以准确快速提供目标病毒的检测结果。目前，对新型冠状病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光RT-PCR鉴定，主要针对新型冠状病毒基因组开放读码框1a/b(openreading frame 1ab，ORF1ab)和核壳蛋白(nucleocapsid protein，N)。但是，鉴于RNA病毒变异速度较快，容易对突变病毒造成漏检，不利于病毒的及时发现与防控。
因此，有必要开发针对性的检测体系，用于精准识别新型冠状病毒突变株，从而为疫情防控提供可靠依据。
发明内容
本发明针对新型冠状病毒及其D614G突变株开发了检测的方法和试剂盒，以便能够高效率、高特异性、低成本的对感染患者进行检测。
在本发明的第一方面，提供了一种用于检测新型冠状病毒及其D614G突变株的引物对集，所述引物对集包括：
第一引物对，所述第一引物对包括：
如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.2所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：
第二引物对，所述第二引物对包括：
如SEQ ID NO.4所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.5所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：
内标引物对，所述内标引物对包括：
如SEQ ID NO.7所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.8所示的反向引物。
本发明的第二方面，提供了一种用于用于检测新型冠状病毒及其D614G突变株的探针集，所述探针集包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的第一探针。
在另一优选例中，所述探针集还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的第二探针。
在另一优选例中，所述探针集还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的内标探针。
在另一优选例中，各探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，各探针的3’端包含有荧光淬灭基团。
在另一优选例中，各探针标记的荧光报告基团互不相同。
本发明的第三方面，提供了一种用于检测新型冠状病毒及其D614G突变株的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对集。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针集。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括选自下组的一种或多重成分：热启动Taq抗体酶、Taq酶、逆转录酶、UDG酶、dNTPs。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括阴性质控品。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括阳性质控品。
在另一优选例中，使用所述试剂盒过程中，配置RT-PCR反应体系中SEQ ID NO.:1和SEQ ID NO.:2所示引物浓度为10pmol，SEQ ID NO.:3所示探针的浓度为5pmol。
在另一优选例中，使用所述试剂盒过程中，配置RT-PCR反应体系中SEQ ID NO.:4和SEQ ID NO.:5所示引物浓度为8pmol，SEQ ID NO.:6所示探针的浓度为3pmol。
在另一优选例中，使用所述试剂盒过程中，配置RT-PCR反应体系中SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8所示引物浓度为8pmol，SEQ ID NO.:9所示探针的浓度为4pmol。
本发明的第四方面，提供了一种检测新型冠状病毒及其D614G突变株的方法，所述方法包括步骤：
(1)提供待检测对象的核酸样本；
(2)制备RT-PCR反应体系并进行RT-PCR检测：
其中，所述RT-PCR反应体系包括：步骤(1)提供的所述核酸样本、本发明第一方面所述的引物对集、和本发明第二方面所述的探针集。
在另一优选例中，所述核酸样本可来自咽拭子样本、肺泡灌洗液样本、血液样本、痰液样本、粪便样本或环境样本。
在另一优选例中，所述方法为非诊断目的的检测方法。
在另一优选例中，所述PCR反应体系还包括阳性质控品，和/或阴性质控品。
在另一优选例中，所述PCR反应体系还包括PCR反应酶系。
在另一优选例中，步骤(2)中，配置RT-PCR反应体系中SEQ ID NO.:1和SEQ IDNO.:2所示引物浓度为10pmol，SEQ ID NO.:3所示探针的浓度为5pmol。
在另一优选例中，步骤(2)中，配置RT-PCR反应体系中SEQ ID NO.:4和SEQ IDNO.:5所示引物浓度为8pmol，SEQ ID NO.:6所示探针的浓度为3pmol。
在另一优选例中，步骤(2)中，配置RT-PCR反应体系中SEQ ID NO.:7和SEQ IDNO.:8所示引物浓度为8pmol，SEQ ID NO.:9所示探针的浓度为4pmol。
