CN111500771B

CN111500771B - 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的引物组和试剂盒

Info

Publication number: CN111500771B
Application number: CN202010313543.4A
Authority: CN
Inventors: 张子龙; 田桢干; 张威; 李深伟; 张晓航; 杜鹃; 张宏; 陆晔
Original assignee: Shanghai International Travel Health Care Center Shanghai Customs Port Outpatient Department
Current assignee: Shanghai International Travel Health Care Center Shanghai Customs Port Outpatient Department
Priority date: 2020-04-20
Filing date: 2020-04-20
Publication date: 2021-03-23
Anticipated expiration: 2040-04-20
Also published as: CN111500771A

Abstract

本发明提供了一种新型冠状病毒SARS‑CoV‑2检测的引物组和试剂盒，属于病毒检测技术领域，所述引物组包括针对orf1a/b片段的引物组和/或针对S基因的引物组；所述针对orf1a/b片段的引物组包括F3‑inside、B3‑inside、FIP‑inside、BIP‑inside、LF‑inside和crRNA‑inside‑R；所述针对S基因的引物组包括S gene‑F3、S gene‑B3、S gene‑FIP、S gene‑BIP、S gene‑LF、S gene‑LB和crRNA‑Sgene‑R；利用本发明所述引物组和试剂盒进行新型冠状病毒检测，耗时短，成本低，检测灵敏度高，特异性好。

Description

一种新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的引物组和试剂盒

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的引物组和试剂盒。

背景技术

对于此次疫情，国家迅速作出响应，展开一系列防控措施。并在发现病原体后与国际社会共享病毒基因序列信息。随后中国疾病预防控制中心公布了用于SARS-CoV-2荧光PCR检测的引物和探针，荧光PCR方法成为了本次疫情感染确诊方法。但是近几日，越来越多的现场检测反应，荧光PCR方法存在检测假阴性的情况。另外，荧光PCR方法由于操作复杂，需要专业的人士进行检测，并且反应时间较长，现场确诊操作不便和确诊时间延迟。

目前的现场快速检测方法主要有胶体金法和等温扩增法。胶体金法检测时间快，操作简单，但是灵敏性和特异性较差。等温扩增法最主要用的是环介导的等温扩增法(LAMP)和重组酶聚合酶等温扩增法(RPA)，LAMP方法灵敏性好，时间短，设备简单，特异性较差，而RPA法的成本较高且专利保护严重，难以在现场大规模应用。

相比于传统的分子诊断技术，这两年刚刚发明的CRISPR诊断(CRISPR-Dx)技术具有快速、灵敏、特异和成本低等优点。例如，该技术在做传染病检测时，从样本采集到出检测结果只需1小时；其检测灵敏度可达阿摩(attomolar)；其特异性很高，可区分单碱基的差异；检测的试剂成本都很低。因此，CRISPR-Dx也在2018年被美国Science杂志誉为“下一代分子诊断技术”。

CRISPR-Dx的优势让其在传染病快检等方向具有非常重要的应用潜力，可应用于医院、海关、CDC以及农业中的动植物、人员检疫等场景。值得一提的是，CRISPR-Dx可与等温扩增技术结合起来，因而不需要复杂的仪器设备；同时，除了报告荧光外，该技术也可以用试纸条来显色，因此使用起来非常简便，也进一步增加了该技术的应用范围，例如各种样本采集现场的快速检测。

针对新型冠状病毒，有文献报道以Cas13酶结合RPA技术的检测思路，但是因Cas13酶具有RNA切割活性，操作复杂，需要的CrRNA设计也更长更复杂，RPA试剂价格昂贵，不适应于市场的广泛推广。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于Cas12酶的新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的引物组和试剂盒；所述引物组和试剂盒，结合LAMP技术与Crispr技术，既保证了LAMP技术的时效性，又增加了Crispr技术的高特异性。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的引物组，包括针对orf1a/b片段的引物组和/或针对S基因的引物组；

所述针对orf1a/b片段的引物组包括F3-inside、B3-inside、FIP-inside、BIP-inside、LF-inside和crRNA-inside-R；所述F3-inside、B3-inside、FIP-inside、BIP-inside、LF-inside和crRNA-inside-R的核苷酸序列依次如SEQ ID No.1～SEQ ID No.6所示；

