CN109234464A - 用于检测塞尼卡谷病毒的引物及探针、荧光定量pcr试剂盒及方法和应用 - Google Patents
用于检测塞尼卡谷病毒的引物及探针、荧光定量pcr试剂盒及方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于检测塞尼卡谷病毒的引物及探针、荧光定量PCR试剂盒及方法和应用，其中，引物的核苷酸序列如下：上游引物：5'GGCATGATCCCCCTAGCATA 3'，下游引物：5'GGCACGCTAAGGCCTAGCT 3'；探针的序列如下：5'FAM‑CTACAGCGGGAACTG‑MGB 3'。本发明的有益效果是：使用本发明的试剂盒能够快速、准确地实现对塞尼卡谷病毒的检测；本发明的试剂盒在3.15x101‑3.15x109copies·μL‑1模板范围内具有良好的线性关系，敏感性是常规PCR的10倍；特异性良好，与其他常见猪病病毒无交叉反应；重复性试验变异系数小于1.2%；与常规PCR方法相比，该方法对临床样品的阳性检出率更高；综上所述，该方法特异性强、灵敏度高、重复性好，为塞尼卡谷病毒的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。
Description
技术领域
本发明涉及病毒PCR检测技术领域，特别涉及一种用于检测塞尼卡谷病毒的引物及探针、荧光定量PCR试剂盒及PCR检测体系构建方法和应用。
背景技术
2015年9月以来，美国中西部多个地区的猪群暴发水疱性疾病，病情急促，新生仔猪感染后死亡率达30 %～70 %。经过病原学的鉴别诊断之后排除了猪水疱病、口蹄疫和水疱性口炎等疾病，最终证实该病与塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus，SVV)感染有关。
SVV，或称为 Senecavirus A (SVV)，属于小RNA病毒科，塞尼卡谷病毒属。猪感染SVV之后常表现为急性水疱症状，鼻吻出现水疱性病变，可见一个或多个充满液体的囊泡；囊泡破裂后转为溃疡，一般在SVV感染后的十至十五天形成结痂。水疱性病变或者溃疡性病变在冠状带周围和蹄冠部趾间比较常见，病变后会导致边缘上皮坏死，致使猪站立困难，甚至跛行。截至目前，美国、巴西、哥伦比亚、加拿大、泰国和中国等国家已出现SVV感染的病例，其他国家是否有感染情况还不清楚，但是现有研究显示近两年出现SVV感染案例的国家数目正在增加。
我国最早于2015年发现了由SVV感染导致的猪水泡性疾病，2016年首次报道分离到了SVV。目前，SVV在我国猪群中的发病情况及流行情况并不清楚。猪感染SVV后的临床症状与水泡性口炎、口蹄疫、猪水疱病、猪水泡疹等症状相似，可能会引起混淆。因此建立一种快速、准确的SVV实验室诊断方法对于SVV与其他疾病的鉴别诊断以及进一步了解SVV在我国猪群中的流行情况具有重要意义。
本发明根据GenBank中SVV基因序列设计一对特异性引物和一条特异性TaqMan-MGB探针，建立了一种快速检测SVV病毒载量的特异性TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。通过对反应条件和反应体系的优化，使得该方法在3.15x101-3.15x109copies·μL-1范围内具有良好的线性关系，敏感性是常规PCR方法的10倍。利用所建立的荧光定量PCR方法可以在2-3h内快速准确地对样品中的SVV进行检测，既能进行定性检测，又能准确定量。而且与常规PCR方法相比，该方法可对其结果进行实时监控，无需进一步进行凝胶电泳分析。该方法的建立为SVV的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。
发明内容
为了能够提供一种更加快速、特异及敏感的SVV检测方法，为SVV的快速特异性检测及其流行病学调查以及预防和控制我国SVV的流行提供可靠的技术工具，本发明提供了一种用于检测SVV的特异性引物及探针、荧光定量PCR试剂盒及方法和应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种用于SVV特异性检测用引物及探针，其中：
所述引物序列如下：
上游引物： 5' GGCATGATCCCCCTAGCATA 3'，
下游引物： 5' GGCACGCTAAGGCCTAGCT 3'；
所述探针序列如下所示：
5' FAM-CTACAGCGGGAACTG-MGB 3'。
为了更好的实现上述发明目的，本发明还提供了一种用于检测SVV的荧光定量PCR检测试剂，所述试剂包括以下组分：反应混合液、水和用于SVV特异性检测用引物和探针；
所述引物序列如下：
上游引物： 5' GGCATGATCCCCCTAGCATA 3'，
下游引物： 5' GGCACGCTAAGGCCTAGCT 3'；
