CN111560472A

CN111560472A - 一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的探针和引物、试剂盒、检测方法及应用

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Publication number: CN111560472A
Application number: CN202010358418.5A
Authority: CN
Inventors: 陈西
Original assignee: Harbin Institute of Technology
Current assignee: Harbin Institute of Technology
Priority date: 2020-04-29
Filing date: 2020-04-29
Publication date: 2020-08-21
Anticipated expiration: 2040-04-29
Also published as: CN111560472B

Abstract

一种用于检测新冠病毒SARS‑CoV‑2的探针和引物、试剂盒、检测方法及应用，属于分子生物学核酸检测技术，为了解决实现现场检测、并减少检测过程中出现的污染，提高病毒RNA检测灵敏性，特异性等的技术问题，本发明提供了一种用于检测新冠病毒SARS‑CoV‑2的探针和引物以及含有上述探针和引物的试剂盒，还提供了一种全程闭管RNA指数扩增法(WEPEAR法)，本发明实现了对N基因低至到1ag(约4拷贝)的检测灵敏度，实现了对S基因低至1拷贝的检测灵敏度，同时还实现了基于RT‑RPA(或RT‑ERA)对病毒核酸RNA的双基因同时检测以进一步提高检测结果可靠性，可用于现场检测或家用检测。

Description

一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的探针和引物、试剂盒、检测方法及应用

技术领域

本发明属于分子生物学核酸检测技术，具体涉及一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的探针和引物、试剂盒、检测方法及应用。

背景技术

SARS-CoV-2病毒会导致COVID-19的急性肺炎，并最终可以导致病人死亡。由于新冠病毒的人传人已经被临床数据证实，为了更好地避免交叉感染，急需要开发对新冠病毒的准确、灵敏、可现场操作的检测手段。2019年1月5日，新冠病毒的RNA基因序列被公布，为基于核酸序列的新冠病毒检测手段的研发鉴定了基础。其中逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，或者RT-PCR)检测法是最早被报导和应用的检测 SARS-CoV-2病毒的有效手段。由于RT-PCR检测需要配备昂贵的实时荧光定量PCR仪器以及专业人员操作，RT-PCR法尚不是病毒的现场检测手段。

除了要尽量实现对病毒的现场检测，一个良好的检测技术还需要尽可能地增加检测灵敏度以减少假阴性结果，以及增加测结果的可靠性以减少假阳性结果。目前广泛使用RT-PCR 法需要使用昂贵的实时荧光定量PCR仪器以及专业人员操作，而这些仪器一般只在大型医院和专业检测机构才会配备，因此无法实现现场检测，这就导致了疑似病人需要去人员集中的大型医院或者专业检测机构进行病毒检测，而目前已经证实新冠病毒能够人传人，这就大大增加了携带新冠病毒的疑似病人传染他人的几率，以及未携带新冠病毒的病人被他人感染的几率。因此，实现对病毒的现场检测极为重要。

RT-LAMP是一种对核酸进行恒温扩增的方法，用这种方法来检测新冠病毒RNA已经有类似报道，但其对新冠病毒检测的灵敏度还不够高，需病毒RNA在10拷贝左右才能检测出来。另外，RT-LAMP法需要在较高的温度下进行(60℃)，同时需要检测荧光，因此也需要价格不菲的能够精确控温和检测荧光的设备，尚不能实现真正意义上的现场检测。

目前基因编辑的方法也被应用于检测病毒RNA，但是基因编辑检测方法含多个步骤，操作更为繁琐；另外基因编辑法来检测病毒灵敏尚未达到单拷贝。

基于抗体的病毒检测方法结合侧流胶体金试纸条一般能够实现现场检测，但是基于抗体的检测方法其抗体的开发时间耗时较长需要数周乃至数月，难以在病毒爆发的初期被开发和应用；另外，抗体检测方法的灵敏度一般也不及核算检测方法。

目前有通过核酸恒温扩增(如ERA或RPA)对病毒核酸进行检测，但检测RNA病毒(例如新冠病毒SARS-CoV-2)比检测DNA病毒会更加困难，因为DNA通常可以直接被扩增，而RNA需要首先通过逆转录过程(reverse transcription或RT)，先将RNA逆转录为cDNA 才能实现后续的指数扩增。然而RNA转录成cDNA的过程与后续cDNA的指数扩增过程所使用的反应条件(例如温度)和试剂(例如是否需要激活剂)通常存在不兼容或者不协调的难题。因此，往往需要将两部分别进行操作(或者强制性同锅进行，然而这样通常会大大降低扩增效果)。再加上ERA核酸扩增方法的灵敏度高，任何多的开管步骤都会大大增加对反应体系的污染和干扰的可能性，从而降低检测结果的可靠性，因此实现全程闭管地检测病毒 RNA很重要。

关于假阴性检测结果，这一般是由于检测方法的灵敏度不足导致的，这让在初期被新冠病毒感染的病人难以得到及时诊断和治疗，因此增加检测手段的灵敏度很重要。另一方面假阳性的检测结果会让未携带新冠病毒的病人被误诊为新冠病毒感染者，因此在后续集中隔离期间也会大大增加他们后续被新冠病毒感染的风险。

发明内容

本发明要解决的技术问题为如何实现既能全程闭管地检测RNA以达到尽可能避免对反应体系的污染，又能够将逆转录步骤同后续对cDNA的指数扩增实质性分开使逆转录步骤和后续恒温扩增步骤都在各自最优条件下进行，实现现场检测、提高病毒RNA检测灵敏性，特异性。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的探针和引物，所述探针和引物为下述中的一种：

a.所述探针为N基因exo探针，用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的N基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，正向引物序列如SEQ ID No.2所示，反向引物序列如SEQ ID No.3 所示；

b.所述探针为N基因nfo探针，用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的N基因，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，正向引物序列如SEQ ID No.5所示，反向引物序列如SEQ ID No.6 所示；

c.所述探针为S基因exo探针，用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的S基因，核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，正向引物序列如SEQ ID No.8所示，反向引物序列如SEQ ID No.9所示；

d.所述探针为S基因nfo探针，用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的S基因，核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，正向引物序列如SEQ ID No.11所示，反向引物序列如SEQ ID No.12所示。

进一步地限定，所述N基因exo探针的序列结构特征为：

tattattgggtaaaccttggggccgacgttgtt/i6FAMdT/t/idSp/a/iBHQ1dT/cgcgccccactg-Phosphate；

所述N基因nfo探针的序列结构特征为：6-FAM-gcgatcaaaacaacgtcggccccaaggtttacc/idSp/ aataatactgcgtct-Phosphate，对应的反向引物5’-端含有生物素标签；

