CN112094944A - 一种定量检测新型冠状病毒拷贝数的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种定量检测新型冠状病毒拷贝数的试剂盒，所述试剂盒包括核酸提取试剂盒和核酸扩增试剂盒，其中核酸提取试剂盒采用磁珠法对样本进行快速核酸裂解吸附，核酸扩增试剂盒采用荧光定量RT‑PCR技术进行定量分析，同时设计了最合适的引物和探针序列，并采用了含有SARS‑CoV‑2和HCV基因片段的假病毒作为标准品，通过具备国际标准品的HCV来定标检测假病毒原液SARS‑CoV‑2病毒含量，非常准确表征标准品的拷贝数，克服了荧光PCR分析CT值的相对判断标准的不准确性，进一步提升了新型冠状病毒核酸检测效果，提高了检测灵敏度。本发明提供的定量检测新型冠状病毒拷贝数的试剂盒具有较高的灵敏度和特异性、能精确定量新型冠状病毒拷贝数，操作简便，结果准确可靠。

Description

一种定量检测新型冠状病毒拷贝数的试剂盒
技术领域
本发明属于分子诊断生物学技术领域，涉及一种定量检测新型冠状病毒拷贝数的试剂盒。
背景技术
近日关于新冠肺炎无症状感染者是否引发我国疫情反弹，成为社会广泛关注的热点问 题。部分重型、危重型COVID-19患者经治疗后病情好转，但往往因高龄、免疫功能低下、 结构性肺病，或由于病情严重致肺部纤维化导致肺部结构改变，造成血液循环灌注不全面， 导致部分隐藏的病毒未完全被清除，或者细胞仍为带毒状态，但机体排毒量尚未达到核酸 检测阳性所需的病毒量，若此时机体免疫力低下，未被完全杀死的病毒可能复发、再燃， 导致病情反复。因此在临床中，检测患者体内SARS-CoV-2载量很有必要。
随着近年来分子生物学诊断技术迅猛发展，荧光定量PCR技术成为传染病病原基因诊断方法中越来越受到关注的一种重要手段。荧光定量PCR(FQ-PCR)技术是一种目前国内外应用较为广泛的定量PCR技术，是通过始点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现的，其中以TaqMan探针法标记的FQ-PCR技术应用最广泛。该技术克服了传统检测技术由于样品病原含量较低带来的检测难度，在数小时内即可确定传染病病原体的种类，具有灵敏度高、特异性强、线性关系好、操作简单、自动化程度高、防污染并且高通量、快速等特点，现已广泛应用于人类和动物传染性疾病的定性定量检测。在RNA病毒的 RT-PCR检测中，影响试验过程的因素较多，如操作误差、设备误差、试剂差异、样本本身的处理差异，均可能会造成试验结果的不同，可能还有假阴、阳性出现。因此，RT-PCR 测定必须使用质控品进行严格的质量控制，才能保证结果的可靠性。此外，进行定量测定，必须有定量的标准品或内标。由于天然病毒潜在的传染危险性及其RNA分子的不稳定性，目前应用的质控品如灭活的病毒颗粒、cDNA、质粒DNA、裸露的RNA以及体外转录RNA，都难以达到试验要求，所以研制稳定可靠、无生物传染性的质控物和标准品，不但对RNA 病毒的RT-PCR检测，而且对商品化的病毒RT-PCR试剂盒的评价都具有重要意义。
在这样的背景下，通过假病毒包装技术制备标准品将会是一种非常安全可靠的研究手段。假病毒(pseudotype virus)，是指种病毒拥有自己的遗传物质，囊膜上却包被有另一种病毒的糖蛋白，因而具有了另一种病毒的感染特征。假型病毒与提供囊膜蛋白的真病毒一样，对宿主细胞有同样的侵染性。这种基因型和表现型不一致的现象叫假型，具有这种特征的病毒叫假病毒，这种病毒只能进行“一个细胞周期”的侵染，生物安全性比较强。以逆转录病毒载体为基础，将要包装的外源基因结合报告基因通过转染，将外源基因整合到宿主细胞基因组中实现稳定表达(建立细胞系)或瞬时表达的目的。通过逆转录病毒的复制，以及载体提供的包装信号，即可得到一种外源基因被逆转录病毒衣壳包裹的复制缺陷型的假病毒颗粒。使用内含目的RNA的假病毒颗粒作为RNA病毒荧光定量RT-PCR检测的质控品和标准品不仅无生物传染危险性，而且在核酸提取中，对病原体内RNA有很好的模拟作用，同时假病毒RNA不易对实验仪器和环境造成交叉污染而导致假阳性结果，避免了以往研制的商品化试剂盒中常用质粒标准品不能很好地对样品进行处理及对逆转录过程进行有效控制的问题。因此作为试剂盒的阳性参考品，构建一种可以模拟病毒从RNA至核酸扩增全过程的阳性参考品是一种很好的解决方法。
CN111378785A公开了采用新型冠状病毒的RdRp、Gene E和Gene N基因构建的假病毒作为标准品，并采用q-PCR进行定量检测新型冠状病毒，但由于SARS-CoV-2目前尚没有国际标准品，因此采用含有SARS-CoV-2基因的假病毒仍然难以精确定量新型冠状病毒拷贝数；由于还需提取假病毒的RNA，反转录成DNA，再进一步进行PCR反应；另外还需要利用CDC和WHO的引物、探针的检测体系，对假病毒的目的基因拷贝数开展ddPCR的绝对定量，进而用于核酸诊断2019-nCoV的试剂盒的性能评价中，为检测过程带来了很多不便，但定量的新型冠状病毒拷贝数仍存在不够精确的风险。
目前市面的COVID-19核酸检测试剂盒的核酸提取过程复杂，耗时长，灵敏度低，难以精确定量新型冠状病毒拷贝数。而且目前还没有关于新型冠状病毒的磁珠核酸提取和RT-PCR定量检测，精确定量新型冠状病毒拷贝数的试剂盒的相关报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种高灵敏度和特异性、能精确定量新型冠状病毒拷贝数的新型冠状病毒RT-PCR定量检测试剂盒。该试剂盒在实践中既可以对感染SARS-CoV-2 病毒的人群进行早期临床诊断，也可以对病人的治疗情况进行定量检测，效果极为良好。
本发明采用磁珠法对样本进行快速核酸裂解吸附，并采用荧光定量RT-PCR技术，即通过实时监控PCR体系中的荧光信号，对样本中的初始模板进行定量分析，同时设计了最合适的引物和探针序列，并采用了含有COVID-19和HCV基因片段的假病毒作为标准品，通过具备国际标准品的HCV来定标检测，进一步提升了新型冠状病毒核酸检测效果，提高了检测灵敏度。
