CN110079530A

CN110079530A - 一种源自布氏乳杆菌的基因编辑工具及其制备方法和应用

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Publication number: CN110079530A
Application number: CN201910440489.7A
Authority: CN
Inventors: 李和刚; 张宁; 赵金山; 辛京京; 秦怀远; 郝小静
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2019-05-24
Filing date: 2019-05-24
Publication date: 2019-08-02

Abstract

本发明提供了一种源自布氏乳杆菌的基因编辑工具及其制备方法和应用，属于基因编辑技术领域，所述源自布氏乳杆菌的基因编辑工具包括pcDNA3.1‑LbCas9质粒和pLbCas9‑sgRNA质粒。所述应用包括以下步骤：确定靶标序列，设计单链寡核苷酸对；退火获得双链DNA片段；连接到pLbCas9‑sgRNA质粒中获得靶标序列sgRNA表达载体；靶标序列sgRNA表达载体与pcDNA3.1‑LbCas9质粒共转染细胞后培养。所述基因编辑工具所识别的3’‑端PAM序列是5’‑NNAAAA‑3’(不同于传统的5’‑NGG‑3’)，扩展了可以编辑的基因位点的范围。

Description

一种源自布氏乳杆菌的基因编辑工具及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，尤其涉及一种源自布氏乳杆菌的基因编辑工具及其应用及其制备方法和应用。

背景技术

(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)系统广泛存在于原核生物基因中，是细菌和古细菌为应对质粒和病毒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。CRISPR/Cas9利用一段小RNA来识别并剪切DNA以降解外来核酸分子。Cong等(Multiplex Genome EngineeringUsing CRISPR/Cas Systems.Science.2013)及Mali等(RNA-guided human genomeengineering viaCas9.Science.2013)证明Cas9系统能在293T、K562、iPS等多种细胞中，进行有效的靶向酶切，非同源重组(NHEJ)、同源重组(HR)效率在3-25％之间，与TALEN酶切效果相当。他们还证明，多个靶点可以同时进行靶向酶切。但是，随后的研究表明，spCas9存在较为明显的脱靶效应(High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells.Nature Biotechnology.Fu et al,2013；High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9nuclease specificity.Nature Biotechnology.Pattanayak etal,2013)。传统的CRISPR/Cas9系统识别的PAM序列是3’-NGG，这限制了它的应用范围。因此，有必要开发出识别新的PAM序列的CRISPR/Cas9系统。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种识别PAM序列为5’-NNAAAA-3’的源自布氏乳杆菌的基因编辑工具及其制备方法和应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种源自布氏乳杆菌的基因编辑工具，包括pcDNA3.1-LbCas9质粒和pLbCas9-sgRNA质粒；

所述pcDNA3.1-LbCas9质粒包括初始质粒pcDNA3.1(+)和编码LbCas9的DNA片段；

所述pLbCas9-sgRNA质粒包括初始质粒pUC57和sgRNA通用表达框DNA片段。

优选的，所述编码LbCas9的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选的，sgRNA通用表达框DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选的，所述pLbCas9-sgRNA质粒的核苷酸序列如SEQ ED NO：3所示。

本发明提供了所述的基因编辑工具的制备方法，包括以下步骤：

将编码LbCas9的DNA片段插入到初始质粒pcDNA3.1(+)中构建获得pcDNA3.1-LbCas9质粒；

将sgRNA通用表达框DNA片段插入到初始质粒pUC57中获得pLbCas9-sgRNA质粒。

优选的，步骤1)中所述编码LbCas9的DNA片段的插入位点为初始质粒pcDNA3.1(+)的BamHI酶切位点和EcoR酶切位点之间；步骤2)中所述sgRNA通用表达框DNA片段的插入位点为初始质粒pUC57的EcoRV酶切位点。

本发明提供了所述的基因编辑工具在基因编辑中的应用，包括以下步骤：

1)确定待编辑基因的靶标序列，并根据所述靶标序列设计所述靶标序列的单链寡核苷酸对；

2)将所述单链寡核苷酸对退火获得双链DNA片段；

3)将所述双链DNA片段连接到pLbCas9-sgRNA质粒中获得靶标序列sgRNA表达载体；

4)将所述靶标序列sgRNA表达载体与所述pcDNA3.1-LbCas9质粒共转染细胞后培养36～60h。

优选的，步骤1)中所述靶标序列的长度为15～25bp。

优选的，所述靶标序列sgRNA表达载体与所述pcDNA3.1-LbCas9质粒的质量比例为(1～5)：(1～5)。

优选的，步骤3)中所述双链DNA片段与pLbCas9-sgRNA质粒通过酶切后连接；所述酶切用酶为BbsⅠ酶。

本发明的有益效果：本发明提供的源自布氏乳杆菌的基因编辑工具，包括pcDNA3.1-LbCas9质粒和pLbCas9-sgRNA质粒；所述pcDNA3.1-LbCas9质粒包括初始质粒pcDNA3.1(+)和编码LbCas9的DNA片段；所述pLbCas9-sgRNA质粒包括初始质粒pUC57和sgRNA通用表达框DNA片段。所述基因编辑工具可以识别20bp左右的靶标DNA序列并开展特异性切割，产生特定基因的序列突变；所识别的3’-端PAM序列是5’-NNAAAA-3’，而传统CRISPR/Cas9系统所识别的3’-端PAM序列是5’-NGG-3’，因此所述基因编辑工具CRISPR/LbCas9基因编辑工具扩展了可以编辑的基因位点的范围，尤其适用于在PolyT序列比较多的染色体区域开展基因编辑。

附图说明

图1为实施例2中pLbCas9-T1质粒与pcDNA3.1-LbCas9载体共转染细胞产生的序列突变；

图2为实施例3中pLbCas9-T2质粒与pcDNA3.1-LbCas9载体共转染细胞产生的序列突变；

图3为实施例4中pLbCas9-T3质粒与pcDNA3.1-LbCas9载体共转染细胞产生的序列突变。

具体实施方式

本发明提供了一种源自布氏乳杆菌的基因编辑工具，包括pcDNA3.1-LbCas9质粒和pLbCas9-sgRNA质粒；所述pcDNA3.1-LbCas9质粒包括初始质粒pcDNA3.1(+)和编码LbCas9的DNA片段；所述pLbCas9-sgRNA质粒包括初始质粒pUC57和sgRNA通用表达框DNA片段；所述源自布氏乳杆菌的基因编辑工具识别的3’-端PAM序列为5’-NNAAAA-3’。

在本发明中，所述pcDNA3.1-LbCas9质粒包括初始质粒pcDNA3.1(+)和编码LbCas9的DNA片段；本发明对所述初始质粒pcDNA3.1(+)的来源没有特殊限定，优选的采用市售产品。本发明中，所述编码LbCas9的DNA片段的核苷酸序列优选的如SEQ ID NO：1所示。本发明中，所述编码LbCas9的DNA片段的插入位点优选为初始质粒pcDNA3.1(+)的BamHI酶切位点和EcoR酶切位点之间。在本发明中，所述LbCas9(WP_014940461.1,1373AA)的氨基酸序列如SEQ ED NO：4所示。

