CN113354718A - 一种哌尼生素前体、表达盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种哌尼生素前体、表达盒用于高效表达哌尼生素，所述前体为蛋白簇包括核心肽penA1、penB蛋白、penT蛋白、penC蛋白和penD蛋白，并提供了用于编码上述哌尼生素前体的表达盒，从5’端到3’端核心肽编码基因penA1、penB蛋白编码基因penB、penT蛋白编码基因penT、penC蛋白编码基因penC、penD蛋白编码基因penD依次串联排列。本发明获得的哌尼生素，活性好，生物稳定性强，对热、胃液肠液等具有很好的耐受性，抑菌效果显著，而且表达量高，培养成本低、生产周期短、易于产业化。

Description

一种哌尼生素前体、表达盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种哌尼生素及其制备方法，属于生物技术领域。

技术背景

细菌素是细菌在代谢过程中通过核糖体合成的一类具有抑菌活性的多肽或 前体多肽，有着理想的益生菌特性，其具备有效抑制病原体、调节炎症、促进伤 口愈合和粘膜防御等功能，且不产生任何副作用的特点。哌尼生素(Penisin) 由Paenibacillus sp A3产生，属于翻译后修饰多肽lantibiotics，由44个氨 基酸残基组成(序列为：NFGLYTSQCYSSQCYSSKCYSDSCYSSDCYTGRHMCGYTHGYSC)， 分子量4594.5Da，pH2-12稳定、耐受胰蛋白酶和蛋白酶K，对大肠杆菌、恶臭 假单胞菌、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌的MIC小于10μg/ml，浓度为92μg/ml 时溶血性同PBS相当、对哺乳动物细胞无毒性，80mg/kg体重用量时能显著降 低小鼠大腿感染模型(金黄色葡萄球菌MTCC96)的细菌载量(Baindara等，2016)， 具有开发成饲用抗生素替代品的潜力。

哌尼生素通常由野生型Paenibacillus sp A3分泌，但是哌尼生素受到培养 方式、培养基成分的影响，其分泌量很少，而且培养成本高。目前尚未有优化或 者人工改造哌尼生素的生产菌株。

因此本专利利用枯草芽孢杆菌SCK168为表达宿主菌，将哌尼生素的基因簇 基因penA1BTCD构建成表达盒，成功实现哌尼生素在枯草芽孢杆菌高效分泌表达， 提高哌尼生素的产量，降低生产成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种哌尼生素(penisin)高效表达的前体、表达盒、 方法用于生产和制备哌尼生素，为饲料添加剂、兽药、食品及医药提供一种廉价 的生物抗菌剂和防腐剂。

本发明的目的是通过以下措施实现的：

一种哌尼生素前体，包括核心肽penA1、penB蛋白、penT蛋白、penC蛋白 和penD蛋白。

优选的，上述分泌型哌尼生素前体中核心肽penA1氨基酸序列为SEQ ID NO.2。SEQ ID NO.2为核心肽或者不成熟肽，经过前体中其他功能蛋白加工修饰后切除N端20个氨基酸，形成只有44个氨基酸的成熟肽。

一种哌尼生素的表达盒，用于编码上述哌尼生素前体。具体的，从5’端到 3’端核心肽编码基因penA1、penB蛋白编码基因penB、penT蛋白编码基因penT、 penC蛋白编码基因penC、penD蛋白编码基因penD以依次串联排列。

上述哌尼生素的表达盒，包括启动子，启动子的3’端连接核心肽编码基因 penA1。

上述分泌型哌尼生素的表达盒，核心肽penA1编码基因、penB蛋白编码基 因、penT蛋白编码基因、penC蛋白编码基因、penD蛋白编码基因的串联位置有 核糖体结合位点。

上述分泌型哌尼生素的表达盒，所述启动子为P43启动子。

上述哌尼生素的表达盒，采用三段克隆片段，片段1为penA1编码基因，片 段2为penB蛋白编码基因和penT蛋白编码基因，片段3为penC蛋白编码基因 和penD蛋白编码基因。

上述哌尼生素的表达盒，采用in-fusion克隆扩增技术，采用引物P1和P2 克隆片段1，P3和P4克隆片段2，P5和P6克隆片段3。

上述哌尼生素的表达盒，表达盒序列为SEQ ID NO.1。

一种表达载体，包括上述表达盒。优选的，所述表达载体为pP43NMK表达载 体。优选的，所述哌尼生素的表达盒的载体序列如SEQ ID NO.3所示。

一种基因工程菌，包括上述表达盒或表达载体。优选的，所述基因工程菌为 枯草芽孢杆菌。更优选为枯草芽孢杆菌SCK168。

上述分泌型哌尼生素的制备方法，包括以下步骤：

(1)用引物将基因penA1、penBT、penCD克隆形成三个片段；

(2)通过In-fusion克隆技术将penA1、penBT、penCD基因片段连接于 表达载体，与载体上的启动子和信号肽基因连接后形成penA1BTCD表达盒；

(3)将带有penA1BTCD表达盒的重组载体转化入基因工程菌SCK168中筛选 阳性重组子，在培养基中发酵培养。

所述分泌型哌尼生素的制备方法还包括以下步骤：

(4)将重组子在培养基中发酵培养，取发酵液测定其抑菌活性和含量；

(5)测定发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果检测抑菌活性；

(6)发酵液通过过滤后用高效液相法测定其含量。

上述分泌型哌尼生素的制备方法，基因工程菌为枯草芽孢杆菌，发酵液中的 哌尼生素表达量为0.5～1g/L。

上述分泌型哌尼生素的制备方法，所述基因工程菌的培养基为：豆粕粉1％， 酵母粉1％，蛋白胨1％，葡萄糖1％，氯化钠0.5％。

本发明利用高保真酶扩增哌尼生素的基因簇penA1BTCD的penA1、penBT和 penCD，再利用In-fusion克隆技术将哌尼生素的基因簇3段基因连接，构建成 哌尼生素表达盒，该表达盒置于强启动子的下游将其导入基因工程菌，实现哌尼 生素的分泌表达。

有益效果

1、本发明提供的哌尼生素前体，是一个penA1BTCD蛋白簇，penA1是核心 肽，经过前体中其他功能蛋白加工修饰后切除N端20个氨基酸，形成只有44 个氨基酸的成熟肽；penB是Ia类脱水酶，penC是环化酶，penB负责丝氨酸和 苏氨酸残基的脱水，而环化酶(penC)催化半胱氨酸对脱水残基的亲核攻击；penT 是专用lantibiotic ABC转运蛋白,转运penisin所需，penD是lantibiotic脱 水酶，利用该哌尼生素前体可以高效分泌表达哌尼生素。

2.本发明获得的分泌型哌尼生素，为随机结构，活性好，生物稳定性强，对 热、胃液肠液等具有很好的耐受性，抑菌效果显著。

3.本发明获得的哌尼生素表达盒载体“启动子-核心肽基因penA1-penBTCD 基因”，通过对哌尼生素基因簇编码基因的组合，实现了哌尼生素的合成并运输 到胞外分泌表达。

4.本发明制备哌尼生素，其表达水平达0.5～1.0g/L，高于目前所有报道中 哌尼生素的表达水平。该方法培养成本低，产量高，为哌尼生素的规模产业化生 产提供了新的方向和思路。

