CN109825465A - 基于平衡udp-糖供给合成乳酰-n-新四糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于平衡UDP‑糖供给合成乳酰‑N‑新四糖的方法，所述重组枯草芽孢杆菌是通过在宿主菌Bacillus subtilis 168△amyE:P₄₃‑lacY，P₄₃‑lgtB，P_xylA‑comK的基因组上整合两个β‑1,4‑半乳糖转移酶，并整合葡萄糖‑6‑磷酸异构酶基因、谷氨酰胺‑果糖‑6‑磷酸氨基转移酶基因、UTP‑葡萄糖‑1‑磷酸尿苷酰转移酶基因、UDP‑葡萄糖‑差向异构酶基因，且敲除UDP‑葡萄糖6‑脱氢酶基因，并外源表达β‑1,3‑N‑葡糖氨基转移酶基因得到的。本发明构建的重组枯草芽孢杆菌合成乳酰‑N‑新四糖，在摇瓶上的产量可达到1800mg/L，实现了乳酰‑N‑新四糖的高效合成。

Description

基于平衡UDP-糖供给合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆 菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于遗传工程的技术领域，具体涉及一种基于平衡UDP-糖供给合成乳酰-N- 新四糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

乳酰-N-新四糖是母乳中是重要的寡糖成分之一，由于具有促进细胞分化、提高肠道上皮细胞免疫调节功能、增加肠道益生菌的相对丰度等重要生理功能，被欧洲食品安全局(EFSA)和美国的FDA批准为食品天添加剂。到目前为止，仅在人乳中发现乳酰-N- 新四糖，而从人乳中提取并不适合大规模生产。由于化学合成步骤繁琐、转化率低，酶法合成存在底物价格昂贵的缺点，所以采用绿色环境友好型的生物合成有望实现乳酰-N- 新四糖的工业化生产。

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)作为革兰氏阳性菌中的一种代表模式菌株，并且不产生内毒素，被美国食品药品监督管理局(FDA)认证为是(Generally recognized assafe， GRAS)。因此，运用代谢工程手段构建枯草芽孢杆菌工程菌是生产乳酰-N-新四糖的有效策略。其自身途径中的尿苷二磷酸半乳糖，乙酰氨基葡萄糖尿苷二磷酸是合成的关键前体，但是由于这两个UDP-糖的合成途径中的关键酶催化活力不足，以及前体之间供给的不平衡限制了产物的高效合成。因此，如何对前体UDP-糖的供给进行平衡是亟需解决的问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种基于平衡UDP-糖供给合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。

具体的，一方面，本发明提供了一种基于平衡UDP-糖供给合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌是通过在宿主菌Bacillus subtilis 168△amyE:P₄₃-lacY，P₄₃-lgtB，P_xylA-comK的基因组上整合两个β-1,4-半乳糖转移酶，并整合葡萄糖-6-磷酸异构酶基因、谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶基因、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因、UDP-葡萄糖-差向异构酶基因，且敲除UDP-葡萄糖6-脱氢酶基因，并外源表达β-1,3-N-葡糖氨基转移酶基因得到的。

本发明通过强化表达4个关键酶基因葡萄糖-6-磷酸异构酶基因、谷氨酰胺-果糖-6- 磷酸氨基转移酶基因、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因、UDP-葡萄糖-差向异构酶基因，以及敲除1个分支途径关键酶UDP-葡萄糖6-脱氢酶基因，即通过优化UDP-糖前体供给的合成途径中关键酶基因的表达量以及敲除分支途径中关键酶基因，明显增加乳酰-N-新四糖的产量。

需要进一步说明的，所述宿主菌是以枯草芽孢杆菌168为基础，通过以启动子P_xylA调控基因comK的表达，乳糖透性酶编码基因整合到基因组amyE位点，β-1,4-半乳糖转移酶编码基因整合到基因组ydeS位点和ydzO位点中间得到的。

第二方面，本发明还提供了所述的基于平衡UDP-糖供给合成乳酰-N-新四糖的构建方法，该方法包括以下步骤：

(1)通过融合PCR构建包含ydaH，ydzA基因同源臂、β-1,4-半乳糖转移酶基因、 P₄₃启动子、博来霉素抗性基因序列的重组片段1；包含yszA，ysxE基因同源臂、β-1,4- 半乳糖转移酶基因、P₄₃启动子、氯霉素抗性基因序列的重组片段2；

(2)通过融合PCR构建P₄₃控制表达的葡萄糖-6-磷酸异构酶基因的重组片段3，P₄₃控制表达的谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶基因的重组片段4；

(3)通过融合PCR构建P₄₃控制表达的UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因的重组片段5，P₄₃控制表达的UDP-葡萄糖-差向异构酶基因的重组片段6，包含tuaD基因左同源臂片段，P7Z6片段，tuaD基因右同源臂片段的重组片段7；

(4)将步骤(1)构建的重组片段1转化宿主菌，通过验证获得重组枯草芽孢杆菌BY04；再将重组片段转化重组枯草芽孢杆菌BY04，得到重组枯草芽孢杆菌BY05；

(5)将步骤(2)构建的重组片段3转化重组枯草芽孢杆菌BY05，获得重组枯草芽孢杆菌mI1，再将重组片段4转化mI1，得到重组枯草芽孢杆菌mI2；将mI2菌进行抗性基因的消除，得到mI2.2菌；

(6)将步骤(3)构建的重组片段5转化mI2.2菌，得到重组枯草芽孢杆菌mI3，再将重组片段6转化步骤mI3菌，得到重组枯草芽孢杆菌mI4，再将重组片段7转化mI4 菌，得到重组枯草芽孢杆菌mI5.0；

(7)将pP43NMK-lgtA转化重组枯草芽孢杆菌mI5.0，得到合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌mI5。

进一步的，步骤(1)中，重组片段1的序列如SEQ ID NO.1所示，重组片段2的序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步的，步骤(2)中，重组片段3的序列如SEQ ID NO.3所示，重组片段4的序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步的，步骤(3)中，重组片段5的序列如SEQ ID NO.5所示，重组片段6的序列如SEQ ID NO.6所示，重组片段7的序列如SEQ ID NO.7所示。

进一步的，步骤(5)中，通过同源重组，葡萄糖-6-磷酸异构酶基因插入在rsbRC位点和yojG位点之间，谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶基因插入在comER位点和yqeM 位点之间。

进一步的，步骤(6)中，通过同源重组，UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因插入在yycA位点和yybT位点之间，UDP-葡萄糖-差向异构酶基因插入在ybgE位点和ybgF 位点之间。

第三方面，本发明还提供了所述重组枯草芽孢杆菌在发酵生产乳酰-N-新四糖中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明通过优化UDP-糖前体供给的合成途径中关键酶基因的表达量以及敲除分支途径中关键酶基因，明显增加乳酰-N-新四糖的产量。本发明构建的重组枯草芽孢杆菌合成乳酰-N-新四糖，在摇瓶上产量可达到1800mg/L，实现了乳酰-N-新四糖的高效合成，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产乳酰-N-新四糖及其工业化奠定了基础。

附图说明

图1为本发明重组mI1菌株的PCR琼脂糖凝胶电泳图；

图2为本发明重组mI2菌株的PCR琼脂糖凝胶电泳图；

图3为本发明重组mI3菌株的PCR琼脂糖凝胶电泳图；

图4为本发明重组mI4菌株的PCR琼脂糖凝胶电泳图；

图5为本发明重组mI5.0菌株的PCR琼脂糖凝胶电泳图；

图6为平衡UDP-糖供给后对乳酰-N-新四糖产量的影响；

图7为不同UDP-Gal强化程度对乳酰-N-新四糖产量的影响。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细的解释说明。

实施例1重组PZL(P₄₃-lacY)片段的构建

以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)基因组为模板，根据NCBI上公布的amyE 基因(Gene ID：938356)，设计两侧同源臂引物，序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2 的左侧同源臂引物：

amyE-1F:5’-TATTCCGTATGTCAAGTGGCTGCGGTTTAT-3’(SEQ ID NO:1)，

amyE-1R:5’-AATTGTTATCCGCTCTCTTGACACTCCTTATTTGATTTTTTGAAG ACTTACTTCGG-3’(SEQ ID NO:2)，

序列分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的右侧同源臂引物：

amyE-2F:5’-CTTAAGGGCAAGGCTAGACGGGACTTA-3’(SEQ ID NO:3)，

amyE-2R:5’-GGCACACCGATGTACACGTCATC-3’(SEQ ID NO:4)，

使用上述引物从枯草芽孢杆菌基因组中扩增amyE两侧同源臂基因序列；以质粒pP43NMK为模板，分别设计序列为SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的引物：

P43-F:5’-CATTATACGAACGGTAAATCTGATAGGTGGTATGTTTTCGCTTGAACTTTTAAATACAG-3’(SEQ ID NO:5)，

P43-R:5’-AGTTTGTGTTTTTTAAATAGTACATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAATGGTACCGC-3’(SEQ ID NO:6)，

使用上述引物，获得P₄₃的扩增片段。以P7Z6质粒为模板，设计序列分别为SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8的博来霉素抗性基因扩增引物：

zeo-F:5’-TCAAATAAGGAGTGTCAAGAGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAA CAG-3’(SEQID NO:7)，

zeo-R:5’-AACATACCACCTATCAGATTTACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTCAGT-3’(SEQ ID NO:8)，

使用上述引物，获得博来霉素抗性基因的扩增片段。将P₄₃的扩增片段和博来霉素抗性基因扩增片段跑胶验证正确后进行柱回收。将P₄₃的扩增片段和博来霉素抗性基因扩增片段通过融合PCR技术进行融合。第一轮PCR条件为：等摩尔量柱回收的P₄₃和博来霉素抗性DNA，总量大于1000ng，primer star酶量25μL，加ddH₂O定容50μL，PCR条件 55℃，11个循环。第二轮PCR条件为：上述PCR产物为模板，zeo-F，P₄₃-R分别为上下游引物，按照常规PCR设置条件，获得ZP43片段。

以大肠杆菌(Escherichia coli K-12)基因组为模板，根据NCBI上公布的乳糖透性酶基因lacY(Gene ID：949083)，设计序列分别为SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的引物：

lacY-F:5’-GTAAGAGAGGAATGTACACATGTACTATTTAAAAAACACAAACTTTTGGATGTTCGGTT-3’(SEQ ID NO:9)，

lacY-R:5’-TAAGTCCCGTCTAGCCTTGCCCTTAAGCGACTTCATTCACCTGACGA CG-3’(SEQID NO:10)，

使用上述引物扩增乳糖透性酶基因片段。将amyE基因左侧同源臂、amyE基因右侧同源臂、ZP43片段、乳糖透性酶基因片段跑胶验证正确后进行柱回收。通过融合PCR 技术将amyE基因左侧同源臂、amyE基因右侧同源臂、ZP43片段、乳糖透性酶基因片段进行融合。第一轮PCR条件为：等摩尔量柱回收的DNA，总量大于1000ng，primer star 酶量25μL，加ddH₂O定容50μL，PCR条件55℃，11个循环。第二轮PCR条件为：上述PCR产物为模板，以SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的序列:

zong-F:5’-CATGTAAGCCATAAGCCATTCGTAA-3’(SEQ ID NO:11)，

zong-R:5’-AGCAAGACTCATCGCAACCC-3’(SEQ ID NO:12)分别为上下游引物，按照常规PCR设置条件，获得PZL片段。重组片段PZL的序列如SEQ ID NO:13所示。

实施例2重组P_xylA-comk片段的构建

以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis 168)基因组为模板，设计两侧同源臂引物，序列分别为SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的左侧同源臂引物：

yhzC-F:5’-CATACATAGGAAGCAGGCATTGTTCATAAC-3’(SEQ ID NO:14)，

yhzC-R:5’-atacgggatcaaatccgatgaaagagaaaaaatcgtacactgagctc-3’(SEQ IDNO:15)，

序列分别为SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17的右侧同源臂引物：

comK-F:5’-aagggggaaatgggatccatgagtcagaaaacagacgcacct-3’(SEQ ID NO:16)，

comK-R:5’-ACTACCTCAGTTGAAGGCTATAATCCAAG-3’(SEQ ID NO:17)，

使用上述引物从枯草芽孢杆菌基因组中两侧同源臂基因序列；以质粒pLCx-dcas9为模板，分别设计序列为SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19的引物：

P_xylA-F:5’-tttctctttcatcggatttgatcccgtataccgttcgtatagcatacattat-3’(SEQID NO:18)，

P_xylA-R:5’-gactcatggatcccatttccccctttgatttttagatatcac-3’(SEQ ID NO:19)，

使用上述引物，获得带有氯霉素抗性的P_xylA启动子的扩增片段。通过融合PCR，将重组同源臂以及带抗性基因的启动子融合，第一轮PCR条件为：等摩尔量柱回收的DNA，总量大于1000ng，primer star酶量25μL，加ddH₂O定容50μL，PCR条件55℃，11个循环。第二轮PCR条件为：上述PCR产物为模板，以SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示的序列:

zong-F:5’-gacccgcgtccggtttttgataagccgaagaaag-3’(SEQ ID NO:20)，

zong-R:5’-agtaaattcagttgcgcccggaccaatttggacac-3’(SEQ ID NO:21)，

分别为上下游引物，按照常规PCR设置条件，获得P_xylA-comk片段，片段P_xylA-comk的序列如SEQ ID NO:22所示。

实施例3p7S6P43-lgtB片段的构建

以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis 168)基因组为模板，设计两侧同源臂引物，序列分别为SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的左侧同源臂引物：

ydeS-F:5’-gggacaaggaatagtaagccggcaa-3’(SEQ ID NO:23)，

ydeS-R:5’-tcctgtgtgaaattgttatccgctcctacatactctctgtagcagaggtagcttga’(SEQ ID NO:24)，