由于采用磁珠法提取新型冠状病毒核酸的过程中，受磁珠吸附核酸效率和磁珠碰撞效率的影响，更适用于微量核酸的提取；定量RT-PCR可实时检测产物量，通过加入已知浓度的假病毒标准品绘制标准曲线，然后根据待测样品在标准曲线中的位置推算初始模板的浓度。它操作简便，结果准确可靠，是一种新的临床检测方法。
一方面，本发明提供了含有SARS-CoV-2和HCV基因片段的假病毒标准品用于制备定量检测新型冠状病毒拷贝数试剂盒的用途。
进一步地，所述假病毒标准品的基因含有由SARS-CoV-2的ORF1ab和N保守区以及HCV保守区基因序列串联并合成的目标基因CoV/HCV RNA，CoV/HCV RNA的序列如序列表中Seq ID NO.10。
经过实验证明，选用自新型冠状病毒的ORF1ab基因和N基因的序列片段，并设计合适的的引物和探针，进行新型冠状病毒核酸提取检测时，能够明显提高检测灵敏度。
假病毒标准品中串联有HCV保守区基因，可通过具备国际标准品的HCV来定标检测假病毒原液SARS-CoV-2病毒含量，从而非常准确表征标准品的拷贝数。
进一步地，所述假病毒标准品的制备方法为：
1)将MS2噬菌体、SARS-CoV-2的ORF1ab和N保守区、HCV的保守区基因序列串联并合成目标基因MS2-CoV/HCV；
2)将MS2-CoV/HCV基因插入原核表达载体pET-28b中，构建pET-28b-MS2-CoV/HCV重组质粒；
3)将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒并双酶切鉴定，经IPTG诱导培养后经SDS-PAGE鉴定表达情况，纯化后得到CoV/HCV RNA；
其中，ORF1ab保守区基因序列如Seq ID NO.7所示，N保守区基因序列如Seq IDNO.8 所示，HCV保守区基因序列如Seq ID NO.9所示，MS2-CoV/HCV、pET-28b-MS2-CoV/HCV的序列如序列表中Seq ID NO.11、Seq ID NO.12所示。
另一方面，本发明提供了一种定量检测新型冠状病毒拷贝数的试剂盒，所述试剂盒包括含有SARS-CoV-2和HCV基因片段的假病毒标准品。
再一方面，本发明提供了一种定量检测新型冠状病毒拷贝数的试剂盒，所述试剂盒包括两组引物和探针，所述两组引物和探针分别为：
第一组
对应于ORF1ab基因的正向引物的序列如序列表中Seq ID NO.1所示；
对应于ORF1ab基因的反向引物的序列如序列表中Seq ID NO.2所示；
对应于ORF1ab基因的探针序列如序列表中Seq ID NO.3所示；
第二组
对应于N基因的正向引物的序列如序列表中Seq ID NO.4所示；
对应于N基因的反向引物的序列如序列表中Seq ID NO.5所示；
对应于N基因的探针序列如序列表中Seq ID NO.6所示。
进一步地，所述试剂盒还包括含有SARS-CoV-2和HCV基因片段的假病毒标准品。
进一步地，所述假病毒标准品的基因含有由SARS-CoV-2的ORF1ab和N保守区以及HCV保守区基因序列串联并合成的目标基因CoV/HCV RNA。
进一步地，所述假病毒标准品的制备方法为：
1)将MS2噬菌体、SARS-CoV-2的ORF1ab和N保守区、HCV的保守区基因序列串联并合成目标基因MS2-CoV/HCV；
2)将MS2-CoV/HCV基因插入原核表达载体pET-28b中，构建pET-28b-MS2-CoV/HCV重组质粒；
3)将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒并双酶切鉴定，经IPTG诱导培养后经SDS-PAGE鉴定表达情况，纯化后得到CoV/HCV RNA。
进一步地，所述试剂盒还含有HCV国际标准品。
本发明试剂盒中的阳性标准品是利用装甲RNA技术制备一种包装有SARS-CoV-2和HCV保守基因片段的噬菌体样假病毒颗粒。通过具备国际标准品的HCV来定标检测假病毒原液SARS-CoV-2病毒含量，非常准确表征标准品的拷贝数，克服了PCR分析CT值的相对判断标准的不准确性。
进一步地，所述试剂盒还包括第三组内标引物和探针为：
对应于β-Globin基因正向引物的序列如序列表中Seq ID NO.13所示；
对应于β-Globin基因的反向引物的序列如序列表中Seq ID NO.14所示；
对应于β-Globin基因的探针序列如序列表中Seq ID NO.15所示；
进一步地，所述的三组探针还包括荧光发生基因和荧光淬灭基因，其中对应于ORF1ab 基因的探针的荧光发生基因为FAM，荧光淬灭基因为BHQ1；对应于N基因的探针的荧光发生基因为ROX，荧光淬灭基因为BHQ1；对应于β-Globin基因的探针的荧光发生基因为VIC，荧光淬灭基因为BHQ1。
进一步地，所述试剂盒还包括裂解液、清洗液、洗脱液、蛋白酶K、磁珠。
本发明提供的定量检测新型冠状病毒拷贝数试剂盒，包括核酸提取试剂盒和核酸扩增试剂盒，其中的核酸提取试剂盒包括裂解液、清洗液、洗脱液、蛋白酶K、磁珠。
本发明的试剂盒对样本处理采用磁珠法提取病毒核酸，裂解液中含强有力的蛋白质变性剂，迅速溶解蛋白质，使核酸释放出来；释放出来的核酸成分可以结合在磁珠上；随后通过多次洗涤的作用，将蛋白质、无机盐离子和多种有机杂质去除；最后用洗脱液将纯化后的核酸洗脱下来。将该技术应用于本试剂盒后，一方面避免了传统方法中使用酚、氯仿、异戊醇等有毒试剂，另一方面引入机械化操作，减少了人为操作因素对结果的影响。
进一步地，所述裂解液为硫氰酸胍溶液；清洗液为乙醇溶液；洗脱液为低盐缓冲液或水。
进一步地，所述裂解液为0.5mol/L～1mol/L的硫氰酸胍溶液；清洗液包括清洗液Ⅰ和清洗液Ⅱ，清洗液Ⅰ为50％的异丙醇溶液，清洗液Ⅱ为100％的乙醇溶液；洗脱液为DEPC水；蛋白酶K的浓度为50mol/L～100mol/L；磁珠固含量为2.5％。
进一步地，所述裂解液中还可添加Carrier RNA。
在核酸提取过程中，若需要提高提取产物RNA的浓度，可在裂解液中添加CarrierRNA(3ul/样本，1ug/ul)。
进一步地，所述试剂盒还包括逆转录酶、DNA聚合酶、dNTPs、PCR buffer、引物、探针。