所述针对S基因的引物组包括S gene-F3、S gene-B3、S gene-FIP、S gene-BIP、Sgene-LF、S gene-LB和crRNA-Sgene-R；所述S gene-F3、S gene-B3、S gene-FIP、S gene-BIP、S gene-LF、S gene-LB和crRNA-Sgene-R的核苷酸序列依次如SEQ ID No.7～SEQ IDNo.13所示。

优选的，所述FIP-inside、BIP-inside、S gene-FIP和S gene-BIP的使用浓度独立为1.5～1.7μmol/L；所述F3-inside、B3-inside、S gene-F3和S gene-B3的使用浓度独立为0.15～0.25μmol/L；所述LF-inside、S gene-LF和S gene-LB的使用浓度独立为0.35～0.45μmol/L。

本发明提供了一种新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的试剂盒，包括所述的引物组。

优选的，所述试剂盒还包括RT-LAMP扩增试剂和Crispr检测试剂。

优选的，所述LAMP扩增试剂包括LAMP Mixture、LAMP dye和dUTP。

优选的，所述T7-crRNA-F的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示。

优选的，所述Crispr检测试剂包括crRNA-inside-R、crRNA-Sgene-R、T7-crRNA-F、Cas12a酶和HEX-N12-BHQ1。

优选的，所述crRNA的使用浓度为8～12μmmol/L。

优选的，所述Cas12a酶的使用浓度为250～500nmol/L。

优选的，所述HEX-N12-BHQ1的使用浓度为8～12μmmol/L。

本发明的有益效果：本发明提供的新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的引物组和试剂盒；将LAMP技术与Crispr技术相结合，既保证了LAMP技术的时效性，又增加了Crispr技术的高特异性；利用本发明所述的试剂盒进行新型冠状病毒检测，耗时短，成本低，设备需求简单，检测灵敏度高，特异性好，能够显著减少假阴性；本发明所述试剂盒检测灵敏度能够达到100copies/反应，与现在通用的荧光PCR方法相比处于同一数量级，但是特异性高于荧光PCR，反应时间比荧光PCR少一半。采用临床样本进行检测，本发明所述的试剂盒检测结果与荧光PCR检测结果相比，准确率达到100％。

附图说明

图1为新型冠状病毒的基因序列与其他近源序列对比结果；

图2为以包括orf1a/b片段的质粒为模板，RT-LAMP灵敏度检测的结果；

图3为以包括S基因的质粒为模板，RT-LAMP灵敏度检测的结果；

图4为以包括orf1a/b片段的质粒及新型冠状病毒能力验证样本、其他病毒样本为模板，RT-LAMP特异性检测的结果；

图5为以包括S基因的质粒及新型冠状病毒能力验证样本、其他病毒样本为模板，RT-LAMP特异性检测的结果。

具体实施方式

所述针对orf1a/b片段的引物组包括F3-inside、B3-inside、FIP-inside、BIP-inside、LF-inside和crRNA-inside-R；所述F3-inside、B3-inside、FIP-inside、BIP-inside、LF-inside和crRNA-inside-R的核苷酸序列依次如SEQ ID No.1～SEQ ID No.6所示；所述针对S基因的引物组包括S gene-F3、S gene-B3、S gene-FIP、S gene-BIP、S gene-LF、S gene-LB和crRNA-Sgene-R；所述S gene-F3、S gene-B3、S gene-FIP、S gene-BIP、Sgene-LF、S gene-LB和crRNA-Sgene-R的核苷酸序列依次如SEQ ID No.7～SEQ ID No.13所示。

在本发明中，所述针对orf1a/b片段的引物组的核苷酸序列具体如表1所示；所述针对S基因的引物组的核苷酸序列具体如表2所示。

表1 针对orf1a/b片段的引物组的核苷酸序列

Name	Sequence(5’-3’)
		F3-inside	ctcaatatgagtatggtactgaag(SEQ ID NO.1)
B3-inside	aaccactaaaactattcacttca(SEQ ID NO.2)
		FIP-inside	tctaaccaatcttcttcttgctctttttggaatttggtgccac(SEQ ID NO.3)
BIP-inside	cggcagtgaggacaatcagacactggtgtaagttccatctc(SEQ ID NO.4)
		LF-inside	ggttgaagagcagcagaa(SEQ ID NO.5)
crRNA-inside-R	taattgaggttgaacctcaaatctacaacagtagaaattccctatagtgagtcgtattaatttc(SEQ ID NO.6)