所述S基因exo探针的序列结构特征为：cctgcatacactaattctttcacacgtggtg/iTAMdT/t/idSp/A/ iBHQ2dT/taccctgacaaagtt-Phosphate；

所述S基因nfo探针的序列结构特征为：6-FAM-cctgcatacactaattctttcacacgtggtg/idSp/ ttattaccctgacaa-Phosphate，对应的反向引物5’-端含有生物素标签；

其中：i6FAMdT为6-FAM荧光素修饰的胸腺嘧啶T-残基；idSp为无碱四氢呋喃THF残基；iBHQ1dT为BHQ1黑洞淬灭基团修饰的胸腺嘧啶T-残基；Phosphate为磷酸基团；iTAMdT为TAM罗丹明分子修饰的胸腺嘧啶T-残基；iBHQ2dT为BHQ2黑洞淬灭基团修饰的胸腺嘧啶T-残基。

进一步，本发明还提供了一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的探针和引物组合，这种组合可以实现对新冠病毒S基因和N基因的同锅同时检测，能够进一步提高检测结果的可靠性。所述探针和引物组合由上述用于检测新冠病毒SARS-CoV-2 N基因的exo探针和引物与用于检测新冠病毒SARS-CoV-2 S基因的exo探针和引物组成；用于检测新冠病毒SARS-CoV-2N基因的exo探针，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，正向引物序列如SEQ IDNo.2所示，反向引物序列如SEQ ID No.3所示；用于检测新冠病毒SARS-CoV-2S基因的exo探针，核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，正向引物序列如SEQ ID No.8所示，反向引物序列如SEQ ID No.9所示；N基因的exo探针的序列结构特征为：

tattattgggtaaaccttggggccgacgttgtt/i6FAMdT/t/idSp/a/iBHQ1dT/cgcgccccactg-Phosphate；S基因的exo探针的序列结构特征为：cctgcatacactaattctttcacacgtggtg/iTAMdT/t/idSp/A/ iBHQ2dT/taccctgacaaagtt-Phosphate；其中：i6FAMdT为6-FAM荧光素修饰的胸腺嘧啶T-残基； idSp为无碱四氢呋喃THF残基；iBHQ1dT为BHQ1黑洞淬灭基团修饰的胸腺嘧啶T-残基； Phosphate为磷酸基团；iTAMdT为TAM罗丹明分子修饰的胸腺嘧啶T-残基；iBHQ2dT为BHQ2 黑洞淬灭基团修饰的胸腺嘧啶T-残基。

本发明还提供了一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的试剂盒，所述试剂盒含有上述的探针和引物，或上述的探针和引物组合。

进一步地限定，所述试剂盒还含有阳性标准品，所述阳性标准品的制备方法为：

步骤1：将待测病毒RNA的全长或者部分片段所对应的DNA序列通过基因合成得到相应的DNA片段，再克隆到含T7启动子的质粒载体中；

步骤2：将步骤1制备好的含病毒基因的质粒载体用限制性内切酶将病毒基因片段的3’- 端切断，纯化得到线性化后的质粒；

步骤3：利用T7转录酶对步骤2得到的线性化后的质粒进行体外转录，转录产物经纯化后得到待测病毒RNA的阳性标准品。

优选地，步骤1所述的质粒载体为pET-28a(+)。

更进一步地限定，当所述试剂盒含有上述的探针和引物时：用于检测新冠病毒SARS-CoV-2 N基因或S基因的exo探针浓度均为120-150nM，引物的工作浓度均为 400-500nM；用于检测新冠病毒SARS-CoV-2 N基因或S基因的nfo探针浓度均为120-150nM，引物的工作浓度均为400-500nM；当所述试剂盒含有上述的探针和引物组合时，用于检测N 基因和S基因的exo探针的工作浓度均为30nM，引物的工作浓度均为100nM。

本发明还提供了一种检测病毒RNA的方法，所述方法为利用全程闭管RNA指数扩增法对病毒RNA进行检测；所述全程闭管RNA指数扩增法是指在同一个反应管中，在不开盖的条件下，分步完成逆转录与指数重组酶扩增ERA反应。

进一步地限定，所述检测病毒RNA的方法，步骤如下：

1)逆转录：在反应管中，将病毒RNA核酸样品、RNA酶抑制剂、探针及引物、检测试剂、不含ERA激活剂的RT-ERA反应试剂混合，将ERA激活剂加在反应管瓶盖内，将反应管合盖后，置于37℃条件下60s进行逆转录反应，得到cDNA；

2)ERA反应：将步骤1)逆转录后的反应管离心，使瓶盖中的ERA激活剂与步骤1) 中所得到的反应液混合，然后于40℃并保持4min，振荡后离心，将反应管置于40℃下保持26min，得到核酸扩增液；

3)通过荧光或者侧流胶体金试纸条对步骤2)得到的核酸扩增液进行检测。

更进一步地限定，步骤1)所述ERA激活剂为Mg(OAc)₂。

更进一步地限定，步骤1)所述RT-ERA(逆转录-指数重组酶扩增)反应试剂还包括额外加入的RNase酶抑制剂、核酸酶(exo探针用exonuclease III，nfo探针用endonucleaseIV)。

更进一步地限定，在50μl反应体系中所额外加入的酶的量为：RNA酶抑制剂为5U，exonuclease III酶为100U，endonuclease IV酶为10U。

本发明还提供了上述探针和引物在制备检测新冠病毒SARS-CoV-2的试剂盒或试剂中的应用。

有益效果

1.本发明开发的全程闭管RNA指数扩增法(WEPEAR法)检测法可以使用简单的蓝白光显影仪，基层的诊所和医院就能够配备，从而可以实现现场检测；检测方法中的核酸扩增时间为30min，比RT-PCR法需要两小时左右更节省时间。另外，本发明中还设计了引物探针来搭配侧流胶体金试纸条来检测，2-3min内出结果，进而实现家用快速检测，有助于避免人与人之间的交叉传播，有助于控制新冠病毒爆发。WEPEAR法实现了对核酸RNA“样品进—结果出”的超灵敏现场检测以及最大可能地避免污染以保障检测结果的可靠性。

2.本发明使用exo荧光探针实现了对N基因低至到1ag(约4拷贝)的检测灵敏度，实现了对S基因低至1拷贝(0.05拷贝/μl，约20微升样品)的检测灵敏度，单拷贝检测灵敏度也是病毒RNA检测的极限灵敏度，检测手段为荧光检测，此为基于RT-RPA扩增(或RT-ERA 扩增)对RNA检测到目前为止的最高灵敏度。