在本发明中，所述pLbCas9-sgRNA质粒包括初始质粒pUC57和sgRNA通用表达框DNA片段。在本发明中，所述初始质粒pUC57优选的来源是市售商品；所述sgRNA通用表达框DNA片段包括顺次连接的U6启动子序列、转录起始信号、spacer克隆位点、sgRNA下游序列、U6终止子编码序列和bGHpolyA序列；所述sgRNA通用表达框DNA片段优选的将上述序列整合后进行调整，所述sgRNA通用表达框DNA片段的核苷酸序列优选的如SEQ ID NO：2所示。在本发明中，所述sgRNA通用表达框DNA片段优选的插入初始质粒pUC57的EcoRV酶切位点。本发明中，所述pLbCas9-sgRNA质粒的核苷酸序列最优选的如SEQ ED NO：3所示。

在本发明中，所述编码LbCas9的DNA片段的插入位点为初始质粒pcDNA3.1(+)的BamH I酶切位点和EcoRI酶切位点之间；在本发明中，所述插入优选的通过将所述编码LbCas9的DNA片段和初始质粒pcDNA3.1(+)分别进行双酶切后进行连接；所述双酶切用酶为BamH I酶和EcoR I酶。本发明中，所述酶切的体系以50μL计，优选的包括BamH I酶1μL；EcoR酶1μL，编码LbCas9的DNA片段1μg，Buffer H 5μL和余量的双蒸水。在本发明中，所述酶切体系中的试剂优选的购自宝生物工程(大连)有限公司。本发明在所述酶切后将酶切产物进行连接。在本发明中，所述连接的体系以10μL计，优选的包括T4 DNA连接酶1μL，T4 DNA连接Buffer1μL，编码LbCas9的DNA片段的酶切产物4μL，初始质粒pcDNA3.1(+)酶切产物4μL；所述连接过程中所用试剂优选的购自NEB公司，货号M0202S；所述连接的温度优选为4℃，所述连接的时间优选为10～14h。本发明在获得所述pcDNA3.1-LbCas9质粒后优选的将所述质粒导入大肠杆菌感受态细胞中进行克隆，本发明对所述克隆的具体操作没有特殊限定，采用本领域常规的操作即可。

本发明将sgRNA通用表达框DNA片段插入到初始质粒pUC57中获得pLbCas9-sgRNA质粒。在本发明中，所述sgRNA通用表达框DNA片段的插入位点优选为初始质粒pUC57的EcoRV酶切位点；本发明对所述sgRNA通用表达框DNA片段插入到初始质粒pUC57中的方法没有特殊限定，按照本领域常规的酶切连接法插入自行制备或委托生物公司进行合成。在本发明的一个具体实施过程中，委托生工生物工程(上海)股份有限公司制备pLbCas9-sgRNA质粒。

本发明还提供了所述的基因编辑工具在基因编辑中的应用，包括以下步骤：1)确定待编辑基因的靶标序列，并根据所述靶标序列设计所述靶标序列的单链寡核苷酸对；2)将所述单链寡核苷酸对退火获得双链DNA片段；3)将所述双链DNA片段连接到pLbCas9-sgRNA质粒中获得靶标序列sgRNA表达载体；4)将所述靶标序列sgRNA表达载体与所述pcDNA3.1-LbCas9质粒共转染细胞后培养36～60h。

在本发明中，首先确定待编辑基因的靶标序列；本发明对所述待编辑基因没有特殊限定，任何哺乳动物细胞中的基因均可作为待编辑的基因；在本发明中，所述靶标序列的长度优选为15～25bp，更优选为18～22bp。本发明在确定靶标序列后，根据所述靶标序列设计所述靶标序列的单链寡核苷酸对；在本发明中，所述单链寡核苷酸对通过如下规则设计：正向寡核苷酸序列为在靶标序列5’端加上CACCG(若靶标序列5’端末端为G，则省去最后一个G，即仅加上CACC)，反向寡核苷酸为在靶标序列的反向互补序列5’端加上AAAC、3’端加上C(若靶标序列5’端末端为G，则3’端不加C)。

本发明在获得所述单链寡核苷酸对后，将所述单链寡核苷酸对退火获得双链DNA片段。在本发明中，所述单链寡核苷酸对优选的委托生物科技公司进行合成。在本发明中，所述退火的具体步骤和条件为：95℃5min，72℃10min，置冰上。

本发明将所述双链DNA片段连接到pLbCas9-sgRNA质粒中获得靶标序列sgRNA表达载体；在本发明中，所述双链DNA片段与pLbCas9-sgRNA质粒通过酶切后连接；所述酶切用酶为BbsⅠ酶。本发明对所述酶切和连接的具体方法和参数没有特殊限定，采用本领域常规的酶切和连接的方法和参数即可。

本发明在获得靶标序列sgRNA表达载体后，将所述靶标序列sgRNA表达载体与所述pcDNA3.1-LbCas9质粒共转染细胞后培养36～60h。在本发明中，所述靶标序列sgRNA表达载体与所述pcDNA3.1-LbCas9质粒的质量比例优选为(1～5)：(1～5)；在本发明中，靶标序列sgRNA表达载体与所述pcDNA3.1-LbCas9质粒的总质量与转染细胞的个数的比例优选为0.5μg:(0.5～5)×10⁶个，更优选为0.5μg:1×10⁶个。在本发明中，所述转染试剂优选为DNAFect Transfection ReagentDNA转染试剂盒(CWBIO，Cat No.CW0860)，本发明对所述转染的操作没有特殊限定，按照转染试剂盒的操作说明书进行即可。本发明中，所述培养的时间优选为40～56h，更优选为48h。在本发明中，所述细胞优选为哺乳动物细胞，在本发明的一个优选的具体实施例中，所述细胞为迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1，购自中国科学院昆明细胞库，编号：KCB 94026。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

源自布氏乳杆菌的基因编辑工具的构建

1.质粒载体pcDNA3.1-LbCas9的构建

合成4128bp的编码LbCas9的DNA片段(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)，通过BamHI、EcoRI双酶切插入到pcDNA3.1(+)中，获得pcDNA3.1-LbCas9载体。

BamH I酶购自宝生物工程(大连)有限公司，货号1010S、EcoR I酶购自宝生物工程(大连)有限公司，货号1040S

酶切体系：50μL，试剂购自宝生物工程(大连)有限公司)：BamH I酶1μL，EcoR I酶1μL，编码LbCas9的DNA片段或cDNA3.1(+)质粒1μg，Buffer H 5μL，补加双蒸水至50μL。酶切温度为37℃，酶切时间为3h。

