CN112063758A - 一种检测SARS-CoV-2的LAMP引物组和试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种检测SARS-CoV-2的LAMP引物组和试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，提出了一种检测SARS‑CoV‑2的LAMP引物组和试剂盒及其使用方法，LAMP引物组包括引物组A、引物组B、引物组C、引物组D中的一种或多种；所述引物组A包括引物F3‑N1，B3‑N1，FIP‑N1，BIP‑N1，环引物LF‑N1，环引物LB‑N1；所述引物组B包括引物F3‑N2，B3‑N2，BIP‑N1，BIP‑N2，环引物LF‑N2，环引物LB‑N2；所述引物组C包括引物F3‑S1，B3‑S1，FIP‑S1，BIP‑S1，环引物LF‑S1环引物LB‑S1；所述引物组D包括引物F3‑S2，B3‑S2，FIP‑S2，BIP‑S2，环引物LF‑S2，环引物LB‑S2。通过上述技术方案，解决了现有技术中检测存在影响因素多，操作步骤多，检测时间长的问题。

Description

一种检测SARS-CoV-2的LAMP引物组和试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种检测SARS-CoV-2的LAMP引物组和试剂盒及其使用方法。
背景技术
COVID-19是由SARS-CoV-2感染所致的疾病，目前针对SARS-CoV-2的检测试剂主要有2种，一是基于免疫检测患者血液中的抗体IgG和IgM，一种是检测呼吸道标本中的核酸。血清学抗体检测由于标本采集容易,标本处理和试验操作简单,测试时间短,速度快，IgM最可能出现的问题就是在窗口期，从病毒进入人体到检测出抗体的时间，大约有一周，在此期间检测易出现假阴性。核酸检测，如RT-qPCR,可检测出多数无相关临床症状的无症状感染者，具有特异性强，准确性高的特点，但是PCR对实验条件、设施要求高，并且影响因素多，操作步骤多，检测时间长。环介导等温扩增法(LAMP)仅需要简单的水浴锅就可以完成检测，具有简便快速的特性。
由于LAMP方法灵敏度高，特异性强、快速扩增，而且鉴定简便，现在已经广泛应用于病原体细菌、病毒、真菌、寄生虫等的检测。
SARS-CoV-2常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。因此建立一种快速、准确、灵敏、操作简单的检测方法对新型冠状病毒防控工作具有重要的意义。
发明内容
本发明提出一种检测SARS-CoV-2的LAMP引物组和试剂盒及其使用方法，解决了现有技术中SARS-CoV-2的检测存在影响因素多，操作步骤多，检测时间长的问题。
本发明的技术方案是这样实现的：一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的LAMP引物组合物，包括引物组A、引物组B、引物组C、引物组D中的一种或多种；
所述引物组A包括SEQ ID NO：1所示的引物F3-N1，SEQ ID NO：5所示的引物B3-N1，SEQ ID NO：17所示的引物FIP-N1，SEQ ID NO：21所示的引物BIP-N1，SEQ ID NO：9所示的环引物LF-N1，SEQ ID NO：13所示的环引物LB-N1；
所述引物组B包括SEQ ID NO：2所示的引物F3-N2，SEQ ID NO：6所示的引物B3-N2，SEQ ID NO：21所示的引物BIP-N1，SEQ ID NO：22所示的引物BIP-N2，SEQ ID NO：10所示的环引物LF-N2，SEQ ID NO：14所示的环引物LB-N2；
所述引物组C包括SEQ ID NO：3所示的引物F3-S1，SEQ ID NO：7所示的引物B3-S1，SEQ ID NO：19所示的引物FIP-S1，SEQ ID NO：23所示的引物BIP-S1，SEQ ID NO：11所示的环引物LF-S1，SEQ ID NO：17所示的环引物LB-S1；；
所述引物组D包括SEQ ID NO：4所示的引物F3-S2，SEQ ID NO：8所示的引物B3-S2，SEQ ID NO：20所示的引物FIP-S2，SEQ ID NO：24所示的引物BIP-S2，SEQ ID NO：12所示的环引物LF-S2，SEQ ID NO：18所示的环引物LB-S2。
进一步地，所述试剂盒包含上述LAMP引物组合物。
进一步地，所述试剂盒还包含甜菜碱、dNTPs、Bst DNA聚合酶、10×buffer、MgSO4、羟基萘酚蓝指示剂、去离子双蒸水、RNA模板或DNA模板。
进一步地，所述引物组合物中各引物的浓度均为100uM，所述试剂盒中甜菜碱的浓度为5M，dNTPs的浓度为10mM，Bst DNA聚合酶的浓度为8U/ul，MgSO4的浓度为100mM，羟基萘酚蓝指示剂的浓度为120μM。
上述LAMP试剂盒用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的使用方法，包括如下步骤：