所述的核酸扩增试剂盒，内含nCoV反应液、阳性标准品、阳性质控品和阴性质控品，其中的nCoV反应液包含逆转录酶、DNA聚合酶、dNTPs、PCR buffer、引物和探针。
进一步地，所述逆转录酶的用量为50～200U/反应；DNA聚合酶的用量为1～8U/反应；dNTPs选用dATP、dGTP、dCTP、dUTP组合，组合配比为1：1：1：1或1：1：1：2，浓度为10mmol/L～25mmol/L；PCR buffer中镁离子的浓度为50mmol/L～100mmol/L；引物浓度为0.2μmol/L～1μmol/L；探针浓度为0.05μmol/L～0.1μmol/L。
进一步地，所述逆转录酶的用量为100U/反应；DNA聚合酶的用量为5U/反应；dNTPs选用dATP，dGTP，dCTP，dUTP的组合配比为1：1：1：2，浓度为20mmol/L；PCR buffer 中镁离子的浓度为100mmol/L；引物浓度为1μmol/L；探针浓度为0.1μmol/L。
进一步地，其特征在于，所述核酸扩增试剂盒进行核酸扩增反应时，反应温度和时间为50℃20min，95℃1min；反应条件为95℃3s，58℃15s，共45个循环；37℃10s。
本发明提供了一种定量检测新型冠状病毒拷贝数的试剂盒，所述试剂盒包括核酸提取试剂盒和核酸扩增试剂盒，其中核酸提取试剂盒采用磁珠法对样本进行快速核酸裂解吸附，核酸扩增试剂盒采用荧光定量RT-PCR技术进行定量分析，同时设计了最合适的引物和探针序列，并采用了含有SARS-CoV-2和HCV基因片段的假病毒作为标准品，通过具备国际标准品的HCV来定标检测假病毒原液SARS-CoV-2病毒含量，非常准确表征标准品的拷贝数，克服了荧光PCR分析CT值的相对判断标准的不准确性，进一步提升了新型冠状病毒核酸检测效果，提高了检测灵敏度。本发明提供的定量检测新型冠状病毒拷贝数的试剂盒具有较高的高灵敏度和特异性、能精确定量新型冠状病毒拷贝数，操作简便，结果准确可靠。
附图说明
图1为根据定量标准品绘制的标准曲线
图2为实施例1的对应于ORF1ab基因的4对引物扩增曲线图
图3为实施例1的对应于N基因的4对引物扩增曲线图
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。本实施例中未特别指出的试剂均为已知产品，通过购买市售产品获得。
一、实验设备、材料、仪器
1、荧光基因
VIC：greenfluorescentprotein(绿色荧光蛋白)；FAM：6-Carboxy-fluorescein(6-羧基-荧光素)；HEX：5-Hexachloro-flurescein(5-六氯-荧光素)；Cy5：Indodicarbocyanine(Cy5荧光素)；Rox：Carboxy-x-rhodamine(羧基-X-罗丹明)；TET：5-Tetrachloro-fluorescein(5-四氯- 荧光素)。
2、荧光淬灭基因
BHQ-1：BlackHole Quencher-1，黑洞淬灭剂-1；BHQ-2：Black Hole Quencher-2，黑洞淬灭剂-2；BHQ-3：BlackHole Quencher-3，黑洞淬灭剂-3；BBQ：BlackBerry Quencher，黑莓猝灭剂；TAMRA：Tetramethyl-6-carboxyrhodamine(四甲基-6-羧基罗丹明)。
在本发明中，上述荧光染料(荧光基因)、荧光淬灭剂(荧光淬灭基因)仅仅是部分列举，也可采用其他试剂。本发明各实施例中，荧光基因、荧光淬灭基因、酶、甘油以及去核酸水等匀从市面上常规采购，具体可以是购自赛默飞life、罗氏公司的定量反应液等，当然，不限于上述公司，也可以购自美国ABI、BIO-RAD等公司。
3、对照品
阳性标准品为假病毒CoV/HCV RNA，用于标定的HCV国际标准品购自深圳远扬生物有限公司；阳性质控品为采用TE Buffer和假病毒CoV/HCV RNA按照所需浓度配制而成；阴性质控品为含内标的TE Buffer，保存条件为-20±10℃以下。
4、设备
核酸提取采用奥盛Auto-Pure32A磁珠核酸提取仪及同类仪器；RT-PCR采用ABI7500 扩增仪器。
二、定量检测新型冠状病毒拷贝数的试剂盒的组分配制及检测方法
1、核酸提取
1)试剂盒组分：裂解液为0.5mol/L～1mol/L的硫氰酸胍溶液、清洗液Ⅰ为50％的异丙醇溶液、清洗液Ⅱ为100％的乙醇溶液、洗脱液为DEPC水、50mol/L～100mol/L的蛋白酶K、磁珠固含量为25％。其中裂解液、清洗液Ⅰ、清洗液Ⅱ分装与不同的瓶子中，称为裂解液瓶、清洗液Ⅰ瓶、清洗液Ⅱ瓶。
2)初次使用时，分别在上述瓶子中加入异丙醇或无水乙醇：其中裂解液瓶中加入15mL 无水乙醇；清洗液Ⅱ瓶中加入40mL无水乙醇。混匀后在瓶身做好标记，于室温密封保存。
3)根据样本数量(横向一排可处理2个样本)，如表1所示，在96孔板各对应槽位中加入下列试剂和样本：
表1、96孔板中对应槽位的试剂添加情况
孔位/列 试剂 体积
1/7 裂解液 600μl
1/7 磁珠 20μl
1/7 蛋白酶K 25μl
2/8 清洗液Ⅰ 500μl
3/9 清洗液Ⅱ 500μl
4/10 清洗液Ⅱ 500μl
5/11 空 /
6/12 洗脱液 60μl
若需要提高提取产物RNA的浓度，可在裂解液孔添加Carrier RNA(3ul/样本，1ug/ul)。
5)在第1和7列孔里各加入待处理样本400μl，按表2所示运行设置参数并运行。
表2、运行参数设置情况
Figure BDA0002632029810000081
6)仪器运行完毕后，将96孔板取出。
7)将第6和第12列中洗脱产物转移至干净的离心管中，进行下一步实验或-20±5℃保存。
2、PCR扩增与检测
1)引物和探针的设计
通过对国家生物信息中心/国家基因组科学数据中心公布的新型冠状病毒基因组序列利用引物探针在线设计工具http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer对ORF1ab基因和N基因设计特异性引物和探针。综合考虑特异性和扩增效率，最终选择两组引物探针序列如下：