序列分别为SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的右侧同源臂引物：

ydzO-F:5’-tgaagcccgcctaatgagcgggcttttttctgataagaactgcaaaagctgcggatt at-3’(SEQ ID NO:25)，

ydzO-R:5’-ccaccctatagataaatttttcggctgccatat-3’(SEQ ID NO:26)，

使用上述引物从枯草芽孢杆菌基因组中扩增两侧同源臂基因序列。

以质粒p7S6P43为模板，分别设计序列为SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28的引物：

p7S6P43-F:5’-agagtatgtaggagcggataacaatttcacacagga-3’(SEQ ID NO:27)，

p7S6P43-R:5’-AAAGAAATGACATGATTTTGCATgtgtacattcctctcttacctataatggtacc gc-3’ (SEQ ID NO:28)，

以重组质粒pP43NMK-lgtA-lgtB为模板(在专利CN108410787A中已经有公开)，分别设计序列为SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30的引物：

lgtB-F:5’-aggtaagagaggaatgtacacATGCAAAATCATGTCATTTCTTTAGCATCAGCAG-3’(SEQ ID NO:29)，

lgtB-R:5’-cccgctcattaggcgggcttcatcaTTACTGAAACGGAACGATAAACTGTTCGCG-3’(SEQ ID NO:30)，

使用上述引物，将获得的扩增片段跑胶验证正确后进行柱回收。通过融合PCR，将重组同源臂，β-1,4-半乳糖转移酶编码基因以及带抗性基因的启动子融合，第一轮PCR 条件为：等摩尔量柱回收的DNA，总量大于1000ng，primer star酶量25μL，加ddH₂O 定容50μL，PCR条件55℃，11个循环。第二轮PCR条件为：上述PCR产物为模板，以SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:32所示的序列:

zong-F:5’-CGTATCCGATTTGGGTGAGTGTGA-3’(SEQ ID NO:31)，

zong-R:5’-TGATGTCAATCTAATGCCTCCTTACTGG-3’(SEQ ID NO:32)分别为上下游引物，按照常规PCR设置条件，获得p7S6P43-lgtB片段。p7S6P43-lgtB片段的序列如SEQ IDNO:33所示。

实施例4重组质粒pP43NMK-lgtA的构建

以重组质粒pP43NMK-lgtA-lgtB为模版，设计反向重组引物，序列分别为SEQ IDNO:34和SEQ ID NO:35：

fz-lgtA-F:5’-tgaagcccgcctaatgagcgggcttttttaagcttggcgtaatcatggtcatagc tgtt-3’(SEQ ID NO:34)，

fz-lgtA-R:5’-CTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCCCAGCCTTTCTTATTAAAACCACTTTGTCAG CC-3’(SEQ ID NO:35)，

使用上述引物将获得的扩增片段跑胶验证正确后，取10μL的PCR反应体系，转化大肠杆菌JM109感受态，通过测序，验证重组质粒pP43NMK-lgtA构建成功，重组质粒 pP43NMK-lgtA的基因序列如SEQ ID NO:36所示。

实施例5重组p7Z6P43-lgtB片段的构建

以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)基因组为模板，设计两侧同源臂引物，序列分别为SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38的左侧同源臂引物：

ydaH-F:5’-GGCTTTCGTTGTCTTGTGTTCAAGAAATTTCCA-3’(SEQ ID NO:37)，

ydaH-R:5’-CTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCCCAGCCTTTCTTATTAAAACCACTTTGTCAGCC-3’(SEQ ID NO:38)，

序列分别为SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40的右侧同源臂引物：

ydZA-F:5’-AAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTATCATAAAGATCCAGCCTTTTTGCGCT-3’(SEQ ID NO:39)，

ydZA-R:5’-CTAAAGCCCAAGTCACAATATATTGATCGCCT-3’(SEQ ID NO:40)，

以质粒p7Z6P43为模板，分别设计序列为SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42的引物：

p7Z6P43-F:5’-GTTTTAATAAGAAAGGCTGGGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGC-3’(SEQ ID NO:41)，

p7Z6P43-R:5’-AAAGAAATGACATGATTTTGCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAATGGTACC GC-3’(SEQ ID NO:42)，

以出发菌株Bacillus subtilis 168△amyE:P₄₃-lacY，P₄₃-lgtB，P_xylA-comK的基因组为模板，分别设计序列为SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44的引物：

lgtB-1F:5’-AGGTAAGAGAGGAATGTACACATGCAAAATCATGTCATTTCTTTAGCATCAGCAG-3’(SEQ ID NO:43)，

lgtB-1R:5’-CCCGCTCATTAGGCGGGCTTCATCATTACTGAAACGGAACGATAAAC TGTTCGCG-3’(SEQ ID NO:44)，

使用上述引物，将获得的扩增片段跑胶验证正确后进行柱回收。通过融合PCR，将重组同源臂，β-1,4-半乳糖转移酶编码基因以及带抗性基因的启动子融合。第一轮PCR 条件为：等摩尔量柱回收的DNA，总量大于1000ng，primer star酶量25μL，加ddH₂O 定容50μL，PCR条件55℃，11个循环。第二轮PCR条件为：上述PCR产物为模板，融合PCR的引物分别为SEQID NO:45和SEQ ID NO:46：

zong-1F:5’-AACCTCCTTGTCTTCTTTCCAGTCTTATCTC-3’(SEQ ID NO:45)，

zong-1R:5’-ATCACTTCTCTTTCTTTCACGCTCATCCT-3’(SEQ ID NO:46)，按照常规PCR设置条件，获得p7Z6P43-lgtB片段，p7Z6P43-lgtB片段的序列如SEQ ID NO:47 所示。

实施例6重组p7C6P43-lgtB片段的构建

以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)基因组为模板，设计两侧同源臂引物，序列分别为SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49的左侧同源臂引物：

yszA-F:5’-CATCCAGCGTAAAACGTTCACGGGAATAATCTAGG-3’(SEQ ID NO:48)，

yszA-R:5’-TTATCCGCTCTGGCGCGGACTTGTTTGTTTATATCCATTCTAAATGAAGG-3’(SEQID NO:49)，

序列分别为SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51的右侧同源臂引物：

ysxE-F:5’-GCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTAAGACGTGGACTCGTTTTCAGCCTGAAATT TT-3’(SEQ ID NO:50)，

ysxE-R:5’-CATCCCAGCAGCTGATCAGGATGAATTCT-3’(SEQ ID NO:51)，

以质粒p7C6P43为模板，分别设计序列为SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:53的引物：

p7C6P43-F:5’-ACAAGTCCGCGCCAGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATG-3’(SEQID NO:52)，

p7C6P43-R:5’-AGAAATGACATGATTTTGCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAATGGTACCG CT-3’(SEQ ID NO:53)，

以出发菌株基因组为模板，分别设计序列为SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55的引物：

lgtB-2F:5’-ATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGCAAAATCATGTCATTTCTTTAGCATCAGCAG CG-3’(SEQ ID NO:54)，

lgtB-2R:5’-GCCCGCTCATTAGGCGGGCTTCATCATTACTGAAACGGAACGATAAACTGTTCGCGT-3’(SEQ ID NO:55)，

使用上述引物，将获得的扩增片段跑胶验证正确后进行柱回收。通过融合PCR，将重组同源臂，β-1,4-半乳糖转移酶编码基因以及带抗性基因的启动子融合。第一轮PCR 条件为：等摩尔量柱回收的DNA，总量大于1000ng，primer star酶量25μL，加ddH₂O 定容50μL，PCR条件55℃，11个循环。第二轮PCR条件为：上述PCR产物为模板，融合PCR的引物分别为SEQID NO:56和SEQ ID NO:57：

zong-2F:5’-GCCAGGAAGCCACAGCACATCATAGC-3’(SEQ ID NO:56)，

zong-2R:5’-TTCGTTCATTCGTTCCCGTTTACAGAACAAATAGC-3’(SEQ ID NO:57)，按照常规PCR设置条件，获得p7C6P43-lgtB片段，p7C6P43-lgtB片段的序列如SEQ ID NO:58所示。

实施例7出发菌株枯草芽孢杆菌的构建

将构建好的重组片段PxylA-comK转化枯草芽孢杆菌感受态细胞(Bacillussubtilis 168)，重组片段的添加量为100-300ng，电转条件：电压2.5kV，电击试剂5ms，37℃复苏5h后涂布氯霉素抗性平板，37℃培养24h，获得重组枯草芽孢杆菌BS168comk。

BS168comk重组枯草芽孢杆菌通过木糖诱导制作感受态。在37℃，220rpm条件下，LB液体培养12h后，用LB液体培养基将OD600稀释至1，并添加终浓度为2％的木糖，继续培养2h，获得BS168comk感受态，重组片段PZL的添加量为500ng，37℃培养1h 后涂布博来霉素抗性平板，37℃培养过夜，获得重组枯草芽孢杆菌BY00。

BY00通过木糖诱导制作成感受态细胞，重组片段p7S6P43-lgtB的添加量为500ng，37℃培养1h后涂布壮观霉素抗性平板，37℃培养过夜，获得重组枯草芽孢杆菌BY01。通过Cre/lox重组系统，敲除抗性基因，获得BY01.2菌。

BY01.2通过木糖诱导制作成感受态细胞，重组质粒pP43NMK-lgtA的添加量为500ng，37℃培养1h后涂布卡那霉素抗性平板，37℃培养过夜，获得菌株BY03。

实施例8

将构建好的重组p7Z6P43-lgtB片段转化感受态细胞BY01.2，挑选转化子进行菌落PCR验证，分别设计验证引物序列SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60的引物：

YZ-1F:5’-CGAAGGAATGCCGGTGTGCCAACTGAATC-3’(SEQ ID NO:59)，

YZ-1R:5’-CGACCTCCAGCGTGTATTGCTTGATGATGC-3’(SEQ ID NO:60)，验证正确后获得重组枯草芽孢杆菌BY03a，菌落PCR琼脂糖凝胶电泳图如图1所示。

将重组质粒pP43NMK-lgtA转化上述重组枯草芽孢杆菌BY03a，37℃培养1h后涂布卡那霉素抗性平板，37℃培养过夜，获得重组枯草芽孢杆菌BY04。

将构建好的重组p7C6P43-lgtB片段转化重组枯草芽孢杆菌BY03a感受态细胞，挑选转化子进行菌落PCR验证，分别设计验证引物序列SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62的引物：

YZ-2F:5’-GGGCACAGCGGGATACATCATCTCAAGAAA-3’(SEQ ID NO:61)，

YZ-2R:5’-TGAACCACGGCAGCCTGTCTATACACCAT-3’(SEQ ID NO:62)。

验证正确后获得重组枯草芽孢杆菌BY03b，得到的菌落PCR琼脂糖凝胶电泳图如图2所示。

将重组质粒pP43NMK-lgtA转化重组枯草芽孢杆菌BY03b，37℃培养1h后涂布卡那霉素抗性平板，37℃培养过夜，获得一种提高乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌 BY05。

所用pLCx-dcas9，p7S6P43，p7Z6P43，p7C6P43质粒来自江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号，生物工程学院，生物系统与生物加工工程研究室，上述p7S6P43，p7Z6P43，p7C6P43质粒在Modular pathway engineering ofkey carbon-precursor supply-pathways for improvedN-acetylnuraminic acidproduction in Bacillus subtilis(Zhang XL，LiuYF，Liu L， WangM，Li JH，Du GC，Chen J.2018)中已经公开。上述pLCx-dcas9质粒在CRISPRi allows optimal temporal control ofNacetylglucosaminebioproduction by a dynamic coordination of glucose andxylose metabolisminBacillus subtilis(WuYK,Chen TC,LiuYF,Lv XQ,Li JH， Du GC，Amaro RL,Liu L.2018)中已经公开。

实施例9UDP-GlcNAc前体供给的强化

本发明中的UDP-GlcNAc的前体供给强化包括强化途径中葡萄糖-6-磷酸异构酶基因 pgi，谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶基因glmS。

葡萄糖-6-磷酸异构酶基因pgi的强化，其构建过程如下：

设计将P43-pgi基因插入在rsbRC位点和yoji位点之间

以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)基因组为模板，设计两侧同源臂引物，序列分别为SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64的左侧同源臂引物：

rsbRC-F:5’-gagggtacaaagatgtgaactatacgcttgc_-3’(SEQ ID NO:63)，

rsbRC-R:5’-gaaattgttatccgctcaaggccttaagccttataccttttttaattttaagtccga-3’(SEQ ID NO:64)，

序列分别为SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66的右侧同源臂引物：

yogi-F:5’-gcccgcctaatgagcgggcttttttatacctttttgattaatcattccattgatacgt cca-3’ (SEQ ID NO:65)，

yogi-R:5’-catgaaagcgatcataaaagaagatgtgcaag-3’(SEQ ID NO:66)，

以质粒p7Z6P43为模板，分别设计序列为SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68的引物：

p7Z6P43-F:5’-ggtataaggcttaaggccttgagcggataacaatttcacacaggaaacag-3’(SEQ ID NO:67)，

p7Z6P43-R:5’-CAAAGCGTACATGCGTCATgtgtacattcctctcttacctataatggtaccgc-3’(SEQ ID NO:68)，

以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)基因组为模板，分别设计序列为SEQID NO:69 和SEQ ID NO:70的引物：

pgi-F:5’-agaggaatgtacacATGACGCATGTACGCTTTGACTACTCAAAA-3’ (SEQ ID NO:69)，

pgi-R:5’-gcccgctcattaggcgggcttcatcaTTAATCTTCCAGACGTTTTTCAAGCTCTGCTT -3’(SEQ ID NO:70)，