3.基于WEPEAR法使用检测N基因的绿色荧光exo探针搭配检测S基因的红色荧光exo 探针，首次实现了基于RT-RPA(或RT-ERA)对病毒核酸RNA的双基因同锅同时检测，进一步提高了检测结果的可靠性。

4.基于WEPEAR法，利用恒温控温设备，使用针对N基因的nfo探针实现了用侧流胶体金试纸条对N基因低至1ag(约4拷贝)灵敏度的检测。

5.基于WEPEAR法，利用家用恒温杯等日常简易设备，使用针对N基因的nfo探针实现了用侧流胶体金试纸条对N基因的家用检测，同时也证明了咽拭子核酸样品即使不经过核酸纯化步骤也可以被直接用于核酸检测。

6.基于WEPEAR法，用针对S基因的nfo探针实现了用侧流胶体金试纸条对S基因的检测，同时也证明了从设计开发相应的探针及引物到最后实现检测一共仅需要一周左右的时间，说明一旦任何RNA病毒爆发，相应的检测方案可以在很快的时间内开发出来，实现应急检测。

附图说明

图1.全程闭管RNA指数扩增法(WEPEAR)实现对病毒核酸RNA的超灵敏现场检测示意图；A)RT-ERA扩增示意图；B)WEPEAR工作原理示意图；

图2.通过对线性化的含T7启动子的质粒进行体外转录，得到单条带的SARS-CoV-2的N基因片段(A)和S基因片段(B)，ladder为DNAmarker，N-RNA代表转录后得到的N 基因片段；S-RNA代表转录后得到的S基因片段；

图3exo探针的设计和工作原理；

图4用exo绿色荧光探针WEPEAR法检测SARS-CoV-2的N基因RNA；A)用蓝白光显影仪对核酸扩增后的反应管进行显影；B用荧光分光光度计对空白反应和含核酸的反应进行测定；

图5.用exo探针基于WEPEAR法使用实时荧光定量PCR仪器来实时自动检测 SARS-CoV-2的N基因(λ_ex＝470±15nm，λ_em＝520±15nm)；

图6.用exo荧光探针检测SARS-CoV-2的S基因RNA；

图7.用exo探针使用实时荧光定量PCR仪来实时检测SARS-CoV-2的S基因(λ_ex＝550±11 nm，λ_em＝586±10nm)，A)荧光强度随时间变化曲线；B)荧光强度随波长变化曲线；

图8.用S基因的exo探针基于WEPEAR法和RT-ERA和实现对S基因的单拷贝灵敏度的荧光检测；A)凝胶成像仪的显影结果，B)荧光强度的统计分析；

图9.用检测S基因的exo红色荧光探针和检测N基因的exo绿色荧光探针及引物相搭配用实时荧光定量PCR仪实现双基因同时检测；

图10基于nfo探针搭配侧流胶体金试纸条的检测原理；A)nfo探针的设计和工作原理。 B)侧流胶体金试纸条检测核酸扩增子的原理示意图；

图11.基于WEPEAR法用nfo探针配合使用侧流胶体金试纸条现场快速检测N基因的检测结果；

图12.用nfo探针和保温杯实现在家里对SARS-CoV-2核酸RNA的快速检测；A)用保温杯加热核酸扩增反应管的示意图，1-保温杯，2-漂；B)胶体金试纸条的测试结果；C)用含待检测RNA的咽拭子为样本的胶体金试纸条的测试结果；

图13.基于WEPEAR法用nfo探针搭配侧流胶体金试纸条对SARS-CoV-2核酸RNA之S基因的核酸检测结果；A)从设计引物和探针到实现对S基因的现场检测的关键时间点；B)胶体金试纸条检测结果；C)对RT-ERA反应液纯化后的扩增子的琼脂糖凝胶电泳分析；

图14.exo探针及引物对物检测SARS-CoV-2之N基因和S基因特异性的验证；A：N基因检测，B：S基因检测；

图15.nfo探针及引物对物检测SARS-CoV-2之N基因和S基因特异性的验证；A：N基因检测，B：S基因检测。

具体实施方式

本发明开发了一种全程闭管RNA指数扩增法(WEPEAR法，即whole-courseencapsulated procedure for exponential amplification from RNA)，该方法结合了RT-ERA(reverse transcription exponential recombinase amplification)核酸扩增实现了对新冠病毒RNA的超灵敏(可以达到单拷贝灵敏度)现场检测，如图1所示；这里RT-ERA是一种优化的逆转录-重组酶聚合酶扩增技术(reverse transcription recombinasepolymerase amplification，或RT-RPA)，其核酸扩增的试剂盒由先达公司提供，反应方法参照试剂盒说明书进行，在WEPEAR法中RNA核酸样品被添加到除了ERA激活剂Mg(OAc)₂外含有逆转录和ERA扩增所有必要成分的反应混合物中，同时Mg(OAc)₂被加在反应瓶盖内。由于表面张力的缘故轻轻关闭盖子后Mg(OAc)₂激活剂仍会留在盖子内而不会与反应液接触。接着将反应管置于37℃水浴中60s使逆转录发生。之后通过离心将Mg(OAc)₂激活剂收集到反应管底使Mg(OAc)₂激活剂与反应液混合并触发ERA核酸扩增反应。然后将反应瓶加热至40℃并保持4分钟使初始ERA进行。再次振荡反应管并短暂离心(由于反应混合物具有高粘性，因此该操作对提高检测灵敏度至关重要)，让反应在40℃下再继续26分钟。最后，通过荧光检测(用exo探针和引物)或者侧流胶体金试纸条对核酸扩增反应进行检测。整个WEPEAR法包含四个步骤：逆转录(RT)、ERA激活、预反应和最终反应，能在完全不揭开盖子的情况下完成所有步骤并给出检测结果，从而大大减少污染的可能性(例如气溶胶污染)。

另外本发明设计了exo探针(反应中需用exo酶激活，例如exonuclease III，因而叫做exo 探针)和相关引物可以通过荧光对对扩增产物进行现场检测；通过设计一个荧光探针对，通过绿色荧光和红色荧光实现了同时检测新冠病毒的两个基因，大大提高了检测结果的可靠性规避假阳性结果。本发明还设计了nfo探针(反应中需要使用nfo酶也叫endo酶来激活，例如endonuclease IV，因而叫做nfo探针)及引物，结合侧流胶体金试纸条实现了更加简便的现场检测甚至家用检测。所有这些探针及引物的序列和结构特征见表1。

表1探针及引物的序列和结构特征

下面具体描述本发明，本发明中所涉及的试剂、设备如无特殊说明均为本领域常规试剂或设备，可通过商业化途径购买获得，实验方法如无特殊说明，均为本领域常规实验技术，或参照相应产品试剂的说明书进行。