5.本发明用In-fusion克隆技术将核心肽片段penA1、penBT基因片段、penCD 基因片段连接于带有启动子的表达载体上，构建哌尼生素表达盒载体“启动子 -penA1-penBTCD基因”。因载体上有核心肽与penBTCD连接，实现了哌尼生素 的合成并运输到胞外分泌表达。将含有哌尼生素表达盒载体，转化入基因工程菌， 构建成菌株。菌株在相关培养基中培养，通过测定抑菌圈来判断其活性，HPLC 测定哌尼生素在枯草芽孢杆菌中的表达量为1g/L(1mg/mL)。该哌尼生素表达 系统表达量高于野生菌，而且发酵培养基成本低、发酵周期短、易于产业化。

6、本发明首次利用基因工程和发酵工程发酵表达哌尼生素；利用安全菌株 枯草芽孢杆菌SCK168作为表达宿主菌，带有启动子P43的pP43NMK表达载体， 对哌尼生素基因簇KT934325进行重组，将penA1BTCD与pP43NMK构建表达载体， 本发明表达的哌尼生素具有高活性，且提高哌尼生素在枯草芽孢杆菌的分泌表达 水平，有利于应用推广。

附图说明

图1哌尼生素表达盒

图2哌尼生素表达盒构建过程

图3发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌活性(CS：培养液；168：枯草芽孢杆菌； 1：PEN001发酵液上清；2：PEN002发酵液上清；3：PEN003发酵液上清；4：PEN004 发酵液上清；)

图4发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌活性的稳定性(CS：培养液；168：枯草芽 孢杆菌；1：PEN001发酵液上清；2：PEN002发酵液上清；3：PEN003发酵液上 清；4：PEN004发酵液上清；)

图5哌尼生素纯品(A)和发酵液(B)的高效液相图谱

具体实施方案

下面是具体实施例证对本发明进行具体描述，在此指出以下实施例证只用于 对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术 是由熟练人员可以根据上述发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语和相关领域技术人员所通常 理解的具有相同的含义。

实施例1

(1)通过in-fusion克隆技术，首先构建哌尼生素表达盒(图1)。引物如下 表。

表1引物序列及扩增片段

首先，将载体pP43NMK(BioVector NTCC Inc.)用HindIII和PstI进行双 酶切，酶切反应体系如下：10μL 10×M buffer、5μL载体(50ng/μL)、5μL HindIII和5μL PstI，ddH2O75μL混合后于37℃水浴60min，酶切产物回收 线性化载体。以Paenibacillus sp A3基因组为模板，分别用P1/P2、P3/P4 和P5/P6为引物扩增penA1基因片段、penBT基因片段和penCD基因片段片段， 由于引物P3和P6与载体存在同源序列，P2与P5，P4与P1也存在同源序列(如图2所示，相同颜色的的区域为同源序列)，扩增体系为50μL：2.5U/μL Taq酶，1μL；10×反应缓冲液，5μL；引物，各1μL；模板，1μL； 10mM dNTP，1μL；ddH2O，40μL，扩增条件为：变性，94℃，0.5min；退 火55℃，0.5min；延伸72℃，片段1延伸10s，片段2、3延伸1min，将此 三个片段与线性化pP43NMK载体混合后采用重组克隆试剂盒的方法进行连接，反 应体系如下：2μL 5×In-Fusion混合液、1μL线性化载体(50ng/μL)、3μL 回收纯化的DNA片段(50ng/μL)和4μL超纯水，混合后于37℃水浴15min， 0℃冰浴15min，反应产物转入到大肠杆菌DH5α中，筛选阳性重组子(卡那霉 素抗性)，即构建成载体pP43NMK-penA1BTCD(图2)。其哌尼生素(penisin)表 达盒核苷酸序列SEQ ID NO.1所示(与SEQ ID NO.3有何区别)。表达盒基因序列共计8816bp：1到195为结构基因penA1；463到3585为Ia类脱水酶基因 penB；3582到5459为lantibiotic ABC转运蛋白基因penT；5494到6858为环 化酶基因penC；6939到8625为lantibiotic脱水酶基因penD。

此载体包括但不仅限于pP43NMK，其他的带有启动子和信号肽的芽孢杆菌表 达载体，也可以构建含有哌尼生素表达盒“启动子-核心肽penA1-penBTCD”的 载体。

(2)载体的转化

将载体pP43NMK-penA1BTCD通过电转化的方式转入枯草芽孢杆菌SCK168， 筛选阳性重组子，命名为PEN001、PEN002、PEN003和PEN004。此宿主菌包括但 不仅限于枯草芽孢杆菌，其他的基因工程菌地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌，也可 以实现载体的转化与表达。

(3)检测发酵上清液对金黄色葡萄球菌的抑菌活性

将筛选得到的PEN001、PEN002、PEN003和PEN004菌株在培养基(豆粕粉 1％，酵母粉1％，蛋白胨1％，葡萄糖1％，氯化钠0.5％)37℃、200rpm的条件下 培养8-12小时后，不同时间段测定发酵上清液对大肠杆菌的抑菌活性。抑菌活 性测定其方法如下：Ⅰ.细菌复苏：金黄色葡萄球菌ATCC29213平板划线，37℃ 培养20h；挑取单菌落于相应的液体培养基，置37℃培养12-16h左右。用生 理盐水将菌液稀释至OD₆₀₀吸光值为0.1(约10⁸CFU/ml)，备用。Ⅱ.取10mL发 酵液样品8000g，4℃离心，收集上清-20℃保存待用。Ⅲ.于超净工作台内，吸取100μL指示菌菌液加入到100mL恒温至50±5℃的相应的琼脂培养基中， 轻轻摇匀，避免起泡，此时菌在培养基的含量为10⁶CFU/ml。向每个陪养皿中倒 15-20mL，均匀铺平，待其冷却凝固。用无菌打孔器均匀打孔，吸取150-200μL 发酵液样品注入到相应的孔内，设立灭菌水为空白对照，同时在培养皿上做好标 记，将培养皿放入2-8℃冰箱内放置1-2h进行样品的扩散。将培养皿移入37℃ 培养箱培养。在接下来的6-12h内观察菌体的生长情况及抑菌效果，一般8-12 h即可观察到抑菌圈，枯草芽孢杆菌PEN001、PEN002、PEN003和PEN004菌株发 酵液的抑菌圈直径显著大于枯草芽孢杆菌SCK168，抑菌效果强(图3)。

(4)发酵液哌尼生素的稳定性测定：分别取5mL发酵液上清，用5mol/L HCl 或5mol/L NaOH调上清液pH值至2.0、7.3和12.0，37℃水浴3小时；取5mL 发酵液上清，100℃处理1h；分别向1.5mL的pH调至7.3的发酵上清液加0.2 mL胰蛋白酶和蛋白酶K溶液，使酶的终浓度为l mg/mL，37℃水浴4小时，对照 组及所有酶的反应体系沸水浴处理5min使酶灭活。按照(3)试验步骤检测处 理后的发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌活性，发现哌尼生素耐酸碱、胰酶和蛋白 酶K，高温耐受能力不持久(图4)。

(5)发酵液哌尼生素的含量测定：将筛选得到的PEN001、PEN002、PEN003和 PEN004菌株在培养基(豆粕粉1％，酵母粉1％，蛋白胨1％，葡萄糖3％，氯化钠 0.5％)37℃、200rpm的条件下培养，不同时间段测定发酵上清液中哌尼生素的 含量。其方法如下：以生物公司采用化学法合成哌尼生素(南京金斯瑞)纯品(含 量为99％)，为标准，用反相色谱柱：C18(4.6×250mm或150mm)；洗脱液： 流动相A(0.1％三氟乙酸)、流动相B(90％乙腈)按表3进行洗脱。所设的参数 应为：柱温：25℃(或室温)，检测波长：260nm；最大压力：200bar。采用 此检测方法，PEN001、PEN002、PEN003和PEN004发酵液中哌尼生素有效成分的 含量分别为0.82、0.46、0.67、0.86、1.03g/L。

