CN111020064B

CN111020064B - 新型冠状病毒ORF1ab基因核酸检测试剂盒

Info

Publication number: CN111020064B
Application number: CN202010160162.7A
Authority: CN
Inventors: 蒋析文; 彭海龙; 范建
Original assignee: Daan Gene Co Ltd of Sun Yat Sen University
Current assignee: Guangzhou Da'an gene Co.,Ltd.
Priority date: 2020-03-10
Filing date: 2020-03-10
Publication date: 2020-06-23
Anticipated expiration: 2040-03-10
Also published as: CN111020064A

Abstract

本发明提供了新型冠状病毒ORF1ab基因核酸检测试剂盒，具体的地，本发明公开了一种检测新型冠状病毒的ORF1ab基因的试剂盒及方法，具有极高的灵敏度和特异性。

Description

新型冠状病毒ORF1ab基因核酸检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术和分子诊断领域，具体地说，本发明涉及新型冠状病毒ORF1ab基因核酸检测试剂盒。

背景技术

2019年12月以来，陆续发现了多例不明原因肺炎病例，现已证实为一种新型冠状病毒感染引起的急性呼吸道传染病。基于目前的流行病学调查，潜伏期一般为3-7天，最长不超过14天。此次疫情临床表现以发热、乏力、干咳为主要表现。少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等症状。部分患者仅表现为低热、轻微乏力等，无肺炎表现，多在1周后恢复。世界卫生组织将本次引起病毒性肺炎病例的病原体命名为2019新型冠状病毒，即“2019-nCoV”。

新型冠状病毒（2019-nCoV）属于β属的新型冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm，是目前已知的可以感染人的第7种冠状病毒，其余6种冠状病毒分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。其中前4种在人群中较为常见，致病性较低，一般仅引起类似普通感冒的轻微呼吸道症状；另外2种是SARS冠状病毒和MERS冠状病毒（中东呼吸综合症冠状病毒）。

目前传统的分离培养法培养检测2019新型冠状病毒耗时长、成本高，未能形成快速、完整的2019新型冠状病毒检测体系。

因此，针对新型冠状病毒（2019-nCoV）有必要开发快速、灵敏、使用便捷的检测体系，以满足临床需要。

发明内容

本发明针对新型冠状病毒基因组ORF1ab基因开发了新型冠状病毒诊断体系，能够高效率、高特异性、低成本的对新型冠状病毒2019-nCoV感染患者进行检测。

在本发明的第一方面，提供了一种用于检测新型冠状病毒核酸的引物对集，所述引物对集包括：

第一引物对组，所述第一引物对组包括：

如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.2所示的反向引物。

在另一优选例中，所述引物对集还包括：

内标引物对组，所述内标引物对组包括：

如SEQ ID NO.4所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.5所示的反向引物。

本发明的第二方面，提供了一种多重检测新型冠状病毒核酸的探针组，所述探针组包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的第一探针。

在另一优选例中，所述探针组还包括核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的内控探针。

在另一优选例中，各探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，各探针的3’端包含有荧光淬灭基团。

在另一优选例中，各探针标记的荧光报告基团互不相同。

本发明的第三方面，提供了一种用于多重检测新型冠状病毒核酸的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对集。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针组。

在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含SEQ ID NO.1-6所示的多核苷酸序列；优选地所述引物探针混合液由PCR缓冲液配制。

在另一优选例中，所述第一容器内还包含dNTPs。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器内包含PCR酶系，所述PCR酶系包括热启动酶、和逆转录酶；优选地，所述第二容器内还包括RNA酶抑制剂。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含阳性对照品，所述阳性对照品包含具有ORF1ab基因片段的假病毒；优选地，所述第三容器内还包含具有内标核酸片段的假病毒。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含阴性对照品；优选地，所述阴性对照品为生理盐水。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括第五容器，所述第五容器内包含内标；优选地，所述内标为含内标核酸片段的假病毒。

