CN114657197B - Gsm1p作为正调控因子在提高宿主细胞中蛋白表达中的应用 - Google Patents

Gsm1p作为正调控因子在提高宿主细胞中蛋白表达中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及真核基因表达的转录调控因子的应用，特别是涉及一种组成型启动子Pgap的转录调控因子Gsm1p的应用。本发明公开了Gsm1p作为正调控因子在提高宿主细胞中蛋白表达中的应用，所述Gsm1p的氨基酸序列是由核苷酸序列为SEQ ID NO:1的Gsm1基因所编码的；所述应用为通过在启动子Pgap后插入Gsm1基因从而提高宿主细胞中蛋白的表达。本发明所述的应用能增强毕赤酵母组成型启动子Pgap启动子的转录，从而使其后的外源基因在毕赤酵母中高效表达，而且可以避免多拷贝或者多基因表达时，使用同一启动子产生的稀释效应，导致不同基因表达量差异过大。

Description

Gsm1p作为正调控因子在提高宿主细胞中蛋白表达中的应用
技术领域
本发明属于分子生物学和生物工程学领域，涉及真核基因表达的转录调控因子的应用，特别是涉及一种组成型启动子Pgap的转录调控因子Gsm1p的应用。
背景技术
启动子是调控基因表达的最重要元件之一，PAOX1启动子(诱导型)和Pgap启动子(组成型)是毕赤酵母外源蛋白表达中最具代表性的启动子。
甲醇诱导毕赤酵母表达系统是目前用于表达大多数异源蛋白常用的表达系统，然而并不是所有的外源蛋白均适合甲醇诱导表达而且甲醇在大规模生产时存在极大的安全隐患。相对甲醇诱导，组成型毕赤酵母表达系统表达异源蛋白时不使用甲醇诱导，但是大多数的组成型启动子强度相对较弱，无法获得较高的蛋白产量，致使其在应用上受限制。
针对甲醇诱导的弊端，近年来对毕赤酵母表达系统的优化改造成为了研究热点。在启动子的改造研究上，目前主要是通过各种方法构建新的启动子文库。其中，有不少研究通过在PAOX1上删除或插入顺式作用元件、对5'UTR或核心启动子区域进行点突变等来改造PAOX1从而导致PAOX1的激活，但是这些改造似乎不能很好地消除由高水平葡萄糖和甘油等替代碳源引起的抑制，且远达不到工业应用的水平。对于Pgap文库的构建，唯一的研究是Qin等通过易错PCR进行随机突变构建GAP启动子文库，但是方法随机，无法解释Pgap的调控。随着转录组数据分析的应用，启动子开发工作得到很大的提升。关于调控和提高PAOX1的表达强度相关研究已有很多报道，目前研究表明，甲醇可通过调控多个反式作用元件(主要集中于PAOX1启动子的转录调控因子或者碳源阻遏相关转录因子等)的活性或亚细胞定位，在转录水平调控PAOX1，从而影响甲醇代谢通路相关基因的表达。尽管如此，参与PAOX1调控的机制复杂，部分碳源的去阻遏，在蛋白表达上并未能超越传统的甲醇诱导。目前在启动子调控的研究上主要集中于PAOX1，而对于探索Pgap的转录调控的研究，目前只有Ozge Ata等，通过有针对性地删除或复制转录因子结合位点(TFBS)，构建启动子变异体的高表达rhGH菌株，而在公开文献中报道通过对Pgap启动子的转录调控的改进，来增强Pgap启动子表达目的蛋白产量的报道几乎是空白的。
根据文献报道，关于Gsm1p及Gsm1基因的研究较少，在酿酒酵母中它涉及调节OXPHOS蛋白表达的调控，基于表达模式和序列分析，推测其参与能量代谢的调节。通过比对，Gsm1在毕赤酵母上指向基因PAS_chr2-1_0732(序列号：NC_012964.1)，而目前尚未有报道提及其对Pgap的转录调控。
发明内容
本发明的主要目的是针对宿主细胞中异源蛋白表达存在的问题和不足，提供了一种调控宿主细胞中异源蛋白表达的转录因子Gsm1p，能增强毕赤酵母组成型启动子Pgap启动子的转录，从而使其后的外源基因在毕赤酵母中高效表达。
本发明的第一个方面，提供了Gsm1p作为正调控因子在提高宿主细胞中蛋白表达中的应用，所述Gsm1p的氨基酸序列是由核苷酸序列为SEQ ID NO:1的Gsm1基因所编码的；所述应用为通过在启动子Pgap后插入Gsm1基因从而提高宿主细胞中蛋白的表达。
根据本发明所述的应用，所述宿主细胞是选自：毕赤酵母、酿酒酵母、产甘油假丝酵母。
根据已有文献报道，毕赤酵母、酿酒酵母、产甘油假丝酵母等均可以接受以Pgap为启动子的酵母表达载体，用以表达异源蛋白，因此可作为本发明的宿主细胞。
本发明的第二个方面，提供了一种调控宿主细胞中异源蛋白表达的基因表达盒，以Pgap为启动子并插入Gsm1基因。
本发明的第三个方面，提供了一种载体，其含有本发明所述的基因表达盒。
本发明的第四个方面，提供了一种宿主细胞，其含有本发明所述的基因表达盒，或者含有本发明所述的载体。
本发明的第五个方面，提供了一种增强宿主细胞中蛋白表达的方法，包括：提供如本发明所述的宿主细胞，在合适所述异源蛋白表达的条件下培养所述宿主细胞，从培养基中分离所表达的蛋白。
本发明通过实验揭示了：在Gsm1基因在以Pgap为启动子的异源蛋白合成通路中起到转录激活作用，该序列翻译后形成转录因子Gsm1p参与Pgap启动子的正向调控，从而提高外源基因的表达效率，而且可以避免多拷贝或者多基因表达时，使用同一启动子产生的稀释效应，导致不同基因表达量差异过大。
本发明因此可以构建一种以Pgap为启动子并插入Gsm1基因的基因表达盒，Gsm1p转录激活因子能够增强毕赤酵母组成型启动子Pgap启动子的转录从而使基因表达盒中的外源基因在毕赤酵母(或其他可以接受以Pgap为启动子的酵母)中高效表达，可以显著提高外源基因的表达强度。