表 3 流动相梯度洗脱程序

纯品溶于水中，上样测定纯品的出峰时间，然后发酵液上样。外标法以峰面积和浓度（上样量一致）成正比计算，采用下列公式计算含量：

式中AX为发酵液哌尼生素（penisin）的峰面积；CX为发酵液中哌尼生素的含量（μg/g）；AR为对照品的峰面积：CR为对照品的浓度（μg/mL）。纯品和发酵液图谱为图5A和5B，纯度为95%。

序列表

<110>重庆市畜牧科学院

<120>一种哌尼生素前体、表达盒及其制备方法

<160>

<210> 1

<211> 8624

<212> DNA

<213>哌尼生素（penisin）表达盒

<220>

<221>

<222> （1）..（3）

<223> 起始密码子

<222> （4）..（195）

<223> penA1

<222> （463）..（3585）

<223> penB

<222>（3582）..（5459）

<223> penT

<222>（5494）..（6858）

<223> penC

<222>（6939）..（8624）

<223>penD

<400> 1

atggcaaaca acaatttcga tctggatgtc caagtgaaat cggttaattc ggtaaacgcg 60

aattttgggc tttacacgtc gcaatgctat agttctcaat gctattcttc caaatgttat 120

tccgattctt gctactcctc cgactgctac accggcagac atatgtgcgg ctacacgcac 180

ggctacagct gctaatttcg tccattcctt ccactttcgc cggctgccgc aacaatcttc 240

ggagaaatgt tctccgttcg aagggagaaa atctgtactt tcgcgtgttc ctacagccta 300

cttcggagga acgttcgcgt tcttccgaag tatctcttac gactcgataa cggaaggtga 360

gacgacatgt cagttcaagt ggccccctct caaccaacgc aagctcatgc acatccaagc 420

gtttttcagg cgcttgattt ttttattttg aggatgcctt tattgccggt ggaactattc 480

cagaaccttt ctgtcgatcc aaatgaggat gaggcggtta gccgcaagcc atggttcgag 540

aaattggccg cctacgccga attgcctatc atccgggaag ccattgccgt atccagcttg 600

ccgctgcttc aggctttgcc caatctaacc aaccaggagc atccgcgcaa acaagatcag 660

gccgtaaaag gctttctgcg ctatttgctg cgtatgacct cgcgtccgac gccttttggt 720

ttattttctg gggttacata cggaaatttc ggggagcggt atgcgttcgg gcttcagccc 780

gtaacggccc acaccaaacg agcccgccct gatatggagt ggctgctgaa agtgctgtcc 840

gacttggaga gccggtttga cgtcgtcaag cagttaaagg tcagtctcaa ttgtttggct 900

tatcccgtag gctcccgcct ttacctgccc tacctgacca agtacggcgt caagcagaaa 960

agcaaaagca ctatggagag cacctccgtt cgccttactc cggccgtgaa gcaggtgatg 1020

gagcttaccc gtcagcccct ccccttttgc gagttggcac tgaagctgca cagccaattt 1080

tccgatacgt cactcgagca aataaaccaa tttctgtggc agctggttca gcaggaaatc 1140

atcatcacgg acctgcgccc gcctctcatg accgcttcgc cattcgatta cgtactgcag 1200

cgtttagccg atgtcaccgg tgtggaagac gagaggacga agctagaaac cgccgcagcc 1260

ctcatcgcga gctataaccg tacggaaatc gggcaaggcg agccattata tcatgagctt 1320

gttgagcata tgaaatccgt tgccgaagcg gataatctcc tgcaagtgga tctggccctc 1380

tcgatggaga cgttaaccct ccccaaatcc gttgcgcagg agatcgagcg tgtcggcgaa 1440

gcgctttggc gaatctccgg ggaacggctg agactttcac atctggaaag ctaccgcgcc 1500

gatttcatgg agaaatacgg ggcttaccgc gaggttcccc tgctggagct gctggacgca 1560

gacatcgggc ttggcgctcc ggccggatat gaatatcccc ggggcaaccg caaggaagac 1620

aacacccctt ccttcgccca gcaaaagaaa aagatgctgc tgacccaatg ggtcatgaca 1680

tgcctccagc aggggcggca ggaattggag ctgaccgaca acatggtgat gcagctcgaa 1740

cctgtgccga tggaggaaaa gtacgcgcca cggtcgttgg aattggtttt tggccttgcc 1800

gcccgatccg gccaagcggt ggaggagggt gactttctcc tgattgccgg aggaacgacg 1860

ggcacctacg gtgcaggcaa atccgtcggc cggtttgtcg atttatttga ttcctccttt 1920

gtggacaagc tcaagcaaat tgaccgattg gagcaaaagc ttcagcccga agcgatcctc 1980

gccgagctcg tttatttccc aggagacggc cgcgcggcta atgtcgctct gagcacgaac 2040

attcgcgaat acgaaatcga catcggcacc aattcggcca aagatccgga gcatacgatt 2100

ccgctctccg atctggtcgt cggtatttct gcgagcggtt tttatttgcg gtctctggca 2160

aaaaaccgaa gagttattcc ggtgacaaac cacatgctga atacgtcgaa ttcgcctaac 2220

gtctaccggt ttttgcgtga aatatcgatg gaaaaccagc gcaacattga tttttttgag 2280

tggaacgagt taagaactct tcctttcttg ccgcgggtaa ggtacagcaa aacgatcatt 2340

gcggcggcct gctggaagtt taacggggac ctgccacctt ttcgcgggaa catgacggag 2400

acgcagtggc gccaagcgtt cgaggcgtac cggaagcaat ggaatgttcc gcgctttgtt 2460

tatttgaccc aatcggataa ccgcttgctg ctggatctcg actccccgct tcatcgggac 2520

gaagtgtatc gggattatac gaagcttcag cctggggggc aaatcgtctt aaccgaaacc 2580

ggctttgcgt ttgagcatct gcccgagagc gcagacgggc actacgtgac cgagtttgtc 2640

tttcctctcg tcaaacggga tctgccgcaa gcttccacgc agccggatct cggcggaact 2700

ctcgcctccc cctccatccg cctcgcggag agattgaaaa tgccgggcag cgaatggctg 2760