实施例1：用T7转录酶制备SARS-CoV-2新冠病毒的N和S基因片段作为阳性对照品。

将新冠病毒S和N基因序列提交至朗晶生物科技(中国上海)进行基因合成。合成的新冠病毒N基因序列为：

CATATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAGCGAAATGCACCCCGCATTACGTTTGGTGGACCCTCAGATTCAACT GGCAGTAACCAGAATGGAGAACGCAGTGGGGCGCGATCAAAACAACGTCGGCCCCAAGGTTTACCCAATAATAC TGCGTCTTGGTTCACCGCTCTCACTCAACATGGCAAGGAAGACCTTAAATTCCCTCGAGGACAAGGCGTTCCAA TTAACACCAATAGCAGTCCAGATGACCAAATTGGCTACTACCGAAGAGCTACCAGACGAATTCGTGGTGGTGAC GGTAAAATGTAAAAGCTT。

合成的新冠病毒S基因序列为：

CATATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTACAACCAGAACTCAATTACC CCCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCA ACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTA CTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATAAAAGCTT。

分别将上述N基因与S基因克隆到含有NdeI和HindIII酶切位点的pET-28a(+)载体中。获得的质粒分别命名为pET-28(+)_SARS-CoV-2_N和pET-28(+)_SARS-CoV-2_S。随后使用HindIII限制性内切酶将载体线性化，步骤如下：

在50μl的反应体系中，加入40μl的pET-28(+)_SARS-CoV-2_N或 pET-28(+)_SARS-CoV-2_S质粒溶液，5μl的HindIII和5μl的10×CutSmart缓冲液，所有操作在冰上进行。随后将反应溶液置于37℃反应4小时以完成质粒线性化，之后使用琼脂糖胶电泳来验证实验结果确保线性化成功，随后使用胶回收纯化试剂盒(诺唯赞#DC301)将线性化的质粒纯化。

接下来使用诺唯赞(#TR101-01)的T7转录试剂盒进行体外转录。在20μl的反应体系中，加入8μl上述制备的线性化质粒，2μl的10×缓冲液，2μl的ATP，2μl的GTP，2μl的UTP，2μl的CTP以及2μl的T7 RNA聚合酶混合物(含有T7 RNA聚合酶以及其它的必要成分)。于37℃反应4小时至过夜。接下来在反应管中加入1μl的DNase I(试剂盒中含有)并将反应管在37℃继续孵育15min以完全降解线性质粒模板。将20μl的转录反应液用超纯水稀释到150μl，运用先达基因RNA快速纯化试剂盒(#NR202-50T)纯化后得到SARS-CoV-2新冠病毒的N和S基因片段，即SARS-CoV-2的RNA阳性对照品。琼脂糖胶电泳验证可发现有相应长度的单条带(图2)。

实施例2.基于WEPEAR法用exo探针荧光检测新冠病毒SARS-CoV-2核酸RNA的N 基因。

关于通过用exo探针检测核酸扩增产物，需要设计正向引物、反向引物、以及exo探针， exo探针的设计和工作原理如图3所示。正向和反向引物的长度为33bp左右(30-35bp)，能够扩增100-200bp长度的片段。exo探针的特点是探针中间部位有一个无碱四氢呋喃(THF) 残基(idSp)，可以在适当条件下可被exonuclease III酶切断，在THF残基的5’-侧隔了一个碱基有一个6-FAM荧光素修饰的胸腺嘧啶T-残基(i6FAMdT)，在THF残基3’-侧隔了一个碱基有一个BHQ1黑洞淬灭基团修饰的胸腺嘧啶T-残基(iBHQ1dT)，因此6-FAM荧光素同BHQ1淬灭基团之间仅隔3个碱基残基(THF算一个碱基残基数)，空间距离近，6-FAM荧光素的荧光被BHQ1淬灭。另外，在i6FAMdT的5’-侧有33bp左右的碱基序列(30-35bp)，在iBHQ1dT的3’-方向有12-15bp长的碱基序列，最后exo探针的3’-最末端有一个阻断基团 (如磷酸基)，因此exo探针本身不具有作为引物的功能。当不存在核酸扩增子情况下，exo 探针处于单链状态，FAM和BHQ1是一个荧光共振能量转移对(FRET对)，FAM的荧光大部分被BHQ1淬灭，因此处于低荧光状态。当存在核酸扩增子情况下，exo探针会与扩增子的一条链相杂交而成为双链状态，THF残基会被exonuclease III切断，导致BHQ1释放，FAM 荧光将恢复成为强荧光状态，从而实现对核酸扩增子的检测。在此exo探针的设计中，除了用FAM/BHQ1的FRET对外，还可以使用其它的FRET对，例如红色发射光的TAM罗丹明与BHQ2淬灭基团相搭配的TAM/BHQ2的FRET对。通过用exo探针和引物，基于WEPEAR 法可以用荧光来检测病毒核酸RNA的存在。为了检测荧光，可以用简易的蓝白光显影仪，以可以用实时荧光定量PCR仪器等高端仪器实现实时荧光检测。

本实施例中所使用的引物和探针序列和结如下：

N基因exo正向引物:tttggtggaccctcagattcaactggcagtaac

N基因exo反向引物:gaatttaaggtcttccttgccatgttgagtgag

N基因exo探针:tattattgggtaaaccttggggccgacgttgtt/i6FAMdT/t/ idSp/a/iBHQ1dT/cgcgccccactg-Phosphate，核苷酸序列表中，i6FAMdT以T碱基表示，idSp 以H字母表示，iBHQ1dT以T碱基表示。

