CN111378785A

CN111378785A - 用于核酸诊断新型冠状病毒2019-nCov的假病毒标准品及其应用

Info

Publication number: CN111378785A
Application number: CN202010172424.1A
Authority: CN
Inventors: 蒋涛华; 傅坚刚; 邵悦
Original assignee: Renkuan Shanghai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Renkuan Shanghai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-03-12
Filing date: 2020-03-12
Publication date: 2020-07-07

Abstract

本发明涉及一种用于核酸诊断新型冠状病毒2019‑nCov的假病毒标准品及其应用，该假病毒标准品是通过基因合成、质粒抽提和假病毒包装等步骤制备而成，其中合成的基因包括新型冠状病毒2019‑nCov基因RdRp、Gene E和Gene N。本发明首次提出2019‑nCov的假病毒标准品，区别于以往体外合成的RNA、临床阳性活病毒，完美克服两者的缺点，真正适合用于试剂盒的性能评价，包含检测限、特异性、重复性等，进而应用于针对2019‑nCov的临床诊断；该假病毒标准品，无致病性，可再生，质控方法可靠，批次间稳定，可以长期稳定制备和供应，而且要求实验室生物安全级别为P2，满足很多单位的安全需求。

Description

用于核酸诊断新型冠状病毒2019-nCov的假病毒标准品及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种用于核酸诊断新型冠状病毒 2019-nCov的假病毒标准品及其应用。

背景技术

新型冠状病毒被世卫组织命名为2019-nCov，能引起严重急性呼吸感染(Severeacuterespiratory infection，SARI)，其早期症状同普通病毒感冒类似，随着病情发展，病人会出现呼吸困难、胸闷、甚至呼吸窘迫症状，通过医学影像学检查可见肺部有多发磨玻璃影，严重者可出现肺实变。2019-nCov作为一种新型冠状病毒，是一类具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，该病毒采集自不同地区患者的病毒样本相关序列也已发布至2019新型冠状病毒信息库 (https://bigd.big.ac.cn/ncov)。

NCBI收录序列为NC_045512.2，全长29903bp。将序列与SARS比对，发现有88％的相似性。因此，针对新型冠状病毒2019-nCov的核酸诊断开发尤为重要，为了满足临床诊断的需要，截止目前，国家已经紧急批准了6款核酸诊断试剂盒上市，用于临床诊断，这6款试剂盒都是采用RT-PCR的方法，多日的临床检测结果显示，该诊断存在高比例的假阴性问题，因此科技部也是应急征集除普通实时定量荧光PCR外的快速诊断产品。

不管是哪一类产品，试剂盒的检测限问题，是造成假阴性的最大根源，因此针对诊断产品的检测限，我们需要认真做每款试剂盒的性能评价-检测限。以往针对检测限的性能评价，一般是选择体外合成的RNA或者临床阳性病毒来作为标准品，用于性能评价。但是两者都具有很明显的确定，首先体外合成的RNA，一般是很纯，单一，不涉及提取，不符合临床病毒的微环境，因此必然造成检测灵敏度被高估，这也是存在高概率假阴性的主要原因；再次临床阳性病毒，即使是灭活的病毒，也是存在很大的生物安全隐患，因此要求实验室级别为P3-P4，大部分开发诊断试剂盒单位都不满足该要求，另外临床阳性病毒也是来源很有限，不能被稳定供应，反复用于试剂盒的性能评价。

因此，有病毒的完整包膜结构，有2019-nCov对应的核酸序列，但是生物安全风险较低的假病毒标准品，完美的克服了如上的缺点，非常适合用于核酸诊断新型冠状病毒2019-nCov。

发明内容

本发明的目的在于制备一种用于核酸诊断新型冠状病毒2019-nCov的假病毒标准品，通过基因合成、质粒抽提、病毒包装、浓缩、纯化、定标拷贝数等方法，用于作为对应试剂盒性能评价的参考品，帮助确定试剂盒的检测限、精密度、稳定性等指标，进而应用于针对2019-nCov的临床诊断上。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：

第一方面，本发明提供了一种用于核酸诊断新型冠状病毒2019-nCov的假病毒标准品，假病毒标准品是通过基因合成、质粒抽提和假病毒包装步骤制备而成。

优选地，合成的基因包括新型冠状病毒2019-nCov基因RdRp、Gene E和 Gene N中的一种或多种。本发明根据新型冠状病毒的特点，选取了RdRp (RNA-dependent RNApolymerase，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示)、Gene E(envelope protein，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示)、 Gene N(nucleocapsid phosphoprotein，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3 所示)合计3个区段的序列，用于假病毒的包装，3个区段很好的表征了 2019-nCov的特征序列。