tatctgaaat ggtacggtgc ggatcatcgc gccgacgctt ttatcggagg acctctgctg 2820

gagttttgcc gccaggcgga ggagcaagga tgggctgccg gcagcttctt tatgcgctat 2880

gccgatcccg atccgcatct tcgctggcgt ttctgcggcc atcccgagca gcttcacacc 2940

gtgctgctgc cgcagctgta ccggtttacg cggcagtgcg tggaagacgg actcttgtcc 3000

cgcctggtga tcgatactta cgatccggaa atcgagcggt acgggggccg gacgttgata 3060

gggacggcgg aacggctgtt ctgtgtcgac agccgggtcg tggccgaatg gattcacgcc 3120

agacaatcgg gacacctcag cctggacccg cacttgctgg ctgtcatcag cgtcattgac 3180

atgatggaac gattcgggct gtccttcttc gagcaattcg actggcttaa cacgatggta 3240

cagcataagg agcatttgga gctgttccgt cagcaccggc cgtttcttat gaaattcggg 3300

gatgccagag gaaactttgc ccagcttcgc catctccctg acggagcggt catcctgccg 3360

atgctccaag cccgcggcga ggcgatagcc cggtacgtcg agggaatccg gctgtgccaa 3420

gcggaaggaa ccttgaccaa tactcaagag gatctgatgc aaagcgtgat ccatatgcat 3480

ctaaaccggc tgttcggcat ccaacgagaa gaagagcaga aggtgttgac tctggtcaga 3540

catacgctat acagcttgca gcatgtgagg aggaatcagc catgagctcg gctgcggaag 3600

aagcatccct aaccgtaaat ctaacgaata ttgtgcaatc ctttcgctat tggccccgcg 3660

tgttccaatt gctgtggcag acgcacaaac cgtatttctt gcttattcta gtgattaaca 3720

ttctgcgcgg cgcctcgccg gtcatctcgc tgctgctgct ccaaaccctg atcaacagca 3780

taggcacctc ttgggatacg ggttttcaga ccgtgctttg gccctttatt tggctcacta 3840

cgtttaccgc atttaatgaa gcgctgtcgc tggctcaaaa tttcatcagc aaattatttg 3900

aaacgctgct cagcaatcgg atcaacatgc tcattatgga gaagtcgatt tccctttcgc 3960

ttagcgattt tgagaactcc caggtgcagg acgccctgaa acgcgcccag aacgaggccg 4020

gtcatcggcc ttatcaaatc ctgcagcaga ttttgtccat tgttacggct tccattacgt 4080

tattctcgac cgcggctatg ctcatttcgt ggaaatggtg ggcggctttt ctcctgatcc 4140

tcattccctt gacctccttc tattcgtttc tgaggatcgg gcagcaggag tttatgcttc 4200

aatggaaccg ggccccgaaa atgcggcata cctggtattt gtccgtgctg ctgacaaggg 4260

atctctcttt caaggagatc aagctgtttc aactgggcgg ttatttgctc ggcaaatatc 4320

acgagctgct gcgtcaattt ttggcggaag acaaacgcat gatcaaaaag cggctcggca 4380

tgggagcgat ttttcaagcg atccagcaag gggtcaacgc tttcatgttt ctcatggtct 4440

tatggtccgc ctttaagcgc gaaattttga tcggccatgt ggtcagctat acccaagcga 4500

ttacgttaac cctcgtttcg tcgcaaaatc tgacgcaggg catcctttcc ttatgccagc 4560

acaatttatt tttacagcag ttgttcgctt tcctggatct gcagtcctcc gatcctgccg 4620

ccagaagaat cggagcttcg gaggcttccc gtgcgacgaa tgcgcctgtc atccaatcgg 4680

tggaattccg caatgtgtct ttccgttatc ccggcagcag ttatccggct ctgcgtaatg 4740

tcagcttcac cctgcagcgc ggagaaacac tcgcgattgt agggcgcaac gggtccggga 4800

agacaacgct gatgaagctg ctgacgcagc tgtacgactc ctttgaagga gagattctca 4860

tcaacggagt ctcgatccgc gatatggact gcgaagcgtt tcgccgcaag gtcggcgtcg 4920

tgttccagga ttttgtccaa tatgagatgc aggtccggca aaatatcggt tttggcaacg 4980

tcgccaaaat ggaggacgac gccgaattgt ggaaggcggc ggatcgggcg ggcatcgccg 5040

agttggtccg atcgatgccc gcaggccttg ccacgcagct cggacgcttg tttgacgaag 5100

ggcagcagct ctccggtgga cagtggcagc ggattgccat cgcccgagcc ttcatgcgcg 5160

aagccgagct ctatgtgctg gacgagccca gctccatgct cgacccggaa accgagctgc 5220

aggtgttcca ggcgtttcgg gaactggtcc gcgatcggtt gggcatcttc atttctcacc 5280

gctactccgc catccggtac gccgaccata tcctcatgat ggatcaaggc tccgtggtcg 5340

agcagggcaa tcatcaacag ctcatgcagc agaacgggat gtatgcggag ctctatatga 5400

tgcaagcgaa tgcttatttg gacgccgatc atgagcgcaa agcgcgttcg gccgtttgat 5460

tgcggcaacc atgatccgaa gggagaaatc ggaatgaacc cgaaagaaac ttacgaggcc 5520

aagtggctgc cgcttgaagg cgccgaacga atcgaacggg tccgctcgat tgtgatggag 5580

acggcccggc gattgaagga cccgggagac atcgagcaat tcgctctcgc agaagaaaat 5640

aaacggatag agcaaggaaa attttacgtg aagtggaacg ggctggacct tgcgcggggg 5700

tattcgggtt tatgcctgtt gttcggcgag ctggatcggc tagagcccga tggacaatgg 5760

gacgtcgcag gtcaccgcta tgttattctc atgcagcaag ctttggaaca gcaaggaatc 5820

gagtccttat ccctatggag cggtatggcc ggagtcgtta cgggcatcca ggctttgtcg 5880