本发明的第四方面，提供了一种多重检测新型冠状病毒核酸的方法，所述方法包括步骤：

（1）提供待检测对象的核酸样本；

（2）制备PCR反应体系并进行PCR检测：

其中，所述PCR反应体系包括：步骤（1）提供的所述核酸样本、本发明第一方面所述的引物对集、和本发明第二方面所述的探针组。

在另一优选例中，所述核酸样本可来自咽拭子样本、肺泡灌洗液样本、血液样本、痰液样本、粪便样本或环境样本。

在另一优选例中，所述方法为非诊断目的的检测方法。

在另一优选例中，所述PCR反应体系还包括阳性对照品，和/或阴性对照品。

在另一优选例中，所述PCR反应体系还包括PCR酶系。

本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的引物对集、和/或本发明第二方面所述的探针组的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1：显示了不同浓度梯度FAM通道检测结果；

图2：FAM通道重复性检测结果；

图3：VIC通道重复性检测结果；

图4：典型临床样本检测结果；

图5：对照引物组对ORF1ab-F2、ORF1ab-R2和ORF1ab-P2检测结果；

图6：对照引物组对ORF1ab-F3、ORF1ab-R3和ORF1ab-P3单重检测结果；

图7：对照引物组对ORF1ab-F3、ORF1ab-R3和ORF1ab-P3双重检测结果；

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的试剂盒及方法，采用ORF1ab基因特异引物和Taqman探针，结合特异的内标引物、探针体系监控样本提取、检测过程，实现对新冠状病毒（2019-nCoV）ORF1ab基因的检测，具有特异性强、灵敏度高、准确性高、快速简便等多种优点，可用于科研和临床应用检测，包括对新型冠状病毒的流程病学研究等方面。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101 和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

多重PCR

多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。

影响多重PCR反应的因素有很多，比如：

（1）反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是DNA聚合酶的良好抑制剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。

（2）引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。

（3）最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行PCR反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。

（4）引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方DNA介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。

虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。

本发明提供的检测新型冠状病毒的ORF1ab基因的检测试剂盒，本试剂盒同时包括内源性内标检测系统，用于对标本采集、核酸提取过程及PCR扩增过程的监控，可减少假阴性结果的出现。本试剂盒为双重荧光检测试剂盒，具有敏度高、特异性强、重复性好等特点。

本发明提供一种特异性检测样品中ORF1ab基因的引物序列为：

SEQ ID NO.1：TTAAGCGGACACAATCTTGCT和SEQ ID NO.2:GTTGAATGTCTTCACCTTTGTTAA，

对应的检测探针的序列为SEQ ID NO.3: CACTGTCTTCATGTTGTCGGCCCAAA。

在一个实施例中，所述试剂盒还包括内标质控及扩增引物和检测探针；内标质控扩增引物序列分别为：

SEQ ID NO.4:TCTGTATTGTTTCCTTCATCGTATT和SEQ ID NO.5:ATGATGCACCTTTCAGAACGTA，

对应的检测探针的序列为SEQ ID NO.6： TGTGCACTTACTGCCTCACTTAACGACAGG。

内标既可监测样本采集，也可监测样本提取过程，防止样本核酸提取失败导致假阴性。

在本发明的一个优选地实施方式中，内标片段的核酸序列如下：

TCTGTATTGTTTCCTTCATCGTATTTACAACAGACAGATACTGTGCACTTACTGCCTCACTTAACGACAGGGATACGTTCTGAAAGGTGCATCAT（SEQ ID NO.:7）

在其中一个实施例中，所述试剂盒包括含ORF1ab基因片段的阳性对照，以及阴性对照（灭菌生理盐水）。

在本发明的一个优选地实施方式中，阳性对照中ORF1ab基因片段的核酸序列如下：

TTAAGCGGACACAATCTTGCTAAACACTGTCTTCATGTTGTCGGCCCAAATGTTAACAAAGGTGAAGACATTCAAC（SEQ ID NO.:8）。

在其中一个实施例中，所述试剂盒包括：

PCR反应液，包括： ORF1ab基因和内标基因的引物、探针，dNTPs（dATP:dCTP:dGTP:dTTP=1:1:1:1）及PCR缓冲液；

PCR酶系，包括：热启动Hot.Taq酶和c-MMLV酶。

优选地，引物和探针的浓度为0.1-1μM，dNTPs浓度为0.2-0.4mM，MgCl₂浓度为2-5mM,c-MMLV酶为1-3U，热启动Hot.taq为2.5-10U。