优选地，质粒是将合成后基因插入PCBLVX-PURO载体中构建而成。其中，Gene N插入的载体为PCBLVX-PURO载体，插入位点BstBI，BamHI，命名为PCBLVX-PURO-N gene；Gene E插入的载体为PCBLVX-PURO载体，插入位点XhoI，BamHI命名为PCBLVX-PURO-E gene；ORF1ab/RdRP插入的载体为PCBLVX-PURO载体，插入位点XhoI，BamHI命名为 PCBLVX-PURO-ORF1ab/RdRP。

优选地，假病毒包装步骤中是采用293T/17细胞作为载体。

优选地，假病毒标准品的制备过程还包括将包装的假病毒进行浓缩纯化的步骤。本发明使用biomiga的ViraTrap^TM慢病毒小量纯化试剂盒对假病毒纯化，主要原理是通过纯化柱和脱盐浓缩柱装置。

第二方面，本发明还保护上述假病毒标准品在新型冠状病毒2019-nCov临床诊断产品中的应用。

本发明还保护上述假病毒标准品在核酸诊断新型冠状病毒2019-nCov试剂盒性能评价中的应用，尤其是在评价试剂盒检测限、特异性和稳定性中的一种或多种性能中的应用。本发明首次提出2019-nCov的假病毒标准品，区别于以往体外合成的RNA、临床阳性活病毒，完美克服两者的缺点，真正适合用于试剂盒的性能评价，包含检测限、特异性、重复性等。

第三方面，本发明提供了一种对上述用于核酸诊断新型冠状病毒 2019-nCov的假病毒标准品的拷贝数的检测方法，包括步骤：采用合成的引物、探针提取假病毒中的RNA，之后外反转录为cDNA，再进行ddPCR拷贝数定量检测，得到拷贝数浓度。本发明按照ddPCR体系选择了引物、探针序列，可不需要构建标准曲线的前提下完成对假病毒的QC拷贝数检测，非常准确表征标准品的拷贝数，而且克服了Q-PCR分析CT值的相对判断标准的不准确性。

第四方面，本发明还保护上述检测方法在核酸诊断新型冠状病毒 2019-nCov试剂盒性能评价中的应用。

本发明提供的假病毒标准品，无致病性，可再生，质控方法可靠，批次间稳定，可以长期稳定制备和供应，而且要求实验室生物安全级别为P2，满足很多单位的安全需求。

本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：

1、国内暂时没有同类产品，而市场是有巨大的需求；

2、比现存的标准品更有优势，安全，更接近天然病毒，更符合试剂盒性能评价指标要求；

3、序列经过优化，符合CDC和WHO的要求，符合2019-nCov的特征；

4、采用ddPCR检测绝对拷贝数，定量不需要构建标准曲线，同时克服 Q-PCR的CT值判断问题；

5、假病毒无致病性，可再生，生物安全级别为P2，满足很多单位的安全需求；

6、有效的评估临床核酸诊断试剂盒的性能，指导临床检测的意义。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明所述的2019-nCov与SARS的序列比对结果区域图；

图2为本发明所述的2019-nCov与其他冠状病毒的功能区比对结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

本发明所述的2019-nCov的NCBI收录序列为NC_045512.2，全长29903bp，按照功能区域可以分为如下表1所示：

表1 2019-nCov的功能区域表

将2019-nCov的序列与SARS比对，发现有88％的相似性，根据比对结果，主要区别区域集中在图1下方的细线区域。

将2019-nCov的功能区与其他冠状病毒相比，发现很很多共同的功能区，比对结果具体如图2所示。

本发明根据新型冠状病毒的特点，选取了RdRp(RNA-dependent RNA polymerase，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示)、Gene E(envelope protein，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示)、Gene N(nucleocapsid phosphoprotein，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示)合计3个区段的序列，用于假病毒的包装，3个区段很好的表征了2019-nCov的特征序列。

本发明按照ddPCR体系选择了引物、探针序列，可不需要构建标准曲线的前提下完成对假病毒的QC拷贝数检测，非常准确表征标准品的拷贝数，而且克服了Q-PCR分析CT值的相对判断标准的不准确性。

下面结合具体实施例对本发明提供的技术方案作进一步说明。本实施例提供一种用于核酸诊断新型冠状病毒2019-nCov的假病毒标准品的制备方法及拷贝数的检测方法，具体包括如下步骤。