本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的引物对集、和/或本发明第二方面所述的探针集的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测新型冠状病毒及其D614G突变株。
在另一优选例中，所述PCR为RT-PCR。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1、图2、图3、图4显示了不同浓度的引物和探针对荧光PCR反应的影响；
图5显示了灵敏度检测结果；
图6显示了特异性检测结果；
图7显示了重复性检测结果；
图8显示了临床样本典型检测结果；
图9显示了使用D614G-F1和D614G-R1的引物探针组合检测结果；
图10、图11、图12显示了使用D614G-F3和D614G-R3的引物探针组合检测结果。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，针对新型冠状病毒及其D614G突变株开发了检测的方法和试剂盒。本发明经过多轮筛选验证，从大量引物探针集合中获得了灵敏度高、特异性强、重复性好、抗干扰能力强，并且能够进行多重检测的引物探针集合，可以用于检测新型冠状病毒并鉴定D614G突变株。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。
影响多重PCR反应的因素有很多，比如：
(1)反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是DNA聚合酶的良好抑制剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。
(2)引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。
(3)最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行PCR反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。
(4)引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方DNA介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。
虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。
本发明的有益效果在于：
(1)使用本发明的试剂盒及检测方法，可以用于同时检测新型冠状病毒并鉴定D614G突变株。
(2)本发明的检测试剂盒，检测新型冠状病毒的灵敏度高、特异性强。
(3)本发明经过多轮筛选验证，从大量引物探针集合中获得了抗干扰能力强的引物探针组合，并且能够进行多重检测，能够显著减低漏检风险。
本发明适用于对新型冠状病毒的检测，为病毒鉴定分型和防控提供可靠的依据，值得推广应用。另外，本发明的方法同样适用于非诊断的目的，例如，在疫情防控过程中，使用本发明的检测方法对环境中的病毒核酸进行检测，这些病毒核酸信息可以作为公众健康管理之需。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1试剂盒及检测方法
引物和探针的设计：根据新型冠状病毒的序列，分析基因组的保守区域。在这些保守区域中设计出针对2019新型冠状病毒N基因和S蛋白中D614G突变检测的特异性引物和探针序列。
另外为了对标本采集、核酸提取过程及PCR扩增过程进行监控，选取人类基因组DNA中核糖核酸酶P(RPP30)设计内标引物和探针。
在上述引物、探针的设计过程中，尽量避免发卡结构、引物内部二聚体、引物间二聚体以及错配的形成。此外，通过对NCBI Blast在线数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)对上述设计的新型冠状病毒特异性引物和探针序列进行比对分析避免与其他病毒或人类基因发生非特异结合。通过多轮筛选和优化，最终确定了一套灵敏度和特异性最优的引物、探针序列。
引物探针序列：
序列名称 序列 SEQ ID NO.:
NCOV-N4-F ACCCCAAAATCAGCGAAA 1
NCOV-N4-R GCCGACGTTGTTTTGATC 2
NCOV-N4-P CATTACGTTTGGTGGACCCTCAGAT 3
D614G-F2 GTTGCTGTTCTTTATCAGGGTG 4
D614G-R2 TGTTGACATGTTCAGCCCCTA 5
D614G-P2 ACTCCTACTTGGCGTGTTTATTC 6
P30-F TTTGTTGCTCAGGCTGGAGTAC 7
P30-R GCTGAAGCGGGAGGATCACT 8
P30-P CACAGCTCACTGCAACCTCAATCCTG 9
其中，NCOV-N4-P的5’端荧光基团为FAM，3’端猝灭基团为BHQ1；D614G-P2的5’端荧光基团为TEXAS RED，3’端猝灭基团为BHQ2；P30-P的5’端荧光基团为CY5，3’端猝灭基团为BHQ2。
检验方法及体系的建立
采用的Taqman探针检测新型冠状病毒RNA的原理是：
先利用加入的引物序列NCOV-N4-F与NCOV-N4-R、D614G-F2与D614G-R2分别作为逆转录引物将提取出的新型冠状病毒2019-nCoV和D614G突变型病毒RNA逆转录为带有锚定序列的cDNA，然后再利用NCOV-N4-F与NCOV-N4-R、D614G-F2与D614G-R2分别作为实时荧光PCR检测的正向和反向引物进行扩增。本方法为一步扩增法，即将病毒RNA逆转录为cDNA与DNA扩增两个步骤结合在一起，无需换管进行操作。