表2 针对S基因的引物组的核苷酸序列

在本发明中，所述FIP-inside、BIP-inside、S gene-FIP和S gene-BIP的使用浓度独立优选为1.5～1.7μmol/L，更优选为1.6μmol/L；所述F3-inside、B3-inside、S gene-F3和S gene-B3的使用浓度独立优选为0.15～0.25μmol/L，更优选为0.2μmol/L；所述LF-inside、S gene-LF和S gene-LB的使用浓度独立优选为0.35～0.45μmol/L，更优选为0.4μmol/L。

在本发明中，上述引物组用于对待检样品进行LAMP等温扩增。

本发明还提供了一种新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的试剂盒，包括所述的引物组。

在本发明中，所述试剂盒优选的还包括RT-LAMP扩增试剂和Crispr检测试剂。

在本发明中，所述LAMP扩增试剂优选的包括LAMP Mixture、LAMP dye和dUTP。在本发明中，所述LAMP扩增试剂优选的采用NEB的等温扩增试剂盒WarmStart LAMP Kit(DNA&RNA)；在本发明中，所述LAMP扩增试剂也可以采用其他等效的RT-LAMP等温扩增试剂盒中的试剂。

在本发明中，RT-LAMP扩增体系优选的包括表3所示的组分。其中Primer MIX包括针对orf1a/b片段的引物组中的FIP-inside、BIP-inside、F3-inside、B3-inside和LF-inside；或者包括针对S基因引物组中的S gene-FIP、S gene-BIP、S gene-F3、S gene-B3、Sgene-LF和S gene-LB。

表3 RT-LAMP扩增体系

在本发明中，所述试剂盒还包括退火Buffer、T7-crRNA-F和crRNA-inside-R(或者crRNA-Sgene-R)用于退火。在本发明中，所述T7-crRNA-F的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示，具体如下：5’-gaaattaatacgactcactataggg-3’。

在本发明中，所述试剂盒还包括转录试剂，所述转录试剂采用本领域常规的反转录试剂即可；优选的包括反转录Buffer、NTP mixture、T7 RNA聚合酶和RRI。

在本发明中，所述Crispr检测试剂优选的包括NEBuffer 3、crRNA-inside-R、crRNA-Sgene-R、T7-crRNA-F、Cas12a酶和HEX-N12-BHQ1。在本发明中，所述crRNA的使用浓度优选为8～12μmmol/L，更优选为10μmmol/L；所述Cas12a酶的使用浓度优选为250～500nmol/L；所述HEX-N12-BHQ1的使用浓度优选为8～12μmmol/L，更优选为10μmmol/L。在本发明中，所述Cas12a酶优选的购自上海吐露港生物科技有限公司。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.检测新型冠状病毒的目标基因序列确定

比对了来自武汉的冠状病毒株、中华菊头蝠的bat-SL-CoVZC45、Rs4231、其他4株同源性最近的SARS病毒序列、2003年的人SARS流行株序列、果子狸分离序列、常见的4种人冠状病毒序列(229E、HKU1、NL63、OC43)等，结果如图1所示，选取新型冠状病毒orf1a/b的片段和S基因作为检测的目标基因。

新型冠状病毒orf1a/b片段的核苷酸序列如SEQ ID No.15所示，具体如下：

AAGTAAATGAGTTCGCCTGTGTTGTGGCAGATGCTGTCATAAAAACTTTGCAACCAGTATCTGAATTACTTACACCACTGGGCATTGATTTAGATGAGTGGAGTATGGCTACATACTACTTATTTGATGAGTCTGGTGAGTTTAAATTGGCTTCACATATGTATTGTTCTTTCTACCCTCCAGATGAGGATGAAGAAGAAGGTGATTGTGAAGAAGAAGAGTTTGAGCCATCAACTCAATATGAGTATGGTACTGAAGATGATTACCAAGGTAAACCTTTGGAATTTGGTGCCACTTCTGCTGCTCTTCAACCTGAAGAAGAGCAAGAAGAAGATTGGTTAGATGATGATAGTCAACAAACTGTTGGTCAACAAGACGGCAGTGAGGACAATCAGACAACTACTATTCAAACAATTGTTGAGGTTCAACCTCAATTAGAGATGGAACTTACACCAGTTGTTCAGACTATTGAAGTGAATAGTTTTAGTGGTTATTTAAAACTTACTGACAATGTATACATTAAAAATGCAGACATTGTGGAAGAAGCTAAAAAGGTAAAACCAACAGTGGTTGTTAATGCAGCCAATGTTTACCTTAAACATGGAGGAGGTGTTGCAGGAGCCTTAAATAAGGCTACTAA