使用上述引物，将获得的扩增片段跑胶验证正确后进行柱回收。通过融合PCR，将左同源臂片段，P7ZP43片段，pgi片段，右同源臂片段融合。第一轮PCR条件为：等摩尔量柱回收的DNA，总量大于1000ng，primer star酶量25μL，加ddH₂O定容50μL，PCR 条件55℃，11个循环。第二轮PCR条件为：上述PCR产物为模板，以SEQ ID NO:71 和SEQ ID NO:72所示的序列:

zong-F:5’-gctgtttgcgttcttgccgtgatttcgtgta-3’(SEQ ID NO:71)，

zong-R:5’-GATAAATGCCCTTCTCATCTTTCCCTTCGCTTTCTCC-3’(SEQ ID NO:72)分别为上下游引物，按照常规PCR设置条件，获得3900bp的扩增片段，如SEQ ID NO.73所示。

谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶基因glmS的强化，设计如下：

设计将P43-glmS基因插入在comER位点和yqeM位点之间。

以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis 168)基因组为模板，设计两侧同源臂引物，序列分别为SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:75的左侧同源臂引物：

comER-F:5’-gagggtacaaagatgtgaactatacgcttgc_-3’(SEQ ID NO:74)，

comER-R:5’-gaaattgttatccgctcaaggccttaagccttataccttttttaattttaagtccga-3’(SEQ ID NO:75)，

序列分别为SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:77的右侧同源臂引物： yqeM-F:5’-taaa gcccgcctaatgagcgggcttttttacgagtatgtcatacgttcgtctgtactgcaaaa-3’ (SEQ ID NO:76)，

yqeM-R:5’-ccattttaaagatcgcagctgcggc-3’(SEQ ID NO:77)，

以质粒p7S6P43为模板，分别设计序列为SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:79的引物：

p7S6P43-F:5’-agcagtttcatgtgtaggagcggataacaatttcacacaggaaacag-3’(SEQID NO:78)，

p7S6P43-R:5’-acctacgattccacacatgtgtacattcctctcttacctataatggtaccgc-3’(SEQ ID NO:79)，

以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis 168)基因组为模板，分别设计序列为SEQ IDNO:80 和SEQ ID NO:81的引物：

glmS-F:5’-agaggaatgtacacatgtgtggaatcgtaggttatatcggtcagct-3’(SEQ IDNO:80)， NO:80)，

glmS-R:5’-cccgctcattaggcgggctttactccacagtaacactcttcgcaaggttacga-3’(SEQ ID NO:81)，

使用上述引物，将获得的扩增片段跑胶验证正确后进行柱回收。通过融合PCR，将左同源臂片段，P7SP43片段，glmS片段，右同源臂片段融合。第一轮PCR条件为：等摩尔量柱回收的DNA，总量大于1000ng，primer star酶量25μL，加ddH₂O定容50μL， PCR条件55℃，11个循环。第二轮PCR条件为：上述PCR产物为模板，以SEQ ID NO:82 和SEQ ID NO:83所示的序列:

zong-F:5’-tgtttcgtttgactcgtcgttgtttgcttcct-3’(SEQ ID NO:82)，

zong-R:5’-ctaggcgatgtagttgtccatgtcttccacaag-3’(SEQ ID NO:83)分别为上下游引物，按照常规PCR设置条件，获得5335bp的扩增片段，如SEQ ID NO.84所示。

重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168△amyE::P₄₃-lacY,3copies P₄₃-lgtB,P_xylA-comK)BY03b为宿主菌，通过Cre/lox重组系统，敲除抗性基因，获得 BY03b.2。消除抗性基因后，葡萄糖-6-磷酸异构酶基因pgi的扩增片段的添加量为500ng， 37℃培养1h后涂布博来霉素抗性平板，37℃培养过夜，获得mI1菌株，菌落PCR琼脂凝胶电泳图如图1所示。

谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶基因glmS的扩增片段的添加量为500ng，转化到重组枯草芽孢杆菌mI1感受态细胞，37℃培养1h后涂布壮观霉素抗性平板，37℃培养过夜，获得mI2菌株。通过Cre/lox重组系统，敲除抗性基因，获得mI2.2，菌落PCR琼脂凝胶电泳图如图2所示。

实施例10 UDP-Gal前体供给的强化

本发明中的UDP-Gal的前体供给强化包括强化途径中UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因gtaB，UDP-葡萄糖-差向异构酶基因galE以及敲除UDP-葡萄糖-脱氢酶基因tuaD。

UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因gtaB的强化，其构建过程如下：

设计将P43-gtaB基因插入在yycA位点和yybT位点之间。

以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)基因组为模板，设计两侧同源臂引物，序列分别为SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:86的左侧同源臂引物：

yycA-F:5’-ggcaacggttcatctttttctcagaacg_-3’(SEQ ID NO:85)，

yycA-R:5’-cctgtgtgaaattgttatccgctcttattccacgagataaagagtttgctggct-3’(SEQ ID NO:86)，

序列分别为SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:88的右侧同源臂引物： yybT-F:5’-gccc gcctaatgagcgggcttttttatacctttttgattaatcattccattgatacgtcca-3’(SEQ ID NO:87)，

yybT-R:5’-catgaaagcgatcataaaagaagatgtgcaag-3’(SEQ ID NO:88)，

以质粒p7S6P43为模板，分别设计序列为SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90的引物：

p7S6P43-F:5’-ctttatctcgtggaataagagcggataacaatttcacacaggaaacag-3’(SEQID NO:89)，

p7S6P43-R:5’-CAAAGCGTACATGCGTCATgtgtacattcctctcttacctataatggtaccgc-3’(SEQ ID NO:90)，

以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)基因组为模板，分别设计序列为SEQID NO:91 和SEQ ID NO:92的引物：

gtaB-F:5’-aggtaagagaggaatgtacacatgaaaaaagtacgtaaagccataattccagca-3’(SEQ ID NO:91)，

gtaB--R:5’-gcccgctcattaggcgggctttagatttcttctttgtttagtaaaccttccataaat ggaacg-3’(SEQ ID NO:92)，

使用上述引物，将获得的扩增片段跑胶验证正确后进行柱回收。通过融合PCR，将左同源臂片段，P7SP43片段，gtaB片段，右同源臂片段融合。第一轮PCR条件为：等摩尔量柱回收的DNA，总量大于1000ng，primer star酶量25μL，加ddH2O定容50μL， PCR条件55℃，11个循环。第二轮PCR条件为：上述PCR产物为模板，以SEQ ID NO:93 和SEQ ID NO:94所示的序列:

zong-F:5’-ttcttctattatcggtgttcagcaggt-3’(SEQ ID NO:93)，

zong-R:5’-ggaggcgtacagagatgaaggttat-3’(SEQ ID NO:94)分别为上下游引物，按照常规PCR设置条件，获得4509bp的扩增片段，如SEQ ID NO.95所示。

UDP-葡萄糖-差向异构酶基因galE的强化，其构建过程如下：设计将P43-galE基因插入在ybgE位点和ybgF位点之间。

以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)基因组为模板，设计两侧同源臂引物，序列分别为SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97的左侧同源臂引物：

ybgE-F:5’-gtgaagcggcgtattattaaaggaaaggctgta_-3’(SEQ ID NO:96)，

ybgE-R:5’-tgtgtgaaattgttatccgctctcacacttccactgtccagttaaacgggc-3’(SEQID NO:97)，

序列分别为SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:99的右侧同源臂引物：

ybgF-F:5’-agcccgcctaatgagcgggcttttttaaatcgaaaaagaacctgcccggaggca-3’(SEQ ID NO:98)，

ybgF-R:5’-ccggatttacggtcgcttggctgtatt-3’(SEQ ID NO:99)，

以质粒p7S6P43为模板，分别设计序列为SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:101的引物：

p7C6P43-F:5’-cagtggaagtgtgagagcggataacaatttcacacaggaaacag-3’(SEQ IDNO:100)，

p7C6P43-R:5’-GCCAGTAACAAGTATTGCCATgtgtacattcctctcttacCTATAATGGTACCGC-3’(SEQ ID NO:101)，

以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)基因组为模板，分别设计序列为SEQID NO:102和SEQ ID NO:103的引物：

galE-F:5’-aagagaggaatgtacacATGGCAATACTTGTTACTGGCGGT-3’(SEQ ID NO:102)，

galE-R:5’-cccgctcattaggcgggctTTATTCCGCACTCTTATACCCATTCACATTAGAAGA -3’(SEQ ID NO:103)，

使用上述引物，将获得的扩增片段跑胶验证正确后进行柱回收。通过融合PCR，将左同源臂片段，P7CP43片段，galE片段，右同源臂片段融合。第一轮PCR条件为：等摩尔量柱回收的DNA，总量大于1000ng，primer star酶量25μL，加ddH₂O定容50μL， PCR条件55℃，11个循环。第二轮PCR条件为：上述PCR产物为模板，以SEQ ID NO:104 和SEQ ID NO:105所示的序列:

zong-F:5’-AAAGCCCGACCCGTCTTCCT-3’(SEQ ID NO:104)，

zong-R:5’-TTGGATGTGGAGTGCCGTCTT-3’(SEQ ID NO:105)分别为上下游引物，按照常规PCR设置条件，获得4666bp的扩增片段，如SEQ ID NO.106所示。

UDP-葡萄糖-脱氢酶基因tuaD的敲除，其构建过程如下：

以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)基因组为模板，设计两侧同源臂引物，序列分别为SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:108的左侧同源臂引物：

tuaC-F:5’-CAAATTCCTTATGTCCTGACCTTGCATGGC_-3’(SEQ ID NO:107)，

tuaC-R:5’-tgtgtgaaattgttatccgctcAGCGCTCAACCCTCTCCTGTAAAAT_-3’(SEQ IDNO:108)，

序列分别为SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110的右侧同源臂引物：

tuaE-F:5’-accctggcgttaCGGAACCCTCTGACAAGTATTTTCCGG-3’(SEQ ID NO:109)，

tuaE-R:5’-GCCATTCTCTTTAAAACAGGCGGCAATACAA-3’(SEQ ID NO:110)，

以质粒p7Z6为模板，分别设计序列为SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:112的引物：

p7Z6-F:5’-cagtggaagtgtgagagcggataacaatttcacacaggaaacag-3’(SEQ ID NO:111)，

p7Z6-R:5’-GCCAGTAACAAGTATTGCCATgtgtacattcctctcttacCTATAATGGTACCGC -3’(SEQ ID NO:112)，

使用上述引物，将获得的扩增片段跑胶验证正确后进行柱回收。通过融合PCR，将左同源臂片段，P7Z6片段，右同源臂片段融合。第一轮PCR条件为：等摩尔量柱回收的DNA，总量大于1000ng，primer star酶量25μL，加ddH₂O定容50μL，PCR条件55℃， 11个循环。第二轮PCR条件为：上述PCR产物为模板，以SEQ ID NO:113和SEQ ID NO:114所示的序列：

zong-F:5’-CCGTAGGTTCTGCGTCAGTTGTT-3’(SEQ ID NO:113)，

zong-R:5’-GATGTCGGATAATGCTGCTTGTACTC-3’(SEQ ID NO:114)分别为上下游引物，按照常规PCR设置条件，获得2238bp的扩增片段，如SEQ ID NO.115)。

UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因gtaB的扩增片段的添加量为500ng，转化到重组枯草芽孢杆菌mI2.2感受态细胞，37℃培养1h后涂布壮观霉素抗性平板，37℃培养过夜，获得mI3菌株，菌落PCR琼脂凝胶电泳图如图3所示。

UDP-葡萄糖-差向异构酶基因galE的扩增片段添加量为500ng，转化到重组枯草芽孢杆菌mI3感受态细胞，37℃培养1h后涂布氯霉素抗性平板，37℃培养过夜，获得 mI4菌株，菌落PCR琼脂凝胶电泳图如图4所示。

敲除UDP-葡萄糖-脱氢酶基因tuaD的扩增片段添加量为500ng，转化到重组枯草芽孢杆菌mI4感受态细胞，37℃培养1h后涂布博来霉素抗性平板，37℃培养过夜，获得 mI5.0菌株，菌落PCR琼脂凝胶电泳图如图5所示。

将重组质粒pP43NMK-lgtA转化重组枯草芽孢杆菌mI5.0，37℃培养1h后涂布卡那霉素抗性平板，37℃培养过夜，获得一种提高乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌mI5。

实施例11重组枯草芽孢杆菌mI5发酵法生产乳酰-N-新四糖

采用实施例10构建得到的重组枯草芽孢杆菌mI5菌与宿主菌进行摇瓶发酵，制成种子液。种子液的制作方法为：挑取平板上的单菌落在LB液体培养基中，同时添加终浓度为30μg/mL的卡那霉素，在37℃、220rpm条件下，培养10-12h。

将种子液按10％的接种量转入发酵培养基中(发酵培养基：胰蛋白胨6g/L，酵母粉12g/L，(NH₄)SO₄6g/L，K₂HPO₄·3H₂O 12.5g/L，KH₂PO₄2.5g/L，MgSO₄·7H₂O 1.2g/L，葡萄糖60g/L，乳糖5g/L)，于37℃、220rpm条件下培养48h。如图6在发酵培养液的上清测得乳酰-N-新四糖，含量为1800mg/L。较重组枯草芽孢杆菌BY05提高38.5％；同时本发明提供的重组枯草芽孢杆菌发酵产乳酰-N-新四糖的葡萄糖得率为33.7mg/g，较重组枯草芽孢杆菌BY05提高了25％，实现了乳酰-N-新四糖在重组枯草芽孢杆菌的生产强度和产量的提高，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产乳酰-N-新四糖及其工业化奠定了基础。