exo探针单基因检测引物和探针用量分别为(终浓度)：正向引物：400或500nM，反向引物：400或500nM，exo探针：120或150nM均可。

本实施例用exo荧光探针和WEPEAR流程实现“样品进-结果出”地对SARS-CoV-2的N基因超灵敏现场检测。RT-ERA反应使用的是来自先达基因公司GenDx Biotech Co.,Ltd.的 RT-基础型核酸扩增试剂盒(#KS102)。在50μl的反应体系中，将2.5μl的exo正向引物(10μM)，2.5μl的exo反向引物(10μM)，0.75μl的exo荧光探针(10μM)，1μl的murine RNase抑制剂(5U/μl)(Vazyme，#R301-01)，1μl的RNA样本，20μl的超纯水，以及0.5μl的200U/μl的exonuclease III(thermo scientific，#EN0191)依次加进20μl的DA溶解液中，得到约48μl 的反应液，再用移液器将此反应液加入干粉反应管中。干粉反应管含有除Mg(OAc)₂以外RT-ERA反应所需的所有其它组分。接着将2μl的Mg(OAc)₂激活剂加入反应管盖内，然后轻轻将反应管盖好，由于表面张力的缘故，Mg(OAc)₂会留在盖子内而不会流进反应液里。将此反应管置于37℃反应60s使逆转录过程发生，病毒RNA被转录为cDNA，接下来将反应管短暂离心，Mg(OAc)₂激活剂在离心力作用下被收集到反应管底并与48μl的反应液混合，将反应管振荡并离心，此时Mg(OAc)₂与反应体系均匀混合开始激活核酸扩增反应。首先将反应管在40℃温热4min实现预反应，接下来将PCR管子再振荡混匀并短暂离心，将反应管置于40℃继续反应26min，核酸扩增反应结束。一般情况下也需要同时设置一个不含病毒RNA 的核酸扩增反应作为阴性对照以排除可能发生的假阳性结果。

接下来，将反应管置于蓝白光板显色仪上，用蓝光(440-480nm)激发，假如反应管出现了比空白对照更强的绿色荧光，则可以鉴定RNA核酸的存在，反之则不存在。如图4所示，图4中A所示为用蓝白光显影仪对核酸扩增后的反应管进行显影，可以看到1ag及以上的反应都出现了绿色荧光，当核酸量到达1pg时荧光强度接近峰值。图4中B所示为用荧光分光光度计对空白反应和含核酸的反应进行测定，可以看到核酸RNA的量从1ag起，荧光强度开始高于空白对照反应，当核酸量到达1pg时荧光强度接近峰值。实验中所用的仪器为Molecular Devices SpectraMax i3x，耗材是平底透明96孔板，使用的是荧光分光光度计的功能。结果表明，低至1ag的核酸样品可以被快速方便地检测出来，因而这是一个快速、超灵敏的现场检测方案。

实施例3：用exo探针基于WEPEAR法和RT-ERA扩增使用实时荧光定量PCR仪器来实时检测SARS-CoV-2的N基因。

本实施例中使用带透明平盖的250μl容积的八连管来进行反应，同时需要在实时荧光定量PCR仪的使用中正确设置各项参数。本实施例的检测过程中使用的引物、探针以及试剂基本同实施例2一样，但具体操作流程有一定变动。

具体来讲，首先取一个带透明平盖的八连管，将1μl待测核酸样品加进八连管底部，同时将2μl的Mg(OAc)₂激活剂加进八连管的盖子中。对于50μl的反应体系，接下来将2.5μl 的exo正向引物(10μM)，2.5μl的exo反向引物(10μM)，0.75μl的exo荧光探针(10μM)， 1μl的murine RNase抑制剂(5U/μl)(Vazyme，#R301-01)，20μl的超纯水，以及0.5μl的200U/μl的exonuclease III(thermo scientific，#EN0191)依次加进20μl的DA溶解液中，得到约47μl 的反应液，再用移液器将此反应液加入干粉反应管中，轻轻上下吸吹混匀。干粉反应管含有除Mg(OAc)₂以外RT-ERA反应所需的所有其它组分。之后，将此反应液转移进含1μl核酸样品的八连管中，轻轻上下吸吹混匀，然后轻轻将反应管盖上，由于表面张力的缘故，盖子内的Mg(OAc)₂不会流进反应液里。将此反应管置于37℃反应45s使逆转录过程发生，病毒RNA 被转录为cDNA，接下来将反应管短暂离心，Mg(OAc)₂激活剂在离心力作用下被收集到反应管底并与48μl的反应液混合，将反应管振荡并离心，此时Mg(OAc)₂与反应体系均匀混合开始激活核酸扩增反应。迅速将八连管放进设好检测程序的实时荧光定量PCR仪器中，开始实时荧光检测，反应共进行30min，通过与空白样品的荧光曲线相对照，即可判定是否有核酸存在，其中一个代表性结果如图5所示，从曲线可以看出荧光强度在25分钟后基本达到峰值，这表明实验中30分钟的反应时间足以达到exo绿色荧光探针检测所能达到的最高荧光强度。同时也可以发现荧光强度在5分钟后开始呈指数增长。实验中所用的仪器为Applied Biosystem QuantStudio 6Flex real-time PCR仪。

实施例4：用exo探针基于WEPEAR法和RT-ERA扩增使用凝胶仪来检测SARS-CoV-2的S基因。

在本实施例中，引物和探针的设计原理和方法与实施例2中类似，相应引物和探针的结构如下所示，其中探针所使用的是红色发光的TAM罗丹明分子，搭配的是BHQ2黑洞荧光淬灭基团。这些引物和探针的序列及结构如下：

S基因exo正向引物:gtctctagtcagtgtgttaatcttacaaccagaac

S基因exo反向引物:cattggaaaagaaaggtaagaacaagtcctgag

S基因exo探针:

cctgcatacactaattctttcacacgtggtg/iTAMdT/t/idSp/A/iBHQ2dT/taccctgacaaagtt-Phosphate，核苷酸序列表中，iTAMdT以T碱基表示，idSp以H字母表示，iBHQ2dT以T碱基表示。

本实施例中，用凝胶仪来检测每个核酸扩增反应管的荧光，激发光为紫外激发(300-400nm)，发色光为可见光(400-800nm)，用凝胶仪对核酸扩增后的反应管进行显影，可以看到1ag及以上的反应都出现了明显高于空白对照(0ag)的荧光，说明检测的灵敏度非常高，当核酸量到达10fg时荧光强度接近峰值。实验中所用的仪器为广州博鹭腾GelView5000Plus智能凝胶成像系统(图6)。

实施例5：用exo探针基于WEPEAR法使用实时荧光定量PCR仪器来自动检测 SARS-CoV-2的N基因。

本实施例的操作流程同实施例3一样，所用的是用于检测S基因的引物和exo探针，同实施例4一样。测试结果如图7所示，可以看到含有核酸样品的反应管的荧光随着时间变化有明显增长，其荧光强度增加值大大高于空白组，从曲线可以看出荧光强度在12分钟后基本达到峰值，同时可以可以发现荧光强度在3分钟后开始呈指数增长，这比检测N基因的曲线达到指数增长要早，也预示着检测S基因的exo探针灵敏度更高；实验中所用的仪器为Applied Biosystem QuantStudio 6Flex real-time PCR仪(图7中A)；同时也可以看反应之后，曲线显示经RT-ERA反应后，含核酸样品的扩增反应液的荧光强度是空白组的7倍(图7中B)。