所述探针序列如下所示：
5' FAM-CTACAGCGGGAACTG-MGB 3'。
其中，所述反应混合液为TaKaRa公司生产的Premix Ex Taq（Probe qPCR）。
所述水为TaKaRa公司生产的RNase-free Water。
一种制备检测SVV的荧光定量PCR试剂盒，为含有上述的荧光定量PCR检测试剂的试剂盒。
所述引物和探针或所述试剂或所述试剂盒，在检测SVV或制备检测SVV检测产品中的应用。
为了更好的实现上述发明目的，本发明还提供了一种用于检测SVV的荧光定量PCR检测体系的构建方法，所述构建方法包括：
（1）设计及合成引物和探针；其中，所述引物序列如下：
上游引物： 5' GGCATGATCCCCCTAGCATA 3'，
下游引物： 5' GGCACGCTAAGGCCTAGCT 3'；
所述探针序列如下所示：
5' FAM-CTACAGCGGGAACTG-MGB 3'；
（2）制备阳性质粒标准品；
（3）进行荧光定量PCR反应条件的优化，建立荧光定量PCR检测体系。
其中，所述步骤（2）具体为：
用DNA/RNA核酸共提试剂盒提取样品中的总RNA，取5.5μL总RNA、4μL 5×All-In-OneRT MasterMix和10.5μL RNase-free Water，混匀后进行反转录，反转录条件为25℃保持10min、42℃保持30min，所得产物为cDNA，可直接用于荧光定量PCR或置-20℃保存备用；
以上下游引物通过常规PCR扩增SVV目的基因，产物经回收试剂盒纯化后连接pMD19-T载体，转化至E.coliDH5α大肠杆菌，通过序列测定获得阳性克隆质粒即为质粒标准品；测定DNA浓度后，换算成拷贝数，并稀释至1010copies•μL-1，-20℃保存，用前稀释作为质粒标准品。
所述步骤（3）中，优化后的反应条件为：95℃ 2min；95℃ 15sec，60℃ 35sec，40个循环。
所述步骤（3）中，所述荧光定量PCR检测体系共为25μL，含12.5μL 2×Premix ExTaq（Probe qPCR），10μL RNase-free water，0.5μL Probe（10μM），0.5μL Primer F（10μM），0.5μL Primer R（10μM），1μL质粒标准品。
为了更好的实现上述发明目的，本发明还提供了一种用于检测SVV的荧光定量PCR检测方法，所述检测方法包括：
（1）设计及合成引物和探针；其中，所述引物序列如下：
上游引物： 5' GGCATGATCCCCCTAGCATA 3'，
下游引物： 5' GGCACGCTAAGGCCTAGCT 3'；
所述探针序列如下所示：
5' FAM-CTACAGCGGGAACTG-MGB 3'；
（2）制备阳性质粒标准品；
（3）进行荧光定量PCR反应条件的优化，建立荧光定量PCR检测体系；
（4）采用荧光定量PCR检测体系对病毒进行检测。
其中，所述步骤（2）具体为：
用DNA/RNA核酸共提试剂盒提取样品中的总RNA，取5.5μL总RNA、4μL 5×All-In-OneRT MasterMix和10.5μL RNase-free Water，混匀后进行反转录，反转录条件为25℃保持10min、42℃保持30min，所得产物为cDNA，可直接用于荧光定量PCR或置-20℃保存备用；
以上下游引物通过常规PCR扩增SVV目的基因，产物经回收试剂盒纯化后连接pMD19-T载体，转化至E.coliDH5α大肠杆菌，通过序列测定获得阳性克隆质粒即为质粒标准品；测定DNA浓度后，换算成拷贝数，并稀释至1010copies•μL-1，-20℃保存，用前稀释作为质粒标准品。
所述步骤（3）中，优化后的反应条件为：95℃ 2min；95℃ 15sec，60℃ 35sec，40个循环。
所述步骤（3）中，所述荧光定量PCR检测体系共为25μL，含12.5μL 2×Premix ExTaq（Probe qPCR），10μL RNase-free water，0.5μL Probe（10μM），0.5μL Primer F（10μM），0.5μL Primer R（10μM），1μL质粒标准品。
本发明的有益效果是：本发明的引物和探针是根据GenBank中塞尼卡谷病毒序列设计出的一对特异性引物和一条特异性TaqMan-MGB探针，并建立了一种快速、准确检测SVV病毒载量的特异性TaqMan-MGB荧光定量PCR方法，使得该方法在3.15x101-3.15x109copies·μL-1范围内具有良好的线性关系，敏感性是常规PCR方法的10倍；而且与常规PCR方法相比，该方法可对其结果进行实时监控，无需进一步进行凝胶电泳分析；将待检样品提取RNA反转录成cDNA之后进行荧光定量PCR反应，可以在2-3h内快速准确地对样品中的SVV进行检测，既能进行定性检测，又能准确定量；进一步地，通过试验表明，利用本发明引物和探针构建的荧光定量PCR检测方法，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优势，为SVV的早期快速检测，及其流行病学调查以及预防和控制我国SVV的流行提供快速、简便和可靠的技术工具。