对照实施例1

pDG-Cre质粒用于敲除mI1菌株的抗性基因，获得无抗性的mI1.2菌株。重组枯草芽孢杆菌mI1.2为宿主菌，将UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因gtaB的扩增片段转化到宿主菌，获得mI6.0菌株。

将UDP-葡萄糖-差向异构酶基因galE的扩增片段转化到重组枯草芽孢杆菌mI6.0菌株，获得mI7.0菌株。

将敲除UDP-葡萄糖-脱氢酶基因tuaD的扩增片段转化到重组枯草芽孢杆菌mI7.0菌株，获得mI8.0菌株。

将重组质粒pP43NMK-lgtA转化重组枯草芽孢杆菌mI6.0、mI7.0、mI8.0，37℃培养1h后涂布卡那霉素抗性平板，37℃培养过夜，分别获得重组枯草芽孢杆菌mI6、mI7、 mI8。

将mI6、mI7、mI8进行摇瓶发酵。将三株菌制成种子液，种子液的制作方法为：挑取平板上的单菌落在LB液体培养基中，同时添加终浓度为30μg/mL的卡那霉素，在37℃、220rpm条件下，培养10-12h。将种子液按10％的接种量转入发酵培养基中。于37℃、 220rpm条件下培养48h。在发酵培养液的上清测得乳酰-N-新四糖。已知mI6、mI7、mI8 与mI3、mI4、mI5相对应的都没有强化谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶基因glmS。如图7可知，mI6、mI7、mI8菌株均没有mI5菌产乳酰-N-新四糖的含量高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 光明乳业股份有限公司

<120> 基于平衡UDP-糖供给合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用

<160> 115

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 1

tattccgtat gtcaagtggc tgcggtttat 30

<210> 2

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 2

aattgttatc cgctctcttg acactcctta tttgattttt tgaagactta cttcgg 56

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 3

cttaagggca aggctagacg ggactta 27

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 4

ggcacaccga tgtacacgtc atc 23

<210> 5

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 5

cattatacga acggtaaatc tgataggtgg tatgttttcg cttgaacttt taaatacag 59

<210> 6

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 6

agtttgtgtt ttttaaatag tacatgtgta cattcctctc ttacctataa tggtaccgc 59

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 7

tcaaataagg agtgtcaaga gagcggataa caatttcaca caggaaacag 50

<210> 8

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 8

aacataccac ctatcagatt taccgttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttattcagt 59

<210> 9

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 9

gtaagagagg aatgtacaca tgtactattt aaaaaacaca aacttttgga tgttcggtt 59

<210> 10

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 10

taagtcccgt ctagccttgc ccttaagcga cttcattcac ctgacgacg 49

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 11

catgtaagcc ataagccatt cgtaa 25

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 12

agcaagactc atcgcaaccc 20

<210> 13

<211> 3811

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 13

catgtaagcc ataagccatt cgtaaaagtg cgggaggaag gtcatgaata atctgcgtaa 60

tagactttca ggcgtgaatg ggaaaaataa gagagtaaaa gaaaaagaac aaaaaatctg 120

gtcggagatt gggatgatag cgggagcatt tgcgctgctt gatgtgatca tccgcggcat 180

tatgtttgaa tttccgttta aagaatgggc tgcaagcctt gtgtttttgt tcatcattat 240

cttatattac tgcatcaggg ctgcggcatc cggaatgctc atgccgagaa tagacaccaa 300

agaagaactg caaaaacggg tgaagcagca gcgaatagaa tcaattgcgg tcgcctttgc 360

ggtagtggtg cttacgatgt acgacagggg gattccccat acattcttcg cttggctgaa 420

aatgattctt ctttttatcg tctgcggcgg cgttctgttt ctgcttcggt atgtgattgt 480

gaagctggct tacagaagag cggtaaaaga agaaataaaa aagaaatcat cttttttgtt 540

tggaaagcga gggaagcgtt cacagtttcg ggcagctttt tttataggaa cattgatttg 600

tattcactct gccaagttgt tttgatagag tgattgtgat aattttaaat gtaagcgtta 660

acaaaattct ccagtcttca catcggtttg aaaggaggaa gcggaagaat gaagtaagag 720

ggatttttga ctccgaagta agtcttcaaa aaatcaaata aggagtgtca agagagcgga 780

taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg aattcgagct cggtacccgg 840

ggatcctcta gagataccgt tcgtatagca tacattatac gaagttatct tgatatggct 900

ttttatatgt gttactctac atacagaaag gaggaactaa acatggccaa gttgaccagt 960

gccgttccgg tgctcaccgc gcgcgacgtc gccggagcgg tcgagttctg gaccgaccgg 1020

ctcgggttct cccgggactt cgtggaggac gacttcgccg gtgtggtccg ggacgacgtg 1080

accctgttca tcagcgcggt ccaggaccag gtggtgccgg acaacaccct ggcctgggtg 1140

tgggtgcgcg gcctggacga gctgtacgcc gagtggtcgg aggtcgtgtc cacgaacttc 1200

cgggacgcct ccgggccggc catgaccgag atcggcgagc agccgtgggg gcgggagttc 1260

gccctgcgcg acccggccgg caactgcgtg cacttcgtgg ccgaggagca ggactgaata 1320

acttcgtata gcatacatta tacgaacggt aaatctgata ggtggtatgt tttcgcttga 1380

acttttaaat acagccattg aacatacggt tgatttaata actgacaaac atcaccctct 1440

tgctaaagcg gccaaggacg ccgccgccgg ggctgtttgc gttcttgccg tgatttcgtg 1500

taccattggt ttacttattt ttttgccaag gctgtaatgg ctgaaaattc ttacatttat 1560

tttacatttt tagaaatggg cgtgaaaaaa agcgcgcgat tatgtaaaat ataaagtgat 1620

agcggtacca ttataggtaa gagaggaatg tacacatgta ctatttaaaa aacacaaact 1680

tttggatgtt cggtttattc tttttctttt acttttttat catgggagcc tacttcccgt 1740

ttttcccgat ttggctacat gacatcaacc atatcagcaa aagtgatacg ggtattattt 1800

ttgccgctat ttctctgttc tcgctattat tccaaccgct gtttggtctg ctttctgaca 1860

aactcgggct gcgcaaatac ctgctgtgga ttattaccgg catgttagtg atgtttgcgc 1920

cgttctttat ttttatcttc gggccactgt tacaatacaa cattttagta ggatcgattg 1980

ttggtggtat ttatctaggc ttttgtttta acgccggtgc gccagcagta gaggcattta 2040

ttgagaaagt cagccgtcgc agtaatttcg aatttggtcg cgcgcggatg tttggctgtg 2100

ttggctgggc gctgtgtgcc tcgattgtcg gcatcatgtt caccatcaat aatcagtttg 2160

ttttctggct gggctctggc tgtgcactca tcctcgccgt tttactcttt ttcgccaaaa 2220

cggatgcgcc ctcttctgcc acggttgcca atgcggtagg tgccaaccat tcggcattta 2280

gccttaagct ggcactggaa ctgttcagac agccaaaact gtggtttttg tcactgtatg 2340

ttattggcgt ttcctgcacc tacgatgttt ttgaccaaca gtttgctaat ttctttactt 2400

cgttctttgc taccggtgaa cagggtacgc gggtatttgg ctacgtaacg acaatgggcg 2460

aattacttaa cgcctcgatt atgttctttg cgccactgat cattaatcgc atcggtggga 2520

aaaacgccct gctgctggct ggcactatta tgtctgtacg tattattggc tcatcgttcg 2580

ccacctcagc gctggaagtg gttattctga aaacgctgca tatgtttgaa gtaccgttcc 2640

tgctggtggg ctgctttaaa tatattacca gccagtttga agtgcgtttt tcagcgacga 2700

tttatctggt ctgtttctgc ttctttaagc aactggcgat gatttttatg tctgtactgg 2760

cgggcaatat gtatgaaagc atcggtttcc agggcgctta tctggtgctg ggtctggtgg 2820

cgctgggctt caccttaatt tccgtgttca cgcttagcgg ccccggcccg ctttccctgc 2880

tgcgtcgtca ggtgaatgaa gtcgcttaag ggcaaggcta gacgggactt accgaaagaa 2940

accatcaatg atggtttctt ttttgttcat aaatcagaca aaacttttct cttgcaaaag 3000

tttgtgaagt gttgcacaat ataaatgtga aatacttcac aaacaaaaag acatcaaaga 3060

gaaacatacc ctggaaggat gattaatgat gaacaaacat gtaaataaag tagctttaat 3120

cggagcgggt tttgttggaa gcagttatgc atttgcgtta attaaccaag gaatcacaga 3180

tgagcttgtg gtcattgatg taaataaaga aaaagcaatg ggcgatgtga tggatttaaa 3240

ccacggaaag gcgtttgcgc cacaaccggt caaaacatct tacggaacat atgaagactg 3300

caaggatgct gatattgtct gcatttgcgc cggagcaaac caaaaacctg gtgagacacg 3360

ccttgaatta gtagaaaaga acttgaagat tttcaaaggc atcgttagtg aagtcatggc 3420

gagcggattt gacggcattt tcttagtcgc gacaaatccg gttgatatcc tgacttacgc 3480

aacatggaaa ttcagcggcc tgccaaaaga gcgggtgatt ggaagcggca caacacttga 3540

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cggcggtgtg ccggtcagtg aactcgttga gaaaaacgat gcgtacaaac aagaggagct 3720

ggaccaaatt gtagatgatg tgaaaaacgc agcttaccat atcattgaga aaaaaggcgc 3780

gacttattat ggggttgcga tgagtcttgc t 3811

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 14

catacatagg aagcaggcat tgttcataac 30

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<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 15

atacgggatc aaatccgatg aaagagaaaa aatcgtacac tgagctc 47

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<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 16

aagggggaaa tgggatccat gagtcagaaa acagacgcac ct 42

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<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 17

actacctcag ttgaaggcta taatccaag 29

<210> 18

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 18

tttctctttc atcggatttg atcccgtata ccgttcgtat agcatacatt at 52

<210> 19

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 19

gactcatgga tcccatttcc ccctttgatt tttagatatc ac 42

<210> 20

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 20

gacccgcgtc cggtttttga taagccgaag aaag 34

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<211> 35

<212> DNA

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<400> 21

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<210> 22

<211> 4568

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 22

gacccgcgtc cggtttttga taagccgaag aaagcgaaaa aattagaggg caaaaccgct 60

attattactg gaggagacag cgggattgga cgcgctgtct cggtgttatt cgcaaaagaa 120

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tatgtagaaa aggaaggggt aaaatgcctg ctgattgcag gagatgtcgg ggatgaagcg 240

ttttgcaatg atgtggtcgg gcaggcaagc caagtgtttc catccattga tatattggtt 300

aacaatgcag ctgagcagca tgtccagccc agcattgaaa aaatcaccag ccaccagctg 360

atcagaacct tccaaacaaa cattttttcc atgttttact taacaaaggc agtgctgcct 420

catttaaaaa aagggagctc tattattaat accgcttcaa ttaccgccta taaaggcaat 480

aaaacgctga tcgattattc agcgacaaaa ggcgcgatcg ttacgtttac aaggtccctt 540

tcccagtcgc ttgttcagca gggcatacgg gtcaatgcag tggcaccggg tcccatttgg 600

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tctagattgc cctgccccaa tttcaaaaat aaaatctttt tcaagcagtg tatttacttg 3300

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ggagttcttc aaaatttcat ctaatattaa tttttgattc atttttttta ctaaagcttg 3420

atctgcaatt tgaataataa ccactccttt gtttatccac cgaactaagt tggtgttttt 3480

tgaagcttga attagatatt taaaagtatc atatctaata ttataactaa attttctaaa 3540

aaaaacattg aaataaacat ttattttgta tatgatgaga taaagttagt ttattggata 3600

aacaaactaa ctcaattaag atagttgatg gataaacttg ttcacttaaa tcaaaggggg 3660

aaatgacaaa tggtccaaac tagtgatatc taaaaatcaa agggggaaat gggatccatg 3720

agtcagaaaa cagacgcacc tttagaatcg tatgaagtga acggcgcaac aattgccgtg 3780

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gagatgtcac atagcttgaa ttctctgaag ctagaaatac ataaacatcg gccaattcca 4440

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<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 23

gggacaagga atagtaagcc ggcaa 25

<210> 24

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 24

tcctgtgtga aattgttatc cgctcctaca tactctctgt agcagaggta gcttga 56

<210> 25

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<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 25

tgaagcccgc ctaatgagcg ggcttttttc tgataagaac tgcaaaagct gcggattat 59

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 26

ccaccctata gataaatttt tcggctgcca tat 33

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<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 27

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<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 28

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<212> DNA

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<400> 29

aggtaagaga ggaatgtaca catgcaaaat catgtcattt ctttagcatc agcag 55

<210> 30

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 30

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<211> 24

<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 33

cgtatccgat ttgggtgagt gtgacaatca atccagcacc gcttggagaa agtccaattg 60

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tggtttactt atttttttgc caaggctgta atggctgaaa attcttacat ttattttaca 2400

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tcgttccgtt tcagtaatga tgaagcccgc ctaatgagcg ggcttttttc tgataagaac 3360

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ttcaatcgtg aatacataac atcatattat tacattcctt ttcatcgatt ggaacaaggg 3540