实施例6：用S基因的exo探针基于WEPEAR法实现对S基因的单拷贝灵敏度的荧光检测。

通过实验发现为S基因设计的exo探针和引物相比于检测N基因的exo探针和引物有着更高的灵敏度。因此在此实施例中证实了基于exo探针的荧光检测能够达到单拷贝灵敏度检测限，也是检测灵敏度的极限。本实施例的操作流程同实施例2和4基本一样，唯一的改进之处是稍微修改了WEPEAR方案，在反应过程中的3min、6min和9min时需要上下振荡后再短暂离心反应管，使每段扩增后的核酸尽量与反应液混合均匀，以提高检测灵敏度。关于样品，以1拷贝/微升(～0.25ag/μl)为标准制备了极为稀释的核酸溶液。一共进行了5次独立的实验，在每个实验中，除了空白对照(0拷贝RNA)外，还包括1或者3个测试反应(每个为1拷贝的RNA)。在RT-ERA反应后，11个反应中有10个可检测到的比其各自空白对照更亮的荧光(图8)。对于没有显示比对照更亮的荧光的反应管(图8中B，在红色虚线圆圈内)，这可能是由于反应溶液中没有RNA分子，因为在极稀释的溶液下，用移液器从1拷贝/ 微升储备溶液中取出1个单分子时，有可能会正好取不出。A)凝胶成像仪的显影结果，实验中所用的仪器为广州博鹭腾GelView 5000Plus智能凝胶成像系统。B)荧光强度的统计分析。Student’st-test分析结果显示核酸样品和空白对照组的荧光差异是很强的(P＝0.017)。

实施例7：用检测S基因的exo红色荧光探针和检测N基因的exo绿色荧光探针搭配基于WEPEAR法用实时荧光PCR仪以实现双基因同时检测。

通过同时检测两个基因可以提高检测结果的可靠性，因而也能尽可能规避假阳性结果的发生。本实施例中的步骤同实施例3和5基本一致，但是需要加入两对引物以及两个探针，以实现同时双基因检测，同时相应的引物及探针的浓度也做了调整：N基因和S基因的正向和反向引物浓度均为100nM，N基因和S基因的exo探针的浓度均为：30nM。在本实施例中，从荧光曲线可以看到，N基因及S基因的荧光信号变化(ΔRn)从第6分钟和第3分钟开始出现指数增加，而空白对照组的荧光变化并无明显变化，这表明将检测两种基因的引物和探针相组合，可以实现同时双基因荧光检测(图9)。

实验中所用的仪器为Applied Biosystem QuantStudio 6Flex real-time PCR仪，荧光的激发和检测参数如下：对用FAM标记的exo探针检测N基因RNA：λ_ex＝470±15nm，λ_em＝520±15nm；用TAM标记的exo探针检测S基因：λ_ex＝550±11nm，λ_em＝586±10nm。从图中也可以看出，检测S基因的exo探针比检测N基因的exo探针有更高的灵敏性。

实施例8：基于WEPEAR法用nfo探针配合侧流胶体金试纸条现场快速检测N基因。

为了更好地达到现场检测的目的，本发明还设计了nfo探针及正反向引物，可以通过侧流胶体金试纸条实现更方便地检测。nfo探针及引物的设计和工作原理见图10中A所示，其中正向和反向引物大约33bp(30-35bp)长，其中一条引物的5’-端含有一个生物素标签，这样就能扩增出100-200bp大小含生物素标签的扩增子。所设计的nfo探针的序列使之能与扩增子的含生物素标签的那条链相结合，另外nfo探针的中间部分含有一个无碱四氢呋喃残基 (THF)，THF残基5’-侧含有33bp左右长度的碱基并在5’-最末端有一个5-FAM荧光素分子 (作为抗原而非荧光团)，THF残基3’-侧含有15bp左右长度的碱基并在其最末端有一个阻断基团(如磷酸基)使之不能作为引物。在单链状态下，nfo探针的THF残基不能被endonuclease IV酶切断，但当有扩增子存在下，nfo探针与扩增子的含生物素标签的链相结合，变成双链结构，THF残基即可被endonuclease IV酶切断，释放THF残基3’-端带阻断基的部分从而将 nfo探针转化为引物，最终得到一个一端含6-FAM荧光素而另一端含一个生物素标签的双标记的扩增子。这种双标记的扩增子可以很容易地用侧流胶体金试纸条来检测，不需要任何特殊的设置。

侧流带胶体金试纸条的工作原理见图10中B所示。其特征是固定有α-生物素抗体固定的测试线(test line)和固定有α-[α-FAM-gold]抗体的控制线(control line)。此外，在两条线的下方和样品垫的上方有一个胶体金颗粒区(金颗粒被α-FAM抗体包被)。当侧流胶体金试纸条的样品垫插入稀释后的RT-ERA反应溶液中时，胶体金颗粒将随着反应液依次流过测试线和控制线。如果在RT-ERA反应液中含有双标记的扩增子，双标记的扩增子将桥连α-FAM 抗体包被的胶体金颗粒和测试线中的α-生物素抗体，从而使测试线变为红色。同时含有α-[α-FAM-gold]抗体的控制线也会结合α-FAM抗体包被的金颗粒，以证明试纸条是有效的。通过设计特异性检测N基因或S基因nfo探针相应引物，SARS-CoV-2的N基因或S基因可以很方便地被检测出。

本实施例中，使用检测N基因的nfo正向和反向引物以及nfo探针的序列和结构如下：

N基因nfo正向引物:tttggtggaccctcagattcaactggcagtaac

N基因nfo反向引物:Biotin-gaatttaaggtcttccttgccatgttgagtgag

N基因nfo探针:6-FAM-gcgatcaaaacaacgtcggccccaaggtttacc/idSp/aataatactgcgtct-Phosphate 核苷酸序列表中，idSp以H字母表示。