A、制备待测样品的RNA或者DNA,作为LAMP反应的RNA模板或DNA模板；
B、配制LAMP反应体系，进行环介导等温扩增反应；
C、结果判断，若反应体系由紫罗兰色变为天蓝色，则待测样品为阳性，若反应体系保持紫罗兰色，则待测样品为阴性。
进一步地，所述LAMP反应体系选自引物组A反应体系、引物组B反应体系、引物组C反应体系、引物组D反应体系中的一种或多种反应体系；
进一步地，所述配制引物组A反应体系的方法包括：取甜菜碱4ul，dNTPs 3.5ul，Bst DNA聚合酶1ul，10×buffer2.5μl，MgSO4 0.5ul，RNA模板或DNA模板1μl，羟基萘酚蓝指示剂1μl，引物F3-N1和B3-N1的用量均为0.05ul，引物FIP-N1和BIP-N1的用量均为0.4ul，环引物LF-N1和LB-N1的用量均为0.2ul，用去离子双蒸水加至25μl；
所述配制引物组B反应体系的方法包括：取甜菜碱4ul，dNTPs 3.5ul，Bst DNA聚合酶1ul，10×buffer 2.5μl，MgSO4 0.5ul，RNA模板或DNA模板1μl，羟基萘酚蓝指示剂1ul，引物F3-N2和B3-N2的用量均为0.05ul，引物FIP-N1和BIP-N2的用量均为0.4ul，环引物LF-N2和LB-N2的用量均为0.2ul，用去离子双蒸水加至25μl；
所述配制引物组C反应体系的方法包括：取甜菜碱4ul，dNTPs 3.5ul，Bst DNA聚合酶1ul，10×buffer 2.5μl，MgSO4 0.5ul，RNA模板或DNA模板1μl，羟基萘酚蓝指示剂1ul，引物F3-S1和B3-S1的用量均为0.05ul，引物FIP-S1和BIP-S1的用量均为0.4ul，环引物LF-S1和LB-S1的用量均为0.2ul，用去离子双蒸水加至25μl；
所述配制引物组D反应体系的方法包括：取甜菜碱4ul，dNTPs 3.5ul，Bst DNA聚合酶1ul，10×buffer 2.5μl，MgSO4 0.5ul，RNA模板或DNA模板1μl，羟基萘酚蓝指示剂1ul，引物F3-S2和B3-S2的用量均为0.05ul，引物FIP-S2和BIP-S2的用量均为0.4ul，环引物LF-S2和LB-S2的用量均为0.2ul，用去离子双蒸水加至25μl。
进一步地，所述环介导等温扩增反应的反应程序包括：当采用DNA模板时，将DNA模板经变性处理，然后将整个LAMP反应体系在62℃保温20-50min；当采用RNA模板时，将整个LAMP反应体系在62℃保温20-50min。
进一步地，所述变性处理的条件为DNA模板于95℃热浴10min，随后立即进行冰浴5min。
本发明的工作原理及有益效果为：
1、本发明中靶序列选择SARS-CoV-2的N、S基因区域，在N、S区域分别设计引物，采用本发明设计的引物制备的LAMP检测试剂盒通过对多个基因片段的联合检测，极大地提高了检测的灵敏度，通过对反应时间的优化，反复实验，建立了本检测方法，其灵敏度可在每个反应体系中检出10拷贝，可以满足快速检测新冠病毒的要求，并且通过荧光显色判断的结果可知，超过荧光定量PCR方法的敏感性；引物特异性强，反应20-50min即可观察到阳性结果；同时反应结果可以直接用肉眼观察，并且可以通过浊度仪、荧光目视的方法实时观察；检测反应在等温下进行，受仪器影响较小；只需一台恒温装置即可，可以走向家庭化。解决了现有技术中SARS-CoV-2的检测存在影响因素多，操作步骤多，检测时间长的问题，设计的引物具备高敏感性、特异性，制备的试剂盒检测结果实时、直接和稳定，成本低，使用非常便捷。
2、SARS-CoV-2属于冠状病毒家族SARS-CoV-2所致的疾病，对其进行检测显然需要排除其它成员的干扰，通过序列比对分析，找出SARS-CoV-2特异的序列。SARS-CoV-2核酸组成包括N、S、E以及ORF1ab区域。由于N基因相对比较保守和稳定；报道显示N基因的灵敏度要比ORF1b基因高10倍，选择N基因作为筛选指标显然可提高检测的敏感性。S基因编码棘突蛋白，与病毒的感染能力有关，通过与ACE2受体结合进入受体细胞，对其检测有助于监控新冠病毒的感染机制。由于RNA病毒有较强的突变能力，为提高检测的的敏感性，本发明中靶序列选择SARS-CoV-2的N、S基因区域，在N、S区域分别设计引物，均达到或超过荧光定量PCR方法的敏感性。
3、本发明中采用质粒模板如SARS-CoV-2、MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-229E、HCoV-HKU1序列进行LAMP反应，只有含SARS-CoV-2基因模板可以扩出特异性条带，说明对新冠病毒家族其它成员(MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-229E、HCoV-HKU1)的检测，该检测试剂盒不能检测出非SARS-CoV-2病毒序列，引物特异性强。
4、本发明中可以直接用肉眼实时观察反应体系来得知检测结果，当反应体系颜色由紫罗兰色变为天蓝色，则表示结果为阳性，待测样品中包含SARS-CoV-2，反应体系颜色保持紫罗兰色，则表示结果为阴性，待测样品中不包含SARS-CoV-2；同时检测反应在等温下进行，只需一台恒温装置即可，受仪器影响较小，可以走向家庭化。