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ggccattatg taggtgtcat ggcaatggaa aaaatacttg caatgtaaac aggcctctaa 3660

agagacctgt tttttaatat ccagatgatt gtctagtttc agcttgggct ctatgaccac 3720

tcccataact gaaatagtct aatatttata ccagaaggga ttgtttatat aaataaaagt 3780

ttatataatg acgggggcgc taaggaaacg cggggagcga ctcaggtttt cgtttcaaag 3840

ttttgatcct taagatatac ggagcgctac atatggaaac gtaaagggga atgtataatc 3900

atttggcgtg tatataacga tttgcttata tattgatttg ggaaggagga gctcatatga 3960

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atacattgca attgatctta catcaaattg atcaagagga tgaattgtta aaccatatca 4260

aacaaaagaa aactcaagcg tgttgccagt aaggaggcat tagattgaca tca 4313

<210> 34

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 34

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<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 35

ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcccagcct ttcttattaa aaccactttg tcagcc 56

<210> 36

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<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 36

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tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt 720

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tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga 1800

ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta 1860

aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg 1920

ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact 1980

ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata 2040

agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt 2100

tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa 2160

ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga aaccattatt 2220

atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct cgcgcgtttc 2280

ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg 2340

taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt 2400

cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac tgagagtgca ccatatgcgg 2460

tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgcca ttcgccattc 2520

aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg 2580

gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca 2640

cgacgttgta aaacgacggc cagtgaattc cttaaggaac gtacagacgg cttaaaagcc 2700

tttaaaaacg tttttaaggg gtttgtagac aaggtaaagg ataaaacagc acaattccaa 2760

gaaaaacacg atttagaacc taaaaagaac gaatttgaac taactcataa ccgagaggta 2820

aaaaaagaac gaagtcgaga tcagggaatg agtttataaa ataaaaaaag cacctgaaaa 2880

ggtgtctttt tttgatggtt ttgaacttgt tctttcttat cttgatacat atagaaataa 2940

cgtcattttt attttagttg ctgaaaggtg cgttgaagtg ttggtatgta tgtgttttaa 3000

agtattgaaa acccttaaaa ttggttgcac agaaaaaccc catctgttaa agttataagt 3060

gactaaacaa ataactaaat agatgggggt ttcttttaat attatgtgtc ctaatagtag 3120

catttattca gatgaaaaat caagggtttt agtggacaag acaaaaagtg gaaaagtgag 3180

accatggaga gaaaagaaaa tcgctaatgt tgattacttt gaacttctgc atattcttga 3240

atttaaaaag gctgaaagag taaaagattg tgctgaaata ttagagtata aacaaaatcg 3300

tgaaacaggc gaaagaaagt tgtatcgagt gtggttttgt aaatccaggc tttgtccaat 3360

gtgcaactgg aggagagcaa tgaaacatgg cattcagtca caaaaggttg ttgctgaagt 3420

tattaaacaa aagccaacag ttcgttggtt gtttctcaca ttaacagtta aaaatgttta 3480

tgatggcgaa gaattaaata agagtttgtc agatatggct caaggatttc gccgaatgat 3540

gcaatataaa aaaattaata aaaatcttgt tggttttatg cgtgcaacgg aagtgacaat 3600

aaataataaa gataattctt ataatcagca catgcatgta ttggtatgtg tggaaccaac 3660

ttattttaag aatacagaaa actacgtgaa tcaaaaacaa tggattcaat tttggaaaaa 3720

ggcaatgaaa ttagactatg atccaaatgt aaaagttcaa atgattcgac cgaaaaataa 3780

atataaatcg gatatacaat cggcaattga cgaaactgca aaatatcctg taaaggatac 3840

ggattttatg accgatgatg aagaaaagaa tttgaaacgt ttgtctgatt tggaggaagg 3900

tttacaccgt aaaaggttaa tctcctatgg tggtttgtta aaagaaatac ataaaaaatt 3960

aaaccttgat gacacagaag aaggcgattt gattcataca gatgatgacg aaaaagccga 4020

tgaagatgga ttttctatta ttgcaatgtg gaattgggaa cggaaaaatt attttattaa 4080

agagtagttc aacaaacggg ccagtttgtt gaagattaga tgctataatt gttattaaaa 4140

ggattgaagg atgcttagga agacgagtta ttaatagctg aataagaacg gtgctctcca 4200

aatattctta tttagaaaag caaatctaaa attatctgaa aagggaatga gaatagtgaa 4260

tggaccaata ataatgacta gagaagaaag aatgaagatt gttcatgaaa ttaaggaacg 4320

aatattggat aaatatgggg atgatgttaa ggctattggt gtttatggct ctcttggtcg 4380

tcagactgat gggccctatt cggatattga gatgatgtgt gtcatgtcaa cagaggaagc 4440

agagttcagc catgaatgga caaccggtga gtggaaggtg gaagtgaatt ttgatagcga 4500

agagattcta ctagattatg catctcaggt ggaatcagat tggccgctta cacatggtca 4560

atttttctct attttgccga tttatgattc aggtggatac ttagagaaag tgtatcaaac 4620

tgctaaatcg gtagaagccc aaacgttcca cgatgcgatt tgtgccctta tcgtagaaga 4680

gctgtttgaa tatgcaggca aatggcgtaa tattcgtgtg caaggaccga caacatttct 4740

accatccttg actgtacagg tagcaatggc aggtgccatg ttgattggtc tgcatcatcg 4800

catctgttat acgacgagcg cttcggtctt aactgaagca gttaagcaat cagatcttcc 4860

ttcaggttat gaccatctgt gccagttcgt aatgtctggt caactttccg actctgagaa 4920

acttctggaa tcgctagaga atttctggaa tgggattcag gagtggacag aacgacacgg 4980

atatatagtg gatgtgtcaa aacgcatacc attttgaacg atgacctcta ataattgtta 5040

atcatgttgg ttacgtattt attaacttct cctagtatta gtaattatca tggctgtcat 5100

ggcgcattaa cggaataaag ggtgtgctta aatcgggcca ttttgcgtaa taagaaaaag 5160

gattaattat gagcgaattg aattaataat aaggtaatag atttacatta gaaaatgaaa 5220

ggggatttta tgcgtgagaa tgttacagtc tatcccggca ttgccagtcg gggatattaa 5280

aaagagtata ggtttttatt gggataaagt aggtttcact ttggttcacc atgaagatgg 5340

attcgcagtt ctaatgtgta atgaggttcg gattcatcta tgggaggcaa gtgatgaagg 5400

ctggcgcctc gtagtaatga ttcaccggtt tgtacaggtg cggagtcgtt tattgctggt 5460

actgctagtt gccgcattga agtagaggga attgatgaat tatatcaaca tattaagcct 5520

ttgggcattt tgcaccccaa tacatcatta aaagatcagt ggtgggatga acgagacttt 5580

gcagtaattg atcccgacaa caatttgatt agcttttttc aacaaataaa aagctaaaat 5640

ctattattaa tctgttcagc aatcgggcgc gattgctgaa taaaagatac gagagacctc 5700

tcttgtatct tttttatttt gagtggtttt gtccgttaca ctagaaaacc gaaagacaat 5760

aaaaatttta ttcttgctga gtctggcttt cggtaagcta gacaaaacgg acaaaataaa 5820

aattggcaag ggtttaaagg tggagatttt ttgagtgatc ttctcaaaaa atactacctg 5880

tcccttgctg atttttaaac gagcacgaga gcaaaacccc cctttgctga ggtggcagag 5940

ggcaggtttt tttgtttctt ttttctcgta aaaaaaagaa aggtcttaaa ggttttatgg 6000

ttttggtcgg cactgccgcg cctcgcagag cacacacttt atgaatataa agtatagtgt 6060

gttatacttt acttggaagt ggttgccgga aagagcgaaa atgcctcaca tttgtgccac 6120

ctaaaaagga gcgatttaca tatgagttat gcagtttgta gaatgcaaaa agtgaaatca 6180

gctggactaa aaggcatgca atttcataat caaagagagc gaaaaagtag aacgaatgat 6240

gatattgacc atgagcgaac acgtgaaaat tatgatttga aaaatgataa aaatattgat 6300

tacaacgaac gtgtcaaaga aattattgaa tcacaaaaaa caggtacaag aaaaacgagg 6360

aaagatgctg ttcttgtaaa tgagttgcta gtaacatctg accgagattt ttttgagcaa 6420

ctggatcctg ataggtggta tgttttcgct tgaactttta aatacagcca ttgaacatac 6480

ggttgattta ataactgaca aacatcaccc tcttgctaaa gcggccaagg acgccgccgc 6540

cggggctgtt tgcgttcttg ccgtgatttc gtgtaccatt ggtttactta tttttttgcc 6600

aaggctgtaa tggctgaaaa ttcttacatt tattttacat ttttagaaat gggcgtgaaa 6660

aaaagcgcgc gattatgtaa aatataaagt gatagcggta ccattatagg taagagagga 6720

atgtacacat gccgtctgaa gcttttagac gccatagagc ctatcgcgaa aataaacttc 6780

aaccgttagt ctctgtttta atctgcgctt ataacgtgga aaaatatttt gcccaatcac 6840

tggcagcggt tgtgaatcag acatggagaa acctggatat tcttatcgtc gatgatggct 6900

caacagatgg aacacttgct attgcccaaa gatttcaaga acaggatggc agaattcgca 6960

tcttagcaca gccgcgcaat tctggcctta ttccgtcatt aaacatcgga ttagatgaac 7020

tggcgaaaag cggcggaggc ggagaatata tcgctagaac agatgccgat gatattgctg 7080

ccccggattg gattgaaaaa atcgttggcg aaatggaaaa agatagatca atcatcgcaa 7140

tgggagcgtg gcttgaagtg ttaagcgaag aaaaagatgg caatagactg gctcgccatc 7200

atgaacatgg aaaaatctgg aaaaaaccga caagacatga agatattgcc gatttctttc 7260

cgtttggcaa tccgattcat aataacacaa tgatcatgag acgcagcgtc attgatggcg 7320

gacttagata taacacagaa cgcgattggg cggaagatta ccagttttgg tacgatgttt 7380

ctaaactggg aagacttgca tattatccgg aagcgctggt gaaatatcgc cttcatgcta 7440

atcaagtctc aagcaaatat agcatcagac agcatgaaat tgcacaaggc atccagaaaa 7500

cagcgcgcaa cgattttctt caaagcatgg gatttaaaac aagatttgat tctctggaat 7560

accgccagat caaagcagtt gcgtatgaac tgcttgaaaa acatctgccg gaagaagatt 7620

ttgaaagagc aagacgcttt ctttaccaat gttttaaacg cacagataca ttaccggctg 7680

gcgcctggct ggattttgca gcggatggaa gaatgagacg cttatttaca ctgcgccagt 7740

actttggaat cctgcataga ctgctgaaaa accgctaatg a 7781

<210> 37

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 37

ggctttcgtt gtcttgtgtt caagaaattt cca 33

<210> 38

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 38

ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcccagcct ttcttattaa aaccactttg tcagcc 56

<210> 39

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 39

aagcccgcct aatgagcggg cttttttatc ataaagatcc agcctttttg cgct 54

<210> 40

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 40

ctaaagccca agtcacaata tattgatcgc ct 32

<210> 41

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 41

gttttaataa gaaaggctgg gagcggataa caatttcaca caggaaacag c 51

<210> 42

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 42

aaagaaatga catgattttg catgtgtaca ttcctctctt acctataatg gtaccgc 57

<210> 43

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 43

aggtaagaga ggaatgtaca catgcaaaat catgtcattt ctttagcatc agcag 55

<210> 44

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 44

cccgctcatt aggcgggctt catcattact gaaacggaac gataaactgt tcgcg 55

<210> 45

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 45

aacctccttg tcttctttcc agtcttatct c 31

<210> 46

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 46

atcacttctc tttctttcac gctcatcct 29

<210> 47

<211> 3627

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 47

aacctccttg tcttctttcc agtcttatct ctaggatgaa attggaggaa gaataacgtg 60

catgtcatta caacacaagt actttttatt ttttgttttt tattgctgat tcactcgata 120

gaaaccttag cctatgcgac aaggctttcc ggagctcgcg ttggatttat tgcgtccgcg 180

ctttctctgt ttaatgtcat ggtcatcgta tccagaatgt cgaatatggt gcagcagccc 240

tttactgggc atttaattga tgatgctgga aaaaacgcac tggcgattgt aggggagcag 300

ttccgctttt taattttcgg atcgacagtc ggcaccattt tgggcattat cctgctcccg 360

tcttttgtcg ctcttttttc acgggcgatt attcacttgg cgggcggcgg cggctccgtt 420

tttcaagtat tccgaaaggg attctcgaaa caaggattca aaaatgccct ttcctatttg 480

cgtctgccgt ccatttcata tgtaaaagga tttcatatgc gcttgattcc gaagcgtttg 540

tttgtcatca acatgctgat cacatcgatt tatacgattg gtgtgctttc ggctttatac 600

gcaggccttt tggcgccgga gcgcagcacg acagccgtca tggcttcggg tttgatcaac 660

ggaattgcaa cgatgctgct ggctattttt gttgatccta aggtatccgt tcttgctgat 720

gatgtggcaa aaggaaaacg aagctatatc tatttaaaat ggacctctgt cacaatggtc 780

acatcaaggg tggcgggcac actcctcgcc cagctcatgt ttattcccgg ggcctactat 840

atcgcgtggc tgacaaagtg gttttaataa gaaaggctgg gagcggataa caatttcaca 900

caggaaacag ctatgaccat gattacgaat tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag 960