因此，本发明的一个优选的实施方式中，本发明提供了一种用于检测新型冠状病毒核酸的试剂盒，所述试剂盒包括引物对集和探针组；

其中，所述引物对集包括第一引物对和内标引物对，

所述第一引物对包括：

如SEQ ID NO.1所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.2所示的反向引物，

所述内标引物对包括：

如SEQ ID NO.4所示的正向引物；和，如SEQ ID NO.5所示的反向引物；

所述探针组包括：

核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的第一探针，和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的内控探针。

本发明还提供了一种ORF1ab基因检试剂盒的使用方法，包括如下步骤：提取待测样本(提取试剂采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（货号：DA0623），得到核酸样本（阳性质控和阴性质控同步参与提取）；取5μL加入到上述PCR反应液（17μL）和酶系混合物(3μL)中，在实时荧光PCR仪中进行扩增反应，荧光通道依次选择VIC、FAM、和Cy5,PCR扩增程序如下；

50℃，15min，95℃，15min；1个循环

94℃，15sec，55℃，45sec（搜集荧光）；45个循环。

PCR结束后通过不同荧光通道曲线及Ct值判断新型冠状病毒核酸阴、阳性，检测结果可用于新型冠状病毒感染的辅助诊断以及药物疗效的观察，为研究提供可靠的依据。

本发明中新型冠状病毒2019-nCoV的基因序列参见GISAID：BetaCov/Wuhan/WH01/2019|EPI_ISL_406798；关于其ORF1ab基因的寡核苷酸序列信息可参考文献（Roujian Lu,Xiang Zhao, Juan Li,et.al,Genomic characterisation and epidemiology of 2019novel coronavirus: implications for virus origins and receptorbinding.Lancet. 2020 Jan 30）。

本试剂盒组成详见表1和表2，可检测新型冠状病毒2019-nCoV的ORF1ab靶标基因。

表1 试剂盒组成

组成	主要组分
		PCR反应液	特异性引物和荧光探针（SEQ ID NO.:1-6）、dNTPs、PCR缓冲液
PCR酶系	热启动Hot.Taq酶、逆转录酶C-MMLV、RNA酶抑制剂
		阳性对照品	含ORF1ab基因片段假病毒
阴性对照品	生理盐水
		内标	含内标片段的假病毒

试剂盒所需引物、探针序列如表2：

表2 引物、探针及序列号

引物探针名称	引物/探针序列	SEQ ID NO.
			ORF1abF	TTAAGCGGACACAATCTTGCT	1
ORF1abR	GTTGAATGTCTTCACCTTTGTTAA	2
			ORF1ab Probe	FAM-CACTGTCTTCATGTTGTCGGCCCAAA-BHQ1	3
内标ICF	TGAGGGAGTGCAACGTTATT	4
			内标ICR	ATCGGTTTTGGCTGCATA	5
内标IC Probe	VIC-TCGCTCAAGGGAGAAAGGTCC-BHQ1	6