使用nfo探针搭配侧流胶体金试纸条快速现场检测核酸的流程与用exo探针来荧光检测的流程有些许不同。关于具体步骤，RT-ERA反应使用的是来自先达基因公司GenDxBiotech Co., Ltd.的RT-基础型核酸扩增试剂盒(#KS102)。在50μl的反应体系中，将2μl的nfo正向引物 (10μM)，2μl的nfo反向引物(10μM)，0.6μl的nfo探针(10μM)，1μl的murineRNase抑制剂(5U/μl)(Vazyme，#R301-01)，1μl的RNA样本，21μl的超纯水，以及1μl的10U/μl的endonuclease IV(NEB,#M0304S)依次加进20μl的DA溶解液中，得到约48μl的反应液，再用移液器将此反应液加入干粉反应管中。干粉反应管含有除Mg(OAc)₂以外RT-ERA反应所需的所有其它组分。接着将2μl的Mg(OAc)₂激活剂加入反应管盖内，然后轻轻将反应管盖好，由于表面张力的缘故，Mg(OAc)₂会留在盖子内而不会流进反应液里。将此反应管置于37℃反应60s使逆转录过程发生，病毒RNA被转录为cDNA，接下来将反应管短暂离心，Mg(OAc)₂激活剂在离心力作用下被收集到反应管底并与48μl的反应液混合，将反应管振荡并离心，此时Mg(OAc)₂与反应体系均匀混合开始激活核酸扩增反应。首先将反应管在40℃温热4min实现预反应，接下来将PCR管子再振荡混匀并短暂离心，将反应管置于40℃继续反应26min，核酸扩增反应结束。一般情况下也需要同时设置一个不含病毒RNA的核酸扩增反应作为阴性对照以排除可能发生的假阳性结果。

接下来需要用侧流胶体金试纸条(LF)来检测是否有核酸扩增出来，使用的是HybriDetect LF试纸条(Amplification Future，#WLF8201)。取上述反应液取10μl到1.5ml的离心管中，用超纯水稀释到200μl。接下来，将HybriDetect胶体金试纸条的样品垫部分插进离心管中静置约2-3min，如果检测线的颜色相比于空白对照明显变红，则说明有核酸RNA存在。如下是不同浓度N基因RNA核酸样本的检测结果，可以看到当核酸量达到1ag及以上时，检测线出现比空白更强的红色，显示待核酸RNA的存在(图11)。

实施例9：基于WEPEAR法用nfo探针使用家用保温杯实现在家里对SARS-CoV-2核酸RNA的检测。

为了更进一步简化测试设备，本发明中还使用家用保温杯作为恒温加热装置。在搅拌下通过向盛了温水(>40℃)的保温杯中逐渐加入室温的水(约25℃)，水温可以被精确地控制在40℃，并在30min之内维持在不低于39℃的温度。用这个测试方案中不需要任何特殊设备，实现了对N基因的家用检测。在此检测方案中，一个较优的检测参数如下(均为终浓度)： nfo单基因检测：正向引物400nM，反向引物400nM，nfo探针120nM。

在本实施例中，所用的试剂、引物、探针以及操作步骤都同实施例8一样，唯一不同的是加热设备从恒温金属浴或者PCR仪器改为了一个家用保温杯，大大简化了测试对仪器设备的要求，使此检测方案可以在家里进行，实现更好地现场检测(图12中A)。通过往盛了温水的保温杯中逐渐加入常温的水，保温杯中的水可以被很容易地精确调整到40℃，轻轻加上一个泡沫盖后，大约在15-25min后温度会降低到39℃并一直持续到30min后核酸扩增反应结束。用一个泡沫的飘可以将反应管浮在温水上实现准确温控。通过这种方法来扩增核酸 RNA，使用胶体金试纸条，实现了对N基因的快速检测(图12中B)。同时，如果核酸RNA样品直接与咽拭子混合，不经过纯化，也可以实现对N基因的快速检测(图12中C)。

实施例10：在获得病毒基因序列一周内快速发展nfo探针和引物实现对SARS-CoV-2的 S基因的现场检测。

在此实施例中，相应的引物和nfo探针的序列和结构如下所示。

S基因nfo正向引物:gtctctagtcagtgtgttaatcttacaaccagaac

S基因nfo反向引物:Biotin-cattggaaaagaaaggtaagaacaagtcctgag

S基因nfo探针:6-FAM-cctgcatacactaattctttcacacgtggtg/idSp/ttattaccctgacaa-Phosphate，核苷酸序列表中，idSp以H字母表示。

根据SARS-CoV-2核酸序列，引物和探针在第一天被设计，第二天开始合成，第六天得到，并在第七天实现了用此探针对核酸RNA的现场检测(图13中A)，检测结果显示S基因反应管用胶体金试纸条检测出现了明显条带，而空白对照试验没有(图13中B)。将RT-ERA 的反应也进行核酸纯化和用琼脂糖凝胶电泳检测，证明了核酸扩增子的确存在于RT-ERA反应体系中(图13中C)验证了在RT-ERA反应中形成了双功能化扩增子。

综上，本发明所述的现场检测手段可以在获取病毒基因序列的数天之内被开发出来。通过对SARS-CoV-2的S基因设计nfo探针和引物，继而合成nfo探针和引物，最后完成对S基因的现场检测，一共仅仅花了7天时间。而基于抗体的现场检测方法，制备高效价抗体就需要数周乃至数月，难以满足病毒爆发后的应急检测需要。因此本发明所公布的全程闭管RNA指数扩增WEPEAR法不仅能实现现场检测，还能满足应急检测需求。

实施例11：exo探针及引物对检测SARS-CoV-2之N基因和S基因之特异性的验证。

以非典冠状病毒SARS-CoV之N基因RNA为对照，参照实施例2的方法，检测本申请所述的exo探针及引物对物检测SARS-CoV-2之N基因和S基因特异性，结果如图14所示，检测SARS-CoV-2之N基因的exo探针及引物只在SARS-CoV-2之N基因RNA(100pg)存在下反应产生荧光(右)，在空白对照中(水)和在非典冠状病毒SARS-CoV之N基因RNA (100pg)存在下没有或仅有微弱荧光(左、中)。检测SARS-CoV-2之S基因的exo探针及引物只在SARS-CoV-2之S基因RNA(100pg)存在下反应产生荧光(右)，在空白对照中(水) 和在非典冠状病毒SARS-CoV之S基因RNA(100pg)存在下没有或仅有微弱荧光(左、中)。

实施例12：nfo探针及引物对检测SARS-CoV-2之N基因和S基因之特异性的验证。

以中东呼吸综合征冠状病毒MERS-CoV之N基因RNA为对照，参照实施例8的方法，检测本申请所述的nfo探针及引物对物检测SARS-CoV-2之N基因和S基因特异性，结果如图15所示：检测SARS-CoV-2之N基因的nfo探针及引物只在SARS-CoV-2之N基因RNA (100pg)存在其反应液能被侧流胶体金试纸条检测出有核酸存在(右)，在空白对照中(水) 和在中东呼吸综合征冠状病毒MERS-CoV之N基因RNA(100pg)存在下不能被侧流胶体金试纸条检测出有核酸存在(左、中)。检测SARS-CoV-2之S基因的exo探针及引物只在 SARS-CoV-2之S基因RNA(100pg)存在下其反应液能被侧流胶体金试纸条检测出有核酸存在(右)，在空白对照中(水)和在中东呼吸综合征冠状病毒MERS-CoV之S基因RNA(100pg) 存在下不能被侧流胶体金试纸条检测出有核酸存在(左、中)。