连接的步骤和参数：

连接体系(10μL，连接试剂购自NEB公司，货号M0202S)：1μL T4 DNA连接酶，1μL T4DNA连接Buffer，4μL编码LbCas9的DNA片段(4.2kb)，4μL pcDNA3.1(+)载体(5.4kb)。

连接条件：4℃过夜。

转化的步骤和参数：

将5μL连接产物加入50μL感受态细胞(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号9057)中，轻弹混匀，于冰上静置30min，42℃热激90S，于冰上静置2min，添加500μL的LB培养基，置于37℃摇床中以200转/min的转速复苏1h，取100μL复苏菌液均匀涂抹于含有60mg/ml氨苄青霉素的固体LB培养基上，37℃静置培养14h。

挑菌：在上一步的固体LB培养板中挑取单菌落5～10个，置于1mL含60mg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，在37℃摇床中以200转/min的转速培养2～3h，用于测序。测序验证正确的进行后续实验。

2.质粒载体pLbCas9-sgRNA的构建

向导RNA通用表达载体pLbCas9-sgRNA序列构成：

sgRNA表达载体(U6启动子):合成序列，见pX335序列中中1-249(U6启动子)+G(转录起始信号)+spacer克隆位点(两个反向的Bbs1位点，两个Bbs1位点之间插入随机序列)+sgRNA下游序列+U6终止子+bGH polyA

U6启动子序列：

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga

cgaaacacc(SEQ ID NO：5)

转录起始信号：G

spacer克隆位点：gggtcttcg(SEQ ID NO：6)

随机序列：

ggcgagctgcacgctgccgtcctcgatgttgtggcggatcttgaagttcaccttgatgccgttcttctgcttgtcggccatgatatagacgttgtggctgttgtagttgtactccagcttgtgccccaggatgttgccgtcctccttgaagtcgatgcccttcagctcgatgcggttcaccagggtgtcgccctcgaacttcacctcggcgcgggtcttgtagttgccgtcgtccttgaagaagatggtgcgctcctggacgtagccttcgggcatggcggacttgaagaagtcgtgctgcttcatgtggtcggggtagcggctgaagca(SEQ ID NO：7)

spacer克隆位点：agaagacctgc(SEQ ID NO：8)

sgRNA下游序列：

gttttagaaggatgttaaatcaataaggttaaacgtttgaccttattgatttaacatcatgtgttgaaatcaagcaagcgctttgcgcggagtttaaacttttgacccattatatgggcattac(SEQ ID NO：9)

U6终止子：tttttt(SEQ ID NO：10)

bGH polyA：

ctagagctcgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttgtttgcccctcccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcctaataaaatgaggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtggggtggggcaggacagcaag ggggaggatt gggaagagaa tagcaggcat gctgggga(SEQ ID NO：11)

sgRNA通用表达框整理后序列如SEQ ID NO：2所示。

gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgggtcttcgggcgagctgcacgctgccgtcctcgatgttgtggcggatcttgaagttcaccttgatgccgttcttctgcttgtcggccatgatatagacgttgtggctgttgtagttgtactccagcttgtgccccaggatgttgccgtcctccttgaagtcgatgcccttcagctcgatgcggttcaccagggtgtcgccctcgaacttcacctcggcgcgggtcttgtagttgccgtcgtccttgaagaagatggtgcgctcctggacgtagccttcgggcatggcggacttgaagaagtcgtgctgcttcatgtggtcggggtagcggctgaagcaagaagacctgttttagaaggatgttaaatcaataaggttaaacgtttgaccttattgatttaacatcatgtgttgaaatcaagcaagcgctttgcgcggagtttaaacttttgacccattatatgggcattacttttttctagagctcgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagagaatagcaggcatgctgggga

将上述959bp序列交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并克隆到pUC57载体上(克隆位置为EcoRV酶切位点，432-433bp之间)，获得pLbCas9-sgRNA质粒。

pLbCas9-sgRNA载体全序列长3669bp，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

实施例2

源自布氏乳杆菌的基因编辑工具在在哺乳动物细胞系基因编辑中的应用

迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1，购自中国科学院昆明细胞库，编号：KCB 94026。

1、sgRNA靶点设计

在绵羊6号染色体(NCBI GI:417531944)的序列中提取绵羊DKK2基因包含第一外显子的序列(DKK2-440，如下所示)，设计靶标位点。

agactgagttcacacggtgctgggcccccaaagccaagtggggttgggggaacagagtctgcgagtcccggcgccccgagtgcagggccccgtgttggggtcctccttcccatttgtatccgtatccttgcgggctttgcgcctccccgggggacccctcgccgggagatggccgcactgatgcggggcaaggactcctcccgctgcctgctcctactggccgcggtgctgatggtggagagctcacagttcggcagctcgcgggccaaactcaactccatcaagtcctctctgggcggggagacgcctgcccaggccgccaatcgatctgcgggcacttaccaaggactggctttcggcggcagtaagaagggcaaaaacctggggcaggtaggaaaatacccccaatacactcttcaaccagaagaggtagggacccg(SEQ IDNO：12)

靶标序列T1：tcggcggcagtaagaagggc(SEQ ID NO：13)

2、sgRNA表达质粒对的构建

首先根据设计的靶标序列送公司合成单链寡核苷酸，具体序列如下：

Tb1-F：caccg tcggcggcagtaagaagggc(SEQ ID NO：14)

Tb1-R：aaac gcccttcttactgccgccgac(SEQ ID NO：15)

Tb1-F与Tb1-R退火(具体步骤和条件为：95℃5min，72℃10min，置冰上)获得带粘性末端的双链DNA短片段，经BbsⅠ酶切，连入pLbCas9-sgRNA载体中(pLbCas9-sgRNA同时使用BbsⅠ酶切，产生3.3kb和0.3kb片段，回收3.3kb片段与双链DNA短片段连接)，获得T1靶标序列sgRNA的表达载体pLbCas9-T1。

菌落PCR通用引物对(获得370bp片段者为阳性，获得700bp片段者为阴性，PA-R为测序引物)：

U6-F:5'cttgggtagtttgcagtt3'(SEQ ID NO：16)

PA-R:5'cagtgggagtggcacctt3'(SEQ ID NO：17)

测序验证方法：使用测序引物PA-R进行常规测序，测序结果与相应靶标的正向寡核苷酸Tb1-F进行比对，同源性为100％者判定为正确的质粒。

将pLbCas9-T1与pcDNA3.1-LbCas9载体按照1:1的质量比例转染迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1作为实验组，每组三个处理，每个处理的转染质粒总量为0.5μg，转细胞数为1×10⁶个，转染试剂均为DNA Fect Transfection ReagentDNA转染试剂(CWBIO，CatNo.CW0860)，每个处理中转染试剂的加入量为6μL，并按照说明书进行操作。对照组使用pLbCas9-sgRNA空质粒与pcDNA3.1-LbCas9质粒进行共转染(转染比例和总量同实验组)。