羟基萘酚蓝指示剂(简称HNB)是一种二价金属离子指示剂，原理是镁离子与HNB结合使得反应体系初始颜色为紫罗兰色，随着反应的进行，Mg2+与析出的焦磷酸根离子反应生成焦磷酸镁沉淀，羟基萘酚蓝失去了镁离子使得体系颜色变为天蓝色，而未反应的体系则仍保持着紫罗兰色，以此判断LAMP反应结果，而该颜色的变化肉眼可见。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1为本发明检测SARS-CoV-2的实施例1-4LAMP试剂盒的检测结果；
图中：1-4分别表示LAMP反应体系的反应时间为20min、30min、40min、50min的检测结果；5表示实施例1中未加入模板的LAMP反应体系的检测结果，即阴性对照。
图2为本发明实施例4待测样品采用LAMP试剂盒的灵敏度检测结果；
图中：1-3分别表示每微升DNA拷贝数1.0×102、1.0×101、1.0×100进行LAMP反应的反应结果；4表示未加入模板的LAMP反应体系的反应结果，即阴性对照。
图3为本发明实施例4待测样品采用荧光定量PCR检测结果；
图中：①-③分别表示每微升DNA拷贝数1.0×102、1.0×101、1.0×100进行荧光定量PCR检测的结果；④表示未加入模板的荧光定量PCR检测的结果，即阴性对照。
图4为采用本发明实施例4LAMP试剂盒的特异度检测结果；
图中：1-5分别表示质粒模板如SARS-CoV-2、MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-229E、HCoV-HKU1进行LAMP反应的反应结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例所用的甜菜碱购自Sigma-Aldrich中国，dNTPs购自Takara，即宝日医生物技术(北京)有限公司，Bst DNA聚合酶3.0(该版本的酶具有反转录功能)和10X buffer(即反应缓冲溶液)购自NEB，即纽英伦生物技术(北京)有限公司，MgSO4购自NEB，羟基萘酚蓝指示剂购自上海康朗生物科技有限公司，去离子双蒸水，DNA模板和RNA模板购自上海康朗生物科技有限公司，DNA模板还可通过将购买得到DNA重组质粒转化细菌后再提取，以此DNA重组质粒为模板经PCR扩增制备待测区域的DNA片段，随后经分光光度计检测其浓度并根据其长度及碱基平均分子量，折算成拷贝数，用于实验条件的优化。RNA模板首先用分光光度计检测其浓度并根据其长度及碱基平均分子量，折算成拷贝数，用于实验条件的优化。
本发明所采用的引物组如下表1。表中F3和B3为LAMP外引物，LF、LB为环引物，FIP和BIP为LAMP内引物。FIP由F1c(F1的互补区段)和F2组成，BIP由B1c(B1的互补区段)和B2组成。N1表示N基因区域1引物，N2表示N基因区域2引物，S1表示S基因区域1引物，S2表示S基因区域2引物。Tm值表示一半DNA解链时所对应的温度。
具体的F3-N1、F3-N2、B3-N1、B3-N2为N基因外引物；LF-N1、LF-N2、LB-N1、LB-N2为N基因环引物，FIP-N1、FIP-N2、BIP-N1、BIP-N2为N基因内引物；F3-S1、F3-S2、B3-S1、B3-S2为S基因外引物；LF-S1、LF-S2、LB-S1、LB-S2为S基因环引物，FIP-S1、FIP-S2、BIP-S1、BIP-S2为S基因内引物。
表1引物序列表
Figure BDA0002707902800000051
Figure BDA0002707902800000061
下述实施例中采用的引物组A反应体系、引物组B反应体系、引物组C反应体系、引物组D反应体系各组分浓度、用量如下表2-5，表中“uM”即表示“微摩尔每升”，“mM”即表示“毫摩尔每升”，“M”表示“摩尔每升”，ddH2O表示去离子双蒸水。
表2引物组A反应体系
Figure BDA0002707902800000062
表3引物组B反应体系
Figure BDA0002707902800000071
表4引物组C反应体系
Figure BDA0002707902800000072
Figure BDA0002707902800000081
表5引物组D反应体系
Figure BDA0002707902800000082
实施例1
一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的LAMP试剂盒，所述试剂盒包含的LAMP引物组包括引物组A、引物组B、引物组C、引物组D，还包含甜菜碱、dNTPs、Bst DNA聚合酶3.0、10×buffer、MgSO4、羟基萘酚蓝指示剂、去离子双蒸水、DNA模板。该LAMP试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
A、准备每微升100拷贝的待测样品DNA模板；
B、按照表2-5，分别配制引物组A反应体系、引物组B反应体系、引物组C反应体系、引物组D反应体系，同时用未加入模板的体系作为阴性对照；