为了确定引物和探针的检测体系，分别尝试了不同浓度的引物和探针对荧光PCR反应的影响。
当NCOV-N4-F、NCOV-N4-R引物浓度为10pmol，NCOV-N4-P探针的浓度为5pmol，D614G-F2、D614G-R2引物浓度为10pmol，D614G-P2探针的浓度为5pmol，P30-F、P30-R引物浓度为10pmol，P30-P探针的浓度为5pmol时的扩增曲线如图1所示。
当NCOV-N4-F、NCOV-N4-R引物浓度为10pmol，NCOV-N4-P探针的浓度为5pmol，D614G-F2、D614G-R2引物浓度为8pmol，D614G-P2探针的浓度为4pmol，P30-F、P30-R引物浓度为8pmol，P30-P探针的浓度为3pmol，扩增曲线如图2所示。
当NCOV-N4-F、NCOV-N4-R引物浓度为10pmol，NCOV-N4-P探针的浓度为5pmol，D614G-F2、D614G-R2引物浓度为8pmol，D614G-P2探针的浓度为4pmol，P30-F、P30-R引物浓度为6pmol，P30-P探针的浓度为3pmol，扩增曲线如图3所示。
当NCOV-N4-F、NCOV-N4-R引物浓度为10pmol，NCOV-N4-P探针的浓度为5pmol，D614G-F2、D614G-R2引物浓度为8pmol，D614G-P2探针的浓度为3pmol，P30-F、P30-R引物浓度为8pmol，P30-P探针的浓度为4pmol，扩增曲线如图4所示。
结果显示，当NCOV-N4-F、NCOV-N4-R引物浓度为10pmol，NCOV-N4-P探针的浓度为5pmol，D614G-F2、D614G-R2引物浓度为8pmol，D614G-P2探针的浓度为3pmol，P30-F、P30-R引物浓度为8pmol，P30-P探针的浓度为4pmol，扩增曲线最好(图4)。
最终确定的反应体系(25μL)如下：
其中RT-PCR反应酶系由热启动Taq抗体酶、Taq酶、逆转录酶、UDG酶、dNTPs组成。逆转录酶可选择mMLV等常用逆转录酶。热启动Taq抗体酶、Taq酶、逆转录酶、UDG酶、dNTPs均可采用市售产品，如Qiagen公司的产品,其中每人份RT-PCR反应体系中热启动Taq抗体酶的用量为3U，Taq酶用量为3U，逆转录酶用量为3U，UDG酶用量为1U，dNTPs用量为10mmol。
通过对不同退火温度进行测试，最终确定在ABI7500荧光PCR仪上的反应程序为：50℃2分钟，1个循环；95℃2分钟，1个循环；95℃5秒→60℃35秒(收集荧光)，45个循环。
实施例2灵敏度的检测
将目的片段连接到构建好的pET28a-MS2载体中并转化表达宿主菌BL21感受态细胞，挑取单克隆并测序验证后进行诱导表达,将破碎完全的表达产物以RNaseA和DNaseⅠ消化处理后即为含有目的片段的病毒样颗粒。将测定浓度后的假病毒稀释到合适浓度后再进行10倍倍比稀释，浓度分别为1.00E+07、1.00E+06、1.00E+05、1.00E+04、1.00E+03copies/ml。用上述确定的检测体系和循环参数对上述假病毒进行检测(图5)。结果显示，本发明试剂盒具有较高的灵敏度，可检出1.00E+03copies/ml的样本。
实施例3特异性、重复性检测
将甲型/乙型流感病毒、冠状病毒229E、冠状病毒NL63、冠状病毒OC43、冠状病毒HKU1、呼吸道合胞病毒、腺病毒、肺炎支原体、EB病毒、肺炎衣原体作为特异性样本进行检测(图6)。结果显示，此种检测方法具有较高的特异性。
选取浓度为1.00E+06copies/ml和1.00E+04copies/ml的假病毒进行检测，各重复10次(图7)。结果表明重复性较好。
实施例4临床样本检测
检测样本核酸的提取：
(1)临床待测样本核酸模板提取
采集23例疑似咽拭子临床样本，提取待测样本(提取试剂采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂(粤穗械备20170583号)，得到核酸样本(阳性质控和阴性质控同步参与提取)；取5μL核酸样本配制PCR反应体系，在实时荧光PCR仪中进行扩增反应，荧光通道依次选择FAM、TEXAS RED、CY5，PCR扩增程序如下；
50℃，2min，95℃，2min；1个循环
95℃，5sec，60℃，35sec(收集荧光)；45个循环。
PCR结束后通过不同荧光通道曲线及Ct值判断对应病原体核酸的阴、阳性。
在所检测的23例疑似临床样本中，共检出18例，其中有10例为新型冠状病毒S基因D614G-A野生型核酸阳性临床样本，8例为新型冠状病毒S基因D614G-G突变型核酸阳性临床样本。典型检测结果如图8所示。
测序验证结果表明本发明检测体系检测准确率达到了100％，进一步证明了本发明体系检测的临床检测准确性。
大量临床检测表明，临床样本中存在的干扰物质对检测结果会产生影响，导致检测结果出现波动，灵敏度降低甚至出现假阴性的情况。例如，临床检测普遍使用的咽拭子样本，有时会存在血液污染。需要使用检测试剂对血液污染样本进行检测，验证其抗干扰能力。
在上述检测确认的8例新型冠状病毒S基因D614G-G突变型核酸阳性临床样本中，挑选5例病毒弱阳性样本，然后分别加入5％体积的全血，对照组加入等量的无菌水。将血液组和对照组分别用本发明试剂盒进行检测，各重复10次。结果表明，本发明检测试剂的结果符合率为100％，说明本发明多重检测试剂，具有优异的抗干扰能力。