ORF1ab基因特异性的正向和反向引物的序列分别是 5’-TTTCCACTGTTTTCGTGCC-3’，和5’-GACCCATAGTAGCGCAGAG-3’；ORF1ab基因特异性的探针的序列是5’-CAGTTCCTCTTCACATAATCGCCCCGAG-3’，并且探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团BHQ1。
N基因特异性的正向和反向引物的序列分别是5’-GTGCTGTTTCCTTTGCCGATA-3’，和5’-CAGTTCCTCTTCACATAATCGCCCCGAG-3’；N基因特异性的探针的序列是 5’ACAGTGTTATTTGGTGCAGCTCGTGGTT-3’，并且探针的两端分别结合有荧光发生基团ROX和荧光淬灭基团BHQ1。
2)反应体系的建立和优化
引物探针浓度的优化：在反应体系中其他反应组分不变的条件下，分别使用0.2μmol/L 至1μmol/L浓度梯度的引物和0.05μmol/L至0.1μmol/L浓度梯度的探针进行PCR反应，经过多次重复试验，最终确定最佳引物浓度为1μmol/L，探针浓度为0.1μmol/L。
DNA聚合酶用量的优化：在反应体系中其他反应组分不变的情况下，分别使用1U至8U浓度梯度的酶用量/反应，经多次重复试验，最终确定最佳酶用量为5U/反应。
RT酶用量的优化：在反应体系中其他反应组分不变的情况下，分别使用从50U(酶用量)至200U浓度梯度的酶用量/反应，进行RT-PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳RT酶用量为100U/反应。
脱氧三磷酸核苷的优化：脱氧三磷酸核苷(dNTP)混合物选用dATP，dGTP，dCTP，dUTP组合，选择两个比例(1：1：1：1和1：1：1：2)来做对比，结果显示配比为1：1： 1：2为最优选。按最佳比例配制后的dNTPs分别用10mmol/L至25mmol/L浓度梯度进行多次重复试验，最佳浓度为20mmol/L。
镁离子浓度的优化：在反应体系中其他反应组分不变的情况下，分别使用50mmol/L 至100mmol/L浓度梯度的镁离子，经多次重复试验，最终确定最佳镁离子浓度为100mmol/L。
反应温度和时间的优化：根据酶的活性和寡多核苷酸的长度，主要对反应温度和延伸时间进行了优化，最终确定最佳的反应温度和时间为50℃20min，95℃1min；PCR反应条件为95℃3s，58℃15s，共45个循环；37℃10s。
根据优化结果，确定核酸扩增试剂盒的反应体系最佳配置如表3所示。
逆转录酶的用量为100U/反应；DNA聚合酶的用量为5U/反应；dNTPs选用dATP、dGTP、dCTP、dUTP的组合配比为1：1：1：2，浓度为20mmol/L；PCR buffer中镁离子的浓度为100mmol/L；引物浓度为1μmol/L；探针浓度为0.1μmol/L。
表3、核酸扩增试剂盒的反应体系最佳配置
Figure BDA0002632029810000101
3)读取阳性标准品和检测样品的拷贝数
分别按照表1、2、3配置试剂盒，本试剂盒中阳性标准品为假病毒CoV/HCV RNA，浓度为102-107copies/ml，荧光PCR仪会根据定量标准品绘制标准曲线(如图1)，并依此对检测样本中的SARS-CoV-2含量进行测定。
实施例1定量检测新型冠状病毒拷贝数试剂盒中引物探针组的设计
本实施例对新型冠状病毒的ORF1ab基因和N基因分别设计了多对特异性引物和探针，并进行比对。大量实验证明，不同的引物对PCR扩增的效果以及试剂盒检测灵敏度具有一定的影响。本实施例针对ORF1ab基因和N基因分别设计了四组引物探针，对应 ORF1ab基因的ORF1ab-1、ORF1ab-2、ORF1ab-3、ORF1ab-4(引物序列如表4所示)；对应N基因的N-1、N-2、N-3、N-4(引物序列如表5所示)。这些序列可以分别与新型冠状病毒的ORF1ab基因和N基因的相应序列特异性结合，ORF1ab基因的阳性样本扩增曲线如图2所示，N基因的阳性样本扩增曲线如图3所示。
表4、ORF1ab-1、ORF1ab-2、ORF1ab-3、ORF1ab-4序列信息
Figure BDA0002632029810000111
表5、N-1、N-2、N-3、N-4序列信息
Figure BDA0002632029810000112
由图2和图3可以看出，ORF1ab-1和N-1的扩增曲线最优，出峰最早，荧光强度最高，并且有明显的指数期和平台期。其他引物探针曲线上升峰高较低，出峰时间较晚，分别相较于ORF1ab-1和N-1的表现偏弱些。说明ORF1ab-1和N-1引物探针目的产物的复制速度更快、数量更多，扩增反应效率更高。
按照表1、表2和表3配置试剂盒，其中配置ORF1ab-1和N-1的的试剂盒定为试剂盒1，配置ORF1ab-2和N-2的的试剂盒定为试剂盒2，并都以如序列表中Seq ID NO.10、 Seq IDNO.11、Seq ID NO.12所示的对应于β-Globin基因引物探针作为内标引物和探针，比较试剂盒1与试剂盒2的检测灵敏度。样本选取作为阳性对照的假病毒CoV/HCV RNA，按照表6和表7所示的模板浓度配置10～106copies的样本溶液，并以HCV进行标定，每个浓度样本重复检测三次，检测结果如表6和表7所示。
表6、试剂盒1检测结果
Figure BDA0002632029810000121
Figure BDA0002632029810000131
表7、试剂盒2检测结果
Figure BDA0002632029810000132
Figure BDA0002632029810000141
根据表6可以看出，采用试剂盒1进行检测时，ORF1ab的检测限为102copies，Ct值为37.15-37.21，N的检测限为102copies，Ct值为36.81-36.97；根据表7可以看出，采用试剂盒2进行检测时，ORF1ab的检测限为103copies，Ct值为36.07-36.31，N的检测限为103copies，Ct值为35.88-36.71。可见试剂盒1的检测限更低，能检测到更低浓度的病毒含量，检测灵敏度明显高于试剂盒2，从而证明包含对应于ORF1ab-1和N-1设计的引物和探针的定量检测新型冠状病毒拷贝数试剂盒的检测灵敏度更高。