1、基因合成

1.1合成Gene N，插入PCBLVX-PURO载体，插入位点BstBI，BamHI，命名为PCBLVX-PURO-N gene；

1.2合成Gene E，插入PCBLVX-PURO载体，插入位点XhoI，BamHI，命名为PCBLVX-PURO-E gene；

1.3合成ORF1ab/RdRP，插入PCBLVX-PURO载体，插入位点XhoI， BamHI，命名为PCBLVX-PURO-ORF1ab/RdRP。

其中，本发明采用的PCBLVX-PURO载体的制备方法包括步骤：(1)依据核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示的序列，合成PCBLVX-PURO载体的基因；(2)合成产物在体外拼接后，PCR扩增出全长；(3)PCR产物转化感受态，然后涂板，待长出克隆菌后，挑取单克隆，转移到1ml的LB试管中培养，之后放大培养，收集100ml浑浊菌液；(4)利用天根无内毒素质粒大提试剂盒(DP117)抽提目的载体100ug。

2、质粒抽提

2.1质粒转化感受态，然后涂板，待长出克隆菌后，挑取单克隆，转移到 1m的LB试管中培养，之后放大培养，收集100ml浑浊菌液；

2.2利用天根无内毒素质粒大提试剂盒(DP117)抽提目的质粒100ug。

3、假病毒包装

3.1复苏293T/17细胞，培养传代，调整到指数增长期，待细胞长到5x10⁵活细胞/ml，铺板到3个T-75flask，每个放入10ml的细胞悬液；

3.2隔天待细胞长到70-90％的汇合度时，使用Lipofectamin LTX分别将 PCBLVX-PURO-N gene+Lenti-Packaging Mix、PCBLVX-PURO-E gene+Lenti Packaging Mix、PCBLVX-PURO-ORF1ab/RdRP+Lenti Packaging Mix共转到3 个293T/17细胞中；

3.372小时收集含假病毒的细胞上清，1000rpm在4℃离心10分钟，使用 0.22uM滤器过滤，去掉细胞和碎片，收集滤过液体。

4、假病毒浓缩纯化

使用biomiga的ViraTrap^TM慢病毒小量纯化试剂盒对假病毒纯化，主要原理是通过纯化柱和脱盐浓缩柱装置，依次经过超滤，过阴离子柱，洗脱得到病毒液，最后在经过超虑，得到纯化后的病毒。

5、拷贝数检测

5.1根据CDC和WHO推荐的引物、探针，安排合成，具体如表2所示：

表2引物、探针序列

5.2使用试剂盒提取假病毒中的RNA，

Viral RNA Mini Kit，使用苏州锐讯开发的《新型冠状病毒(COVID-19)核酸检测试剂盒》一步法反转录成cDNA，使用qubit3.0定量，调整为1.25ng/ul。

5.3在bio-rad QX200上开展ddPCR拷贝数定量，简单步骤为：

5.3.1配制PCR反应液，如表3所示。

表3 ddPCR反应体系

5.3.2制备微滴

从上述体系中取20μl PCR反应液，转移至微滴发生卡(DG8 cartridge) sample孔中，再加入70μl微滴发生油(droplet generation oil)至oil孔中，利用QX200^TM微滴式数字PCR仪的微滴生成器制备反应微滴。每个微滴发生卡一次可同时完成8个样品的微滴制备，用时约2.5min。

5.3.3PCR扩增

将每个样品的微滴分别转移至96孔PCR反应板中对应的反应孔中，用铝膜热封(180℃，5sec)后，于普通PCR仪上进行扩增。本实验的PCR扩增是在Bio-Rad T100 PCR仪上完成的，温度程序见表4。

表4温度程序

5.3.4检测和数据分析

将PCR扩增后的96孔板放入QX200^TM微滴式数字PCR仪的微滴分析器中，并在软件QuantaSoft上设定检测模式为CNV(拷贝数变异)，内参基因设定为2(单拷贝2倍体基因)。检测FAM、VIC的荧光信号。仪器会自动分析每个样品的每个微滴中荧光信号，然后，由QuantaSoft完成对数据的自动处理，获得靶序列在PCR反应体系中的拷贝数浓度(单位：copies/μl)。

结果显示：

(1)对于RdRP假病毒，100ul的1x10e8TU/ml的假病毒中含有目的基因片段大约2.7x10e8 copies；

(2)对于Gene E假病毒，100ul的1x10e8TU/ml的假病毒中含有目的基因片段大约3.6x10e8 copies；

(3)对于Gene N假病毒，100ul的1x10e8TU/ml的假病毒中含有目的基因片段大约1.9x10e8 copies。

上述数据均为经过ddPCR检测3次得到的平均值。

综上，本发明采用创新的假病毒体系，建立模拟2019-nCov的病毒核酸、包膜结构，利用CDC和WHO的引物、探针的检测体系，对假病毒的目的基因拷贝数开展ddPCR的绝对定量，进而用于核酸诊断2019-nCov的试剂盒的性能评价中。

