CN112877470A - 一种新冠病毒rpa反应体系及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新冠病毒RPA反应体系及其应用，包括M1扩增引物、M2扩增引物和探针、N扩增引物和探针、E扩增引物和探针，所述M1扩增引物的核酸序列为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5，所述M2扩增引物和探针的核酸序列分别为SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8，所述N扩增引物和探针的核酸序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3，所述E扩增引物和探针的核酸序列分别为SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11。本发明相对于现有技术，基于RPA技术，通过引物、探针及反应条件的优化，建立起RPA反应体系，可方便居民自行进行病毒检测，检测结果清晰易读。
Description
技术领域
本发明涉及一种病毒检测方法，特别是涉及一种新冠病毒RPA反应体系及其应用。
背景技术
新型冠状病毒症状一般为发热、乏力、干咳、严重者可导致死亡。对疫情防控来说最大的难点是潜伏期的感染人员，等到有发热症状才去医院检测。这过程周期长，容易造成病毒扩散，另外一方面发热居民去医院检测也容易造成交叉感染，导致原本不是该病毒感染的人群也被他人感染。因此，开发居民在家就可以进行初步检测的简易核酸检测试纸条意义重大。
发明内容
本发明提供了一种新冠病毒RPA反应体系，以方便居民在家中自行通过试纸进行新冠病毒检测。
本发明提供了一种新冠病毒RPA反应体系，所述新冠病毒RPA反应体系包括M1扩增引物、 M2扩增引物和探针、N扩增引物和探针、E扩增引物和探针，所述M1扩增引物的核酸序列为 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5，所述M2扩增引物和探针的核酸序列分别为SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8，所述N扩增引物和探针的核酸序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、 SEQ ID NO:3，所述E扩增引物和探针的核酸序列分别为SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11。
进一步地，所述RPA反应体系使用方法如下：
取新冠扩增引物和探针、DNA聚合酶、Buffer、ddwater与待测样本混合，并加入Mg2+溶液。
更进一步地，所述待测样本中核酸浓度不小于(30-50)*10-6ng/μL。
更进一步地，所述待测样本与RPA反应体系的体积比为1：30-60。
本发明还公开一种应用上述新冠病毒RPA反应体系的检测产品，还包括新冠病毒层析试纸条。
进一步地，所述检测产品的使用方法包括扩增过程，所述扩增过程包括：
取待测样本于RPA反应体系中，在30-45℃下反应3-15min，获得新冠扩增产物。
更进一步地，所述检测产品的使用方法还包括检测过程，所述检测过程为：
取新冠扩增产物于新冠病毒层析试纸条进行检测。
进一步地，所述新冠病毒层析试纸条为HybriDetect2T试纸条。
本发明相对于现有技术，基于RPA技术，通过引物、探针及反应条件的优化，敏感性等的研究建立起RPA反应体系，可方便居民自行进行RPA-LFD检测，使检测结果清晰易读。
附图说明
图1为本发明实施例M1、M2、N、E引物和探针的基因目的条带电泳图；
图2为本发明实施例M1、M2、N、E引物和探针5min、15min、20min、25min、35min的扩增电泳条带图；
图3为本发明实施例N引物和探针下，模板稀释103～1011倍的浓度梯度电泳条带图；
图4为本发明实施例N引物和探针下不同温度的电泳条带图；
图5为本发明实施例新冠病毒层析试纸条测试图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
本发明实施例新冠病毒RPA反应体系组份如下：
在使用时，按上表配好体系后，混匀，加入到
nfo试剂盒提供的含有冻干DNA 聚合酶的反应管中，加入2.5μLMg2+溶液反应即开始，Mg2+溶液为硫酸镁或氯化镁的溶液。
其中，M1扩增引物、M2扩增引物和探针、N扩增引物和探针、E扩增引物和探针分别为新冠M-1、M-2、N、E基因的引物和探针，引物信息如下：
采用M1扩增引物、M2扩增引物和探针、N扩增引物和探针、E扩增引物和探针对应的基因阳性质粒使用PCR扩增仪进行扩增反应，在琼脂糖电泳仪中进行电泳，结果如图1所示(由左至右依次为M1、M2、N、E基因目的条带)。
在M1、M2、N、E四对引物和探针反应体系下，设置5min、15min、20min、25min、35min的时间梯度，在39℃下反应。结果如图2所示，四对引物均在5min时可扩增出目的条带。
经测定，用于扩增的质粒(待测样本)中N基因质粒的核酸浓度为47.0ng/μL，计算后得出拷贝数为2.96*1011。对N基因质粒10、100、103…1011倍梯度稀释后，用作模板，进行RPA反应，如图3所示，N基因质粒稀释106倍浓度后，仍可扩增出目的条带，可实现微量检测。
以稀释106倍的N基因质粒做待测样本，分别在35℃、37℃、39℃、42℃下反应5min和10min，结果如图4所示，35℃下需10min才能扩增出条带，而37℃、39℃、42℃下5min即可扩增出条带。
本发明实施例检测产品还包括新冠病毒层析试纸条。
采用新冠病毒层析试纸条为HybriDetect2T试纸条，进行测试，过程如下：
选择稀释106倍的M2、N、E基因质粒在39℃下进行RPA反应10min，将扩增产物用侧向流层析试纸条检测，如图5所示，有明显的阳性条带产生。
本发明实施例基于RPA技术，通过引物、探针及反应条件的优化，敏感性等研究，建立起RPA 反应体系，可方便居民自行进行RPA-LFD检测，使检测结果清晰易读。同时，本发明实施例的检测灵敏度高，即使居民操作不当导致待测样品采集量少，也可进行有效扩增，降低操作难度。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。
Claims (9)
1.一种新冠病毒RPA反应体系，其特征在于，所述新冠病毒RPA反应体系包括M1扩增引物、M2扩增引物和探针、N扩增引物和探针、E扩增引物和探针，所述M1扩增引物的核酸序列为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5，所述M2扩增引物和探针的核酸序列分别为SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8，所述N扩增引物和探针的核酸序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3，所述E扩增引物和探针的核酸序列分别为SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11。
2.根据权利要求1所述一种新冠病毒RPA反应体系，其特征在于，所述RPA反应体系使用方法如下：
取新冠扩增引物和探针、DNA聚合酶、Buffer、ddwater与待测样本混合，并加入Mg2+溶液。
3.根据权利要求2所述一种新冠病毒RPA反应体系，其特征在于，所述待测样本中核酸浓度不小于(30-50)*10-6ng/μL。
4.根据权利要求2所述一种新冠病毒RPA反应体系，其特征在于，所述待测样本与RPA反应体系的体积比为1：30-60。
5.一种应用权利要求1-4任一项所述新冠病毒RPA反应体系的检测产品。
6.根据权利要求5所述检测产品，其特征在于，所述检测产品还包括新冠病毒层析试纸条。
7.根据权利要求6所述检测产品，其特征在于，所述检测产品的使用方法包括扩增过程，所述扩增过程包括：
取待测样本于RPA反应体系中，在30-45℃下反应3-15min，获得新冠扩增产物。
8.根据权利要求7所述一种新冠病毒RPA反应体系，其特征在于，所述检测产品的使用方法还包括检测过程，所述检测过程为：
取扩增产物于新冠病毒层析试纸条进行检测。
9.根据权利要求6所述一种新冠病毒RPA反应体系，其特征在于，所述新冠病毒层析试纸条为HybriDetect2T试纸条。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20210601 |