培养48h后，提取细胞基因组DNA，使用引物对DKK2-F、DKK2-R进行PCR扩增，对获得的440bp的PCR产物进行克隆测序。共挑取20个单克隆菌落测序，原始序列测序结果如下：cacttaccaaggactggctttcggcggcagtaagaagggcaaaaacctggggcaggtagg(SEQ ID NO：18)，其中分别有5个单克隆的序列发生改变，序列有不同程度的敲除(如附图1所示)。该结果表明，pLbCas9-T1与pcDNA3.1-LbCas9载体混合转染对迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1的敲除效率达到25％，这一结果说明，所述基因编辑工具，可以识别20bp左右的靶标DNA序列并开展特异性切割，产生特定基因的序列突变。

实施例3

1、sgRNA靶点设计

在绵羊6号染色体(NCBI GI:417531944)的序列中提取绵羊DKK2基因第一外显子的编码区(18259978-18260199，如下所示)，设计靶标位点。

atggccgcac tgatgcgggg caaggactcc tcccgctgcc tgctcctact ggccgcggtg

ctgatggtgg agagctcaca gttcggcagc tcgcgggcca aactcaactc catcaagtcc

tctctgggcg gggagaggcc tgcccagggc gccaatcgat ctgcgggcac ttaccaagga

ctggctttcg gcggcagtaa gaagggcaaa aacctggggc ag(SEQ ID NO：12)

靶标序列T2：

cggcggcagtaagaagggca(SEQ ID NO：19)

2、sgRNA表达质粒对的构建

Tb2-F：caccg cggcggcagtaagaagggca(SEQ ID NO：20)

Tb2-R：aaac tgcccttcttactgccgccgc(SEQ ID NO：21)

Tb2-F与Tb2-R退火获得带粘性末端的双链DNA短片段，经BbsⅠ酶切，连入pLbCas9-sgRNA载体中(pLbCas9-sgRNA同时使用BbsⅠ酶切，产生3.3kb和0.3kb片段，回收3.3kb片段与双链DNA短片段连接)，获得T2靶标序列sgRNA的表达载体pLbCas9-T2。

U6-F:5'CTTGGGTAGTTTGCAGTT3'(SEQ ID NO：16)

PA-R:5'CAGTGGGAGTGGCACCTT3'(SEQ ID NO：17)

测序验证方法：使用测序引物PA-R进行常规测序，测序结果与相应靶标的正向寡核苷酸Tb2-F进行比对，同源性为100％者判定为正确的质粒。

将pLbCas9-T2与pcDNA3.1-LbCas9载体按照1:1的质量比例转染迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1作为实验组，每组三个处理，每个处理的转染质粒总量为0.5μg，转细胞数为1×10⁶个，转染试剂均为DNA Fect Transfection ReagentDNA转染试剂(CWBIO，CatNo.CW0860)，每个处理中转染试剂的加入量为6μL，并按照说明书进行操作。对照组使用pLbCas9-sgRNA空质粒与pcDNA3.1-LbCas9质粒进行共转染(转染比例和总量同实验组)。

培养48h后，提取细胞基因组DNA，使用引物对DKK2-F、DKK2-R进行PCR扩增，对获得的440bp的PCR产物进行克隆测序。共挑取20个单克隆菌落测序，原始序列测序结果如下：acttaccaaggactggctttcggcggcagtaagaagggcaaaaacctggggcaggtagga(SEQ ID NO：22)，其中分别有5个单克隆的序列发生改变，序列有不同程度的敲除(如附图2所示)。该结果表明，pLbCas9-T2与pcDNA3.1-LbCas9载体混合转染对迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1的敲除效率达到25％，这一结果说明，所述基因编辑工具，可以识别20bp左右的靶标DNA序列并开展特异性切割，产生特定基因的序列突变。

实施例4

1、sgRNA靶点设计

atggccgcac tgatgcgggg caaggactcc tcccgctgcc tgctcctact ggccgcggtg

ctgatggtgg agagctcaca gttcggcagc tcgcgggcca aactcaactc catcaagtcc

tctctgggcg gggagaggcc tgcccagggc gccaatcgat ctgcgggcac ttaccaagga

ctggctttcg gcggcagtaa gaagggcaaa aacctggggc ag(SEQ ID NO：12)

靶标序列T3：

aaaaacctggggcaggtagg(SEQ ID NO：23)

2、sgRNA表达质粒对的构建

Tb3-F：caccg aaaaacctggggcaggtagg(SEQ ID NO：24)

Tb3-R：aaac cctacctgccccaggtttttc(SEQ ID NO：25)

Tb3-F与Tb3-R退火获得带粘性末端的双链DNA短片段，经BbsⅠ酶切，连入pLbCas9-sgRNA载体中(pLbCas9-sgRNA同时使用BbsⅠ酶切，产生3.3kb和0.3kb片段，回收3.3kb片段与双链DNA短片段连接)，获得T1靶标序列sgRNA的表达载体pLbCas9-T1。

U6-F:5'CTTGGGTAGTTTGCAGTT3'(SEQ ID NO：16)

PA-R:5'CAGTGGGAGTGGCACCTT3'(SEQ ID NO：17)

测序验证方法：使用测序引物PA-R进行常规测序，测序结果与相应靶标的正向寡核苷酸Tb3-F进行比对，同源性为100％者判定为正确的质粒。

将pLbCas9-T3与pcDNA3.1-LbCas9载体按照1:1的质量比例转染迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1作为实验组，每组三个处理，每个处理的转染质粒总量为0.5μg，转细胞数为1×10⁶个，转染试剂均为DNA Fect Transfection ReagentDNA转染试剂(CWBIO，CatNo.CW0860)，每个处理中转染试剂的加入量为6μL，并按照说明书进行操作。对照组使用pLbCas9-sgRNA空质粒与pcDNA3.1-LbCas9质粒进行共转染(转染比例和总量同实验组)。

培养48h后，提取细胞基因组DNA，使用引物对DKK2-F、DKK2-R进行PCR扩增，对获得的440bp的PCR产物进行克隆测序。共挑取20个单克隆菌落测序，原始序列测序结果如下：tcggcggcagtaagaagggcaaaaacctggggcaggtaggaaaatacccccaatacactc(SEQ ID NO：26)，其中分别有6个单克隆的序列发生改变，序列有不同程度的敲除(如附图3所示)。该结果表明，pLbCas9-T3与pcDNA3.1-LbCas9载体混合转染对迪庆绵羊皮肤上皮细胞系DQSHS1的敲除效率达到30％，这一结果说明，所述基因编辑工具可以识别20bp左右的靶标DNA序列并开展特异性切割，产生特定基因的序列突变。