cggcagggca cccggtacgc gaatatgctt cggtccctca acgacttttt cctgcgcatg 5940

ttccccgagt acatgtatgt tgtccggaga aatataaaag aaggcgtgct catgtccgat 6000

tacgacgtga tgcagggctt aagcggcata ggccgttatt tgctgcactt taaagagcat 6060

cccgagatgc gcattgcgct tacgcaggtg cttgagtata tggttgagct gtgcgggtac 6120

aaggagatgc aaggtaaaca agttccggga tggtatattt cgcccgaccg gcttatttcc 6180

tcctccgatc aggagttata ccccgagggt tacttcaact gcggagtttc ccacggcatt 6240

ccgggtcctt tggccctgct ctcccttgcg cacctgcaag gcgtagaagt cgagggcggg 6300

caggaagcca tccgctccat cgccgagtgg ttgatgcggt ttacgatcaa ggatgagtac 6360

ggcctctatt ggcccggtca tgtatcgtgg caagagcaga cagcgggcgc ggcaagcggc 6420

tcgccgtccc gcgaagcttg gtgctatggc gggcccggcg tcgcacgcac gctatggctc 6480

gcggggcaag cgctcggaga accggcgtgg aggcaagcgg cgattgaatc gttccttgga 6540

acggcccggc ggcccgaacg gctgtggaac ttgcattccg ccaccttttg ccacggctat 6600

gccggtctcc tgcaaatgac gcagcggatg atcgcagaca cggggaccac ggagctcatt 6660

cctttacgcg accgtctcgt tgatcggatt gttcagtcct atgatgcgag tgcgccttac 6720

ggctttgcag agctggaaga aggcgaaaag ctgcatttcg ccggagtgct ggacggggca 6780

gcaggcgttg cgctcacgct gcttgcggtc attcaagatc aggagccgga gtgggatcag 6840

gttttcctat tgaagtaagg ttagttgtta cgtaaaaaag ccttcggtgc cggatcgttt 6900

cgttccggac gcgaaggctt ttttttgcag gggaattact agattttcat gactccaccg 6960

gtgctggccg aggttacgag cttggaatag cgggccagat aacccgtttt caccttcggc 7020

tcgaagcctt tccagttcgc acggcggcgt tcgaattcct cgtcgctgac cagcagctcg 7080

attttacggt taacgagatc gagctcgatg atatcgccgt cctcgacgaa tgcgatcgga 7140

ccgccttccg ccgcttccgg cgagatgtgg ccgatgctga taccgcgtga tgcgccggag 7200

aaacggccgt ccgtaatgag accgactttc gcgccgaggc ccattccgac gatctgcgag 7260

gttggggcga gcatttccgg catgccggga ccgcctttcg gaccttcgta acggataacg 7320

acgacatggc cttcttttac tttgccgttg gcgatgcctt ccagcgccgc ttcctgcgaa 7380

tcgaagcaga tggccggccc tttgtgatag ccgcccacgg acttgtccac cgcgccgacc 7440

ttgatgatcg agccgttcgg tgccaggttg ccgaacagca ccgccaagcc gccttgctcc 7500

gaatgcgggt tatccagcgt acggatgacg tccgtgttca aaatctcgca gccggcgacg 7560

ttttcgcgca gcgttttacc ggtcacggtg atgcggtcgc cgtacagcgc gcccggcttt 7620

ttgaacagtt cgttcaggac ggcgctcacg cctccggcgt tgtgaacgtc ctcgatatga 7680

taatcggagg ccggagcgat tttggccaag tgcgggatgc gcttcgccac ttcattgatc 7740

cgctcgatcg ggtattcgaa gcccgcttcg tgcgccagag cgagtgtgtg cagcacagta 7800

ttggtcgagc cgcccatcgc catatccagc gcgaacgcat tgtcgatcgc ttccatcgtc 7860

acgatatcgc gcggcttgat atccttttga atcaactcca tgagctgctt cgcggaacgc 7920

ttcacgaatt ccttacggtc atcggaaatc gccaaaatgg tgccgttgcc cgggagcgcc 7980

agaccgagag cttccgccag acagttcatc gagttggccg tgaacatgcc ggagcaggag 8040

ccgcaggtcg gacagccgta ttgctcaagc tcaagcagac ctttatcgtc gattttgccg 8100

gcttggtaag cgcccacgcc ttcgaatacg gaagacagtg aaatcgaacg tccgtcgctc 8160

gtttttccgg ctttcatcgg accgccgctg acgaataccg tcggaatgtt gacgcgcagc 8220

gcgcccatca tcatgcccgg cgtaattttg tcgcagttcg ggatgcagac catgccgtcg 8280

aaccagtgcg cggacacaac cgtttcgaga gaatccgcaa taatctcgcg gctcggcaag 8340

gaatagcgca tgccgatatg ccccatggca atgccgtcgt ctacgccgat cgtgttaaat 8400

tcaaacggca cgccgcccgc ttcgcgaatc gcttctttca cgagcttgcc gaattcctgc 8460

aggtgaacgt gacccggaac gatgtcgata tacgagttgc aaaccgcgat aaacggcttg 8520

tcgaagtcct cctctttgac gccggcggcg cgcagcaagc tgcggtgcgg agcgcggtca 8580

aagccctttt tgatcatgtc gcttctcatt tttcccttgg acat 8624

<210> 2

<211> 64

<212>protein

<213>核心肽penA1

<400> 2

MANNNFDLDV QVKSVNSVNA NFGLYTSQCY SSQCYSSKCY SDSCYSSDCY TGRHMCGYTH 60

GYSC 64

<210> 3

<211> 15409

<212> DNA

<213>哌尼生素（penisin）表达盒载体

<220>

<221>

<222>(4544)..( 4546)

<223>起始密码子

<222>(4547)..( 4741)

<223> penA1

<222>(5009)..( 8131)

<223>penB

<222>(8128)..( 10005)

<223>penT

<222>(10040)..( 11404)

<223>penC

<222>(11485)..( 13170)

<223>penD

<222>(1)..( 4546)、(13171)..( 15409)