对比例1
在研究过程中，针对新型冠状病毒N基因核酸序列以及新型冠状病毒D614G突变型核酸序列筛选了数十组PCR引物和探针，经过大量测试，最终获得了灵敏度和特异性能够满足临床检测需求，检测性能稳定，抗干扰能力强，且能够进行多重检测的引物、探针组合。
本发明针对新型冠状病毒2019-nCoV的N基因和S基因D614G突变检测靶标，经过了大量的筛选、组合。例如针对S基因D614G突变，设计的部分典型引物序列如下：
D614G-F1:AGGTTGCTGTTCTTTATCAGGG(SEQ ID NO.:10)
D614G-R1:ACCTGTAGAATAAACACGCCAA(SEQ ID NO.:11)
D614G-P1:CTGCACAGAAGTCCCTGTTGCTATTCA(SEQ ID NO.:12)
D614G-F3:TGTTCTTTTGGTGGTGTCAG(SEQ ID NO.:13)
D614G-R3:GACTTCTGTGCAGTTAACACCC(SEQ ID NO.:14)
D614G-P3:ATAAAGAACAGCAACCTGGT(SEQ ID NO.:15)
具体检测步骤、检测条件、探针序列同以上相同，进行PCR检测测试。
使用D614G-F1和D614G-R1的引物探针组合，检测新型冠状病毒野生型毒株的检测结果如图9所示，检测结果表明该引物对特异性较差，与新型冠状病毒野生型毒株存在交叉反应，容易引起针对突变株的误判。
使用D614G-F3和D614G-F3的引物探针组合检测新型冠状病毒野生型毒株，特异性检测结果如图10所示，结果表明该引物对的特异性较好；检测新型冠状病毒S基因D614G突变株，在单一检测体系中对S基因D614G突变靶核酸的灵敏度较佳，但是在多重检测体系中S基因D614G突变靶低浓度核酸扩增受到明显抑制，且S型曲线不明显，单重和多重体系检测结果如图11和图12所示。表明对照引物对D614G-F3和D614G-F3无法应用于多重检测体系中。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 广州达安基因股份有限公司
<120> 检测新型冠状病毒及其D614G突变株的方法和试剂盒
<130> 020088
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
accccaaaat cagcgaaa 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
gccgacgttg ttttgatc 18
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
cattacgttt ggtggaccct cagat 25
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
gttgctgttc tttatcaggg tg 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
tgttgacatg ttcagcccct a 21
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
actcctactt ggcgtgttta ttc 23
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
tttgttgctc aggctggagt ac 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
gctgaagcgg gaggatcact 20
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
cacagctcac tgcaacctca atcctg 26
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
aggttgctgt tctttatcag gg 22
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
acctgtagaa taaacacgcc aa 22
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
ctgcacagaa gtccctgttg ctattca 27
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
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tgttcttttg gtggtgtcag 20
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
gacttctgtg cagttaacac cc 22
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
ataaagaaca gcaacctggt 20

Claims (7)

1.一种用于检测新型冠状病毒及其D614G突变株的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物对集和探针集；