附图说明
图1 为本发明实施例6中SVV TaqMan-MGB荧光定量PCR动力学曲线图；其中，1-9分别为3.15x109-3.15x101copies·μL-1的标准品。
图2为本发明实施例6中SVV TaqMan-MGB荧光定量PCR标准曲线图。
图3 为本发明实施例6中SVV TaqMan-MGB荧光定量PCR特异性试验结果的示意图；其中，1：SVV；2-10分别为CSFV, PRRSV, PRV, PEDV, TGEV, RV, PPV, PCV2和阴性对照。
图4 为本发明实施例6中SVV常规PCR敏感性试验结果的示意图；其中，M：DL2000Marker；1-6分别为：稀释度为3.66×105-3.42×101copies•μL-1的SVV cDNA和阴性对照。
具体实施方式
本发明根据GenBank中塞尼卡谷病毒基因序列设计一对特异性引物和一条特异性TaqMan-MGB探针，建立了一种快速检测SVV病毒载量的特异性TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。通过对反应条件和反应体系的优化，使得该方法在3.15x101-3.15x109copies·μL-1范围内具有良好的线性关系，敏感性是常规PCR方法的10倍。而且与常规PCR方法相比，该方法可对其结果进行实时监控，无需进一步进行凝胶电泳分析。
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。
实施例1 引物及探针
本发明实施例提供了一种用于SVV特异性检测用引物及探针，其中：
所述引物序列如下：
上游引物： 5' GGCATGATCCCCCTAGCATA 3'，
下游引物： 5' GGCACGCTAAGGCCTAGCT 3'；
所述探针序列如下所示：
5' FAM-CTACAGCGGGAACTG-MGB 3'。
实施例2 荧光定量PCR检测试剂
本发明实施例提供了一种用于检测SVV的荧光定量PCR检测试剂，所述试剂包括以下组分：反应混合液、水和用于检测SVV的引物和探针；其中，
所述引物序列如下：
上游引物： 5' GGCATGATCCCCCTAGCATA 3'，
下游引物： 5' GGCACGCTAAGGCCTAGCT 3'；
所述探针序列如下所示：
5' FAM-CTACAGCGGGAACTG-MGB 3'。
反应混合液为TaKaRa公司生产的Premix Ex Taq（Probe qPCR）；水为TaKaRa公司生产的RNase-free Water。
实施例3 荧光定量PCR试剂盒
本发明实施例提供了一种制备检测SVV的荧光定量PCR试剂盒，具体为含有实施例2荧光定量PCR检测试剂的试剂盒。
实施例4 PCR检测体系的构建方法
本发明实施例提供了一种用于检测塞尼卡谷病毒的荧光定量PCR检测体系的构建方法，包括：
（1）设计及合成引物和探针；
所述引物序列如下：
上游引物： 5' GGCATGATCCCCCTAGCATA 3'，
下游引物： 5' GGCACGCTAAGGCCTAGCT 3'；
所述探针序列如下所示：
5' FAM-CTACAGCGGGAACTG-MGB 3'；
（2）制备阳性质粒标准品；
（3）进行荧光定量PCR反应条件的优化，建立荧光定量PCR检测体系。
其中，所述步骤（2）具体为：
用DNA/RNA核酸共提试剂盒提取样品中的总RNA，取5.5μL总RNA、4μL 5×All-In-OneRT MasterMix和10.5μL RNase-free Water，混匀后进行反转录，反转录条件为25℃保持10min、42℃保持30min，所得产物为cDNA，可直接用于荧光定量PCR或置-20℃保存备用；
以上下游引物通过常规PCR扩增SVV目的基因，产物经回收试剂盒纯化后连接pMD19-T载体，转化至E.coliDH5α大肠杆菌，通过序列测定获得阳性克隆质粒即为质粒标准品；测定DNA浓度后，换算成拷贝数，-20℃保存，用前稀释作为质粒标准品。
步骤（3）中，优化后的反应条件为95℃ 2min；95℃ 15sec，60℃ 35sec，40个循环。
步骤（3）中，所述荧光定量PCR检测体系共为25μL，含12.5μL 2×Premix Ex Taq（Probe qPCR），10μL RNase-free water，0.5μL Probe（10μM），0.5μL Primer F（10μM），0.5μL Primer R（10μM），1μL质粒标准品。
实施例5 荧光定量PCR检测方法