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 仁宽(上海)生物科技有限公司

<120> 用于核酸诊断新型冠状病毒2019-nCov的假病毒标准品及其应用

<130> 2

<160> 19

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2995

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gttgtctgta ctgccgttgc cacatagatc atccaaatcc taaaggattt tgtgacttaa 60

aaggtaagta tgtacaaata cctacaactt gtgctaatga ccctgtgggt tttacactta 120

aaaacacagt ctgtaccgtc tgcggtatgt ggaaaggtta tggctgtagt tgtgatcaac 180

tccgcgaacc catgcttcag tcagctgatg cacaatcgtt tttaaacggg tttgcggtgt 240

aagtgcagcc cgtcttacac cgtgcggcac aggcactagt actgatgtcg tatacagggc 300

ttttgacatc tacaatgata aagtagctgg ttttgctaaa ttcctaaaaa ctaattgttg 360

tcgcttccaa gaaaaggacg aagatgacaa tttaattgat tcttactttg tagttaagag 420

acacactttc tctaactacc aacatgaaga aacaatttat aatttactta aggattgtcc 480

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atcacgtcaa cgtcttacta aatacacaat ggcagacctc gtctatgctt taaggcattt 600

tgatgaaggt aattgtgaca cattaaaaga aatacttgtc acatacaatt gttgtgatga 660

tgattatttc aataaaaagg actggtatga ttttgtagaa aacccagata tattacgcgt 720

atacgccaac ttaggtgaac gtgtacgcca agctttgtta aaaacagtac aattctgtga 780

tgccatgcga aatgctggta ttgttggtgt actgacatta gataatcaag atctcaatgg 840

taactggtat gatttcggtg atttcataca aaccacgcca ggtagtggag ttcctgttgt 900

agattcttat tattcattgt taatgcctat attaaccttg accagggctt taactgcaga 960

gtcacatgtt gacactgact taacaaagcc ttacattaag tgggatttgt taaaatatga 1020

cttcacggaa gagaggttaa aactctttga ccgttatttt aaatattggg atcagacata 1080

ccacccaaat tgtgttaact gtttggatga cagatgcatt ctgcattgtg caaactttaa 1140

tgttttattc tctacagtgt tcccacctac aagttttgga ccactagtga gaaaaatatt 1200

tgttgatggt gttccatttg tagtttcaac tggataccac ttcagagagc taggtgttgt 1260

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gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg gggcatcaag cagctccagg caagaatcct 1500

ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa 1560

actcatttgc accactgctg tgccttggaa tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca 1620

gatttggaat cacacgacct ggatggagtg ggacagagaa attaacaatt acacaagctt 1680

aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt 1740

ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta 1800

tataaaatta ttcataatga tagtaggagg cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt 1860