优选地，所述荧光基团选自下组：FAM、VIC、HEX、NED、ROX、TET、JOE、TAMRA、CY3、CY5。

优选地，所述淬灭基因选自下组：MGB、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3。

本发明的引物设计中，对特异性引物及探针经大量试验筛选，并对其进行组合、优化、验证，最终优选出组合后不会互相干扰、扩增效率高、特异性好的多重检测最优引探组合。

本发明所述试剂盒用于判定检测有效标准为：

每次检测均同时检测阴性质控品、阳性质控品，当检测结果的阳性质控品为阳性，且阴性质控品为阴性时，表明实验结果有效。

本发明所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：

（1）提取检测样本中的总核酸，获得核酸样本。

（2）将所述核酸样本与PCR反应液、PCR酶系混合，制得PCR反应体系。

（3）实时荧光PCR反应，程序如下：

第一阶段：50 ℃ 2-15 min，95 ℃ 10-15 min，1个循环；

第二阶段：94 ℃ 10-15 s，55-60 ℃ 45 s，45个循环。

PCR结束后通过不同荧光通道曲线及Ct值判断对应病原体核酸的阴、阳性给出检测结果。

本发明的有益效果在于：

本发明通过针对性检测新型冠状病毒2019-nCoV的ORF1ab基因核酸靶标，能够高效率、高特异性、高灵敏度、低成本的对新型冠状病毒2019-nCoV感染患者进行检测，显著提高了病毒鉴定的准确性。

本发明适用于对新型冠状病毒2019-nCoV核酸的检测，为病毒鉴定和防控提供可靠的依据，值得推广应用。另外，本发明的方法同样适用于非诊断的目的，例如，在疫情防控过程中，使用本发明的检测方法对环境中的病毒核酸进行检测，这些病毒核酸信息可以作为公众健康管理之需。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook. J等著《分子克隆实验室指南》（黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例 1 新型冠状病毒ORF1ab基因检测试剂盒

该试剂盒由PCR反应液、PCR酶系、内标、阳性对照品、阴性对照品和DEPC水构成，其中PCR反应液由5×RT-PCR Buffer、引物和探针、dNTPs组成；PCR酶系由逆转录酶、RNA酶抑制剂、热启动DNA聚合酶和酶稀释液构成；阳性对照品由含ORF1ab靶标序列的假病毒制备而成，阴性对照品为生理盐水，内标为含内标靶序列的假病毒制备而成。

所述引物在扩增体系中的终浓度为800nM，探针终浓度为200nM。

该试剂盒的反应体系为25μL，具体如下：PCR酶系3μL，PCR反应液17μL，核酸模板2-5μL，补DEPC水至25μL。

实施例2 试剂盒的操作和结果判定

（1）病毒基因组DNA的提取

采用中山大学达安基因股份有限公司的核酸提取或纯化试剂（货号：DA0623）在样本处理区按照说明书操作步骤提取核酸。提取前每例样本按50：1的比例加入内标进行提取。阴性对照品和阳性对照品均参与提取，作为对环境和PCR检测试剂的质控。

（2）反应体系的配制

采用实施例1的试剂盒进行以下实验，待试剂盒PCR反应液在室温条件下完全溶解后，快速震荡混匀，25μL PCR反应体系为：PCR反应液17μL，酶系3μL，模板5μL。

（3）PCR扩增

将PCR 管放入荧光PCR 仪（ABI7500）中，按照如下要求设定PCR反应程序：

程序1，50℃、15min、1次循环；

程序2，95℃、15min、1次循环；

程序3，94℃、15s，55℃、45s（收集荧光），45次循环。

（4）质量控制

本试剂盒的结果判读如下；

阴性对照品： FAM 检测通道无扩增曲线； VIC 检测通道有扩增曲线；

阳性对照品： FAM 检测通道有扩增曲线，且 Ct 值≤35；VIC 检测通道有或无扩增曲线；

以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行

（5）结果判读

（5.1）若检测样品的FAM检测通道无扩增曲线，且该VIC通道有扩增曲线，可判样品为未检测到新型冠状病毒RNA；

（5.2）若检测样品的FAM检测通道有扩增曲线且Ct值≤40，VIC检测通道有或无扩增曲线，可判样品为新型冠状病毒阳性。

实施例3 试剂盒特异性检测

采用实施例1所述的试剂盒对甲型流感H3N2，H7N9，乙型流感Yamagata，呼吸道合胞病毒A型，腺病毒1、3型，肠道病毒A型，人偏肺病毒，EB病毒，人巨细胞病毒，轮状病毒，诺如病毒，肺炎支原体，结核分枝杆菌，冠状病毒（HKU1，OC43，NL63，229E），SARS假病毒，MERS假病毒）和新型冠状病毒（2019-nCoV）进行检测，均无FAM通道荧光的检出；而对新型冠状病毒阳性样本检出为阳性。表明本发明试剂盒特异性好。