新型冠状病毒S基因核苷酸序列如SEQ ID No.16所示，具体如下：

GTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGG

2.引物设计

通过软件设计引物并进行修正，具体见表1和表2。

表1 针对orf1a/b片段的引物组的核苷酸序列

表2 针对S基因的引物组的核苷酸序列

Name	Sequence(5’-3’)
		S gene-F3	tcagggtttttcggcttta(SEQ ID NO.7)
S gene-B3	tgagagagggtcaagtgc(SEQ ID NO.8)
		S gene-FIP	aatcaccaggagtcaaataacttcttgccaataggtattaacatcac(SEQ ID NO.9)
S gene-BIP	tgctgcagcttattatgtgggttaacagcatctgtaatggttcc(SEQ ID NO.10)
		S gene-LF	agcaagtaaagtttgaaacc(SEQ ID NO.11)
S gene-LB	tcaacctaggacttttctattaaa(SEQ ID NO.12)
		crRNA-Sgene-R	gctgtccaacctgaagaaatctacaacagtagaaattccctatagtgagtcgtattaatttc(SEQ ID NO.13)

3.检测流程

环介导的等温扩增(LAMP)

采用NEB的等温扩增试剂盒WarmStart LAMP Kit(DNA&RNA)(主要成分及用量见下表)，或者其他等效的RT-LAMP等温扩增试剂盒。

扩增体系见表3。

表3 RT-LAMP扩增体系

其中PrimerMIX包括针对orf1a/b片段的FIP-inside、BIP-inside、F3-inside、B3-inside和LF-inside；FIP-inside和BIP-inside的浓度为1.6μmol/L，F3-inside和B3-inside的浓度为0.2μmol/L；LF-inside的浓度为0.4μmol/L。

或者包括针对S基因引物组中的S gene-FIP、S gene-BIP、S gene-F3、S gene-B3、S gene-LF和S gene-LB；S gene-FIP和S gene-BIP的浓度为1.6μmol/L；S gene-F3和Sgene-B3的浓度为0.2μmol/L，S gene-LF和S gene-LB的浓度为0.4μmol/L。

等温扩增程序：采用等温扩增仪或者荧光PCR仪，65℃反应40min获得扩增产物。

CrRNA制备

CrRNA可以由公司进行合成，也可以自行转录，自行转录采用试剂为Thermo公司转录试剂或者其他等效转录试剂。

T7-crRNA-F序列为：5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGG-3’(SEQ ID No.14)；orf1a/b基因的crRNA-orf1a/b-R序列如crRNA-inside-R；S基因的crRNA-S-R序列如crRNA-Sgene-R。

CrRNA的制备包括退火和反转录两个步骤。

其中退火体系如表4。

表4 退火体系组成

退火程序：在95℃初始变性5min，然后从95℃冷却至20℃，使用热循环仪每min降低1℃。

转录体系如表5。

表5 转录体系

试剂	体积
		ddH<sub>2</sub>O	20μl
5×buffer	10μl
		NTPmixture	10μl
模板(退火产物)	2.5μl
		T7RNA聚合酶	5μl
RRI	2.5μl
		总体积	50μl

转录程序：37℃过夜，16～24h。

纯化回收crRNA：纯化方法按RNA Clean&Concentrator^TM-5试剂盒说明书操作。

Crispr检测：

按照下表配置Crispr检测体系，37℃反应10min，每min读取荧光值。

Crispr检测体系如表6。

表6 Crispr检测体系组成

其中，Cas12a酶购买自上海吐露港生物科技有限公司。

四、结果判定

口岸现场快速检测判定

每次实验设置阴性对照管及阳性对照管，阴性对照无扩增曲线而阳性对照有明显扩增曲线则实验结果有效。

阳性：针对单靶标RT-LAMP反应40min后，观察扩增曲线，如有明确S型扩增曲线，且曲线起峰的时间少于30min，则判定为该样本本次检测阳性。

样本整体检测结果的确定参照中国疾病预防控制中心的文件《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》。