actttctata gtgaatagag ttaggcaggg atattcacca ttatcgtttc agacccacct 1920

cccaaccccg aggggacccg acaggcccga aggaatagaa gaagaaggtg gagagagaga 1980

cagagacaga tccattcgat tagtgaacgg atctcgacgg tatcgccttt aaaagaaaag 2040

gggggattgg ggggtacagt gcaggggaaa gaatagtaga cataatagca acagacatac 2100

aaactaaaga attacaaaaa caaattacaa aaattcaaaa ttttcgggtt tattacaggg 2160

acagcagaga tccagtttat cgatggatcg ctagcgctac cggactcaga tctcgagctc 2220

aagcttcgaa ttctgcagtc gacggtaccg cgggcccggg atcccgcgac tctagatccg 2280

cgtctggaac aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa 2340

ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat 2400

tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta 2460

tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc 2520

aacccccact ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt 2580

ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg 2640

ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc 2700

atggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 2760

ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 2820

tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 2880

tggaattaat tctgcagtcg agacctagaa aaacatggag caatcacaag tagcaataca 2940

gcagctacca atgctgattg tgcctggcta gaagcacaag aggaggagga ggtgggtttt 3000

ccagtcacac ctcaggtacc tttaagacca atgacttaca aggcagctgt agatcttagc 3060

cactttttaa aagaaaagag gggactggaa gggctaattc actcccaacg aagacaagat 3120

atccttgatc tgtggatcta ccacacacaa ggctacttcc ctgattagca gaactacaca 3180

ccagggccag gggtcagata tccactgacc tttggatggt gctacaagct agtaccagtt 3240

gagccagata aggtagaaga ggccaataaa ggagagaaca ccagcttgtt acaccctgtg 3300

agcctgcatg ggatggatga cccggagaga gaagtgttag agtggaggtt tgacagccgc 3360

ctagcatttc atcacgtggc ccgagagctg catccggagt acttcaagaa ctgctgatat 3420

cgagcttgct acaagggact ttccgctggg gactttccag ggaggcgtgg cctgggcggg 3480

actggggagt ggcgagccct cagatcctgc atataagcag ctgctttttg cctgtactgg 3540

gtctctctgg ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact 3600

gcttaagcct caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg 3660

tgactctggt aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag 3720

tagtagttca tgtcatctta ttattcagta tttataactt gcaaagaaat gaatatcaga 3780

gagtgagagg ccttgacatt gctagcgttt taccgtcgac ctctagctag agcttggcgt 3840

aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca 3900

tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat 3960

taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt 4020

aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct 4080

cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 4140

aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 4200

aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 4260

tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 4320

caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 4380

cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 4440

ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 4500

gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 4560

agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 4620

gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 4680

acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 4740

gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 4800

gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 4860

cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 4920

caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 4980

gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 5040

cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 5100

cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 5160

caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 5220

gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 5280

gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 5340

cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 5400

catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 5460

gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 5520

ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 5580

gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 5640

cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 5700

tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 5760

gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 5820

atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 5880

ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 5940

gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 6000

acgtcgacgg atcgggagat caacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc 6060

aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg 6120

tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tggatcaact ggataactca agctaaccaa 6180

aatcatccca aacttcccac cccataccct attaccactg ccaattacct gtggtttcat 6240

ttactctaaa cctgtgattc ctctgaatta ttttcatttt aaagaaattg tatttgttaa 6300

atatgtacta caaacttagt agtttttaaa gaaattgtat ttgttaaata tgtactacaa 6360

acttagtagt 6370

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gaccccaaaa tcagcgaaat 20

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tctggttact gccagttgaa tctg 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

accccgcatt acgtttggtg gacc 24

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ttacaaacat tggccgcaaa 20

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

gcgcgacatt ccgaagaa 18

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

acaatttgcc cccagcgctt cag 23

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gggagccttg aatacaccaa aa 22

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

tgtagcacga ttgcagcatt g 21

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

atcacattgg cacccgcaat cctg 24

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

gtgaaatggt catgtgtggc gg 22

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

caaatgttaa aaacactatt agcata 26

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

caggtggaac ctcatcagga gatgc 25

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

acaggtacgt taatagttaa tagcgt 26

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

atattgcagc agtacgcaca ca 22

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

acactagcca tccttactgc gcttcg 26

Claims

1.一种用于核酸诊断新型冠状病毒2019-nCov的假病毒标准品，其特征在于：

所述假病毒标准品是通过基因合成、质粒抽提和假病毒包装步骤制备而成。

2.根据权利要求1所述的用于核酸诊断新型冠状病毒2019-nCov的假病毒标准品，其特征在于：

所述基因包括新型冠状病毒2019-nCov基因RdRp、Gene E和Gene N中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的用于核酸诊断新型冠状病毒2019-nCov的假病毒标准品，其特征在于：

所述质粒是将合成后基因插入PCBLVX-PURO载体中构建而成。

4.根据权利要求1所述的用于核酸诊断新型冠状病毒2019-nCov的假病毒标准品，其特征在于：

所述假病毒包装步骤中是采用293T/17细胞作为载体。

5.根据权利要求1所述的用于核酸诊断新型冠状病毒2019-nCov的假病毒标准品，其特征在于：

所述假病毒标准品的制备过程还包括将包装的假病毒进行浓缩纯化的步骤。

6.权利要求1-5任一项所述的假病毒标准品在新型冠状病毒2019-nCov临床诊断产品中的应用。

7.权利要求1-5任一项所述的假病毒标准品在核酸诊断新型冠状病毒2019-nCov试剂盒性能评价中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：

所述性能包括检测限、特异性和稳定性中的一种或多种。

9.一种对权利要求1-5任一项所述的用于核酸诊断新型冠状病毒2019-nCov的假病毒标准品的拷贝数的检测方法，其特征在于，包括步骤：

采用合成的引物、探针提取假病毒中的RNA，之后外反转录为cDNA，再进行ddPCR拷贝数定量检测，得到拷贝数浓度。

10.权利要求9所述的检测方法在核酸诊断新型冠状病毒2019-nCov试剂盒性能评价中的应用。