附图说明
图1是ppic3.5k-Pgap-Gsm1p质粒图谱。
图2是菌株(毕赤酵母)表达木聚糖酶xynB的增长率，图中对照组为未共表达菌株；克隆1和克隆2为Gsm1基因共表达菌株。
具体实施方式
以下将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。下列实施例所采用的分子克隆技术参见J.萨母布鲁克等编的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本文中，Gsm1p表示Gsm1基因表达的蛋白。
实施例1：转录调控因子Gsm1p表达盒的构建
1、Pgap启动子的扩增
本发明以毕赤酵母的Pgap序列作为参考，采用软件DNAMAN 8设计并合成两条寡核苷酸引物，通过PCR法扩增Pgap目的基因。
两条PCR引物如下：
1-F:ACTTACGAGCTCGAGATCTTTTTTGTAG(SEQ ID NO:3)
1-R:ACTTACGCGGATCCGCGATAGTTGTTCAATTG(SEQ ID NO:4)
下划线碱基分别为SacI、BamHI限制性内切酶酶切位点。
PCR反应体系如下表1。
表1：
组分 体积(μL)
2×Q5 Master Mix 12.5
Primer F(10μM) 1.25
Primer R(10μM) 1.25
模板DNA 1(100ng)
ddH2O 9ul
总体积 25ul
PCR程序设定见表2。
表2：
PCR扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，用DNA回收试剂盒进行胶回收，得到大约480bp的片段。
2、ppic3.5k-Pgap载体的构建
将ppic3.5K质粒与Pgap启动子PCR产物分别用限制性内切酶SacI、BamHI于37℃酶切20min，酶切条件如下表3。
表3：
组分 体积(μL)
10×Cutsmart缓冲液 1
Plasmid 1(约200ng)
EcoRI、BamHI 0.2
ddH2O 7.6
总体积 10
酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后分别回收两个目的片段，用T4DNA连接酶连接，连接体系如下表4。
表4：
组分 体积(μL)
10×T4连接酶缓冲液 1
T4 DNA连接酶 0.5
连接载体:插入片段 1:3-1:10(摩尔浓度比)
ddH2O 补至10
总体积 10
用连接酶16℃连接12h，连接产物转化DH5a感受态细胞扩增后用质粒抽提试剂盒抽提质粒，用BamHI和SacI双酶切后跑电泳结果显示有8.2kb和483bp两条带，表明连接成功，通过DNA测序，确定为Pgap基因。
3、转录调控因子Gsm1基因的扩增和测序
本发明以毕赤酵母的基因组作为参考，采用软件DNAMAN 8设计并合成4条寡核苷酸引物，通过PCR法扩增转录调控因子Gsm1基因。
2-F：ACTTACCGGAATTCCGGATGGTAGACAAAGCTACTAC(SEQ ID NO:5)
2-R:ACTTATTTGCGGCCGCTTTATCATGTCAAGATGGGGAG(SEQ ID NO:6)
下划线碱基分别为EcoR I、Not I限制性内切酶酶切位点。
PCR反应体系与PCR程序设定如上述。
PCR扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，用DNA回收试剂盒进行胶回收，得到大约1.4kb的片段。
4、ppic3.5k-Pgap-Gsm1p表达盒的连接
将ppic3.5K-Pgap质粒(序列为SEQ ID NO:2)与转录调控因子Gsm1基因PCR产物分别用限制性内切酶EcoR I、NotI I内切酶双酶切并纯化回收获得。
ppic3.5K-Pgap质粒与转录调控因子Gsm1基因连接方法同步骤2所示，用BamHI和SacI双酶切后跑电泳结果显示有8.7kb和1.4kb两条带，表明连接成功，通过DNA测序，确定为转录调控因子Gsm1基因(序列为SEQ ID NO:1)。
由此，转录调控因子Gsm1p表达盒构建成功(如图1所示)。
实施例2：Gsm1基因整合毕赤酵母基因组
为了提高单考贝表达盒在毕赤酵母染色体上的整合效率，用限制性内切酶Sal I将表达盒线性化并用试剂盒纯化回收。本实验的受体菌为毕赤酵母SMD1168(已含在Pgap之后插入木聚糖酶xynB基因的重组菌，EX6)，电转化后使用含0.3mg/mL的G418平板进行筛选，并提基因组PCR鉴定。
通过PCR产物测序结果显示筛选到的菌株为共表达Gsm1p的阳性克隆。
实施例3：Gsm1p增强组成型启动子Pgap所驱动的异源蛋白表达测定
将实施例1筛选到的阳性克隆1和实施例2筛选到的阳性克隆2进行发酵，发酵条件为28℃，200rpm，培养72h。同时以含有xynB基因的毕赤酵母(EX6)作为对照，培养72h后取上清进行SDS-PAGE电泳检测，分析木聚糖酶xynB表达水平。
结果如图2所示，过表达Gsm1p转录因子后，所挑取的阳性克隆1相比于对照组的表达量提高了159％，阳性克隆2相比于对照组的表达量提高了192％。
SEQUENCE LISTING
<110> 暨南大学
<120> Gsm1p作为正调控因子在提高宿主细胞中蛋白表达中的应用
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1446
<212> DNA
<213> 毕赤酵母
<400> 1