SEQUENCE LISTING

<110> 哈尔滨工业大学

<120> 一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的探针和引物、试剂盒、检测方法及应用

<130>

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 49

<212> DNA

<213> N基因exo探针

<400> 1

tattattggg taaaccttgg ggccgacgtt gtttthatcg cgccccactg 50

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> N基因exo正向引物

<400> 2

tttggtggac cctcagattc aactggcagt aac 33

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> N基因exo反向引物

<400> 3

gaatttaagg tcttccttgc catgttgagt gag 33

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> N基因nfo探针

<400> 4

gcgatcaaaa caacgtcggc cccaaggttt acchaataat actgcgtct 49

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> N基因nfo正向引物

<400> 5

tttggtggac cctcagattc aactggcagt aac 33

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> N基因nfo反向引物

<400> 6

gaatttaagg tcttccttgc catgttgagt gag 33

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> S基因exo探针

<400> 7

cctgcataca ctaattcttt cacacgtggt gtthattacc ctgacaaagt t 51

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> S基因exo探针正向引物

<400> 8

gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc agaac 35

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> S基因exo探针反向引物

<400> 9

cattggaaaa gaaaggtaag aacaagtcct gag 33

<210> 10

<211> 46

<212> DNA

<213> S基因nfo探针

<400> 10

cctgcataca ctaattcttt cacacgtggt ghttattacc ctgacaa 47

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> S基因nfo探针正向引物

<400> 11

gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc agaac 35

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> S基因nfo探针反向引物

<400> 12

cattggaaaa gaaaggtaag aacaagtcct gag 33

<210> 13

<211> 315

<212> DNA

<213> 新冠病毒N基因序列

<400> 13

catatgtctg ataatggacc ccaaaatcag cgaaatgcac cccgcattac gtttggtgga 60

ccctcagatt caactggcag taaccagaat ggagaacgca gtggggcgcg atcaaaacaa 120

cgtcggcccc aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcaccgctct cactcaacat 180

ggcaaggaag accttaaatt ccctcgagga caaggcgttc caattaacac caatagcagt 240

ccagatgacc aaattggcta ctaccgaaga gctaccagac gaattcgtgg tggtgacggt 300

aaaatgtaaa agctt 315

<210> 14

<211> 267

<212> DNA

<213> 新冠病毒S基因序列

<400> 14

catatgtttg tttttcttgt tttattgcca ctagtctcta gtcagtgtgt taatcttaca 60

accagaactc aattaccccc tgcatacact aattctttca cacgtggtgt ttattaccct 120

gacaaagttt tcagatcctc agttttacat tcaactcagg acttgttctt acctttcttt 180

tccaatgtta cttggttcca tgctatacat gtctctggga ccaatggtac taagaggttt 240

gataaccctg tcctaccata aaagctt 267

Claims

1.一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的探针和引物，其特征在于，所述探针和引物为下述中的一种：

a.所述探针为N基因exo探针，用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的N基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，正向引物序列如SEQ ID No.2所示，反向引物序列如SEQ ID No.3所示；

b.所述探针为N基因nfo探针，用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的N基因，核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，正向引物序列如SEQ ID No.5所示，反向引物序列如SEQ ID No.6所示；

2.根据权利要求1所述的探针和引物，其特征在于，所述N基因exo探针的序列结构特征为：tattattgggtaaaccttggggccgacgttgtt/i6FAMdT/t/idSp/a/iBHQ1dT/cgcgccccactg-Phosphate；

所述N基因nfo探针的序列结构特征为：6-FAM-gcgatcaaaacaacgtcggccccaaggtttacc/idSp/aataatactgcgtct-Phosphate，对应的反向引物5’-端含有生物素标签；

所述S基因exo探针的序列结构特征为：cctgcatacactaattctttcacacgtggtg/iTAMdT/t/idSp/A/iBHQ2dT/taccctgacaaagtt-Phosphate；

所述S基因nfo探针的序列结构特征为：6-FAM-cctgcatacactaattctttcacacgtggtg/idSp/ttattaccctgacaa-Phosphate，对应的反向引物5’-端含有生物素标签；

3.一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的探针和引物组合，其特征在于，所述探针和引物组合由权利要求1中所述的用于检测新冠病毒SARS-CoV-2N基因的exo探针和引物与用于检测新冠病毒SARS-CoV-2S基因的exo探针和引物组成。

4.一种用于检测新冠病毒SARS-CoV-2的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1-2任意一项所述的探针和引物或权利要求3所述的探针和引物组合。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有阳性标准品，所述阳性标准品的制备方法为：

步骤2：将步骤1制备好的含病毒基因的质粒载体用限制性内切酶将病毒基因片段的3’-端切断，纯化得到线性化后的质粒；

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，当所述试剂盒含有权利要求1所述的探针和引物时：用于检测新冠病毒SARS-CoV-2N基因或S基因的exo探针浓度均为120-150nM，引物的工作浓度均为400-500nM；用于检测新冠病毒SARS-CoV-2N基因或S基因的nfo探针浓度均为120-150nM，引物的工作浓度均为400-500nM；当所述试剂盒含有权利要求2所述的探针和引物组合时，用于检测N基因和S基因的exo探针的工作浓度均为30nM，引物的工作浓度均为100nM。

7.一种检测病毒RNA的方法，其特征在于，所述方法为利用全程闭管RNA指数扩增法对病毒RNA进行检测；所述全程闭管RNA指数扩增法是指在同一个反应管中，在不开盖的条件下，分步完成逆转录RT与指数重组酶扩增ERA反应。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤如下：

1)逆转录RT：在反应管中，将病毒RNA核酸样品、RNA酶抑制剂、探针及引物、检测试剂、不含ERA激活剂的RT-ERA反应试剂混合，将ERA激活剂加在反应管瓶盖内，将反应管合盖后，置于37℃条件下60s进行逆转录反应，得到cDNA；

2)指数重组酶扩增ERA反应：将步骤1)逆转录后的反应管离心，使瓶盖中的ERA激活剂与步骤1)中所得到的反应液混合，然后于40℃并保持4min，振荡后离心，将反应管置于40℃下保持26min，得到核酸扩增液；

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述病毒为新冠病毒SARS-CoV-2；所述检测试剂为权利要求1-2任意一项所述的探针和引物或权利要求3所述的探针和引物组合。

10.权利要求1所述的探针和引物在制备检测新冠病毒SARS-CoV-2的试剂盒或试剂中的应用。