所述引物对集包括第一引物对、第二引物对和内标引物对，
所述第一引物对包括：如SEQ ID NO.1所示的正向引物和如SEQ ID NO.2所示的反向引物；
所述第二引物对包括：
如SEQ ID NO.4所示的正向引物和如SEQ ID NO.5所示的反向引物；
所述内标引物对包括：
如SEQ ID NO.7所示的正向引物和如SEQ ID NO.8所示的反向引物；
所述探针集包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的第一探针；核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示的第二探针和所述探针集还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的内标探针。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括选自下组的一种或多种成分：热启动Taq抗体酶、Taq酶、逆转录酶、UDG酶、dNTPs。
3. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，使用所述试剂盒过程中，配置RT-PCR反应体系中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示引物浓度为10pmol，SEQ ID NO.3所示探针的浓度为5pmol；和/或
使用所述试剂盒过程中，配置RT-PCR反应体系中SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示引物浓度为8pmol，SEQ ID NO.6所示探针的浓度为3pmol；和/或
使用所述试剂盒过程中，配置RT-PCR反应体系中SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示引物浓度为8pmol，SEQ ID NO.9所示探针的浓度为4pmol。
4.一种非诊断目的的检测新型冠状病毒及其D614G突变株的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
（1）提供待检测对象的核酸样本；
（2）制备RT-PCR反应体系并进行RT-PCR检测：
其中，所述RT-PCR反应体系包括：步骤（1）提供的所述核酸样本、引物对集、和探针集；
所述引物对集包括第一引物对、第二引物对和内标引物对，
所述第一引物对包括：如SEQ ID NO.1所示的正向引物和如SEQ ID NO.2所示的反向引物；
所述第二引物对包括：
如SEQ ID NO.4所示的正向引物和如SEQ ID NO.5所示的反向引物；
所述内标引物对包括：
如SEQ ID NO.7所示的正向引物和如SEQ ID NO.8所示的反向引物；
所述探针集包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的第一探针；核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示的第二探针和所述探针集还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的内标探针。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述核酸样本为环境样本。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，配置RT-PCR反应体系中SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示引物浓度为10pmol，SEQ ID NO.3所示探针的浓度为5pmol；和/或
步骤（2）中，配置RT-PCR反应体系中SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示引物浓度为8pmol，SEQ ID NO.6所示探针的浓度为3pmol；和/或
步骤（2）中，配置RT-PCR反应体系中SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示引物浓度为8pmol，SEQ ID NO.9所示探针的浓度为4pmol。
7.引物对集和探针集的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测新型冠状病毒及其D614G突变株；
所述引物对集包括第一引物对、第二引物对和内标引物对，
所述第一引物对包括：如SEQ ID NO.1所示的正向引物和如SEQ ID NO.2所示的反向引物；
所述第二引物对包括：
如SEQ ID NO.4所示的正向引物和如SEQ ID NO.5所示的反向引物；
所述内标引物对包括：
如SEQ ID NO.7所示的正向引物和如SEQ ID NO.8所示的反向引物；
所述探针集包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的第一探针；核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示的第二探针和所述探针集还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的内标探针。
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