ataccgttcg tatagcatac attatacgaa gttatcttga tatggctttt tatatgtgtt 1020

actctacata cagaaaggag gaactaaaca tggccaagtt gaccagtgcc gttccggtgc 1080

tcaccgcgcg cgacgtcgcc ggagcggtcg agttctggac cgaccggctc gggttctccc 1140

gggacttcgt ggaggacgac ttcgccggtg tggtccggga cgacgtgacc ctgttcatca 1200

gcgcggtcca ggaccaggtg gtgccggaca acaccctggc ctgggtgtgg gtgcgcggcc 1260

tggacgagct gtacgccgag tggtcggagg tcgtgtccac gaacttccgg gacgcctccg 1320

ggccggccat gaccgagatc ggcgagcagc cgtgggggcg ggagttcgcc ctgcgcgacc 1380

cggccggcaa ctgcgtgcac ttcgtggccg aggagcagga ctgaataact tcgtatagca 1440

tacattatac gaacggtaaa tcgtcgactg ataggtggta tgttttcgct tgaactttta 1500

aatacagcca ttgaacatac ggttgattta ataactgaca aacatcaccc tcttgctaaa 1560

gcggccaagg acgccgccgc cggggctgtt tgcgttcttg ccgtgatttc gtgtaccatt 1620

ggtttactta tttttttgcc aaggctgtaa tggctgaaaa ttcttacatt tattttacat 1680

ttttagaaat gggcgtgaaa aaaagcgcgc gattatgtaa aatataaagt gatagcggta 1740

ccattatagg taagagagga atgtacacat gcaaaatcat gtcatttctt tagcatcagc 1800

agcggaaaga cgcgctcata ttgccgatac atttggcaga catggaatcc cgtttcaatt 1860

tttcgatgcg cttatgccgt cagaacgctt agaacaggca atggcggaat tagttccggg 1920

cctgtcagct catccgtatc ttagcggagt ggaaaaagca tgctttatga gccatgcggt 1980

cttatggaaa caagctcttg atgaaggcct gccgtacatc acagtttttg aagatgatgt 2040

gctgcttggc gaaggagccg aaaaatttct ggcagaagat gcgtggcttc aggaaagatt 2100

tgatccggat acagcattta tcgtgcgctt agaaacaatg tttatgcatg tcctgacatc 2160

accgagcggc gttgccgatt attgtggaag agcatttccg ttactggaat ctgaacattg 2220

gggcacagcg ggatacatca tctcaagaaa agctatgaga tttttcctgg atagatttgc 2280

tgcccttccg ccggaaggct tacatccggt tgatctgatg atgttttctg atttctttga 2340

tcgcgaagga atgccggtgt gccaactgaa tccggctctt tgtgcccagg aacttcatta 2400

cgccaaattt catgatcaaa acagcgcact gggatctctt atcgaacatg atagacttct 2460

gaaccgcaaa caacagagac gcgatagccc ggcgaacaca tttaaacata gattaattcg 2520

cgctctgaca aaaatctcta gagaacgcga aaaaagacgc caaagacgcg aacagtttat 2580

cgttccgttt cagtaatgat gaagcccgcc taatgagcgg gcttttttat cataaagatc 2640

cagccttttt gcgcttcctt atttatagtt ccttaatccg cggtcgtaca aaaaatttcc 2700

gaatgggacg aaagcggcga tgaagccggc agctgaccat ttcagcggcc atttgacaga 2760

gaaggttgca taagccaaga caagcaaata caaaatgaac aacccgccgt gaaccgaacc 2820

gacaattgtc accgcaagcg gaaggcctgc ccaatattta agcggcatag cgatgaacaa 2880

caggattaag agtgacattc cttcaataaa acccatcgtg cgaagtcttc cgatcggcgt 2940

gtgcagcata aatcgccctc cttgtggaca cgttttcatt ttatactata aacaatccgg 3000

gggggcatat gacagctttc aaaaaatgtt cggaaaacat tcatttttac atgccttttc 3060

tagggaactg tacttgtcat ttacaaaaat acccgagata atgtgtacaa aatcaaaaaa 3120

gaaggatgtt gaaatgaaac ttgaccagat tgatctgaat atcattgagg agctgaagaa 3180

ggacagccgt ttgtcgatga gggaattagg cagaaaaatt aagctgtcgc ctccatctgt 3240

aacagaacgg gtaagacagc ttgaatcgtt tggcatcatc aagcaataca cgctggaggt 3300

cgaccagaaa aaactggggc ttcccgtttc ctgcattgtg gaagcaaccg ttaaaaacgc 3360

ggattatgag cggttcaaaa gctatattca aacattgccg aatattgaat tttgctaccg 3420

gattgcgggt gcagcctgct atatgctgaa aatcaatgcc gaaagcctcg aagcggtaga 3480

agatttcatt aacaaaacat cgccctacgc gcaaaccgtc actcacgtca ttttctcaga 3540

aattgacacg aaaaacgggc gcggttagag agtgccgcgc gaagtctgtt ataataacag 3600

gatgagcgtg aaagaaagag aagtgat 3627

<210> 48

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 48

catccagcgt aaaacgttca cgggaataat ctagg 35

<210> 49

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 49

ttatccgctc tggcgcggac ttgtttgttt atatccattc taaatgaagg 50

<210> 50

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 50

gcccgcctaa tgagcgggct tttttttaag acgtggactc gttttcagcc tgaaatttt 59

<210> 51

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 51

catcccagca gctgatcagg atgaattct 29

<210> 52

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 52

acaagtccgc gccagagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatg 49

<210> 53

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 53

agaaatgaca tgattttgca tgtgtacatt cctctcttac ctataatggt accgct 56

<210> 54

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 54

ataggtaaga gaggaatgta cacatgcaaa atcatgtcat ttctttagca tcagcagcg 59

<210> 55

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 55

gcccgctcat taggcgggct tcatcattac tgaaacggaa cgataaactg ttcgcgt 57

<210> 56

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 56

gccaggaagc cacagcacat catagc 26

<210> 57

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 57

ttcgttcatt cgttcccgtt tacagaacaa atagc 35

<210> 58

<211> 4150

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 58

gccaggaagc cacagcacat catagccctg catgcgtttc attcttgtta caatgtcttg 60

cagcgttgtg tcccatgcgt ggccaaggtg aagtctccct gttacgtttg gcggcgggat 120

gacaacagag tatggctctt ttgtctggtc actgcccgct tcaaaaaatt tgccttttag 180

ccaaaaatca tatcggtctt tttcaaccgc tgccggatca tatttcgtcg gcattgtttg 240

ttcattcgtt tccatcataa ccctccagca tgtttaaaaa tggctgagaa cgaaaaaaga 300

gctcttcatc cctgtaaaag gacgaaaagc tctttcgcgg taccaccttt tttcatgaac 360

tcaatcagtt catgcactta taacggataa cgggtgtttc ccgaatttct ctactcttct 420

ttcaagaaat tatgctcccg ggcgaccttc caatcagaca acataagaag cctttcagca 480

aacggcttct ctctctgcat gcgccttttt tgtactcttc ccgttctaag caggtgtatt 540

tatcagctca ttgtatacat tatttatgtt ctttattata gtaaaagtgt ttttgattcg 600

tcaatcatct tttccaaaaa caccgctttc tatacagatg ggcaggcacc tattgcccaa 660

gtttacatat gatgcttgta aatgcgtaga ggaggatgca ccgtgaagaa acgtttcagc 720

tcttattcgc tgccgccatg ggtaaggcaa attcggcttg tatccgcaca agtgattatt 780

cccattacga tttttcaagg aatcagaacc attttctttc cgacaacctt tgatgttttg 840

ctgctcgcaa tcctaatctt tttagcttgc gcccttcatt tagaatggat ataaacaaac 900

aagtccgcgc cagagcggat aacaatttca cacaggaaac agctatgacc atgattacga 960

attcgagctc ggtacccggg gatcctctag agattgtacc gttcgtatag catacattat 1020

acgaagttat gccatagtga ctggcgatgc tgtcggaatg gacgacggca atagttaccc 1080

ttattatcaa gataagaaag aaaaggattt ttcgctacgc tcaaatcctt taaaaaaaca 1140

caaaagacca cattttttaa tgtggtcttt tattcttcaa ctaaagcacc cattagttca 1200

acaaacgaaa attggataaa gtgggatatt tttaaaatat atatttatgt tacagtaata 1260

ttgactttta aaaaaggatt gattctaatg aagaaagcag acaagtaagc ctcctaaatt 1320

cactttagat aaaaatttag gaggcatatc aaatgaactt taataaaatt gatttagaca 1380

attggaagag aaaagagata tttaatcatt atttgaacca acaaacgact tttagtataa 1440

ccacagaaat tgatattagt gttttatacc gaaacataaa acaagaagga tataaatttt 1500

accctgcatt tattttctta gtgacaaggg tgataaactc aaatacagct tttagaactg 1560

gttacaatag cgacggagag ttaggttatt gggataagtt agagccactt tatacaattt 1620

ttgatggtgt atctaaaaca ttctctggta tttggactcc tgtaaagaat gacttcaaag 1680

agttttatga tttatacctt tctgatgtag agaaatataa tggttcgggg aaattgtttc 1740

ccaaaacacc tatacctgaa aatgcttttt ctctttctat tattccatgg acttcattta 1800

ctgggtttaa cttaaatatc aataataata gtaattacct tctacccatt attacagcag 1860

gaaaattcat taataaaggt aattcaatat atttaccgct atctttacag gtacatcatt 1920

ctgtttgtga tggttatcat gcaggattgt ttatgaactc tattcaggaa ttgtcagata 1980

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accaataaat aacttcgtat agcatacatt atacgaacgg tatgataggt ggtatgtttt 2160

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<212> DNA

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<400> 59

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<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

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<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 61

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<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 62

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<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 63

gagggtacaa agatgtgaac tatacgcttg c 31

<210> 64

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 64

gaaattgtta tccgctcaag gccttaagcc ttataccttt tttaatttta agtccga 57

<210> 65

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 65

gcccgcctaa tgagcgggct tttttatacc tttttgatta atcattccat tgatacgtcc 60

a 61

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<212> DNA

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<400> 66

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<210> 67

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 67

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<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 68

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<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 69

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<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 70

gcccgctcat taggcgggct tcatcattaa tcttccagac gtttttcaag ctctgctt 58

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<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 71

gctgtttgcg ttcttgccgt gatttcgtgt a 31

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<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 72

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<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 73

gttcaacatg gtatgaaaca atcgaggaga ctgatcccaa ttccatttat gcctcaacag 60

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gacttctcta ttaatgtgat ttctaaatca ggtacgacaa ctgaacctgc aatcgctttc 2160

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tcgtcttcaa attcgagcgt tttgtcacgg agtccaagca tccgaaggtc attgatatcc 3540

atttctttgc aagcgttgat gagctcttgt tttcttagca gcggcaacgt ttcccgattc 3600

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acgggaatgt ctttttttct gtttaaggca atgaggcctg ccactccata tgattcatca 3720

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gagggtacaa agatgtgaac tatacgcttg c 31

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<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 75

gaaattgtta tccgctcaag gccttaagcc ttataccttt tttaatttta agtccga 57

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<212> DNA

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<400> 76

taaagcccgc ctaatgagcg ggctttttta cgagtatgtc atacgttcgt ctgtactgca 60

aaa 63

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<212> DNA

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<400> 77

ccattttaaa gatcgcagct gcggc 25

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<212> DNA

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agcagtttca tgtgtaggag cggataacaa tttcacacag gaaacag 47

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<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 79

acctacgatt ccacacatgt gtacattcct ctcttaccta taatggtacc gc 52

<210> 80

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<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 80

agaggaatgt acacatgtgt ggaatcgtag gttatatcgg tcagct 46

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<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 81

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<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 82

tgtttcgttt gactcgtcgt tgtttgcttc ct 32

<210> 83

<211> 33

<212> DNA

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<400> 83

ctaggcgatg tagttgtcca tgtcttccac aag 33

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<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 84

tgtttcgttt gactcgtcgt tgtttgcttc ctgctttacc actgtatttt ctgtctctgt 60

tggtacagct tgcttcaccg gctctttatt tttccctgtg gccagaaaga tcataatcgc 120

tgtgaaaaca gccgcagaag ccgctaaaat aattgctttc ttatgctgat tcaaccaatt 180

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cgaacaggga atccatgtgt tcaaagaaaa aggacgcatt gcagatcttc gtgaagttgt 2760

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accgctcttc attttccttt ctcaaagcgg agaaacagca gacagccgcg cggtactcgt 3660

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tgtatccaga aatgctttct tcatcggacg cggccttgac tacttcgtat gtgtcgaagg 4020