然后分别进行环介导等温扩增反应的反应程序，包括：首先将DNA模板经变性处理，然后将整个LAMP反应体系在62℃保温20min；变性处理的条件为95℃金属浴10min，冰浴5min；
C、结果判断：引物组A反应体系、引物组B反应体系、引物组C反应体系、引物组D反应体系均由紫罗兰色变为天蓝色，说明待测样品为阳性，阴性对照的反应体系保持紫罗兰色。
实施例2
一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的LAMP试剂盒，所述试剂盒包含的LAMP引物组包括引物组A、引物组B、引物组C、引物组D，还包含甜菜碱、dNTPs、Bst DNA聚合酶3.0、10×buffer、MgSO4、羟基萘酚蓝指示剂、去离子双蒸水、DNA模板。该LAMP试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
A、准备每微升100拷贝的待测样品DNA模板；
B、按照表2-5，分别配制引物组A反应体系、引物组B反应体系、引物组C反应体系、引物组D反应体系，同时用未加入模板的体系作为阴性对照；
然后分别进行环介导等温扩增反应的反应程序，包括：首先将DNA模板经变性处理，然后将整个LAMP反应体系在62℃保温30min；变性处理的条件为95℃金属浴10min，冰浴5min；
C、结果判断：引物组A反应体系、引物组B反应体系、引物组C反应体系、引物组D反应体系均由紫罗兰色变为天蓝色，说明待测样品为阳性，阴性对照的反应体系保持紫罗兰色。
实施例3
一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的LAMP试剂盒，所述试剂盒包含的LAMP引物组包括引物组A、引物组B、引物组C、引物组D，还包含甜菜碱、dNTPs、Bst DNA聚合酶3.0、10×buffer、MgSO4、羟基萘酚蓝指示剂、去离子双蒸水、DNA模板。该LAMP试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
A、准备每微升100拷贝的待测样品DNA模板；
B、按照表2-5，分别配制引物组A反应体系、引物组B反应体系、引物组C反应体系、引物组D反应体系，同时用未加入模板的体系作为阴性对照；
然后分别进行环介导等温扩增反应的反应程序，包括：首先将DNA模板经变性处理，然后将整个LAMP反应体系在62℃保温40min；变性处理的条件为95℃金属浴10min，冰浴5min；
C、结果判断：引物组A反应体系、引物组B反应体系、引物组C反应体系、引物组D反应体系均由紫罗兰色变为天蓝色，说明待测样品为阳性，阴性对照的反应体系保持紫罗兰色。
实施例4
一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的LAMP试剂盒，所述试剂盒包含的LAMP引物组包括引物组A、引物组B、引物组C、引物组D，还包含甜菜碱、dNTPs、Bst DNA聚合酶3.0、10×buffer、MgSO4、羟基萘酚蓝指示剂、去离子双蒸水、DNA模板。该LAMP试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
A、准备每微升100拷贝的待测样品DNA模板；
B、按照表2-5，分别配制引物组A反应体系、引物组B反应体系、引物组C反应体系、引物组D反应体系，同时用未加入模板的体系作为阴性对照；
然后分别进行环介导等温扩增反应的反应程序，包括：首先将DNA模板经变性处理，然后将整个LAMP反应体系在62℃保温50min；变性处理的条件为95℃金属浴10min，冰浴5min；
C、结果判断：引物组A反应体系、引物组B反应体系、引物组C反应体系、引物组D反应体系均由紫罗兰色变为天蓝色，说明待测样品为阳性，阴性对照的反应体系保持紫罗兰色。
实施例5
一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的LAMP试剂盒，所述试剂盒包含的LAMP引物组包括引物组A，还包含甜菜碱、dNTPs、Bst DNA聚合酶3.0、10×buffer、MgSO4、羟基萘酚蓝指示剂、去离子双蒸水、RNA模板。该LAMP试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
A、准备每微升10000拷贝的待测样品RNA模板；
B、按照表2，配制引物组A反应体系，同时用未加入模板的体系作为阴性对照；
然后进行环介导等温扩增反应的反应程序，整个LAMP反应体系在62℃保温50min；
C、结果判断：引物组A反应体系由紫罗兰色变为天蓝色，说明待测样品为阳性，阴性对照的反应体系保持紫罗兰色。
实施例6
一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的LAMP试剂盒，所述试剂盒包含的LAMP引物组包括引物组B，还包含甜菜碱、dNTPs、Bst DNA聚合酶3.0、10×buffer、MgSO4、羟基萘酚蓝指示剂、去离子双蒸水、RNA模板。该LAMP试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