<223>pP43NMK载体序列

<400>3

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt ccttaaggaa cgtacagacg 420

gcttaaaagc ctttaaaaac gtttttaagg ggtttgtaga caaggtaaag gataaaacag 480

cacaattcca agaaaaacac gatttagaac ctaaaaagaa cgaatttgaa ctaactcata 540

accgagaggt aaaaaaagaa cgaagtcgag atcagggaat gagtttataa aataaaaaaa 600

gcacctgaaa aggtgtcttt ttttgatggt tttgaacttg ttctttctta tcttgataca 660

tatagaaata acgtcatttt tattttagtt gctgaaaggt gcgttgaagt gttggtatgt 720

atgtgtttta aagtattgaa aacccttaaa attggttgca cagaaaaacc ccatctgtta 780

aagttataag tgactaaaca aataactaaa tagatggggg tttcttttaa tattatgtgt 840

cctaatagta gcatttattc agatgaaaaa tcaagggttt tagtggacaa gacaaaaagt 900

ggaaaagtga gaccatggag agaaaagaaa atcgctaatg ttgattactt tgaacttctg 960

catattcttg aatttaaaaa ggctgaaaga gtaaaagatt gtgctgaaat attagagtat 1020

aaacaaaatc gtgaaacagg cgaaagaaag ttgtatcgag tgtggttttg taaatccagg 1080

ctttgtccaa tgtgcaactg gaggagagca atgaaacatg gcattcagtc acaaaaggtt 1140

gttgctgaag ttattaaaca aaagccaaca gttcgttggt tgtttctcac attaacagtt 1200

aaaaatgttt atgatggcga agaattaaat aagagtttgt cagatatggc tcaaggattt 1260

cgccgaatga tgcaatataa aaaaattaat aaaaatcttg ttggttttat gcgtgcaacg 1320

gaagtgacaa taaataataa agataattct tataatcagc acatgcatgt attggtatgt 1380

gtggaaccaa cttattttaa gaatacagaa aactacgtga atcaaaaaca atggattcaa 1440

ttttggaaaa aggcaatgaa attagactat gatccaaatg taaaagttca aatgattcga 1500

ccgaaaaata aatataaatc ggatatacaa tcggcaattg acgaaactgc aaaatatcct 1560

gtaaaggata cggattttat gaccgatgat gaagaaaaga atttgaaacg tttgtctgat 1620

ttggaggaag gtttacaccg taaaaggtta atctcctatg gtggtttgtt aaaagaaata 1680

cataaaaaat taaaccttga tgacacagaa gaaggcgatt tgattcatac agatgatgac 1740

gaaaaagccg atgaagatgg attttctatt attgcaatgt ggaattggga acggaaaaat 1800

tattttatta aagagtagtt caacaaacgg gccagtttgt tgaagattag atgctataat 1860

tgttattaaa aggattgaag gatgcttagg aagacgagtt attaatagct gaataagaac 1920

ggtgctctcc aaatattctt atttagaaaa gcaaatctaa aattatctga aaagggaatg 1980

agaatagtga atggaccaat aataatgact agagaagaaa gaatgaagat tgttcatgaa 2040

attaaggaac gaatattgga taaatatggg gatgatgtta aggctattgg tgtttatggc 2100

tctcttggtc gtcagactga tgggccctat tcggatattg agatgatgtg tgtcatgtca 2160

acagaggaag cagagttcag ccatgaatgg acaaccggtg agtggaaggt ggaagtgaat 2220

tttgatagcg aagagattct actagattat gcatctcagg tggaatcaga ttggccgctt 2280

acacatggtc aatttttctc tattttgccg atttatgatt caggtggata cttagagaaa 2340

gtgtatcaaa ctgctaaatc ggtagaagcc caaacgttcc acgatgcgat ttgtgccctt 2400

atcgtagaag agctgtttga atatgcaggc aaatggcgta atattcgtgt gcaaggaccg 2460

acaacatttc taccatcctt gactgtacag gtagcaatgg caggtgccat gttgattggt 2520

ctgcatcatc gcatctgtta tacgacgagc gcttcggtct taactgaagc agttaagcaa 2580

tcagatcttc cttcaggtta tgaccatctg tgccagttcg taatgtctgg tcaactttcc 2640

gactctgaga aacttctgga atcgctagag aatttctgga atgggattca ggagtggaca 2700

gaacgacacg gatatatagt ggatgtgtca aaacgcatac cattttgaac gatgacctct 2760

aataattgtt aatcatgttg gttacgtatt tattaacttc tcctagtatt agtaattatc 2820

atggctgtca tggcgcatta acggaataaa gggtgtgctt aaatcgggcc attttgcgta 2880

ataagaaaaa ggattaatta tgagcgaatt gaattaataa taaggtaata gatttacatt 2940

agaaaatgaa aggggatttt atgcgtgaga atgttacagt ctatcccggc attgccagtc 3000

ggggatatta aaaagagtat aggtttttat tgggataaag taggtttcac tttggttcac 3060

catgaagatg gattcgcagt tctaatgtgt aatgaggttc ggattcatct atgggaggca 3120

agtgatgaag gctggcgcct cgtagtaatg attcaccggt ttgtacaggt gcggagtcgt 3180

ttattgctgg tactgctagt tgccgcattg aagtagaggg aattgatgaa ttatatcaac 3240

atattaagcc tttgggcatt ttgcacccca atacatcatt aaaagatcag tggtgggatg 3300

aacgagactt tgcagtaatt gatcccgaca acaatttgat tagctttttt caacaaataa 3360

aaagctaaaa tctattatta atctgttcag caatcgggcg cgattgctga ataaaagata 3420

cgagagacct ctcttgtatc ttttttattt tgagtggttt tgtccgttac actagaaaac 3480

cgaaagacaa taaaaatttt attcttgctg agtctggctt tcggtaagct agacaaaacg 3540

gacaaaataa aaattggcaa gggtttaaag gtggagattt tttgagtgat cttctcaaaa 3600

aatactacct gtcccttgct gatttttaaa cgagcacgag agcaaaaccc ccctttgctg 3660

aggtggcaga gggcaggttt ttttgtttct tttttctcgt aaaaaaaaga aaggtcttaa 3720

aggttttatg gttttggtcg gcactgccgc gcctcgcaga gcacacactt tatgaatata 3780

aagtatagtg tgttatactt tacttggaag tggttgccgg aaagagcgaa aatgcctcac 3840

atttgtgcca cctaaaaagg agcgatttac atatgagtta tgcagtttgt agaatgcaaa 3900

aagtgaaatc agctggacta aaaggcatgc aatttcataa tcaaagagag cgaaaaagta 3960

gaacgaatga tgatattgac catgagcgaa cacgtgaaaa ttatgatttg aaaaatgata 4020

aaaatattga ttacaacgaa cgtgtcaaag aaattattga atcacaaaaa acaggtacaa 4080

gaaaaacgag gaaagatgct gttcttgtaa atgagttgct agtaacatct gaccgagatt 4140

tttttgagca actggatcct gataggtggt atgttttcgc ttgaactttt aaatacagcc 4200

attgaacata cggttgattt aataactgac aaacatcacc ctcttgctaa agcggccaag 4260

gacgctgccg ccggggctgt ttgcgttttt gccgtgattt cgtgtatcat tggtttactt 4320

atttttttgc caaagctgta atggctgaaa attcttacat ttattttaca tttttagaaa 4380

tgggcgtgaa aaaaagcgcg cgattatgta aaatataaag tgatagcggt accattatag 4440

gtaagagagg aatgtacaca tgcgcaactt gaccaagaca tctctattac tggccggctt 4500

atgcacagcg gcccaaatgg tttttgtaac acatgcctca gctgcaatgg caaacaacaa 4560

tttcgatctg gatgtccaag tgaaatcggt taattcggta aacgcgaatt ttgggcttta 4620

cacgtcgcaa tgctatagtt ctcaatgcta ttcttccaaa tgttattccg attcttgcta 4680

ctcctccgac tgctacaccg gcagacatat gtgcggctac acgcacggct acagctgcta 4740

atttcgtcca ttccttccac tttcgccggc tgccgcaaca atcttcggag aaatgttctc 4800

cgttcgaagg gagaaaatct gtactttcgc gtgttcctac agcctacttc ggaggaacgt 4860

tcgcgttctt ccgaagtatc tcttacgact cgataacgga aggtgagacg acatgtcagt 4920

tcaagtggcc ccctctcaac caacgcaagc tcatgcacat ccaagcgttt ttcaggcgct 4980

tgattttttt attttgagga tgcctttatt gccggtggaa ctattccaga acctttctgt 5040

cgatccaaat gaggatgagg cggttagccg caagccatgg ttcgagaaat tggccgccta 5100

cgccgaattg cctatcatcc gggaagccat tgccgtatcc agcttgccgc tgcttcaggc 5160

tttgcccaat ctaaccaacc aggagcatcc gcgcaaacaa gatcaggccg taaaaggctt 5220