本发明实施例提供了一种用于检测SVV的荧光定量PCR检测方法，检测方法包括：
（1）设计及合成引物和探针；
所述引物序列如下：
上游引物： 5' GGCATGATCCCCCTAGCATA 3'，
下游引物： 5' GGCACGCTAAGGCCTAGCT 3'；
所述探针序列如下所示：
5' FAM-CTACAGCGGGAACTG-MGB 3'；
（2）制备阳性质粒标准品；
（3）进行荧光定量PCR反应条件的优化，建立荧光定量PCR检测体系；
（4）采用荧光定量PCR检测体系对病毒进行检测。
其中，所述步骤（2）具体为：
用DNA/RNA核酸共提试剂盒提取样品中的总RNA，取5.5μL总RNA、4μL 5×All-In-OneRT MasterMix和10.5μL RNase-free Water，混匀后进行反转录，反转录条件为25℃保持10min、42℃保持30min，所得产物为cDNA，可直接用于荧光定量PCR或置-20℃保存备用；
以上下游引物通过常规PCR扩增SVV目的基因，产物经回收试剂盒纯化后连接pMD19-T载体，转化至E.coliDH5α大肠杆菌，通过序列测定获得阳性克隆质粒即为质粒标准品；测定DNA浓度后，换算成拷贝数，-20℃保存，用前稀释作为质粒标准品。
步骤（3）中，优化后的反应条件为95℃ 2min；95℃ 15sec，60℃ 35sec，40个循环。
步骤（3）中，所述荧光定量PCR检测体系共为25μL，含12.5μL 2×Premix Ex Taq（Probe qPCR），10μL RNase-free water，0.5μL Probe（10μM），0.5μL Primer F（10μM），0.5μL Primer R（10μM），1μL质粒标准品。
实施例6 应用
本实施例提供了一种引物和探针、或荧光定量PCR检测试剂、或荧光定量PCR试剂盒，用于SVV特异性检测的应用，具体如下：
1材料与方法
1.1仪器与试剂
CFX96荧光定量PCR仪购自Bio-Rad公司，紫外分光光度计购自Thermo公司；质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂购自AxyGen公司；DNA/RNA核酸共提试剂盒购自invitrogen公司；E.coliDH5α、Premix Ex Taq（Probe qPCR）、RNase-free Water购自TaKaRa公司。
1.2引物和探针
特异性引物对和TaqMan-MGB荧光探针具体如下：
引物对的序列如下：
上游引物： 5' GGCATGATCCCCCTAGCATA 3'，
下游引物： 5' GGCACGCTAAGGCCTAGCT 3'；
所述探针序列如下所示：
5' FAM-CTACAGCGGGAACTG-MGB 3'。探针5'端标记的荧光报告基团是FAM，3'端标记荧光淬灭基团为 Non-fluorescent quencher和Minor Groove Binder (MGB)。
1.3病毒RNA提取、反转录和质粒标准品制备
用DNA/RNA核酸共提试剂盒提取样品中的总RNA，取5.5μL总RNA、4μL 5×All-In-OneRT MasterMix和10.5μL RNase-free Water，混匀后进行反转录，反转录条件为25℃保持10min、42℃保持30min，所得产物为cDNA，可直接用于荧光定量PCR或置-20℃保存备用；
以上下游引物通过常规PCR扩增SVV目的基因，产物经回收试剂盒纯化后连接pMD19-T载体，转化至E.coliDH5α大肠杆菌，通过序列测定获得阳性克隆质粒即为质粒标准品；测定DNA浓度后，换算成拷贝数，-20℃保存，用前稀释作为质粒标准品。
1.4 荧光定量PCR反应条件的优化
以质粒标准品为模板，在不同退火温度下进行常规PCR反应，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，确定最佳的引物退火温度。应用矩阵法对荧光定量PCR的引物和探针浓度进行优化，以得到最佳的反应体系和反应条件。
1.5荧光定量PCR标准曲线的建立
将质粒标准品10倍倍比稀释至浓度范围为3.15x101-3.15x109copies·μL-1，进行荧光定量PCR检测，绘制标准曲线。
1.6 特异性试验
利用建立的荧光定量PCR方法对猪瘟病毒（CSFV），猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），猪伪狂犬病毒（PRV），猪流行性腹泻病毒（PEDV），猪传染性胃肠炎病毒（TGEV），轮状病毒（RV），猪细小病毒（PPV）和猪圆环病毒2型（PCV2）等病毒的cDNA或DNA进行检测验证该方法的特异性。
1.7敏感性试验