A、准备每微升1000拷贝的待测样品RNA模板；
B、按照表3，配制引物组B反应体系，同时用未加入模板的体系作为阴性对照；
然后进行环介导等温扩增反应的反应程序，整个LAMP反应体系在62℃保温40min；
C、结果判断：引物组B反应体系由紫罗兰色变为天蓝色，说明待测样品为阳性，阴性对照的反应体系保持紫罗兰色。
实施例7
一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的LAMP试剂盒，所述试剂盒包含的LAMP引物组包括引物组C，还包含甜菜碱、dNTPs、Bst DNA聚合酶3.0、10×buffer、MgSO4、羟基萘酚蓝指示剂、去离子双蒸水、DNA模板。该LAMP试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
A、准备每微升100拷贝的待测样品RNA模板；
B、按照表4，配制引物组C反应体系，同时用未加入模板的体系作为阴性对照；
然后进行环介导等温扩增反应的反应程序，整个LAMP反应体系在62℃保温20min；
C、结果判断：引物组C反应体系由紫罗兰色变为天蓝色，说明待测样品为阳性，阴性对照的反应体系保持紫罗兰色。
实施例8
一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的LAMP试剂盒，所述试剂盒包含的LAMP引物组包括引物组A、引物组C、引物组D，还包含甜菜碱、dNTPs、Bst DNA聚合酶、10×buffer、MgSO4、羟基萘酚蓝指示剂、去离子双蒸水、RNA模板。该LAMP试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
A、准备每微升10拷贝的待测样品RNA模板；
B、按照表2、4、5，分别配制引物组A反应体系、引物组C反应体系、引物组D反应体系，同时用未加入模板的体系作为阴性对照；
然后分别进行环介导等温扩增反应的反应程序：整个LAMP反应体系在62℃保温50min；
C、结果判断：引物组A反应体系、引物组C反应体系、引物组D反应体系均由紫罗兰色变为天蓝色，说明待测样品为阳性，阴性对照的反应体系保持紫罗兰色。
实施例9
一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的LAMP试剂盒，所述试剂盒包含的LAMP引物组包括引物组D，还包含甜菜碱、dNTPs、Bst DNA聚合酶3.0、10×buffer、MgSO4、羟基萘酚蓝指示剂、去离子双蒸水、DNA模板。该LAMP试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
A、准备每微升10000拷贝的待测样品DNA模板；
B、按照表5，配制引物组D反应体系，同时用未加入模板的体系作为阴性对照；
然后进行环介导等温扩增反应的反应程序，包括：首先将DNA模板经变性处理，然后将整个LAMP反应体系在62℃保温50min；变性处理的条件为95℃金属浴10min，冰浴5min；
C、结果判断：引物组D反应体系由紫罗兰色变为天蓝色，说明待测样品为阳性，阴性对照的反应体系保持紫罗兰色。
实施例10
一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的LAMP试剂盒，所述试剂盒包含的LAMP引物组包括引物组A、引物组B，还包含甜菜碱、dNTPs、Bst DNA聚合酶、10×buffer、MgSO4、羟基萘酚蓝指示剂、去离子双蒸水、DNA模板。该LAMP试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
A、准备每微升1000拷贝的待测样品DNA模板；
B、按照表2-3，分别配制引物组A反应体系、引物组B反应体系，同时用未加入模板的体系作为阴性对照；
然后分别进行环介导等温扩增反应的反应程序，包括：首先将DNA模板经变性处理，然后将整个LAMP反应体系在62℃保温50min；变性处理的条件为95℃金属浴10min，冰浴5min；
C、结果判断：引物组A反应体系、引物组B反应体系均由紫罗兰色变为天蓝色，说明待测样品为阳性，阴性对照的反应体系保持紫罗兰色。
实施例11
一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的LAMP试剂盒，所述试剂盒包含的LAMP引物组包括引物组C、引物组D，还包含甜菜碱、dNTPs、Bst DNA聚合酶、10×buffer、MgSO4、羟基萘酚蓝指示剂、去离子双蒸水、DNA模板。该LAMP试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
A、准备每微升100拷贝的待测样品DNA模板；
B、按照表4-5，分别配制引物组C反应体系、引物组D反应体系，同时用未加入模板的体系作为阴性对照；
然后分别进行环介导等温扩增反应的反应程序，包括：首先将DNA模板经变性处理，然后将整个LAMP反应体系在62℃保温40min；变性处理的条件为95℃金属浴10min，冰浴5min；