基于Crispr技术的实验室检测判定

Crispr检测完成后，比较样本扩增曲线与阴性对照Crispr扩增曲线在10min处的荧光值，如果荧光值差大于等于3则判定为阳性，荧光值差小于3则判定为阴性。

五、检测实例

采用本实施例中的引物组、试剂盒对合成质粒、临床灭活样本、其他动物冠状病毒、100例新型冠状病毒临床样本进行检测。

合成质粒的检测

针对orf1a/b和S基因检测片段，委托苏州金唯智生物科技有限公司公司合成质粒orf1a/b和质粒S，浓度均为10¹⁰copies/μl。

梯度稀释后作为模板进行检测，检测体系见实验方法部分。RT-LAMP检测结果见图2，Crispr检测见表7。

表7 orf1a/b质粒Crispr灵敏性检测

表8 S质粒Crispr灵敏性检测

拷贝数	10<sup>6</sup>	10<sup>5</sup>	10<sup>4</sup>	10<sup>3</sup>	800	600	400	200	100	10	NEG
												荧光值	49.75	41.34	55.67	45.48	58.83	38.05	38.41	38.29	43.53	15.88	15.53

针对临床灭活样本的检测

采用上海市临检中心下发的新型冠状病毒核酸检测能力验证样本(灭活临床样本)进行检测，共6个样本(2011、2012、2013、2014、2015、2016)，其中2012、2014、2015经过荧光PCR检测为阳性。

针对6个样本，采用天根生化科技(北京)有限公司的核酸提取试剂盒提取核酸，并稀释10倍、100倍与原液一起作为模板按照实验方法，进行检测。

结果发现2012、2014、2015原液及稀释10倍之后检测为Orf1a/b、S基因都是阳性，稀释100倍之后都为阴性。

检测体系特异性

以质粒做为阳性对照，2011、2012、2013、2014、2015、2016能力验证样本，CCV、FIPV、TGEV、PEDV四种其他冠状病毒样本，1份甲流阳性样本(FluA)核酸为模板，按照检测方法进行检测，结果发现针对orf1a/b基因，水、和其他四种冠状病毒RT-LAMP扩增都有弱阳性，但是经过Crispr检测体系后，水和四种其他冠状病毒都为阴性了，Crispr提高了检测体系的特异性。

表9 orf1a/b检测结果

POS	2012	2012×10<sup>-1</sup>	2012×10<sup>-2</sup>	2014	2014×10<sup>-1</sup>	2014×10<sup>-2</sup>	NEG
								荧光值	8.367	9.101	9.116	1.116	9.506	9.086	1.086	1.056
	2015	2015×10<sup>-1</sup>	2015×10<sup>-2</sup>	2011	2013	2016
								荧光值		8.637	8.292	1.101	1.146	1.131	1.131
	CCV	FIPV	TGEV	PEDV	FluA
								荧光值		1.101	1.116	1.131	1.086	1.176

针对S基因，RT-LAMP 2012，2014，2015都为阳性，其余为阴性。

表10 S基因Crispr检测结果

Crispr检测结果与LAMP检测结果一致，在表9，表10中10^-1，10^-2分别表示稀释10倍，100倍。

临床样本检测结果

选取了100份临床样本，采用荧光PCR检测方法与本发明的试剂盒进行平行检测，本发明的试剂盒，针对orf1a/b片段，阳性30份，阴性70份，与荧光PCR方法一致；本发明的试剂盒，针对S基因，阳性30份，阴性70份，与荧光PCR方法一致。

表11 本发明试剂盒与荧光PCR检测的灵敏性、特异性对比

由上述实施例可知，利用本发明所述的试剂盒进行新型冠状病毒检测，耗时短，成本低，设备需求简单，检测灵敏度高，特异性好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海国际旅行卫生保健中心（上海海关口岸门诊部）

<120> 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的引物组和试剂盒

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ctcaatatga gtatggtact gaag 24