实施例2假病毒标准品的制备及定标
本实施例利用装甲RNA技术制备一种包装有SARS-CoV-2和HCV基因片段的假病毒，用作本发明试剂盒中的阳性标准品，通过具备国际标准品的HCV来定标检测假病毒原液SARS-CoV-2病毒含量，非常准确表征标准品的拷贝数，克服了荧光PCR分析CT值的相对判断标准的不准确性，进一步提升了新型冠状病毒核酸检灵敏度。
本实施例根据新型冠状病毒的特点，选取了ORF1ab和N保守区(ORF1ab保守区基因序列如Seq ID NO.7所示，N保守区基因序列如Seq ID NO.8所示)，用于假病毒的包装，这2个区段很好的表征了SARS-CoV-2的特征序列，同时还串联了HCV的保守区(Seq ID NO.9)，以及MS2噬菌体，串联并合成目标基因MS2-CoV/HCV(Seq ID NO.11)。
将MS2-CoV/HCV基因插入原核表达载体pET-28b中，构建pET-28b-MS2-CoV/HCV 重组质粒(Seq ID NO.12)。
将重组质粒pET-28b-MS2-CoV/HCV转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒并双酶切鉴定，经IPTG诱导培养后经SDS-PAGE鉴定表达情况，纯化后得到CoV/HCV RNA(Seq IDNO.10)，即为假病毒标准品。
采用HCV来定标检测假病毒原液SARS-CoV-2病毒含量：
1)将假病毒原液分别用生理盐水稀释E2/E3/E4/E5/E6倍，得到不同浓度的CoV/HCV RNA。
2)将稀释好的CoV/HCV RNA进行核酸提取，PCR上机检测，HCV标准品验证其定标浓度。
结果显示：
表8、CoV/HCV RNA假病毒浓度检测结果
Figure BDA0002632029810000151
3)根据得到的CoV/HCV RNA浓度，稀释至106copies/mL，105copies/mL，104copies/mL， 103copies/mL，102copies/mL，10copies/mL。
实施例4准确性考察
采用实施例1配置的试剂盒1的检测体系，以实施例2制备并定标的假病毒CoV/HCVRNA作为阳性标准品，对经过确认阳性或者阴性样本的新型冠状病毒的样本进行检测，检测结果如表8所示，作为阳性结果的有S1、S2、S4、S7、S8、S9、S10，并根据标准曲线 (图1)得到新型冠状病毒拷贝数(见表9)，显示为阴性未检出的有S3、S5、S6，新型冠状病毒拷贝数为0。检测结果与预先确认的阳性或阴性结果完全一致，证明本检测体系的检测准确性非常高。
表9检测经过确认阳性或者阴性样本的新型冠状病毒的样本
Figure BDA0002632029810000152
实施例4特异性考察
采用实施例1配置的试剂盒1的检测体系，以实施例2制备并定标的假病毒 CoV/HCVRNA作为阳性标准品，对26种病毒和细菌进行检测，以合成新型冠状病毒靶序列的质粒样本为阳性对照，TE buffer为阴性对照，检测结果如表10所示。
表10 26种病毒和细菌的检测结果
Figure BDA0002632029810000161
由表10可见，结果除阳性对照外，其余病原体模板均为阴性，说明本发明确定的检测体系特异性非常好，为100％。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
序列表
<110> 杭州丹威生物科技有限公司
杭州医学院
<120> 一种定量检测新型冠状病毒拷贝数的试剂盒
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttccactgt tttcgtgcc 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacccatagt agcgcagag 19
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagttcctct tcacataatc gccccgag 28
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgctgtttc ctttgccgat a 21
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagttcctct tcacataatc gccccgag 28
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acagtgttat ttggtgcagc tcgtggtt 28
<210> 7
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggcttcacat atgtattgtt ctttctaccc tccagatgag gatgaagaag aaggtgattg 60
tgaagaagaa gagtttgagc 80
<210> 8
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaggcttcta cgcagaaggg agcagaggcg gcagtcaagc ctcttctcgt tcctcatcac 60
gtagtcgcaa cagttcaaga aattcaactc caggcag 97
<210> 9
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atggtagctg gcacataaac cggaccgctc tcaattgcaa tgacagcttg caaacgggtt 60
tcctcgcctc cctgttttac acccacagct tcaacagctc tggctgcccc gagcgcttgt 120
cttcctgccg 130
<210> 10
<211> 307
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggcttcacat atgtattgtt ctttctaccc tccagatgag gatgaagaag aaggtgattg 60