C、结果判断：引物组C反应体系、引物组D反应体系均由紫罗兰色变为天蓝色，说明待测样品为阳性，阴性对照的反应体系保持紫罗兰色。
实施例12
一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的LAMP试剂盒，所述试剂盒包含的LAMP引物组包括引物组A、引物组C，还包含甜菜碱、dNTPs、Bst DNA聚合酶、10×buffer、MgSO4、羟基萘酚蓝指示剂、去离子双蒸水、DNA模板。该LAMP试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
A、准备每微升10拷贝的待测样品DNA模板；
B、按照表2、4，分别配制引物组A反应体系、引物组C反应体系，同时用未加入模板的体系作为阴性对照；
然后分别进行环介导等温扩增反应的反应程序，包括：首先将DNA模板经变性处理，然后将整个LAMP反应体系在62℃保温30min；变性处理的条件为95℃金属浴10min，冰浴5min；
C、结果判断：引物组A反应体系、引物组C反应体系均由紫罗兰色变为天蓝色，说明待测样品为阳性，阴性对照的反应体系保持紫罗兰色。
试验分析
1.如图1所示，实施例1-4分别将时间设置在20min、30min、40min、50min，图中：1-4分别表示LAMP反应体系的反应时间为20min、30min、40min、50min的检测结果；5表示实施例1中未加入模板的LAMP反应体系的检测结果，即阴性对照。对比时间对反应的影响，可见本发明反应20min即可观察到阳性结果。
2.灵敏度试验
对实施例4模板进行定量后，用灭菌去离子水进行10倍的倍比稀释，使反应管中每微升DNA拷贝数1.0×102、1.0×101、1.0×100模板进行LAMP检测(见图2)和荧光定量PCR检测(见图3)。
图2中：1-3分别表示每微升DNA拷贝数1.0×102、1.0×101、1.0×100进行LAMP反应的反应结果；4表示未加入模板的LAMP反应体系的反应结果，即阴性对照。对比可知，本发明制备的LAMP试剂盒灵敏度可在每个反应体系中检出10拷贝，可以满足快速检测新冠病毒的要求；图3中：①-③分别表示每微升DNA拷贝数1.0×102、1.0×101、1.0×100进行荧光定量PCR检测的结果；④表示未加入模板的荧光定量PCR检测的结果，即阴性对照。由图3结果可知，荧光定量PCR方法最低只能检出100拷贝。
综上可见，本发明制备的LAMP试剂盒灵敏度可在每个反应体系中检出10拷贝，超过荧光定量PCR方法的敏感性。
3.特异度试验
通过核酸比对软件(Primer 5)找出与SARS-CoV-2、MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-229E、HCoV-HKU1对应的序列，然后进行序列合成，经浓度检测后按照前述的方法换算成拷贝数，用于LAMP反应的模板，如图4，图中：1-5分别表示质粒模板如SARS-CoV-2、MERS-CoV、SARS-CoV、HCoV-229E、HCoV-HKU1进行LAMP反应的反应结果。结果显示只有含SARS-CoV-2基因模板可以扩出特异性条带，说明本发明设计的引物特异性强。
综上：本发明针对微生物检测中的特殊性，对不同的靶片段进行反应体系的优化，通过优化方案，反复实验，建立了本检测方法，其灵敏度可在每个反应体系中检出10拷贝，可以满足快速检测病源微生物的要求，并且通过荧光显色判断的结果可知，超过荧光定量PCR方法的敏感性，同时特异性强，检测速度快，20min即可检出结果。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 吉派德生物医药科技（河北）有限公司
<120> 一种检测SARS-CoV-2的LAMP引物组和试剂盒及其使用方法
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
ctactaccga agagctacca 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
tcctcaagga acaacattgc ca 22
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
tcggctttag aaccattgg 19
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
gccaataggt attaacatca ctagg 25
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
aggaacgaga agaggctt 18
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
ttcttagaag cctcagcagc ag 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 7