tctgcgctat ttgctgcgta tgacctcgcg tccgacgcct tttggtttat tttctggggt 5280

tacatacgga aatttcgggg agcggtatgc gttcgggctt cagcccgtaa cggcccacac 5340

caaacgagcc cgccctgata tggagtggct gctgaaagtg ctgtccgact tggagagccg 5400

gtttgacgtc gtcaagcagt taaaggtcag tctcaattgt ttggcttatc ccgtaggctc 5460

ccgcctttac ctgccctacc tgaccaagta cggcgtcaag cagaaaagca aaagcactat 5520

ggagagcacc tccgttcgcc ttactccggc cgtgaagcag gtgatggagc ttacccgtca 5580

gcccctcccc ttttgcgagt tggcactgaa gctgcacagc caattttccg atacgtcact 5640

cgagcaaata aaccaatttc tgtggcagct ggttcagcag gaaatcatca tcacggacct 5700

gcgcccgcct ctcatgaccg cttcgccatt cgattacgta ctgcagcgtt tagccgatgt 5760

caccggtgtg gaagacgaga ggacgaagct agaaaccgcc gcagccctca tcgcgagcta 5820

taaccgtacg gaaatcgggc aaggcgagcc attatatcat gagcttgttg agcatatgaa 5880

atccgttgcc gaagcggata atctcctgca agtggatctg gccctctcga tggagacgtt 5940

aaccctcccc aaatccgttg cgcaggagat cgagcgtgtc ggcgaagcgc tttggcgaat 6000

ctccggggaa cggctgagac tttcacatct ggaaagctac cgcgccgatt tcatggagaa 6060

atacggggct taccgcgagg ttcccctgct ggagctgctg gacgcagaca tcgggcttgg 6120

cgctccggcc ggatatgaat atccccgggg caaccgcaag gaagacaaca ccccttcctt 6180

cgcccagcaa aagaaaaaga tgctgctgac ccaatgggtc atgacatgcc tccagcaggg 6240

gcggcaggaa ttggagctga ccgacaacat ggtgatgcag ctcgaacctg tgccgatgga 6300

ggaaaagtac gcgccacggt cgttggaatt ggtttttggc cttgccgccc gatccggcca 6360

agcggtggag gagggtgact ttctcctgat tgccggagga acgacgggca cctacggtgc 6420

aggcaaatcc gtcggccggt ttgtcgattt atttgattcc tcctttgtgg acaagctcaa 6480

gcaaattgac cgattggagc aaaagcttca gcccgaagcg atcctcgccg agctcgttta 6540

tttcccagga gacggccgcg cggctaatgt cgctctgagc acgaacattc gcgaatacga 6600

aatcgacatc ggcaccaatt cggccaaaga tccggagcat acgattccgc tctccgatct 6660

ggtcgtcggt atttctgcga gcggttttta tttgcggtct ctggcaaaaa accgaagagt 6720

tattccggtg acaaaccaca tgctgaatac gtcgaattcg cctaacgtct accggttttt 6780

gcgtgaaata tcgatggaaa accagcgcaa cattgatttt tttgagtgga acgagttaag 6840

aactcttcct ttcttgccgc gggtaaggta cagcaaaacg atcattgcgg cggcctgctg 6900

gaagtttaac ggggacctgc caccttttcg cgggaacatg acggagacgc agtggcgcca 6960

agcgttcgag gcgtaccgga agcaatggaa tgttccgcgc tttgtttatt tgacccaatc 7020

ggataaccgc ttgctgctgg atctcgactc cccgcttcat cgggacgaag tgtatcggga 7080

ttatacgaag cttcagcctg gggggcaaat cgtcttaacc gaaaccggct ttgcgtttga 7140

gcatctgccc gagagcgcag acgggcacta cgtgaccgag tttgtctttc ctctcgtcaa 7200

acgggatctg ccgcaagctt ccacgcagcc ggatctcggc ggaactctcg cctccccctc 7260

catccgcctc gcggagagat tgaaaatgcc gggcagcgaa tggctgtatc tgaaatggta 7320

cggtgcggat catcgcgccg acgcttttat cggaggacct ctgctggagt tttgccgcca 7380

ggcggaggag caaggatggg ctgccggcag cttctttatg cgctatgccg atcccgatcc 7440

gcatcttcgc tggcgtttct gcggccatcc cgagcagctt cacaccgtgc tgctgccgca 7500

gctgtaccgg tttacgcggc agtgcgtgga agacggactc ttgtcccgcc tggtgatcga 7560

tacttacgat ccggaaatcg agcggtacgg gggccggacg ttgataggga cggcggaacg 7620

gctgttctgt gtcgacagcc gggtcgtggc cgaatggatt cacgccagac aatcgggaca 7680

cctcagcctg gacccgcact tgctggctgt catcagcgtc attgacatga tggaacgatt 7740

cgggctgtcc ttcttcgagc aattcgactg gcttaacacg atggtacagc ataaggagca 7800

tttggagctg ttccgtcagc accggccgtt tcttatgaaa ttcggggatg ccagaggaaa 7860

ctttgcccag cttcgccatc tccctgacgg agcggtcatc ctgccgatgc tccaagcccg 7920

cggcgaggcg atagcccggt acgtcgaggg aatccggctg tgccaagcgg aaggaacctt 7980

gaccaatact caagaggatc tgatgcaaag cgtgatccat atgcatctaa accggctgtt 8040

cggcatccaa cgagaagaag agcagaaggt gttgactctg gtcagacata cgctatacag 8100

cttgcagcat gtgaggagga atcagccatg agctcggctg cggaagaagc atccctaacc 8160

gtaaatctaa cgaatattgt gcaatccttt cgctattggc cccgcgtgtt ccaattgctg 8220

tggcagacgc acaaaccgta tttcttgctt attctagtga ttaacattct gcgcggcgcc 8280

tcgccggtca tctcgctgct gctgctccaa accctgatca acagcatagg cacctcttgg 8340

gatacgggtt ttcagaccgt gctttggccc tttatttggc tcactacgtt taccgcattt 8400

aatgaagcgc tgtcgctggc tcaaaatttc atcagcaaat tatttgaaac gctgctcagc 8460

aatcggatca acatgctcat tatggagaag tcgatttccc tttcgcttag cgattttgag 8520

aactcccagg tgcaggacgc cctgaaacgc gcccagaacg aggccggtca tcggccttat 8580

caaatcctgc agcagatttt gtccattgtt acggcttcca ttacgttatt ctcgaccgcg 8640

gctatgctca tttcgtggaa atggtgggcg gcttttctcc tgatcctcat tcccttgacc 8700

tccttctatt cgtttctgag gatcgggcag caggagttta tgcttcaatg gaaccgggcc 8760

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gagatcaagc tgtttcaact gggcggttat ttgctcggca aatatcacga gctgctgcgt 8880

caatttttgg cggaagacaa acgcatgatc aaaaagcggc tcggcatggg agcgattttt 8940

caagcgatcc agcaaggggt caacgctttc atgtttctca tggtcttatg gtccgccttt 9000

aagcgcgaaa ttttgatcgg ccatgtggtc agctataccc aagcgattac gttaaccctc 9060

gtttcgtcgc aaaatctgac gcagggcatc ctttccttat gccagcacaa tttattttta 9120

cagcagttgt tcgctttcct ggatctgcag tcctccgatc ctgccgccag aagaatcgga 9180

gcttcggagg cttcccgtgc gacgaatgcg cctgtcatcc aatcggtgga attccgcaat 9240

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cagcgcggag aaacactcgc gattgtaggg cgcaacgggt ccgggaagac aacgctgatg 9360

aagctgctga cgcagctgta cgactccttt gaaggagaga ttctcatcaa cggagtctcg 9420

atccgcgata tggactgcga agcgtttcgc cgcaaggtcg gcgtcgtgtt ccaggatttt 9480

gtccaatatg agatgcaggt ccggcaaaat atcggttttg gcaacgtcgc caaaatggag 9540

gacgacgccg aattgtggaa ggcggcggat cgggcgggca tcgccgagtt ggtccgatcg 9600

atgcccgcag gccttgccac gcagctcgga cgcttgtttg acgaagggca gcagctctcc 9660

ggtggacagt ggcagcggat tgccatcgcc cgagccttca tgcgcgaagc cgagctctat 9720

gtgctggacg agcccagctc catgctcgac ccggaaaccg agctgcaggt gttccaggcg 9780

tttcgggaac tggtccgcga tcggttgggc atcttcattt ctcaccgcta ctccgccatc 9840

cggtacgccg accatatcct catgatggat caaggctccg tggtcgagca gggcaatcat 9900

caacagctca tgcagcagaa cgggatgtat gcggagctct atatgatgca agcgaatgct 9960

tatttggacg ccgatcatga gcgcaaagcg cgttcggccg tttgattgcg gcaaccatga 10020

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gaaggacccg ggagacatcg agcaattcgc tctcgcagaa gaaaataaac ggatagagca 10200