由上述实施例可知，本发明提供的所述基因编辑工具可以识别20bp左右的靶标DNA序列并开展特异性切割，产生特定基因的序列突变；敲除效率在25％～30％之间；所述基因编辑工具所识别的3’-端PAM序列是5’-NNAAAA-3’(不同于传统的5’-NGG-3’)，扩展了可以编辑的基因位点的范围，尤其适用于在PolyT序列比较多的染色体区域开展基因编辑。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种源自布氏乳杆菌的基因编辑工具及其制备方法和应用

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4128

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggatccatga aagttaataa ttatcatata ggtctcgata ttgggacctc atcaattggt 60

tgggtcgcaa ttggcaaaga cggaaaaccg ctgcgtgtta aagggaagac agcgattggc 120

gcccggttgt ttcaggaagg caaccccgct gccgaccgca ggatgtttcg aaccactcga 180

cggcgtctga gtcgacggaa gtggcgattg aagttattgg aggaaatatt tgacccatat 240

attacacctg tcgattccac gtttttcgcc aggttgaaac aatccaattt gtcaccaaaa 300

gattcacgca aagaattcaa gggttccatg cttttcccgg atttgaccga catgcagtac 360

cacaaaaatt atccaaccat ttatcattta cgtcatgcat taatgacgca agataaaaaa 420

tttgatattc ggatggttta cttggccatt caccacattg tgaaatatcg cggcaatttc 480

ttaaactcta caccagtaga ttcctttaag gcatcgaagg ttgattttgt tgaccaattt 540

aaaaagttaa acgagttata tgccgcaatt aatcctgaag agtcatttaa aattaatctt 600

gcaaatagcg aagatattgg ccaccagttc ctcgatccat caattcgtaa atttgacaag 660

aaaaagcaaa ttccaaagat tgttcctgtc atgatgaatg ataaagtaac ggacagactt 720

aatggtaaaa tcgcgtcaga aattattcat gctattttag gctataaagc aaaacttgat 780

gttgtcctac agtgcacccc agttgattcc aaaccatggg cacttaaatt cgatgatgag 840

gacattgatg ccaaacttga aaagatttta cctgaaatgg acgaaaatca acaatcaatt 900

gttgctatcc tacagaactt atattctcaa gtaactttga atcaaattgt tcctaatggc 960

atgtcattat cagaatcaat gatcgaaaag tacaatgatc atcatgacca cttgaagttg 1020

tataaaaagc taattgatca actcgctgat ccgaagaaga aagccgtctt aaagaaggca 1080

tatagtcaat acgtgggtga cgatggtaaa gtcatcgaac aagccgagtt ctggtcaagc 1140

gtgaagaaaa atttggatga ttccgagctc tcaaagcaaa ttatggatct gatcgatgca 1200

gaaaaattta tgccaaagca acgaacatcg caaaatgggg tgattcctca tcaactgcac 1260

caaagagaac ttgatgaaat cattgaacat caaagcaaat attacccatg gcttgtcgag 1320

atcaatccca ataagcacga tctccacctt gcaaaataca agattgaaca attggttgct 1380

tttagggttc catattatgt tgggccaatg ataacgccaa aagaccaggc tgaatcagca 1440

gagactgttt tttcttggat ggagcgtaag ggtacagaaa ctgggcagat taccccttgg 1500

aattttgatg aaaaggttga ccggaaggca tccgcaaaca gattcatcaa gcgaatgacc 1560

accaaagata cttatttaat tggtgaggat gttcttccag atgaaagctt attatatgag 1620

aagtttaaag tcctcaatga gttgaacatg gtccgggtta acggcaaatt attgaaggtt 1680

gctgataaac aagcgatatt ccaagatctt ttcgaaaact acaagcatgt ctcggtcaag 1740

aagctgcaaa attacattaa agccaaaaca ggattaccca gtgatccgga gatttcaggt 1800

ttatcagacc ctgagcattt caacaattct ttgggaacat acaatgattt caagaaatta 1860

tttggtagta aggttgacga accagatctt caagatgatt ttgagaagat tgttgaatgg 1920

tcaactgtat ttgaggacaa aaaaatcctg cgggaaaagc ttaacgaaat tacctggtta 1980

tctgatcagc aaaaagatgt tttagaatcc agtcgttacc aaggttgggg ccggctttcc 2040

aagaaactgt taactggaat tgtcaatgac caaggcgaac gaatcattga caaactttgg 2100

aataccaata aaaatttcat gcaaattcag tctgatgatg attttgccaa acggattcac 2160

gaagcgaatg ctgaccaaat gcaggcagtc gacgtggaag atgtgttggc agatgcgtac 2220

acttctccac aaaataagaa ggccatccgc caagtggtta aagtcgttga tgatatccaa 2280

aaggccatgg gcggagttgc gcctaagtat atttctattg agtttacccg ttcagaggac 2340

cgtaatccac gtcggacaat ttcacgacaa cggcaacttg aaaatacctt aaaagatact 2400

gctaaatctt tggctaaatc aatcaatccc gagttacttt ctgaactgga caatgcagca 2460

aagtctaaga agggcctgac tgatcggttg tacttgtact tcacgcaact tgggaaggat 2520

atctacactg gagagccaat caacattgat gaacttaata aatatgacat tgatcatatt 2580

ttgccacagg catttattaa agataattca ctggataacc gtgtactagt tttaacggcg 2640

gttaacaatg gtaaatcgga taacgttcct ctaagaatgt ttggtgccaa gatggggcac 2700

ttctggaaac agcttgctga agcaggcttg attagtaagc gcaaactcaa gaaccttcaa 2760

acagatcccg ataccattag taagtatgcg atgcatggat tcattcgtcg acagttggtt 2820

gaaaccagcc aagttatcaa actggtcgcg aacattttgg gagacaagta tcgcaatgat 2880

gataccaaga ttattgaaat tactgcccgg atgaaccatc agatgagaga tgagtttggg 2940

tttatcaaga atcgtgagat caatgactat catcatgcgt ttgacgccta cttaacagcc 3000

tttttaggta gatatttgta ccatcgatac atcaagcttc gtccatactt cgtctatggt 3060

gatttcaaga agtttagaga agataaagtc actatgcgaa attttaattt tctccatgat 3120

ttaactgatg atactcaaga aaagatcgct gatgctgaga ctggtgaagt aatatgggac 3180

cgcgaaaatt caattcagca gttaaaggat gtttaccatt ataaattcat gctgatttca 3240

cacgaagttt atacgcttcg cggcgcaatg ttcaatcaaa ctgtttatcc tgcatcagat 3300

gccggcaaac gaaaattgat tccggtaaaa gctgatcgac cggtcaatgt ctatggtgga 3360

tatagcggca gtgcggatgc gtatatggca attgtcagaa ttcataataa gaagggcgat 3420

aaatataggg ttgtcggtgt tccaatgcgg gcactggatc gtttagacgc cgcgaaaaac 3480

gtcagtgatg cggactttga ccgggctctc aaagatgtat tggcaccaca gctcacgaag 3540

actaagaaga gtcggaaaac gggagaaatc acccaagtca ttgaagattt tgagattgtt 3600

ttaggaaaag taatgtaccg acaattgatg attgatggtg ataagaagtt catgcttgga 3660

agctcaacct atcaatataa cgccaagcaa ttggtcctct ccgatcaatc tgtcaagaca 3720

cttgcaagca aaggaagatt agatcctctg caagaaagta tggattacaa taacgtctac 3780

actgagattt tagacaaggt taatcagtat ttttctttat atgatatgaa taaatttcgt 3840

cacaagttga atcttggttt cagcaaattt atctcatttc ctaaccataa tgtccttgat 3900

gggaatacta aggtgtcttc tggcaaacgg gagatcttgc aagaaatatt gaatgggcta 3960

catgcaaatc caacattcgg gaatttgaag gatgtcggca tcacaacgcc atttggtcaa 4020

ttacaacagc ctaatggaat tctgctgtca gatgaaacaa agattcgtta tcagtcacca 4080