atggtagaca aagctactac agagagaaaa ctgaaggctc cattatctgg tcgcaaaaga 60
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cctgccgtat acacaaaatc tcccttgaat tttgaaggtt cctacgctat gaccccaatt 540
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aatgacactt ttggaccaac cttacatgga gaagagcctt cttgtgatag ctccactaac 660
cagtacttta taggtccctc attttcgtca gatggcaggg ctcagactct gacatttcca 720
tacgttgtta gtcagattga aagaaccaaa cgctacaatc ctaaagaatt tcgtcgaaga 780
aacaaaaaat cagccatttc gttcagtgtc ggtctaatga cagacgaatc ctcagacaaa 840
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<210> 2
<211> 8759
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
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tcctttggac aactctttct gccaaatcta ggtccaaaat cacttcattg ataccattat 3780
tgtacaactt gagcaagttg tcgatcagct cctcaaattg gtcctctgta acggatgact 3840
caacttgcac attaacttga agctcagtcg attgagtgaa cttgatcagg ttgtgcagct 3900
ggtcagcagc atagggaaac acggcttttc ctaccaaact caaggaatta tcaaactctg 3960
caacacttgc gtatgcaggt agcaagggaa atgtcatact tgaagtcgga cagtgagtgt 4020
agtcttgaga aattctgaag ccgtattttt attatcagtg agtcagtcat caggagatcc 4080
tctacgccgg acgcatcgtg gccgacctgc aggggggggg ggggcgctga ggtctgcctc 4140
gtgaagaagg tgttgctgac tcataccagg cctgaatcgc cccatcatcc agccagaaag 4200
tgagggagcc acggttgatg agagctttgt tgtaggtgga ccagttggtg attttgaact 4260
tttgctttgc cacggaacgg tctgcgttgt cgggaagatg cgtgatctga tccttcaact 4320
cagcaaaagt tcgatttatt caacaaagcc gccgtcccgt caagtcagcg taatgctctg 4380
ccagtgttac aaccaattaa ccaattctga ttagaaaaac tcatcgagca tcaaatgaaa 4440
ctgcaattta ttcatatcag gattatcaat accatatttt tgaaaaagcc gtttctgtaa 4500
tgaaggagaa aactcaccga ggcagttcca taggatggca agatcctggt atcggtctgc 4560
gattccgact cgtccaacat caatacaacc tattaatttc ccctcgtcaa aaataaggtt 4620
atcaagtgag aaatcaccat gagtgacgac tgaatccggt gagaatggca aaagcttatg 4680
catttctttc cagacttgtt caacaggcca gccattacgc tcgtcatcaa aatcactcgc 4740
atcaaccaaa ccgttattca ttcgtgattg cgcctgagcg agacgaaata cgcgatcgct 4800
gttaaaagga caattacaaa caggaatcga atgcaaccgg cgcaggaaca ctgccagcgc 4860
atcaacaata ttttcacctg aatcaggata ttcttctaat acctggaatg ctgttttccc 4920
ggggatcgca gtggtgagta accatgcatc atcaggagta cggataaaat gcttgatggt 4980
cggaagaggc ataaattccg tcagccagtt tagtctgacc atctcatctg taacatcatt 5040
ggcaacgcta cctttgccat gtttcagaaa caactctggc gcatcgggct tcccatacaa 5100