tgaagaagaa gagtttgagc aaggcttcta cgcagaaggg agcagaggcg gcagtcaagc 120
ctcttctcgt tcctcatcac gtagtcgcaa cagttcaaga aattcaactc caggcagatg 180
gtagctggca cataaaccgg accgctctca attgcaatga cagcttgcaa acgggtttcc 240
tcgcctccct gttttacacc cacagcttca acagctctgg ctgccccgag cgcttgtctt 300
cctgccg 307
<210> 11
<211> 1965
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tggctatcgc tgtaggtagc cggaattcca ttcctaggag gtttgacctg tgcgagcttt 60
tagtaccctt gatagggaga acgagacctt cgtcccctcc gttcgcgttt acgcggacgg 120
tgagactgaa gataactcat tctctttaaa atatcgttcg aactggactc ccggtcgttt 180
taactcgact ggggccaaaa cgaaacagtg gcactacccc tctccgtatt cacggggggc 240
gttaagtgtc acatcgatag atcaaggtgc ctacaagcga agtgggtcat cgtggggtcg 300
cccgtacgag gagaaagccg gtttcggctt ctccctcgac gcacgctcct gctacagcct 360
cttccctgta agccaaaact tgacttacat cgaagtgccg cagaacgttg cgaaccgggc 420
gtcgaccgaa gtcctgcaaa aggtcaccca gggtaatttt aaccttggtg ttgctttagc 480
agaggccagg tcgacagcct cacaactcgc gacgcaaacc attgcgctcg tgaaggcgta 540
cactgccgct cgtcgcggta attggcgcca ggcgctccgc taccttgccc taaacgaaga 600
tcgaaagttt cgatcaaaac acgtggccgg caggtggttg gagttgcagt tcggttggtt 660
accactaatg agtgatatcc agggtgcata tgagatgctt acgaaggttc accttcaaga 720
gtttcttcct atgagagccg tacgtcaggt cggtactaac atcaagttag atggccgtct 780
gtcgtatcca gctgcaaact tccagacaac gtgcaacata tcgcgacgta tcgtgatatg 840
gttttacata aacgatgcac gtttggcatg gttgtcgtct ctaggtatct tgaacccact 900
aggtatagtg tgggaaaagg tgcctttctc attcgttgtc gactggctcc tacctgtagg 960
taacatgctc gagggcctta cggcccccgt gggatgctcc tacatgtcag gaacagttac 1020
tgacgtaata acgggtgagt ccatcataag cgttgacgct ccctacgggt ggactgtgga 1080
gagacagggc actgctaagg cccaaatctc agccatgcat cgaggggtac aatccgtatg 1140
gccaacaact ggcgcgtacg taaagtctcc tttctcgatg gtccatacct tagatgcgtt 1200
agcattaatc aggcaacggc tctctagata gagccctcaa ccggagtttg aagcatggct 1260
tctaacttta ctcagttcgt tctcgtcgac aatggcggaa ctggcgacgt gactgtcgcc 1320
ccaagcaact tcgctaacgg ggtcgctgaa tggatcagct ctaactcgcg ttcacaggct 1380
tacaaagtaa cctgtagcgt tcgtcagagc tctgcgcaga atcgcaaata caccatcaaa 1440
gtcgaggtgc ctaaagtggc aacccagact gttggtggtg tagagcttcc tgtagccgca 1500
tggcgttcgt acttaaatat ggaactaacc attccaattt tcgctacgaa ttccgactgc 1560
gagcttattg ttaaggcaat gcaaggtctc ctaaaagatg gaaacccgat tccctcagca 1620
atcgcagcaa actccggcat ctactaatag acgccggcca ggcttcacat atgtattgtt 1680
ctttctaccc tccagatgag gatgaagaag aaggtgattg tgaagaagaa gagtttgagc 1740
aaggcttcta cgcagaaggg agcagaggcg gcagtcaagc ctcttctcgt tcctcatcac 1800
gtagtcgcaa cagttcaaga aattcaactc caggcagatg gtagctggca cataaaccgg 1860
agctctcaat tgcaatgaca gcttgcaaac gggtttcctc gcctccctgt tttacaccca 1920