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cacatgcatc atctcactga aaggcctaga cgatgcggat gacagattcg tattgccgga 4260

agtaaaccca gcgcttgctc cgttggtatc tgttgttcca ttgcagctga tcgcttacta 4320

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tcagctgtca cgcgatggag ctgaaagccg cagttcttaa gcatttcttc gtattcttcc 4620

accgggaacg ttctttgctc gtgtgtctca tcaaaacgat catacgcttc tccgttccac 4680

acaaaaaacg acatatcatg aatgacagaa agctcgtcac ttccggcaaa gctctgccaa 4740

atatagctga tatcttcgtc ctggtcagca aatgtgctat ccggaaagac ttccgcaatt 4800

ttaaaagatg aatgaacatc aaacagcagg atgccttcag gctttaatac ccgaaaaaca 4860

cttttaaagg tttcgatcac atcatttttt gtttttaaat aatttaatga gtcacagcat 4920

atcacaacag cgtcaaattg accgtcaaag ccggtaatct ctctcatatc ctgctgaaga 4980

aataaaatag gctggctact cgataccttt tgctgggcga aagaaagcat ctcttcgctg 5040

agatcgatgc ctgtaacctc gaagcctttt tcggcaagcc ggatggagat ttcccccgtg 5100

ccgcatgcca gatcgagaat acggcctttt tccgggagag atgcttcaat ccattttgtc 5160

cattgatcgt aaggcgcgtg tgacattagc tcgtcataca cgcttgcaaa gccttgataa 5220

atcattgatt cattccaaag tcaagatctg cgagcggagc gtctccccac agcttttcaa 5280

ggttgtagta gcttctttca tccttgtgga agacatggac aactacatcg cctag 5335

<210> 85

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 85

ggcaacggtt catctttttc tcagaacg 28

<210> 86

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 86

cctgtgtgaa attgttatcc gctcttattc cacgagataa agagtttgct ggct 54

<210> 87

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 87

gcccgcctaa tgagcgggct tttttatacc tttttgatta atcattccat tgatacgtcc 60

a 61

<210> 88

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 88

catgaaagcg atcataaaag aagatgtgca ag 32

<210> 89

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 89

ctttatctcg tggaataaga gcggataaca atttcacaca ggaaacag 48

<210> 90

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 90

caaagcgtac atgcgtcatg tgtacattcc tctcttacct ataatggtac cgc 53

<210> 91

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 91

aggtaagaga ggaatgtaca catgaaaaaa gtacgtaaag ccataattcc agca 54

<210> 92

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 92

gcccgctcat taggcgggct ttagatttct tctttgttta gtaaaccttc cataaatgga 60

acg 63

<210> 93

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 93

ttcttctatt atcggtgttc agcaggt 27

<210> 94

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 94

ggaggcgtac agagatgaag gttat 25

<210> 95

<211> 4509

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 95

tggcaacgga cctggaaatg gagggcctgg cggcggaggc ggaaaaagcg tgaatatgtt 60

cggcaccggt gatcctggac cgcttcgtct cttccaatca gcactttccg gccaaatcag 120

ctggatgctt ccattctcat tgatcggatt actgggcgca atcatcagct ggtaccgtga 180

tcgccgcgga catgctgcta aaatgaaaga aacgctattc tgggcggctt ggcttgttcc 240

cgtggctggt ttcttcagca tcgcaggatt cttccaccag tattatttga ttatgctggc 300

accgccgatt gccgcccttt ctggtatcgg atggtatacg atgcaccgct tatacaaaaa 360

taataaagac tggtccagct atcttctgcc ggcagccgtc ttgatcacag ccgtgtttca 420

ggtgtatatt ctgagcgctt atacaagcca aatcggcagt gtatggatgt atgtcctggg 480

gctcttagga ctgggcatca cccttgcact tctgatgctt aaacgcagcc atccgttcag 540

taagctgctg accatcatca gcttgtgcgt tctgcttctc acaccagttt actggtcagc 600

aacgccgctt ctatacggtg gcaacagcgt ccttcctgaa tccggcccgc agctcaaagg 660

ctcagcaaac ggcgggaaca tgttctcttc agaggtcgac agcgggctcc tgtcctatct 720

gagaaaacac aataccggcg aagagtattt atttgctact ttgacaaccg taacagctgc 780

gccatacatc atttacgaaa atgaatctgt tatggcaatg ggcgggttta acggcacgga 840

tcccattctg actgtgtcgg aactgaaaaa actgatcaaa gaaggcaaag tgaaatactt 900

ccttctgtca gaaaacaact caggcaacag cgaacttgtt tcctggatta agaaaaacgg 960

aaaagaaata acatctgacg agtacagcgg ttcctccagc agcacaaaca gcgtgcaggg 1020

aatgcgaaga ggacctggcg gagaaagcca gcaaactctt tatctcgtgg aataagagcg 1080

gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta cgaattcgag ctcggtaccc 1140

ggggatcctc tagagattgt accgttcgta tagcatacat tatacgaagt tatcgatttt 1200

cgttcgtgaa tacatgttat aataactata actaataacg taacgtgact ggcaagagat 1260

atttttaaaa caatgaatag gtttacactt actttagttt tatggaaatg aaagatcata 1320

tcatatataa tctagaataa aattaactaa aataattatt atctagataa aaaatttaga 1380

agccaatgaa atctataaat aaactaaatt aagtttattt aattaacaac tatggatata 1440

aaataggtac taatcaaaat agtgaggagg atatatttga atacatacga acaagttaat 1500

aaagtgaaaa aaatacttcg gaaacattta aaaaataacc ttattggtac ttacatgttt 1560

ggatcaggag ttgagagtgg actaaaacca aatagtgatc ttgacttttt agtcgtcgta 1620

tctgaaccat tgacagatca aagtaaagaa atacttatac aaaaaattag acctatttca 1680

aaaaaaatag gagataaaag caacttacga tatattgaat taacaattat tattcagcaa 1740

gaaatggtac cgtggaatca tcctcccaaa caagaattta tttatggaga atggttacaa 1800

gagctttatg aacaaggata cattcctcag aaggaattaa attcagattt aaccataatg 1860

ctttaccaag caaaacgaaa aaataaaaga atatacggaa attatgactt agaggaatta 1920

ctacctgata ttccattttc tgatgtgaga agagccatta tggattcgtc agaggaatta 1980

atagataatt atcaggatga tgaaaccaac tctatattaa ctttatgccg tatgatttta 2040

actatggaca cgggtaaaat cataccaaaa gatattgcgg gaaatgcagt ggctgaatct 2100

tctccattag aacataggga gagaattttg ttagcagttc gtagttatct tggagagaat 2160

attgaatgga ctaatgaaaa tgtaaattta actataaact atttaaataa cagattaaaa 2220

aaattataaa taacttcgta tagcatacat tatacgaacg gtagaatcgt cgactgatag 2280

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ttcttgccgt gatttcgtgt accattggtt tacttatttt tttgccaagg ctgtaatggc 2460

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aaagtacgta aagccataat tccagcagca ggcttaggaa cacgttttct tccggctacg 2640

aaagcaatgc cgaaagaaat gcttcctatc gttgataaac ctaccattca atacataatt 2700

gaagaagctg ttgaagccgg tattgaagat attattatcg taacaggaaa aagcaagcgt 2760

gcgattgagg atcattttga ttactctcct gagcttgaaa gaaacctaga agaaaaagga 2820

aaaactgagc tgcttgaaaa agtgaaaaag gcttctaacc tggctgacat tcactatatc 2880

cgccaaaaag aacctaaagg tctcggacat gctgtctggt gcgcacgcaa ctttatcggc 2940

gatgagccgt ttgcggtact gcttggtgac gatattgttc aggctgaaac tccagggttg 3000

cgccaattaa tggatgaata tgaaaaaaca ctttcttcta ttatcggtgt tcagcaggtg 3060

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tatcaggtga aaaacttcgt tgaaaaaccg cctaaaggca cagcaccttc taatcttgcc 3180

atcttaggcc gttacgtatt cacgcctgag atcttcatgt atttagaaga gcagcaggtt 3240

ggcgccggcg gagaaattca gctcacagac gccattcaaa agctgaatga aattcaaaga 3300

gtgtttgctt acgattttga aggcaagcgt tatgatgttg gtgaaaagct cggctttatc 3360

acaacaactc ttgaatttgc gatgcaggat aaagagcttc gcgatcagct cgttccattt 3420

atggaaggtt tactaaacaa agaagaaatc taaagcccgc ctaatgagcg ggcttttttt 3480

taagcttctt cttttacatg tacctttaac acagcctgca cttcaggatg cagcttcaca 3540

ggcacgtttg tatatcctaa tgcacgaatg ccgtccggca gttcaagctt ccgcttatct 3600

actttaatgt tatggtcttt ttggagctgt tcagtgattt gcttgcttgt cactgaacca 3660

aataaacggc cgccctcacc tgattttgcg ctaagctcaa cagtcagttt ttctaatgtc 3720

tctttcaagc tcttagcctg ctcaagctca gcaatggctt cttttttctc tttctgcttt 3780

tgtccgttta acgcgctgat gtttgacgcg ttcgcttcaa ccgcgaggcc ttttttaatt 3840

agaaagttat gcgcataacc gtctgctacg tttttgactt cgcctttttt tccttttcct 3900

tttacatctt gtaagaaaat aaccttcatc tctgtacgcc tccctcaaaa tactcatcta 3960

tggcgtgctt cagccgttcc agcgcttcag aaactgaaat gccggacaac tgagtcgccg 4020

catttgttaa atgccctccg ccttccaggg cctccatgat gatctgaaca tttacctcgc 4080

caagcgaccg agcactgata caaaccgttt gttcatcccg tctcgccacc gcaaatgaag 4140

cctcaacctc actcatcgat agcagcgaat cggcagcctg cgcaatcagc acttgatcga 4200

agtattcctc ttcattttca ggaagagaag caatcgcaat gttatcttta tagaggaccg 4260

tatgctggat cagcttcgcc cgtttaatat aggaatcaac ggtttctttc agaaacttct 4320

gcaccagcac cgtgtcggcg ccttttgccc ttaaataaga agccgcatcg aaagtccgcg 4380

agcccgtgcg gagagaaaag ctctttgtat ccactattat accagctaat agggctgttg 4440

cttcaatcat attgattttt aagcgcttcg gctgatattc aagcagctct gtcaccaatt 4500

ccgctgtgg 4509

<210> 96

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 96

gtgaagcggc gtattattaa aggaaaggct gta 33

<210> 97

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 97

tgtgtgaaat tgttatccgc tctcacactt ccactgtcca gttaaacggg c 51

<210> 98

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 98

agcccgccta atgagcgggc ttttttaaat cgaaaaagaa cctgcccgga ggca 54

<210> 99

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 99

ccggatttac ggtcgcttgg ctgtatt 27

<210> 100

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 100

cagtggaagt gtgagagcgg ataacaattt cacacaggaa acag 44

<210> 101

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 101

gccagtaaca agtattgcca tgtgtacatt cctctcttac ctataatggt accgc 55

<210> 102

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 102

aagagaggaa tgtacacatg gcaatacttg ttactggcgg t 41

<210> 103

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 103

cccgctcatt aggcgggctt tattccgcac tcttataccc attcacatta gaaga 55

<210> 104

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 104

aaagcccgac ccgtcttcct 20

<210> 105

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 105

ttggatgtgg agtgccgtct t 21

<210> 106

<211> 4666

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 106

aaagcccgac ccgtcttcct tggggtttgg acaatatttt acagattata tgtttgtgat 60

ggactacgaa gaggggattg gatggcatca tccgagaatt gcgccgtacg caccgcttac 120

gcttgatccg tcttcatctg tttttcatta cggccaggct gtttttgaag gattaaaagc 180

atacagaaca gacgacggca gggtgctgct gttccgtccg gatcaaaata tcaaacggct 240

gaacagatcg tgtgagcgca tgagcatgcc ccctttagac gaagagctgg tgcttgaggc 300

attgacgcaa ttagttgagc tggagaaaga ttgggttcca aaggaaaaag gaacgtcact 360

gtatattcgt ccttttgtca ttgccacaga accgagtctc ggtgtgaagg catccaggag 420

ctatacattt atgatcgtgc tttcgcctgt cggctcctat tatggcgacg atcagctgaa 480

gccggttaga atctatgtcg aagatgagta tgtgagggcg gtcaacggag gagtcgggtt 540

tgcaaaaacg gctggaaact atgccgccag tcttcaggca cagcggaaag cgaatgaact 600

gggctatgac caggtactgt ggctggacgc catcgaaaag aaatatgtgg aagaagtagg 660

gagcatgaac atctttttcg tcataaacgg ggaagctgtc acacctgctt taagcggaag 720

cattttaagc ggggttacac gtgcgtctgc gattgaattg attcgaagct ggggcattcc 780

ggttcgtgaa gagagaatat cgattgatga ggtgtatgcg gcctctgcac gcggagaatt 840

gacagaggtc tttggcacag gcacggcagc agtcgttacg cctgtcggtg aactcaacat 900

ccatggaaaa acggtgattg taggcgacgg gcaaatcggg gacctctcga aaaagctgta 960

tgaaacgata acagatattc agcttggcaa ggtaaaaggc ccgtttaact ggacagtgga 1020

agtgtgagag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacgaattcg 1080

agctcggtac ccggggatcc tctagagatt gtaccgttcg tatagcatac attatacgaa 1140

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gaccacattt tttaatgtgg tcttttattc ttcaactaaa gcacccatta gttcaacaaa 1320

cgaaaattgg ataaagtggg atatttttaa aatatatatt tatgttacag taatattgac 1380

ttttaaaaaa ggattgattc taatgaagaa agcagacaag taagcctcct aaattcactt 1440

tagataaaaa tttaggaggc atatcaaatg aactttaata aaattgattt agacaattgg 1500

aagagaaaag agatatttaa tcattatttg aaccaacaaa cgacttttag tataaccaca 1560

gaaattgata ttagtgtttt ataccgaaac ataaaacaag aaggatataa attttaccct 1620

gcatttattt tcttagtgac aagggtgata aactcaaata cagcttttag aactggttac 1680

aatagcgacg gagagttagg ttattgggat aagttagagc cactttatac aatttttgat 1740

ggtgtatcta aaacattctc tggtatttgg actcctgtaa agaatgactt caaagagttt 1800

tatgatttat acctttctga tgtagagaaa tataatggtt cggggaaatt gtttcccaaa 1860

acacctatac ctgaaaatgc tttttctctt tctattattc catggacttc atttactggg 1920

tttaacttaa atatcaataa taatagtaat taccttctac ccattattac agcaggaaaa 1980

ttcattaata aaggtaattc aatatattta ccgctatctt tacaggtaca tcattctgtt 2040

tgtgatggtt atcatgcagg attgtttatg aactctattc aggaattgtc agataggcct 2100

aatgactggc ttttataata tgagataatg ccgactgtac tttttacagt cggttttcta 2160

acgatacatt aataggtacg aaaaagcaac tttttttgcg cttaaaacca gtcataccaa 2220

taaataactt cgtatagcat acattatacg aacggtatga taggtggtat gttttcgctt 2280

gaacttttaa atacagccat tgaacatacg gttgatttaa taactgacaa acatcaccct 2340

cttgctaaag cggccaagga cgccgccgcc ggggctgttt gcgttcttgc cgtgatttcg 2400

tgtaccattg gtttacttat ttttttgcca aggctgtaat ggctgaaaat tcttacattt 2460

attttacatt tttagaaatg ggcgtgaaaa aaagcgcgcg attatgtaaa atataaagtg 2520

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tgccggttac attggcagcc acacatgtgt tgaactattg aacagcggct acgagattgt 2640