实施例4 试剂盒灵敏度检测

将制备的含新型冠状病毒ORF1ab基因靶标序列的假病毒梯度稀释至10⁷copies/ml、10⁶copies/ml、10⁵copies/ml、10⁴copies/ml、10³copies/ml、5×10²copies/ml、10²copies/ml、使用实施例1所述的试剂盒对上述稀释后的模板分别进行扩增，根据实施例2中的结果判定标准进行判定，本发明试剂盒对新型冠状病毒检测灵敏度结果如表2所示：

表2 新型冠状病毒检测灵敏度结果

107copies/ml

106copies/ml

105copies/ml

104copies/ml

103copies/ml

5×102copies/m

102copies/ml

重复1

+

-

重复2

+

-

+：新型冠状病毒阳性

- ：未检出新型冠状病毒RNA

图1显示了不同浓度梯度FAM通道检测结果。

从表2和图1可见，在浓度低至5×10²copies/ml时，实施例1所述试剂盒仍能检出。因此，在低浓度模板时，本发明所述试剂仍能检出，因而具有很高的灵敏度。

实施例5 试剂盒重复性检测

将制备的含新型冠状病毒ORF1ab靶标序列的假病毒稀释至5×10⁵copies/ml、5×10³copies/m浓度，使用实施例1所述的试剂盒对上述稀释后的假病毒分别进行扩增，每个浓度梯度重复检测10次。根据实施例2中的结果判定标准进行判定，本发明试剂盒对新型冠状病毒检测重复性结果如图2、图3所示。

图2 FAM通道重复性检测结果。

图3 VIC通道重复性检测结果。

从图2和图3可见，在中、低浓度时，实施例1所述试剂盒检测重复性好。

实施例6 临床样本检测

检测样本核酸的提取：

（1）临床待测样本核酸模板提取

采集22例疑似咽拭子临床样本，提取待测样本(提取试剂采用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（货号：DA0623），得到核酸样本（阳性质控和阴性质控同步参与提取）；取5μL核酸样本配制PCR反应体系，在实时荧光PCR仪中进行扩增反应，荧光通道依次选择VIC、FAM,PCR扩增程序如下；

50℃，15min，95℃，15min；1个循环

94℃，15sec，55℃，45sec（收集荧光）；45个循环。

PCR结束后通过不同荧光通道曲线及Ct值判断对应病原体核酸的阴、阳性。

在所检测的22例疑似临床样本中，共检出6例新型冠状病毒2019-nCoV核酸阳性临床样本。典型检测结果如图4所示。

测序验证结果表明本发明检测体系检测准确率达到了100%，进一步证明了本发明体系检测的临床检测准确性。

对比例1

本发明人在研究过程中，针对新型冠状病毒2019-nCoV目标核酸序列筛选了数十组PCR引物和探针，经过大量测试，最终获得了灵敏度和特异性能够满足临床检测需求，且能够进行多重检测的引物、探针组合。

针对新型冠状病毒2019-nCoV的ORF1ab基因检测靶标，本发明人经过了大量的筛选、组合。设计的部分典型引物序列如下：

对照上游引物ORF1ab-F2：CTGCTCGTGTTGTACGATCAA（SEQ ID NO.9）

对照下游引物ORF1ab-R2：TTGTTATAGCGGCCTTCTGTAA（SEQ ID NO.10）

对照探针ORF1ab-P2：TTTCTCCCGCACTCTTGAAACTGCTCA（SEQ ID NO.11）

对照上游引物ORF1ab-F3：AATACTGAGTCCTCTTTATGCATTTG（SEQ ID NO.12）

对照下游引物ORF1ab-R3：GCACAGAATTTTGAGCAGTTTC（SEQ ID NO.13）

对照探针ORF1ab-P3：TGCTCGTGTTGTACGATCAATTTTCTCCC（SEQ ID NO.14）

具体检测步骤、检测条件、探针序列同以上实施例，进行PCR检测测试。

使用ORF1ab-F2和ORF1ab-R2的检测5例新型冠状病毒(2019-nCoV)阳性样本，只有4例检出阳性。结果如图5所示，检测结果表明该引物对准确性较差。