gattctgttg gttggactct aa 22
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 8
agattctgtt ggttggactc t 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 9
gcccagttcc taggtagtag a 21
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 10
tgcgactacg tgatgaggaa cg 22
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 11
gctgtccaac ctgaagaaga 20
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 12
accagctgtc caacctga 18
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 13
ccgcaatcct gctaacaatg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 14
tgctgctctt gctttgctgc 20
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 15
ctgtgcactt gaccctct 18
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 16
acttgaccct ctctcagaaa ca 22
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 17
gcaccatagg gaagtccagc agatctcagt ccaagatggt 40
<210> 18
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 18
tcccctactg ctgcctggag ttgcggcagt caagcctctt 40
<210> 19
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 19
ccacataata agctgcagca ccaagaagtt atttgactcc tggtg 45
<210> 20
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 20
agtcctaggt tgaagataac ccacattgac tcctggtgat tcttct 46
<210> 21
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 21
ctgagggagc cttgaataca ccgaagttgt agcacgattg c 41
<210> 22
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 22
atggctggca atggcggtga agctggttca atctgtcaag ca 42
<210> 23
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 23
tggaaccatt acagatgctg tagacaacgt acactttgtt tctgag 46
<210> 24
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 24
ccattacaga tgctgtagac tgtgcgtgaa ggatttcaac gtacact 47

Claims (9)

1.一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的LAMP引物组合物，其特征在于，包括引物组A、引物组B、引物组C、引物组D中的一种或多种；
所述引物组A包括SEQ ID NO：1所示的引物F3-N1，SEQ ID NO：5所示的引物B3-N1，SEQID NO：17所示的引物FIP-N1，SEQ ID NO：21所示的引物BIP-N1，SEQ ID NO：9所示的环引物LF-N1，SEQ ID NO：13所示的环引物LB-N1；
所述引物组B包括SEQ ID NO：2所示的引物F3-N2，SEQ ID NO：6所示的引物B3-N2，SEQID NO：21所示的引物BIP-N1，SEQ ID NO：22所示的引物BIP-N2，SEQ ID NO：10所示的环引物LF-N2，SEQ ID NO：14所示的环引物LB-N2；
所述引物组C包括SEQ ID NO：3所示的引物F3-S1，SEQ ID NO：7所示的引物B3-S1，SEQID NO：19所示的引物FIP-S1，SEQ ID NO：23所示的引物BIP-S1，SEQ ID NO：11所示的环引物LF-S1，SEQ ID NO：17所示的环引物LB-S1；；