将SVV阳性cDNA按10倍倍比稀释至最低浓度为3.66x101copies•μL-1，进行常规PCR反应，上下游引物分别为5' CGGAAAGCGCTGTAACCACA 3'和5' TTCAAAGGTGCCAGAGGCTG 3'。取扩增产物10μL，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，比较两种检测方法敏感性的差异。
1.8重复性试验
用5种浓度的标准品质粒分别进行4次批次内和批次间的重复性试验并且根据Ct值计算变异系数。
1.9对临床样品的检测
由新希望六和动保中心收集可疑SVV临床样品30份，分别进行荧光定量PCR检测和常规PCR检测，比较分析结果。
2 结果
2.1 质粒标准品的制备
以上下游引物通过常规PCR扩增SVV目的基因，扩增结果如图1所示，产物经回收试剂盒纯化后连接pMD19-T载体，转化至E.coliDH5α大肠杆菌，通过序列测定获得阳性克隆质粒即为质粒标准品。测定DNA浓度后，换算成拷贝数，-20℃保存，用前稀释作为质粒标准品。
2.2荧光定量PCR反应条件的优化
通过对退火温度及引物与探针浓度的优化，最终确定了荧光定量PCR方法的最优反应条件。荧光定量PCR反应体系共为25μL，含12.5μL 2×Premix Ex Taq（Probe qPCR），10μLRNase-free water，0.5μL Probe（10μM），0.5μL Primer F（10μM），0.5μL Primer R（10μM），1μL质粒标准品。反应条件为：95℃ 2min；95℃ 15sec，60℃ 35sec，40个循环。
2.3 荧光定量PCR标准曲线的建立
取浓度为3.15x101-3.15x109copies·μL-1的标准品质粒为模板进行荧光定量PCR扩增并建立标准曲线。由图1和图2可知，线性关系良好，标准曲线建立成功，可用于临床检测。
2.4 特异性试验
用所建立的荧光定量PCR方法对CSFV，PRRSV，PRV，PEDV，TGEV，RV，PPV和PCV2进行检测，检测结果均为阴性，说明所建立的荧光定量方法与这些病毒无交叉反应（图3），试验结果表明该方法具有良好的特异性。
2.5敏感性试验
荧光定量PCR方法能检出的cDNA模板最低浓度为3.15x101copies•μL-1（图1），而常规PCR能检出的模板最低浓度为3.66×102copies•μL-1（图4），试验结果表明所建立的荧光定量PCR方法的敏感性是常规PCR方法的10倍左右。
2.6 重复性试验
用5种不同浓度的标准品分别进行批次内和批次间的重复性试验。试验结果表明，批次内和批次间重复性试验的变异系数均小于1.2%（表1），表明该方法具有良好的重复性与稳定性。
表1 SVV TaqMan-MGB荧光定量PCR重复性试验结果
2.7 临床样品检测结果
对收集的疑似SVV临床样品30份，分别进行荧光定量PCR检测和常规PCR检测。检测结果表明，荧光定量PCR方法阳性检出率（20%）比常规PCR方法（16.7%）更高（表2）。对临床样品的检测结果表明所建立的荧光定量方法比常规方法具有更高的敏感性，更适用于SVV的临床检测，尤其是感染早期病毒含量较低时。
表2 临床样品检测结果
综上，通过上述将本发明的引物、探针应用于塞尼卡谷病毒特异性检测以及样品结果，能够看出，采用本发明的引物、探针构建的荧光定量PCR检测方法与其它猪病病毒无交叉反应，具有良好的特异性；敏感性是常规PCR方法的10倍；利用所建立的荧光定量PCR方法可以在2-3h内快速准确地对样品中的SVV进行检测，既能进行定性检测，又能准确定量。具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优势，为SVV的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.用于检测塞尼卡谷病毒的引物及探针，其特征在于，
所述引物序列如下所示：
上游引物： 5' GGCATGATCCCCCTAGCATA 3'，
下游引物： 5' GGCACGCTAAGGCCTAGCT 3'；
所述探针序列如下所示：
5' FAM-CTACAGCGGGAACTG-MGB 3'。
2.用于检测塞尼卡谷病毒的荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，所述试剂包括以下组分：反应混合液、水和用于检测塞尼卡谷病毒的引物和探针；
所述引物序列如下：
上游引物： 5' GGCATGATCCCCCTAGCATA 3'，
下游引物： 5' GGCACGCTAAGGCCTAGCT 3'；
所述探针序列如下所示：
5' FAM-CTACAGCGGGAACTG-MGB 3'。
3.根据权利要求2所述的用于检测塞尼卡谷病毒的荧光定量PCR检测试剂，其特征在于，所述反应混合液为TaKaRa公司生产的Premix Ex Taq（Probe qPCR）。