tgttcttgat aatctgtcca acagttcagc tgaagcgctg aaccgtgtca aggagattac 2700

aggaaaagat ttaacgttct acgaagcgga tttattggac cgggaagcgg tagattccgt 2760

ttttgctgaa aatgaaatcg aagctgtgat tcattttgca gggttaaaag cagtcggcga 2820

atctgtggcg attcccctca aatattatca taacaatttg acaggaacgt ttattttatg 2880

cgaggccatg gagaaatacg gcgtcaagaa aatcgtattc agttcatctg cgacagtata 2940

cggcgttccg gaaacatcgc cgattacgga agactttcca ttaggcgcga caaatcctta 3000

tgggcagacg aagctcatgc ttgaacaaat attgcgtgat ttgcatacag ccgacaatga 3060

gtggagcgtt gcgctgcttc gttactttaa cccgttcggc gcgcatccaa gcggacggat 3120

cggtgaagac ccgaacggaa tcccaaataa ccttatgccg tatgtggcac aggtagcagt 3180

cgggaagctc gagcaattaa gcgtattcgg aaatgactat ccgacaaaag acgggacagg 3240

cgtacgcgat tatattcacg tcgttgatct cgcagaaggc cacgtcaagg cgctggaaaa 3300

agtattgaac tctacaggag ccgatgcata caaccttgga acaggcacag gctacagcgt 3360

gctggaaatg gtcaaagcct ttgaaaaagt gtcagggaaa gaggttccat accgttttgc 3420

ggaccgccgt ccgggagaca tcgccacatg ctttgcagat cctgcgaaag ccaagcgaga 3480

actaggctgg gaagcgaaac gcggccttga ggaaatgtgt gctgattcct ggagatggca 3540

gtcttctaat gtgaatgggt ataagagtgc ggaataaagc ccgcctaatg agcgggcttt 3600

tttaaatcga aaaagaacct gcccggaggc aggttctttt tattttgaat gagtcatatc 3660

agcagccggc tggcttttgc ggttttttac ataatatatt gcatagcaaa tggccataaa 3720

tggaacgccg caatagagtg cgattctttg attcggatca aaggcaatgc caacgacgga 3780

agccaggcat aacaggaacg cagcaatcgg cacgaacgga tacaaagggg ttctgtattt 3840

caaatcagta accttgtttc ccgcttcgat ataacgtttt ctgaacatga attgagaagc 3900

agcgattccc atccacacga caacgacggc aaaaccggaa atcgacacga gcacaacgta 3960

tacagtgtct ggcgcaaata cgctggacag caacgacaga atgccgccga tcatgctgaa 4020

caccagcgcg ttaaaagggg ttccttttga cgtcagcttt gcaaatgtcg gatgaagcgt 4080

tttttctttt gataaagacc acagcatccg ggaagaagcg tagagtccgg aattagccgc 4140

tgacaggatc gctgtcagga taacaaagtt catgatatcg gctgcgtatg gtacaccgac 4200

tctgtcaaag acagcgacaa acgggctttt gatgacacct gcatcttgaa tcggaatcag 4260

ccctgacagc acaaaaattg ttccgacaaa gaagagcgag agacgccaga ccgttgtttt 4320

tatcgctttt ggtatcgtct tgtcaggatc aacgctttca ccggctgcga ttccgattag 4380

ttccgttccc gaaaaggcaa aattgacgga cagcatcgtc atcaaaatcg ggacaaatcc 4440

attgggaaaa agcccgcctt ccgccgtgaa gttggacagc atcggagcgg cttctccgcc 4500

tttgatcggg atgatgccga acatggcaga gccgcctaaa agaataaata atacaatggc 4560

taatactttg atgctggaaa accaaaattc tgattcagcg aaaaacttga ccgaaaatgc 4620

gttaagcaag aagatgaaca gcgcaaagac ggcactccac atccaa 4666

<210> 107

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 107

caaattcctt atgtcctgac cttgcatggc 30

<210> 108

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 108

tgtgtgaaat tgttatccgc tcagcgctca accctctcct gtaaaat 47

<210> 109

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 109

accctggcgt tacggaaccc tctgacaagt attttccgg 39

<210> 110

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 110

gccattctct ttaaaacagg cggcaataca a 31

<210> 111

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 111

cagtggaagt gtgagagcgg ataacaattt cacacaggaa acag 44

<210> 112

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 112

gccagtaaca agtattgcca tgtgtacatt cctctcttac ctataatggt accgc 55

<210> 113

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 113

ccgtaggttc tgcgtcagtt gtt 23

<210> 114

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 114

gatgtcggat aatgctgctt gtactc 26

<210> 115

<211> 2238

<212> DNA

<213> 人工序列(未知)

<400> 115

ccgtaggttc tgcgtcagtt gttttagcag tcagccacaa gcttcaggaa gaagccaaaa 60

agctttcggg ctttgacagc tcggttttgc caatcggcat acagctcagc cgttttcagg 120

ggaatgagga gacgaaagag gaaatcagaa aaagactcgg actcccgctc gatcagcgtc 180

tggctgtcta tgtcggccgg ctggtcagag agaaaggcat ttttgaactg tctgaagcga 240

tcgaatcgct gcaggactct cctaaggcag tctttgtcgg ggatggtccc gcaaaatcga 300

cgctgacgca gaaggggcat atcgtcacag gccaagtccc gaatcatcag gtaagagact 360

atttacttgc ggcagatcta ttcgtacttc cttcttacag tgaggggatg ccgactgttg 420

tgattgaggc gctggcgcta agggttcctg ttatttgtac ggatgttggc ggagtgtcgt 480

ctttattcgg aaagcaccaa catctgctga ttaaaccgaa atccgctcaa gccttggcgg 540

aagcgatcac tcggtacgaa catgagcaaa tatggaagcc ggaagtagca gatgacttgt 600

atgaaaccgt gcaggctcaa tttgacgcag gaaaaaacgc caaggccttg catcatcagt 660

atcagacggt cacgaaaacg tccgtttaat cgtaagacac tgcgaccatt ataaattgga 720

agatcatttt acaggagagg gttgagcgct gagcggataa caatttcaca caggaaacag 780

ctatgaccat gattacgaat tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag ataccgttcg 840

tatagcatac attatacgaa gttatcttga tatggctttt tatatgtgtt actctacata 900

cagaaaggag gaactaaaca tggccaagtt gaccagtgcc gttccggtgc tcaccgcgcg 960

cgacgtcgcc ggagcggtcg agttctggac cgaccggctc gggttctccc gggacttcgt 1020

ggaggacgac ttcgccggtg tggtccggga cgacgtgacc ctgttcatca gcgcggtcca 1080

ggaccaggtg gtgccggaca acaccctggc ctgggtgtgg gtgcgcggcc tggacgagct 1140

gtacgccgag tggtcggagg tcgtgtccac gaacttccgg gacgcctccg ggccggccat 1200

gaccgagatc ggcgagcagc cgtgggggcg ggagttcgcc ctgcgcgacc cggccggcaa 1260

ctgcgtgcac ttcgtggccg aggagcagga ctgaataact tcgtatagca tacattatac 1320

gaacggtaaa tcgtcgacct gcaggcatgc aagcttggca ctggccgtcg ttttacaacg 1380

tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttacgga accctctgac aagtattttc cgggcttgcc 1440

gcttgaagaa ttggctaaag acttgggaag cgtcaattta taaaaagaaa aagtgttact 1500

tggttgaagc tgccggctgc taggctcggc cgccggctcc tgaaacatca ggaaaggggt 1560

taaacatgtg agtatcaaac gatcagcggt ccatacgcta gcgttactgg ccgctgctat 1620

atttggagtc gtcctattgc tgggagccat ccataaagat ataggtttca tgcagatggc 1680

tgctgtgctt gcggtgttgg caattggcct gtttttactg acgcttgcaa ccgcatttac 1740

aacaaaagaa cggctcttta tggctgtaat ctatattttg atcgcctgca cttttttaaa 1800

taatgcattt tttgccattc atcttggatt tttcagtttg ttcctttacc ggcttctgct 1860

cattgcagcg ggttgccttc atattttcgg catggttcgg aatcgaaccc atattgaaag 1920

atggcatggg ctgcaagtaa aagggatttt actctttttc gccttttggt ttatatatgg 1980

ccttgtttct ctgctgtggg ccaagtcggt aacagttggc ctcaagtatt tagccttatt 2040

ggcaatgggg atcttcttca tttatcttat tgtcatgtac gtgcaaaaaa tggagcggct 2100

gatgattgtt tatgccattt ggctggtgat gacggtattt ctgatgatca ttggttttta 2160

caatcatatc acccaccatc atcttgcgag ttccacattg tacagcggac cggagtacaa 2220

gcagcattat ccgacatc 2238

Claims (10)

1.一种基于平衡UDP-糖供给合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌是通过在宿主菌Bacillus subtilis 168 △amyE:P₄₃-lacY，P₄₃-lgtB，P_xylA-comK的基因组上整合两个β-1,4-半乳糖转移酶，并整合葡萄糖-6-磷酸异构酶基因、谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶基因、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因、UDP-葡萄糖-差向异构酶基因，且敲除UDP-葡萄糖6-脱氢酶基因，并外源表达β-1,3-N-葡糖氨基转移酶基因得到的。

2.根据权利要求1所述的基于平衡UDP-糖供给合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述宿主菌是以枯草芽孢杆菌168为基础，通过以启动子P_xylA调控基因comK的表达，乳糖透性酶编码基因整合到基因组amyE位点，β-1,4-半乳糖转移酶编码基因整合到基因组ydeS位点和ydzO位点中间得到的。

3.根据权利要求1所述的基于平衡UDP-糖供给合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，整合到基因组使用的是Cre/lox重组系统。

4.权利要求1所述的基于平衡UDP-糖供给合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)通过融合PCR构建包含ydaH，ydzA基因同源臂、β-1,4-半乳糖转移酶基因、P₄₃启动子、博来霉素抗性基因序列的重组片段1；包含yszA，ysxE基因同源臂、β-1,4-半乳糖转移酶基因、P₄₃启动子、氯霉素抗性基因序列的重组片段2；

(2)通过融合PCR构建P₄₃控制表达的葡萄糖-6-磷酸异构酶基因的重组片段3，P₄₃控制表达的谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶基因的重组片段4；

(3)通过融合PCR构建P₄₃控制表达的UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因的重组片段5，P₄₃控制表达的UDP-葡萄糖-差向异构酶基因的重组片段6，包含tuaD基因左同源臂片段，P7Z6片段，tuaD基因右同源臂片段的重组片段7；

(4)将步骤(1)构建的重组片段1转化宿主菌，通过验证获得重组枯草芽孢杆菌BY04；再将重组片段转化重组枯草芽孢杆菌BY04，得到重组枯草芽孢杆菌BY05；

(5)将步骤(2)构建的重组片段3转化重组枯草芽孢杆菌BY05，获得重组枯草芽孢杆菌mI1，再将重组片段4转化mI1，得到重组枯草芽孢杆菌mI2；将mI2菌进行抗性基因的消除，得到mI2.2菌；

(6)将步骤(3)构建的重组片段5转化mI2.2菌，得到重组枯草芽孢杆菌mI3，再将重组片段6转化步骤mI3菌，得到重组枯草芽孢杆菌mI4，再将重组片段7转化mI4菌，得到重组枯草芽孢杆菌mI5.0；

(7)将pP43NMK-lgtA转化重组枯草芽孢杆菌mI5.0，得到合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌mI5。

5.根据权利要求4所述的基于平衡UDP-糖供给合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，重组片段1的序列如SEQ ID NO.47所示，重组片段2的序列如SEQ ID NO.58所示。

6.根据权利要求4所述的基于平衡UDP-糖供给合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，重组片段3的序列如SEQ ID NO.73所示，重组片段4的序列如SEQ ID NO.84所示。

7.根据权利要求4所述的基于平衡UDP-糖供给合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，步骤(3)中，重组片段5的序列如SEQ ID NO.95所示，重组片段6的序列如SEQ ID NO.106所示，重组片段7的序列如SEQ ID NO.115所示。

8.根据权利要求4所述的基于平衡UDP-糖供给合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，步骤(5)中，通过同源重组，葡萄糖-6-磷酸异构酶基因插入在rsbRC位点和yojG位点之间，谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶基因插入在comER位点和yqeM位点之间。

9.根据权利要求4所述的基于平衡UDP-糖供给合成乳酰-N-新四糖的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，步骤(6)中，通过同源重组，UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因插入在yycA位点和yybT位点之间，UDP-葡萄糖-差向异构酶基因插入在ybgE位点和ybgF位点之间。

10.权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌在发酵生产乳酰-N-新四糖中的应用。