acaggcttat tcgaaagaac cgtcagtctg aaggacttat aagaattc 4128

<210> 2

<211> 959

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg ggtcttcggg cgagctgcac gctgccgtcc tcgatgttgt ggcggatctt 300

gaagttcacc ttgatgccgt tcttctgctt gtcggccatg atatagacgt tgtggctgtt 360

gtagttgtac tccagcttgt gccccaggat gttgccgtcc tccttgaagt cgatgccctt 420

cagctcgatg cggttcacca gggtgtcgcc ctcgaacttc acctcggcgc gggtcttgta 480

gttgccgtcg tccttgaaga agatggtgcg ctcctggacg tagccttcgg gcatggcgga 540

cttgaagaag tcgtgctgct tcatgtggtc ggggtagcgg ctgaagcaag aagacctgtt 600

ttagaaggat gttaaatcaa taaggttaaa cgtttgacct tattgattta acatcatgtg 660

ttgaaatcaa gcaagcgctt tgcgcggagt ttaaactttt gacccattat atgggcatta 720

cttttttcta gagctcgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt 780

gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc 840

taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt 900

ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaga atagcaggca tgctgggga 959

<210> 3

<211> 3669

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420

tgcatctaga tgagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg 480

ctgttagaga gataattgga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata 540

cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa 600

tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct 660

tgtggaaagg acgaaacacc gggtcttcgg gcgagctgca cgctgccgtc ctcgatgttg 720

tggcggatct tgaagttcac cttgatgccg ttcttctgct tgtcggccat gatatagacg 780

ttgtggctgt tgtagttgta ctccagcttg tgccccagga tgttgccgtc ctccttgaag 840

tcgatgccct tcagctcgat gcggttcacc agggtgtcgc cctcgaactt cacctcggcg 900

cgggtcttgt agttgccgtc gtccttgaag aagatggtgc gctcctggac gtagccttcg 960

ggcatggcgg acttgaagaa gtcgtgctgc ttcatgtggt cggggtagcg gctgaagcaa 1020

gaagacctgt tttagaagga tgttaaatca ataaggttaa acgtttgacc ttattgattt 1080

aacatcatgt gttgaaatca agcaagcgct ttgcgcggag tttaaacttt tgacccatta 1140

tatgggcatt acttttttct agagctcgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc 1200

agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca 1260

ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta 1320

ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagag aatagcaggc 1380

atgctgggga atcggatccc gggcccgtcg actgcagagg cctgcatgca agcttggcgt 1440

aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca 1500

tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat 1560

taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt 1620

aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct 1680

cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 1740

aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 1800

aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 1860

tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 1920

caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 1980

cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 2040

ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 2100

gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 2160

agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 2220

gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 2280

acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 2340

gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 2400

gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 2460

cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 2520

caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 2580

gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 2640

cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 2700

cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 2760

caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 2820

gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 2880

gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 2940

cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 3000

catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 3060

gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 3120

ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 3180

gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 3240

cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 3300

tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 3360

gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 3420

atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 3480

ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 3540

gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 3600

acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc 3660

cctttcgtc 3669

<210> 4

<211> 1371

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Lys Val Asn Asn Tyr His Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Ser Ser

1 5 10 15

Ile Gly Trp Val Ala Ile Gly Lys Asp Gly Lys Pro Leu Arg Val Lys

20 25 30

Gly Lys Thr Ala Ile Gly Ala Arg Leu Phe Gln Glu Gly Asn Pro Ala

35 40 45

Ala Asp Arg Arg Met Phe Arg Thr Thr Arg Arg Arg Leu Ser Arg Arg

50 55 60

Lys Trp Arg Leu Lys Leu Leu Glu Glu Ile Phe Asp Pro Tyr Ile Thr

65 70 75 80

Pro Val Asp Ser Thr Phe Phe Ala Arg Leu Lys Gln Ser Asn Leu Ser

85 90 95

Pro Lys Asp Ser Arg Lys Glu Phe Lys Gly Ser Met Leu Phe Pro Asp

100 105 110

Leu Thr Asp Met Gln Tyr His Lys Asn Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu

115 120 125

Arg His Ala Leu Met Thr Gln Asp Lys Lys Phe Asp Ile Arg Met Val

130 135 140

Tyr Leu Ala Ile His His Ile Val Lys Tyr Arg Gly Asn Phe Leu Asn

145 150 155 160

Ser Thr Pro Val Asp Ser Phe Lys Ala Ser Lys Val Asp Phe Val Asp

165 170 175

Gln Phe Lys Lys Leu Asn Glu Leu Tyr Ala Ala Ile Asn Pro Glu Glu

180 185 190

Ser Phe Lys Ile Asn Leu Ala Asn Ser Glu Asp Ile Gly His Gln Phe

195 200 205

Leu Asp Pro Ser Ile Arg Lys Phe Asp Lys Lys Lys Gln Ile Pro Lys

210 215 220

Ile Val Pro Val Met Met Asn Asp Lys Val Thr Asp Arg Leu Asn Gly

225 230 235 240

Lys Ile Ala Ser Glu Ile Ile His Ala Ile Leu Gly Tyr Lys Ala Lys

245 250 255

Leu Asp Val Val Leu Gln Cys Thr Pro Val Asp Ser Lys Pro Trp Ala

260 265 270

Leu Lys Phe Asp Asp Glu Asp Ile Asp Ala Lys Leu Glu Lys Ile Leu

275 280 285

Pro Glu Met Asp Glu Asn Gln Gln Ser Ile Val Ala Ile Leu Gln Asn

290 295 300

Leu Tyr Ser Gln Val Thr Leu Asn Gln Ile Val Pro Asn Gly Met Ser

305 310 315 320

Leu Ser Glu Ser Met Ile Glu Lys Tyr Asn Asp His His Asp His Leu

325 330 335

Lys Leu Tyr Lys Lys Leu Ile Asp Gln Leu Ala Asp Pro Lys Lys Lys

340 345 350

Ala Val Leu Lys Lys Ala Tyr Ser Gln Tyr Val Gly Asp Asp Gly Lys

355 360 365

Val Ile Glu Gln Ala Glu Phe Trp Ser Ser Val Lys Lys Asn Leu Asp

370 375 380

Asp Ser Glu Leu Ser Lys Gln Ile Met Asp Leu Ile Asp Ala Glu Lys

385 390 395 400

Phe Met Pro Lys Gln Arg Thr Ser Gln Asn Gly Val Ile Pro His Gln

405 410 415

Leu His Gln Arg Glu Leu Asp Glu Ile Ile Glu His Gln Ser Lys Tyr

420 425 430

Tyr Pro Trp Leu Val Glu Ile Asn Pro Asn Lys His Asp Leu His Leu

435 440 445

Ala Lys Tyr Lys Ile Glu Gln Leu Val Ala Phe Arg Val Pro Tyr Tyr

450 455 460

Val Gly Pro Met Ile Thr Pro Lys Asp Gln Ala Glu Ser Ala Glu Thr

465 470 475 480

Val Phe Ser Trp Met Glu Arg Lys Gly Thr Glu Thr Gly Gln Ile Thr

485 490 495

Pro Trp Asn Phe Asp Glu Lys Val Asp Arg Lys Ala Ser Ala Asn Arg

500 505 510

Phe Ile Lys Arg Met Thr Thr Lys Asp Thr Tyr Leu Ile Gly Glu Asp

515 520 525

Val Leu Pro Asp Glu Ser Leu Leu Tyr Glu Lys Phe Lys Val Leu Asn

530 535 540

Glu Leu Asn Met Val Arg Val Asn Gly Lys Leu Leu Lys Val Ala Asp

545 550 555 560

Lys Gln Ala Ile Phe Gln Asp Leu Phe Glu Asn Tyr Lys His Val Ser

565 570 575

Val Lys Lys Leu Gln Asn Tyr Ile Lys Ala Lys Thr Gly Leu Pro Ser

580 585 590

Asp Pro Glu Ile Ser Gly Leu Ser Asp Pro Glu His Phe Asn Asn Ser

595 600 605

Leu Gly Thr Tyr Asn Asp Phe Lys Lys Leu Phe Gly Ser Lys Val Asp

610 615 620

Glu Pro Asp Leu Gln Asp Asp Phe Glu Lys Ile Val Glu Trp Ser Thr

625 630 635 640

Val Phe Glu Asp Lys Lys Ile Leu Arg Glu Lys Leu Asn Glu Ile Thr

645 650 655

Trp Leu Ser Asp Gln Gln Lys Asp Val Leu Glu Ser Ser Arg Tyr Gln

660 665 670

Gly Trp Gly Arg Leu Ser Lys Lys Leu Leu Thr Gly Ile Val Asn Asp

675 680 685

Gln Gly Glu Arg Ile Ile Asp Lys Leu Trp Asn Thr Asn Lys Asn Phe

690 695 700

Met Gln Ile Gln Ser Asp Asp Asp Phe Ala Lys Arg Ile His Glu Ala

705 710 715 720

Asn Ala Asp Gln Met Gln Ala Val Asp Val Glu Asp Val Leu Ala Asp

725 730 735

Ala Tyr Thr Ser Pro Gln Asn Lys Lys Ala Ile Arg Gln Val Val Lys

740 745 750

Val Val Asp Asp Ile Gln Lys Ala Met Gly Gly Val Ala Pro Lys Tyr

755 760 765

Ile Ser Ile Glu Phe Thr Arg Ser Glu Asp Arg Asn Pro Arg Arg Thr

770 775 780

Ile Ser Arg Gln Arg Gln Leu Glu Asn Thr Leu Lys Asp Thr Ala Lys

785 790 795 800

Ser Leu Ala Lys Ser Ile Asn Pro Glu Leu Leu Ser Glu Leu Asp Asn

805 810 815

Ala Ala Lys Ser Lys Lys Gly Leu Thr Asp Arg Leu Tyr Leu Tyr Phe

820 825 830

Thr Gln Leu Gly Lys Asp Ile Tyr Thr Gly Glu Pro Ile Asn Ile Asp

835 840 845

Glu Leu Asn Lys Tyr Asp Ile Asp His Ile Leu Pro Gln Ala Phe Ile

850 855 860

Lys Asp Asn Ser Leu Asp Asn Arg Val Leu Val Leu Thr Ala Val Asn

865 870 875 880

Asn Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Leu Arg Met Phe Gly Ala Lys Met