4.根据权利要求2或3所述的用于检测塞尼卡谷病毒的PCR检测试剂，其特征在于，所述水为TaKaRa公司生产的RNase-free Water。
5.一种制备检测塞尼卡谷病毒的荧光定量PCR试剂盒，为含有权利要求2-4任一项所述的荧光定量PCR检测试剂的试剂盒。
6.如权利要求1所述引物及探针、或如权利要求2-4任一项所述检测试剂、或如权利要求5所述试剂盒，在检测塞尼卡谷病毒或制备检测塞尼卡谷病毒检测产品中的应用。
7.用于检测塞尼卡谷病毒的荧光定量PCR检测体系的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
（1）设计合成引物和探针；其中，所述引物的核苷酸序列如下：
上游引物： 5' GGCATGATCCCCCTAGCATA 3'，
下游引物： 5' GGCACGCTAAGGCCTAGCT 3'；
所述探针序列如下所示：
5' FAM-CTACAGCGGGAACTG-MGB 3'；
（2）制备阳性质粒标准品；
（3）进行荧光定量PCR反应条件的优化，建立荧光定量PCR检测体系。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（2）具体为：
用DNA/RNA核酸共提试剂盒提取样品中的总RNA，取5.5μL总RNA、4μL 5×All-In-OneRT MasterMix和10.5μL RNase-free Water，混匀后进行反转录，反转录条件为25℃保持10min、42℃保持30min，所得产物为cDNA，可直接用于荧光定量PCR或置-20℃保存备用；
以上下游引物通过常规PCR扩增塞尼卡谷病毒目的基因，产物经回收试剂盒纯化后连接pMD19-T载体，转化至E.coliDH5α大肠杆菌，通过序列测定获得阳性克隆质粒即为质粒标准品；测定DNA浓度后，换算成拷贝数，并稀释至1010copies•μL-1，-20℃保存，用前稀释作为质粒标准品。
9.根据权利要求7或8所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中，优化后的反应条件为： 95℃ 2min；95℃ 15sec，60℃ 35sec，40个循环。
10.根据权利要求7-9任一项所述的构建方法，其特征在于，所述步骤（3）中，所述荧光定量PCR检测体系共为25μL，含12.5μL 2×Premix Ex Taq（Probe qPCR），10μL RNase-freewater，0.5μL Probe（10μM），0.5μL Primer F（10μM），0.5μL Primer R（10μM），1μL质粒标准品。
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|---|---|
| CN (1) | CN109234464A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110229933A (zh) * | 2019-06-24 | 2019-09-13 | 派生特（福州）生物科技有限公司 | 一种用于猪赛内卡病毒巢式rt-pcr检测的引物组、试剂盒及应用 |
| CN113201598A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-08-03 | 中国动物卫生与流行病学中心 | 一种用于检测多种猪源性病原的液相芯片 |
| CN114262755A (zh) * | 2022-01-05 | 2022-04-01 | 云南瑞栢泰生物科技有限公司 | 一种针对塞尼卡谷病毒的核酸快速检测方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005030139A2 (en) * | 2003-09-26 | 2005-04-07 | Novartis Ag | Seneca valley virus based compositions and methods for treating disease |
| CN105925728A (zh) * | 2016-06-01 | 2016-09-07 | 华南农业大学 | 一种塞内加谷病毒实时荧光定量pcr检测引物及试剂盒 |
| CN106916910A (zh) * | 2017-05-10 | 2017-07-04 | 广东温氏食品集团股份有限公司 | 塞尼卡谷病毒TaqMan‑MGB荧光定量PCR检测引物、探针及检测方法 |
| WO2017197207A1 (en) * | 2016-05-11 | 2017-11-16 | Ohio State Innovation Foundation | Oncolytic viruses comprising esrage and methods of treating cancer |