使用ORF1ab-F3和ORF1ab-R3的检测结果表明该引物对在单一检测体系中对ORF1ab基因靶核酸的特异性和灵敏度较佳，但是在多重检测体系中ORF1ab基因靶低浓度核酸扩增受到明显抑制，单重和多重体系检测结果如图6和图7所示。表明对照引物对ORF1ab-F3和ORF1ab-R3无法应用于多重检测体系中。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中山大学达安基因股份有限公司

<120> 新型冠状病毒ORF1ab基因核酸检测试剂盒

<130> 000059

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

ttaagcggac acaatcttgc t 21

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

gttgaatgtc ttcacctttg ttaa 24

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

cactgtcttc atgttgtcgg cccaaa 26

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

tctgtattgt ttccttcatc gtatt 25

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

atgatgcacc tttcagaacg ta 22

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

tgtgcactta ctgcctcact taacgacagg 30

<210> 7

<211> 95

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

tctgtattgt ttccttcatc gtatttacaa cagacagata ctgtgcactt actgcctcac 60

ttaacgacag ggatacgttc tgaaaggtgc atcat 95

<210> 8

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

ttaagcggac acaatcttgc taaacactgt cttcatgttg tcggcccaaa tgttaacaaa 60

ggtgaagaca ttcaac 76

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

ctgctcgtgt tgtacgatca a 21

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

ttgttatagc ggccttctgt aa 22

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

tttctcccgc actcttgaaa ctgctca 27

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

aatactgagt cctctttatg catttg 26

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

gcacagaatt ttgagcagtt tc 22

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

tgctcgtgtt gtacgatcaa ttttctccc 29

Claims

1.一种用于检测新型冠状病毒核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物对集和探针组；

其中，所述引物对集包括第一引物对和内标引物对，

所述第一引物对包括：

所述内标引物对包括：

所述探针组包括：

核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的第一探针，和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的内控探针；

并且，所述第一探针的5’端包含有荧光报告基团，所述第一探针的3’端包含有荧光淬灭基团；所述内控探针的5’端包含有荧光报告基团，所述内控探针的3’端包含有荧光淬灭基团；所述第一探针的5’端荧光报告基团和所述内控探针的5’端荧光报告基团不同。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含所述引物对集和所述探针组。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器内包含PCR酶系，所述PCR酶系包括热启动Taq酶和逆转录酶。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述第二容器内还包含RNA酶抑制剂。

5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含阳性对照品，所述阳性对照品包含具有ORF1ab基因片段的假病毒。

6.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含阴性对照品。

7.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第五容器，所述第五容器内包含内标；所述内标为含内标核酸片段的假病毒。

8.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述第一容器内还包括dNTPs。

9.一种非诊断目的的多重检测新型冠状病毒核酸的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

（1）提供待检测对象的核酸样本；

（2）制备PCR反应体系并进行PCR检测：

其中，所述PCR反应体系包括：步骤（1）提供的所述核酸样本、引物对集和探针组；

所述引物对集包括第一引物对和内标引物对，

所述第一引物对包括：

如SEQ ID NO.1所示的正向引物和如SEQ ID NO.2所示的反向引物，

所述内标引物对包括：

如SEQ ID NO.4所示的正向引物和如SEQ ID NO.5所示的反向引物；

所述探针组包括：

核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的第一探针和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的内控探针；

10.权利要求9所述的方法，其特征在于，所述核酸样本来自环境样本。