885 890 895

Gly His Phe Trp Lys Gln Leu Ala Glu Ala Gly Leu Ile Ser Lys Arg

900 905 910

Lys Leu Lys Asn Leu Gln Thr Asp Pro Asp Thr Ile Ser Lys Tyr Ala

915 920 925

Met His Gly Phe Ile Arg Arg Gln Leu Val Glu Thr Ser Gln Val Ile

930 935 940

Lys Leu Val Ala Asn Ile Leu Gly Asp Lys Tyr Arg Asn Asp Asp Thr

945 950 955 960

Lys Ile Ile Glu Ile Thr Ala Arg Met Asn His Gln Met Arg Asp Glu

965 970 975

Phe Gly Phe Ile Lys Asn Arg Glu Ile Asn Asp Tyr His His Ala Phe

980 985 990

Asp Ala Tyr Leu Thr Ala Phe Leu Gly Arg Tyr Leu Tyr His Arg Tyr

995 1000 1005

Ile Lys Leu Arg Pro Tyr Phe Val Tyr Gly Asp Phe Lys Lys Phe Arg

1010 1015 1020

Glu Asp Lys Val Thr Met Arg Asn Phe Asn Phe Leu His Asp Leu Thr

1025 1030 1035 1040

Asp Asp Thr Gln Glu Lys Ile Ala Asp Ala Glu Thr Gly Glu Val Ile

1045 1050 1055

Trp Asp Arg Glu Asn Ser Ile Gln Gln Leu Lys Asp Val Tyr His Tyr

1060 1065 1070

Lys Phe Met Leu Ile Ser His Glu Val Tyr Thr Leu Arg Gly Ala Met

1075 1080 1085

Phe Asn Gln Thr Val Tyr Pro Ala Ser Asp Ala Gly Lys Arg Lys Leu

1090 1095 1100

Ile Pro Val Lys Ala Asp Arg Pro Val Asn Val Tyr Gly Gly Tyr Ser

1105 1110 1115 1120

Gly Ser Ala Asp Ala Tyr Met Ala Ile Val Arg Ile His Asn Lys Lys

1125 1130 1135

Gly Asp Lys Tyr Arg Val Val Gly Val Pro Met Arg Ala Leu Asp Arg

1140 1145 1150

Leu Asp Ala Ala Lys Asn Val Ser Asp Ala Asp Phe Asp Arg Ala Leu

1155 1160 1165

Lys Asp Val Leu Ala Pro Gln Leu Thr Lys Thr Lys Lys Ser Arg Lys

1170 1175 1180

Thr Gly Glu Ile Thr Gln Val Ile Glu Asp Phe Glu Ile Val Leu Gly

1185 1190 1195 1200

Lys Val Met Tyr Arg Gln Leu Met Ile Asp Gly Asp Lys Lys Phe Met

1205 1210 1215

Leu Gly Ser Ser Thr Tyr Gln Tyr Asn Ala Lys Gln Leu Val Leu Ser

1220 1225 1230

Asp Gln Ser Val Lys Thr Leu Ala Ser Lys Gly Arg Leu Asp Pro Leu

1235 1240 1245

Gln Glu Ser Met Asp Tyr Asn Asn Val Tyr Thr Glu Ile Leu Asp Lys

1250 1255 1260

Val Asn Gln Tyr Phe Ser Leu Tyr Asp Met Asn Lys Phe Arg His Lys

1265 1270 1275 1280

Leu Asn Leu Gly Phe Ser Lys Phe Ile Ser Phe Pro Asn His Asn Val

1285 1290 1295

Leu Asp Gly Asn Thr Lys Val Ser Ser Gly Lys Arg Glu Ile Leu Gln

1300 1305 1310

Glu Ile Leu Asn Gly Leu His Ala Asn Pro Thr Phe Gly Asn Leu Lys

1315 1320 1325

Asp Val Gly Ile Thr Thr Pro Phe Gly Gln Leu Gln Gln Pro Asn Gly

1330 1335 1340

Ile Leu Leu Ser Asp Glu Thr Lys Ile Arg Tyr Gln Ser Pro Thr Gly

1345 1350 1355 1360

Leu Phe Glu Arg Thr Val Ser Leu Lys Asp Leu

1365 1370

<210> 5

<211> 249

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacacc 249

<210> 6

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gggtcttcg 9

<210> 7

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggcgagctgc acgctgccgt cctcgatgtt gtggcggatc ttgaagttca ccttgatgcc 60

gttcttctgc ttgtcggcca tgatatagac gttgtggctg ttgtagttgt actccagctt 120

gtgccccagg atgttgccgt cctccttgaa gtcgatgccc ttcagctcga tgcggttcac 180

cagggtgtcg ccctcgaact tcacctcggc gcgggtcttg tagttgccgt cgtccttgaa 240

gaagatggtg cgctcctgga cgtagccttc gggcatggcg gacttgaaga agtcgtgctg 300

cttcatgtgg tcggggtagc ggctgaagca 330

<210> 8

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agaagacctg c 11

<210> 9

<211> 124

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gttttagaag gatgttaaat caataaggtt aaacgtttga ccttattgat ttaacatcat 60

gtgttgaaat caagcaagcg ctttgcgcgg agtttaaact tttgacccat tatatgggca 120

ttac 124

<210> 10

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tttttt 6

<210> 11

<211> 232

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctagagctcg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc 60

cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa 120

atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg 180

ggcaggacag caagggggag gattgggaag agaatagcag gcatgctggg ga 232

<210> 12

<211> 440

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agactgagtt cacacggtgc tgggccccca aagccaagtg gggttggggg aacagagtct 60

gcgagtcccg gcgccccgag tgcagggccc cgtgttgggg tcctccttcc catttgtatc 120

cgtatccttg cgggctttgc gcctccccgg gggacccctc gccgggagat ggccgcactg 180

atgcggggca aggactcctc ccgctgcctg ctcctactgg ccgcggtgct gatggtggag 240

agctcacagt tcggcagctc gcgggccaaa ctcaactcca tcaagtcctc tctgggcggg 300

gagacgcctg cccaggccgc caatcgatct gcgggcactt accaaggact ggctttcggc 360

ggcagtaaga agggcaaaaa cctggggcag gtaggaaaat acccccaata cactcttcaa 420

ccagaagagg tagggacccg 440

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tcggcggcag taagaagggc 20

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

caccgtcggc ggcagtaaga agggc 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aaacgccctt cttactgccg ccgac 25

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cttgggtagt ttgcagtt 18

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cagtgggagt ggcacctt 18

<210> 18

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cacttaccaa ggactggctt tcggcggcag taagaagggc aaaaacctgg ggcaggtagg 60

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cggcggcagt aagaagggca 20

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

caccgcggcg gcagtaagaa gggca 25

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

aaactgccct tcttactgcc gccgc 25

<210> 22

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

acttaccaag gactggcttt cggcggcagt aagaagggca aaaacctggg gcaggtagga 60

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

aaaaacctgg ggcaggtagg 20

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

caccgaaaaa cctggggcag gtagg 25

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

aaaccctacc tgccccaggt ttttc 25

<210> 26

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tcggcggcag taagaagggc aaaaacctgg ggcaggtagg aaaatacccc caatacactc 60

Claims

1.一种源自布氏乳杆菌的基因编辑工具，其特征在于，包括pcDNA3.1-LbCas9质粒和pLbCas9-sgRNA质粒；

所述pLbCas9-sgRNA质粒包括初始质粒pUC57和sgRNA通用表达框DNA片段；

所述源自布氏乳杆菌的基因编辑工具识别的3’-端PAM序列为5’-NNAAAA-3’。

2.根据权利要求1所述的基因编辑工具，其特征在于，所述编码LbCas9的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求1或2所述的基因编辑工具，其特征在于，sgRNA通用表达框DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.根据权利要求1所述的基因编辑工具，其特征在于，所述pLbCas9-sgRNA质粒的核苷酸序列如SEQ ED NO：3所示。

5.权利要求1～4任意一项所述的基因编辑工具的制备方法，包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述编码LbCas9的DNA片段的插入位点为初始质粒pcDNA3.1(+)的BamH I酶切位点和EcoRI酶切位点之间；步骤2)中所述sgRNA通用表达框DNA片段的插入位点为初始质粒pUC57的EcoRV酶切位点。

7.权利要求1～4任意一项所述的基因编辑工具在基因编辑中的应用，包括以下步骤：

2)将所述单链寡核苷酸对退火获得双链DNA片段；

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤1)中所述靶标序列的长度为15～25bp。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述靶标序列sgRNA表达载体与所述pcDNA3.1-LbCas9质粒的质量比例为(1～5)：(1～5)。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤3)中所述双链DNA片段与pLbCas9-sgRNA质粒通过酶切后连接；所述酶切用酶为BbsⅠ酶。