-
2018
- 2018-11-23 CN CN201811405229.8A patent/CN109234464A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005030139A2 (en) * | 2003-09-26 | 2005-04-07 | Novartis Ag | Seneca valley virus based compositions and methods for treating disease |
| WO2017197207A1 (en) * | 2016-05-11 | 2017-11-16 | Ohio State Innovation Foundation | Oncolytic viruses comprising esrage and methods of treating cancer |
| CN105925728A (zh) * | 2016-06-01 | 2016-09-07 | 华南农业大学 | 一种塞内加谷病毒实时荧光定量pcr检测引物及试剂盒 |
| CN106916910A (zh) * | 2017-05-10 | 2017-07-04 | 广东温氏食品集团股份有限公司 | 塞尼卡谷病毒TaqMan‑MGB荧光定量PCR检测引物、探针及检测方法 |
Non-Patent Citations (9)
| Title |
|---|
| ALEXA J. BRACHTL等: "Real-Time Reverse Transcription PCR Assay for Detection of Senecavirus A in Swine Vesicular Diagnostic Specimens", 《PLOS ONE》 * |
| KOSTER,L.G.等: "Seneca valley virus strain 11-55910-3, complete genome", 《GENBANK》 * |
| 刘灿等: "高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立", 《中国兽药杂志》 * |
| 宋建领等: "猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用", 《中国兽医学报》 * |
| 樊晓旭等: "塞尼卡谷病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立", 《中国预防兽医学报》 * |
| 邓力等: "猪瘟兔化弱毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用", 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 * |
| 邱昌庆等: "《动物疫病基因工程疫苗研究与进展》", 31 December 2005, 中国农业出版社 * |
| 陈超等: "《生物技术检验检疫实践教程》", 31 March 2016, 华南理工大学出版社 * |
| 霍红等: "猪流行性乙型脑炎病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立", 《中国预防兽医学报》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110229933A (zh) * | 2019-06-24 | 2019-09-13 | 派生特（福州）生物科技有限公司 | 一种用于猪赛内卡病毒巢式rt-pcr检测的引物组、试剂盒及应用 |
| CN110229933B (zh) * | 2019-06-24 | 2022-06-07 | 派生特（福州）生物科技有限公司 | 一种用于猪赛内卡病毒巢式rt-pcr检测的引物组、试剂盒及应用 |
| CN113201598A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-08-03 | 中国动物卫生与流行病学中心 | 一种用于检测多种猪源性病原的液相芯片 |
| CN113201598B (zh) * | 2020-12-25 | 2022-07-22 | 中国动物卫生与流行病学中心 | 一种用于检测多种猪源性病原的液相芯片 |
| CN114262755A (zh) * | 2022-01-05 | 2022-04-01 | 云南瑞栢泰生物科技有限公司 | 一种针对塞尼卡谷病毒的核酸快速检测方法 |
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