aggaaaattt tacgtgaagt ggaacgggct ggaccttgcg cgggggtatt cgggtttatg 10260

cctgttgttc ggcgagctgg atcggctaga gcccgatgga caatgggacg tcgcaggtca 10320

ccgctatgtt attctcatgc agcaagcttt ggaacagcaa ggaatcgagt ccttatccct 10380

atggagcggt atggccggag tcgttacggg catccaggct ttgtcgcggc agggcacccg 10440

gtacgcgaat atgcttcggt ccctcaacga ctttttcctg cgcatgttcc ccgagtacat 10500

gtatgttgtc cggagaaata taaaagaagg cgtgctcatg tccgattacg acgtgatgca 10560

gggcttaagc ggcataggcc gttatttgct gcactttaaa gagcatcccg agatgcgcat 10620

tgcgcttacg caggtgcttg agtatatggt tgagctgtgc gggtacaagg agatgcaagg 10680

taaacaagtt ccgggatggt atatttcgcc cgaccggctt atttcctcct ccgatcagga 10740

gttatacccc gagggttact tcaactgcgg agtttcccac ggcattccgg gtcctttggc 10800

cctgctctcc cttgcgcacc tgcaaggcgt agaagtcgag ggcgggcagg aagccatccg 10860

ctccatcgcc gagtggttga tgcggtttac gatcaaggat gagtacggcc tctattggcc 10920

cggtcatgta tcgtggcaag agcagacagc gggcgcggca agcggctcgc cgtcccgcga 10980

agcttggtgc tatggcgggc ccggcgtcgc acgcacgcta tggctcgcgg ggcaagcgct 11040

cggagaaccg gcgtggaggc aagcggcgat tgaatcgttc cttggaacgg cccggcggcc 11100

cgaacggctg tggaacttgc attccgccac cttttgccac ggctatgccg gtctcctgca 11160

aatgacgcag cggatgatcg cagacacggg gaccacggag ctcattcctt tacgcgaccg 11220

tctcgttgat cggattgttc agtcctatga tgcgagtgcg ccttacggct ttgcagagct 11280

ggaagaaggc gaaaagctgc atttcgccgg agtgctggac ggggcagcag gcgttgcgct 11340

cacgctgctt gcggtcattc aagatcagga gccggagtgg gatcaggttt tcctattgaa 11400

gtaaggttag ttgttacgta aaaaagcctt cggtgccgga tcgtttcgtt ccggacgcga 11460

aggctttttt ttgcagggga attactagat tttcatgact ccaccggtgc tggccgaggt 11520

tacgagcttg gaatagcggg ccagataacc cgttttcacc ttcggctcga agcctttcca 11580

gttcgcacgg cggcgttcga attcctcgtc gctgaccagc agctcgattt tacggttaac 11640

gagatcgagc tcgatgatat cgccgtcctc gacgaatgcg atcggaccgc cttccgccgc 11700

ttccggcgag atgtggccga tgctgatacc gcgtgatgcg ccggagaaac ggccgtccgt 11760

aatgagaccg actttcgcgc cgaggcccat tccgacgatc tgcgaggttg gggcgagcat 11820

ttccggcatg ccgggaccgc ctttcggacc ttcgtaacgg ataacgacga catggccttc 11880

ttttactttg ccgttggcga tgccttccag cgccgcttcc tgcgaatcga agcagatggc 11940

cggccctttg tgatagccgc ccacggactt gtccaccgcg ccgaccttga tgatcgagcc 12000

gttcggtgcc aggttgccga acagcaccgc caagccgcct tgctccgaat gcgggttatc 12060

cagcgtacgg atgacgtccg tgttcaaaat ctcgcagccg gcgacgtttt cgcgcagcgt 12120

tttaccggtc acggtgatgc ggtcgccgta cagcgcgccc ggctttttga acagttcgtt 12180

caggacggcg ctcacgcctc cggcgttgtg aacgtcctcg atatgataat cggaggccgg 12240

agcgattttg gccaagtgcg ggatgcgctt cgccacttca ttgatccgct cgatcgggta 12300

ttcgaagccc gcttcgtgcg ccagagcgag tgtgtgcagc acagtattgg tcgagccgcc 12360

catcgccata tccagcgcga acgcattgtc gatcgcttcc atcgtcacga tatcgcgcgg 12420

cttgatatcc ttttgaatca actccatgag ctgcttcgcg gaacgcttca cgaattcctt 12480

acggtcatcg gaaatcgcca aaatggtgcc gttgcccggg agcgccagac cgagagcttc 12540

cgccagacag ttcatcgagt tggccgtgaa catgccggag caggagccgc aggtcggaca 12600

gccgtattgc tcaagctcaa gcagaccttt atcgtcgatt ttgccggctt ggtaagcgcc 12660

cacgccttcg aatacggaag acagtgaaat cgaacgtccg tcgctcgttt ttccggcttt 12720

catcggaccg ccgctgacga ataccgtcgg aatgttgacg cgcagcgcgc ccatcatcat 12780

gcccggcgta attttgtcgc agttcgggat gcagaccatg ccgtcgaacc agtgcgcgga 12840

cacaaccgtt tcgagagaat ccgcaataat ctcgcggctc ggcaaggaat agcgcatgcc 12900

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gcccgcttcg cgaatcgctt ctttcacgag cttgccgaat tcctgcaggt gaacgtgacc 13020

cggaacgatg tcgatatacg agttgcaaac cgcgataaac ggcttgtcga agtcctcctc 13080

tttgacgccg gcggcgcgca gcaagctgcg gtgcggagcg cggtcaaagc cctttttgat 13140

catgtcgctt ctcatttttc ccttggacat agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt 13200

cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag 13260

tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg 13320

cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg 13380

gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc 13440

tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc 13500

acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg 13560

aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat 13620

cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag 13680

gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga 13740

tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg 13800

tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt 13860

cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac 13920

gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc 13980

ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt 14040

ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc 14100

ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc 14160

agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg 14220

aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag 14280

atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg 14340

tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt 14400

tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca 14460

tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca 14520

gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc 14580

tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt 14640

ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg 14700

gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc 14760

aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg 14820

ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga 14880

tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga 14940

ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta 15000

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ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact 15120

ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata 15180

agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt 15240

tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa 15300

ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt 15360

atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtc 15409

Claims (10)

1.一种哌尼生素前体，包括核心肽penA1、penB蛋白、penT 蛋白、penC 蛋白和 penD蛋白。

2.如权利要求1所述的哌尼生素前体，penA1氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

3.一种哌尼生素表达盒，用于编码上述哌尼生素前体，从5’端到3’端核心肽编码基因penA1、penB蛋白编码基因penB、penT蛋白编码基因penT、penC蛋白编码基因penC、penD蛋白编码基因penD依次串联排列。

4.如权利要求3所述的哌尼生素表达盒，采用三段克隆片段，片段1为penA1编码基因，片段2为penB蛋白编码基因和penT蛋白编码基因，片段3为penC蛋白编码基因和penD蛋白编码基因。

5.如权利要求4所述的哌尼生素表达盒，采用in-fusion克隆扩增技术，采用引物P1和P2克隆片段1，P3和P4克隆片段2，P5和P6克隆片段3；还包括启动子，启动子的3’端连接核心肽编码基因penA1，所述启动子为P43启动子。

6.如权利要求4所述的哌尼生素表达盒，序列为SEQ ID NO.1。

7.一种表达载体或基因工程菌，包括上述表达盒，所述表达载体为pP43NMK表达载体；所述基因工程菌为枯草芽孢杆菌SCK168。

8.一种哌尼生素的制备方法，包括以下步骤：

（1）用引物将基因penA1、penBT、penCD克隆形成三个片段；

（2）通过 In-fusion 克隆技术将 penA1、penBT、penCD基因片段连接于表达载体，与载体上的启动子和信号肽基因连接后形成penA1BTCD表达盒；

（3）将带有penA1BTCD表达盒的pP43NMK重组载体转化入基因工程菌SCK168中筛选阳性重组子，在培养基中发酵培养，提取发酵液中分泌蛋白。

9.如权利要求8所述哌尼生素的制备方法，哌尼生素表达量为0.5～1 g/L。

10.如权利要求8所述哌尼生素的制备方法，所述基因工程菌的培养基为：豆粕粉1%，酵母粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖1%，氯化钠0.5%。

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