tcgatagatt gtcgcacctg attgcccgac attatcgcga gcccatttat acccatataa 5160
atcagcatcc atgttggaat ttaatcgcgg cctcgagcaa gacgtttccc gttgaatatg 5220
gctcataaca ccccttgtat tactgtttat gtaagcagac agttttattg ttcatgatga 5280
tatattttta tcttgtgcaa tgtaacatca gagattttga gacacaacgt ggctttcccc 5340
cccccccctg caggtcggca tcaccggcgc cacaggtgcg gttgctggcg cctatatcgc 5400
cgacatcacc gatggggaag atcgggctcg ccacttcggg ctcatgagcg cttgtttcgg 5460
cgtgggtatg gtggcaggcc ccgtggccgg gggactgttg ggcgccatct ccttgcatgc 5520
accattcctt gcggcggcgg tgctcaacgg cctcaaccta ctactgggct gcttcctaat 5580
gcaggagtcg cataagggag agcgtcgagt atctatgatt ggaagtatgg gaatggtgat 5640
acccgcattc ttcagtgtct tgaggtctcc tatcagatta tgcccaacta aagcaaccgg 5700
aggaggagat ttcatggtaa atttctctga cttttggtca tcagtagact cgaactgtga 5760
gactatctcg gttatgacag cagaaatgtc cttcttggag acagtaaatg aagtcccacc 5820
aataaagaaa tccttgttat caggaacaaa cttcttgttt cgaacttttt cggtgccttg 5880
aactataaaa tgtagagtgg atatgtcggg taggaatgga gcgggcaaat gcttaccttc 5940
tggaccttca agaggtatgt agggtttgta gatactgatg ccaacttcag tgacaacgtt 6000
gctatttcgt tcaaaccatt ccgaatccag agaaatcaaa gttgtttgtc tactattgat 6060
ccaagccagt gcggtcttga aactgacaat agtgtgctcg tgttttgagg tcatctttgt 6120
atgaataaat ctagtctttg atctaaataa tcttgacgag ccaaggcgat aaatacccaa 6180
atctaaaact cttttaaaac gttaaaagga caagtatgtc tgcctgtatt aaaccccaaa 6240
tcagctcgta gtctgatcct catcaacttg aggggcacta tcttgtttta gagaaatttg 6300
cggagatgcg atatcgagaa aaaggtacgc tgattttaaa cgtgaaattt atctcaagat 6360
ctctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag 6420
acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca 6480
gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga tagcggagtg 6540
tatactggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt 6600
gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct tccgcttcct 6660
cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 6720
aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 6780
aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 6840
tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 6900
caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 6960
cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 7020
ctcaatgctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 7080
gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 7140
agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 7200
gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 7260
acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 7320
gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 7380
gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 7440
cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 7500
caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 7560
gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 7620
cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 7680
cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 7740
caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 7800
gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 7860
gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctgcaggc atcgtggtgt 7920
cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 7980
catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 8040
gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 8100
ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 8160
gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaacacgg gataataccg 8220
cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 8280
tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 8340
gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 8400
atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 8460
ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 8520
gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 8580
acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc 8640
cctttcgtct tcaagaatta attctcatgt ttgacagctt atcatcgata agctgactca 8700
tgttggtatt gtgaaataga cgcagatcgg gaacactgaa aaataacagt tattattcg 8759
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
acttacgagc tcgagatctt ttttgtag 28
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
acttacgcgg atccgcgata gttgttcaat tg 32
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
acttaccgga attccggatg gtagacaaag ctactac 37
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
acttatttgc ggccgcttta tcatgtcaag atggggag 38

Claims (2)

1. 通过过表达Gsm1p在提高宿主细胞中异源蛋白表达中的应用，其特征在于，所述Gsm1p的氨基酸序列是由核苷酸序列为SEQ ID NO: 1的Gsm1基因所编码的；所述应用为通过使宿主细胞过表达Gsm1p从而增强以Pgap为启动子的异源蛋白表达；所述宿主细胞是毕赤酵母。
2.一种增强宿主细胞中异源蛋白表达的方法，其特征在于，包括：使宿主细胞过表达Gsm1p从而增强以Pgap为启动子的异源蛋白表达；在适合所述异源蛋白表达的条件下培养所述宿主细胞，从培养基中分离所表达的蛋白；所述Gsm1p的氨基酸序列是由核苷酸序列为SEQ ID NO: 1的Gsm1基因所编码的；所述宿主细胞是毕赤酵母。
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