cagcttcaac agctctggct gccccgagcg cttgtcttcc tgccg 1965
<210> 12
<211> 2538
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa 60
ttcccctcta gaaataattt tgtttaactt ttaagaagga gatataccat ggtggctatc 120
gctgtaggta gccggaattc cattcctagg aggtttgacc tgtgcgagct tttagtaccc 180
ttgataggga gaacgagacc ttcgtcccct ccgttcgcgt ttacgcggac ggtgagactg 240
aagataactc attctcttta aaatatcgtt cgaactggac tcccggtcgt tttaactcga 300
ctggggccaa aacgaaacag tggcactacc cctctccgta ttcacggggg gcgttaagtg 360
tcacatcgat agatcaaggt gcctacaagc gaagtgggtc atcgtggggt cgcccgtacg 420
aggagaaagc cggtttcggc ttctccctcg acgcacgctc ctgctacagc ctcttccctg 480
taagccaaaa cttgacttac atcgaagtgc cgcagaacgt tgcgaaccgg gcgtcgaccg 540
aagtcctgca aaaggtcacc cagggtaatt ttaaccttgg tgttgcttta gcagaggcca 600
ggtcgacagc ctcacaactc gcgacgcaaa ccattgcgct cgtgaaggcg tacactgccg 660
ctcgtcgcgg taattggcgc caggcgctcc gctaccttgc cctaaacgaa gatcgaaagt 720
ttcgatcaaa acacgtggcc ggcaggtggt tggagttgca gttcggttgg ttaccactaa 780
tgagtgatat ccagggtgca tatgagatgc ttacgaaggt tcaccttcaa gagtttcttc 840
ctatgagagc cgtacgtcag gtcggtacta acatcaagtt agatggccgt ctgtcgtatc 900
cagctgcaaa cttccagaca acgtgcaaca tatcgcgacg tatcgtgata tggttttaca 960
taaacgatgc acgtttggca tggttgtcgt ctctaggtat cttgaaccca ctaggtatag 1020
tgtgggaaaa ggtgcctttc tcattcgttg tcgactggct cctacctgta ggtaacatgc 1080
tcgagggcct tacggccccc gtgggatgct cctacatgtc aggaacagtt actgacgtaa 1140
taacgggtga gtccatcata agcgttgacg ctccctacgg gtggactgtg gagagacagg 1200
gcactgctaa ggcccaaatc tcagccatgc atcgaggggt acaatccgta tggccaacaa 1260
ctggcgcgta cgtaaagtct cctttctcga tggtccatac cttagatgcg ttagcattaa 1320
tcaggcaacg gctctctaga tagagccctc aaccggagtt tgaagcatgg cttctaactt 1380
tactcagttc gttctcgtcg acaatggcgg aactggcgac gtgactgtcg ccccaagcaa 1440
cttcgctaac ggggtcgctg aatggatcag ctctaactcg cgttcacagg cttacaaagt 1500
aacctgtagc gttcgtcaga gctctgcgca gaatcgcaaa tacaccatca aagtcgaggt 1560
gcctaaagtg gcaacccaga ctgttggtgg tgtagagctt cctgtagccg catggcgttc 1620
gtacttaaat atggaactaa ccattccaat tttcgctacg aattccgact gcgagcttat 1680
tgttaaggca atgcaaggtc tcctaaaaga tggaaacccg attccctcag caatcgcagc 1740
aaactccggc atctactaat agacgccggc caggcttcac atatgtattg ttctttctac 1800
cctccagatg aggatgaaga agaaggtgat tgtgaagaag aagagtttga gcaaggcttc 1860
tacgcagaag ggagcagagg cggcagtcaa gcctcttctc gttcctcatc acgtagtcgc 1920
aacagttcaa gaaattcaac tccaggcaga tggtagctgg cacataaacc ggaccgctct 1980
caattgcaat gacagcttgc aaacgggttt cctcgcctcc ctgttttaca cccacagctt 2040
caacagctct ggctgccccg agcgcttgtc ttcctgccgg aattcggctt cacatatgta 2100
ttgttctttc taccctccag atgaggatga agaagaaggt gattgtgaag aagaagagtt 2160
tgagcaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt caagcctctt ctcgttcctc 2220
atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc agatggtagc tggcacataa 2280
accggaccgc tctcaattgc aatgacagct tgcaaacggg tttcctcgcc tccctgtttt 2340
acacccacag cttcaacagc tctggctgcc ccgagcgctt gtcttcctgc cgaagcttgc 2400
ggccgcctcg agcaccacca ccactgagat ccggctgcta acaaagcccg aaaggaagct 2460
gagttggctg ctgccaccgc tgagcaataa ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg 2520
gtcttgaggg gttttttg 2538
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttgcgtgatt atttagctga ctatgac 27
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tcctgtacca ccaacattaa tagca 25
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tcactgccgg cccattcatg g 21

Claims (10)

1.含有SARS-CoV-2和HCV基因片段的假病毒标准品用于制备定量检测新型冠状病毒拷贝数试剂盒的用途。
2.一种定量检测新型冠状病毒拷贝数的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括含有SARS-CoV-2和HCV基因片段的假病毒标准品。
3.一种定量检测新型冠状病毒拷贝数的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括两组引物和探针，所述两组引物和探针分别为：
第一组
对应于ORF1ab基因的正向引物的序列如序列表中Seq ID NO.1所示；
对应于ORF1ab基因的反向引物的序列如序列表中Seq ID NO.2所示；
对应于ORF1ab基因的探针序列如序列表中Seq ID NO.3所示；
第二组
对应于N基因的正向引物的序列如序列表中Seq ID NO.4所示；
对应于N基因的反向引物的序列如序列表中Seq ID NO.5所示；
对应于N基因的探针序列如序列表中Seq ID NO.6所示。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括含有SARS-CoV-2和HCV基因片段的假病毒标准品。
5.如权利要求2或4所述的试剂盒，其特征在于，所述假病毒标准品的基因含有由SARS-CoV-2的ORF1ab和N保守区以及HCV保守区基因序列串联并合成的目标基因CoV/HCV RNA；
其中ORF1ab保守区基因序列如Seq ID NO.7所示，N保守区基因序列如Seq ID NO.8所示，HCV的保守区基因序列如Seq ID NO.9所示，CoV/HCV RNA的序列如序列表中Seq IDNO.10。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述假病毒标准品的制备方法为：
1)将MS2噬菌体、SARS-CoV-2的ORF1ab和N保守区、HCV的保守区基因序列串联并合成目标基因MS2-CoV/HCV；
2)将MS2-CoV/HCV基因插入原核表达载体pET-28b中，构建pET-28b-MS2-CoV/HCV重组质粒；
3)将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒并双酶切鉴定，经IPTG诱导培养后经SDS-PAGE鉴定表达情况，纯化后得到CoV/HCV RNA；
其中，MS2-CoV/HCV、pET-28b-MS2-CoV/HCV的序列如序列表中Seq ID NO.11、Seq IDNO.12所示。
7.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第三组内标引物和探针为：
对应于β-Globin基因正向引物的序列如序列表中Seq ID NO.13所示；
对应于β-Globin基因的反向引物的序列如序列表中Seq ID NO.14所示；
对应于β-Globin基因的探针序列如序列表中Seq ID NO.15所示；
所述的三组探针还包括荧光发生基因和荧光淬灭基因，其中对应于ORF1ab基因的探针的荧光发生基因为FAM，荧光淬灭基因为BHQ1；对应于N基因的探针的荧光发生基因为ROX，荧光淬灭基因为BHQ1；对应于β-Globin基因的探针的荧光发生基因为VIC，荧光淬灭基因为BHQ1。
8.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括裂解液、清洗液、洗脱液、蛋白酶K、磁珠。
9.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括逆转录酶、DNA聚合酶、dNTPs、PCR buffer、引物、探针。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述逆转录酶的用量为50～200U/反应；DNA聚合酶的用量为1～8U/反应；dNTPs选用dATP、dGTP、dCTP、dUTP组合，组合配比为1：1：1：1或1：1：1：2，浓度为10mmol/L～25mmol/L；PCR buffer中镁离子的浓度为50mmol/L～100mmol/L；引物浓度为0.2μmol/L～1μmol/L；探针浓度为0.05μmol/L～0.1μmol/L。
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