所述引物组D包括SEQ ID NO：4所示的引物F3-S2，SEQ ID NO：8所示的引物B3-S2，SEQID NO：20所示的引物FIP-S2，SEQ ID NO：24所示的引物BIP-S2，SEQ ID NO：12所示的环引物LF-S2，SEQ ID NO：18所示的环引物LB-S2。
2.一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述LAMP引物组合物。
3.根据权利要求2所述一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含甜菜碱、dNTPs、Bst DNA聚合酶、10X buffer、MgSO4、羟基萘酚蓝指示剂、去离子双蒸水、RNA模板或DNA模板。
4.根据权利要求3所述一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的LAMP试剂盒，其特征在于，所述引物组合物中各引物的浓度均为100uM，所述试剂盒中甜菜碱的浓度为5M，dNTPs的浓度为10mM，Bst DNA聚合酶的浓度为8U/ul，MgSO4的浓度为100mM，羟基萘酚蓝指示剂的浓度为120μM。
5.一种如权利要求4所述检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的LAMP试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、制备待测样品的RNA或者DNA,作为LAMP反应的RNA模板或DNA模板；
B、配制LAMP反应体系，进行环介导等温扩增反应；
C、结果判断，若反应体系由紫罗兰色变为天蓝色，则待测样品为阳性，若反应体系保持紫罗兰色，则待测样品为阴性。
6.根据权利要求5所述一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的LAMP试剂盒的使用方法，其特征在于，所述LAMP反应体系选自引物组A反应体系、引物组B反应体系、引物组C反应体系、引物组D反应体系中的一种或多种反应体系。
7.根据权利要求6所述一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的LAMP试剂盒的使用方法，其特征在于，所述配制引物组A反应体系的方法包括：取甜菜碱4ul，dNTPs 3.5ul，Bst DNA聚合酶1ul，10×buffer 2.5μl，MgSO4 0.5ul，RNA模板或DNA模板1μl，羟基萘酚蓝指示剂1μl，引物F3-N1和B3-N1的用量均为0.05ul，引物FIP-N1和BIP-N1的用量均为0.4ul，环引物LF-N1和LB-N1的用量均为0.2ul，用去离子双蒸水加至25μl；
所述配制引物组B反应体系的方法包括：取甜菜碱4ul，dNTPs 3.5ul，Bst DNA聚合酶1ul，10×buffer 2.5μl，MgSO4 0.5ul，RNA模板或DNA模板1μl，羟基萘酚蓝指示剂1ul，引物F3-N2和B3-N2的用量均为0.05ul，引物FIP-N1和BIP-N2的用量均为0.4ul，环引物LF-N2和LB-N2的用量均为0.2ul，用去离子双蒸水加至25μl；
所述配制引物组C反应体系的方法包括：取甜菜碱4ul，dNTPs 3.5ul，Bst DNA聚合酶1ul，10×buffer 2.5μl，MgSO4 0.5ul，RNA模板或DNA模板1μl，羟基萘酚蓝指示剂1ul，引物F3-S1和B3-S1的用量均为0.05ul，引物FIP-S1和BIP-S1的用量均为0.4ul，环引物LF-S1和LB-S1的用量均为0.2ul，用去离子双蒸水加至25μl；
所述配制引物组D反应体系的方法包括：取甜菜碱4ul，dNTPs 3.5ul，Bst DNA聚合酶1ul，10×buffer 2.5μl，MgSO4 0.5ul，RNA模板或DNA模板1μl，羟基萘酚蓝指示剂1ul，引物F3-S2和B3-S2的用量均为0.05ul，引物FIP-S2和BIP-S2的用量均为0.4ul，环引物LF-S2和LB-S2的用量均为0.2ul，用去离子双蒸水加至25μl。
8.根据权利要求5所述一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的LAMP试剂盒的使用方法，其特征在于，所述环介导等温扩增反应的反应程序包括：当采用DNA模板时，将DNA模板经变性处理，然后将整个LAMP反应体系在62℃保温20-50min；当采用RNA模板时，将整个LAMP反应体系在62℃保温20-50min。
9.根据权利要求8所述一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的LAMP试剂盒的使用方法，其特征在于，所述变性处理的条件为DNA模板于95℃热浴10min，随后立即进行冰浴5min。
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