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

aaccactaaa actattcact tca 23

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

tctaaccaat cttcttcttg ctctttttgg aatttggtgc cac 43

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

cggcagtgag gacaatcaga cactggtgta agttccatct c 41

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ggttgaagag cagcagaa 18

<210> 6

<211> 64

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

taattgaggt tgaacctcaa atctacaaca gtagaaattc cctatagtga gtcgtattaa 60

tttc 64

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

tcagggtttt tcggcttta 19

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

tgagagaggg tcaagtgc 18

<210> 9

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

aatcaccagg agtcaaataa cttcttgcca ataggtatta acatcac 47

<210> 10

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

tgctgcagct tattatgtgg gttaacagca tctgtaatgg ttcc 44

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

agcaagtaaa gtttgaaacc 20

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

tcaacctagg acttttctat taaa 24

<210> 13

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

gctgtccaac ctgaagaaat ctacaacagt agaaattccc tatagtgagt cgtattaatt 60

tc 62

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

gaaattaata cgactcacta taggg 25

<210> 15

<211> 640

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

aagtaaatga gttcgcctgt gttgtggcag atgctgtcat aaaaactttg caaccagtat 60

ctgaattact tacaccactg ggcattgatt tagatgagtg gagtatggct acatactact 120

tatttgatga gtctggtgag tttaaattgg cttcacatat gtattgttct ttctaccctc 180

cagatgagga tgaagaagaa ggtgattgtg aagaagaaga gtttgagcca tcaactcaat 240

atgagtatgg tactgaagat gattaccaag gtaaaccttt ggaatttggt gccacttctg 300

ctgctcttca acctgaagaa gagcaagaag aagattggtt agatgatgat agtcaacaaa 360

ctgttggtca acaagacggc agtgaggaca atcagacaac tactattcaa acaattgttg 420

aggttcaacc tcaattagag atggaactta caccagttgt tcagactatt gaagtgaata 480

gttttagtgg ttatttaaaa cttactgaca atgtatacat taaaaatgca gacattgtgg 540

aagaagctaa aaaggtaaaa ccaacagtgg ttgttaatgc agccaatgtt taccttaaac 600

atggaggagg tgttgcagga gccttaaata aggctactaa 640

<210> 16

<211> 602

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

gtgagttcag agtttattct agtgcgaata attgcacttt tgaatatgtc tctcagcctt 60

ttcttatgga ccttgaagga aaacagggta atttcaaaaa tcttagggaa tttgtgttta 120

agaatattga tggttatttt aaaatatatt ctaagcacac gcctattaat ttagtgcgtg 180

atctccctca gggtttttcg gctttagaac cattggtaga tttgccaata ggtattaaca 240

tcactaggtt tcaaacttta cttgctttac atagaagtta tttgactcct ggtgattctt 300

cttcaggttg gacagctggt gctgcagctt attatgtggg ttatcttcaa cctaggactt 360

ttctattaaa atataatgaa aatggaacca ttacagatgc tgtagactgt gcacttgacc 420

ctctctcaga aacaaagtgt acgttgaaat ccttcactgt agaaaaagga atctatcaaa 480

cttctaactt tagagtccaa ccaacagaat ctattgttag atttcctaat attacaaact 540

tgtgcccttt tggtgaagtt tttaacgcca ccagatttgc atctgtttat gcttggaaca 600

gg 602

Claims

1.一种新型冠状病毒SARS-CoV-2检测的试剂盒，其特征在于，包括针对orf1a/b片段的引物组和针对S基因的引物组；

所述针对S基因的引物组包括S gene-F3、S gene-B3、S gene-FIP、S gene-BIP、Sgene-LF、S gene-LB和crRNA-Sgene-R；所述S gene-F3、S gene-B3、S gene-FIP、S gene-BIP、Sgene-LF、S gene-LB和crRNA-Sgene-R的核苷酸序列依次如SEQ ID No.7～SEQ ID No.13所示；

所述FIP-inside、BIP-inside、S gene-FIP和S gene-BIP的使用浓度独立为1.6μmol/L；所述F3-inside、B3-inside、S gene-F3和S gene-B3的使用浓度独立为0.2μmol/L；所述LF-inside、S gene-LF和Sgene-LB的使用浓度独立为0.4μmol/L；

所述试剂盒还包括RT-LAMP扩增试剂和Crispr检测试剂；

所述Crispr检测试剂包括crRNA-inside-R、crRNA-Sgene-R、T7-crRNA-F、Cas12a酶和HEX-N12-BHQ1；

所述crRNA的使用浓度为10μmmol/L；

所述Cas12a酶的使用浓度为250～500nmol/L；

所述HEX-N12-BHQ1的使用浓度为10μmmol/L；

所述T7-crRNA-F的核苷酸序列如SEQ ID No.14所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-LAMP扩增试剂包括LAMPMixture、LAMP dye和dUTP。