CN105734061A - 从毕赤酵母中分离的鼠李糖诱导型启动子及其应用 - Google Patents

从毕赤酵母中分离的鼠李糖诱导型启动子及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105734061A
CN105734061A CN201610179949.1A CN201610179949A CN105734061A CN 105734061 A CN105734061 A CN 105734061A CN 201610179949 A CN201610179949 A CN 201610179949A CN 105734061 A CN105734061 A CN 105734061A
Authority
CN
China
Prior art keywords
expression
rhamnose
gene
polynucleotide
promoter
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610179949.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105734061B (zh
Inventor
刘波
张伟
张宇宏
徐欣欣
张宇微
张雪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biotechnology Research Institute of CAAS
Original Assignee
Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biotechnology Research Institute of CAAS filed Critical Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority to CN201610179949.1A priority Critical patent/CN105734061B/zh
Publication of CN105734061A publication Critical patent/CN105734061A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105734061B publication Critical patent/CN105734061B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/102—Plasmid DNA for yeast

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了鼠李糖诱导型启动子及其应用。本发明首先公开了从毕赤酵母中分离的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示的鼠李糖诱导型启动子，验证了所述鼠李糖诱导型启动子启动外源基因表达的强度，并确证了能有效调控目的基因表达的最短启动子。本发明还公开了含有所述鼠李糖诱导型启动子的重组真核表达载体及宿主细胞。本发明进一步提供了一种调控目的异源性基因在毕赤酵母中进行适时表达的方法，包括：用所述的鼠李糖诱导型启动子和待表达的目的异源性基因构建真核表达载体；将构建的真核表达载体转化到酵母中得到重组酵母；通过控制培养基中诱导物鼠李糖的添加量和添加时间来调控目的蛋白适时的表达，实现外源蛋白表达的精确控制。

Description

从毕赤酵母中分离的鼠李糖诱导型启动子及其应用
技术领域
本发明涉及启动子，尤其涉及一种从毕赤酵母(Pichiapastoris)中分离鉴定的鼠李糖诱导型启动子，本发明还涉及含有该鼠李糖诱导型启动子的重组真核表达载体及重组宿主细胞，本发明进一步涉及该诱导型启动子在调控外源基因在真核细胞中进行适时表达等方面的应用，属于鼠李糖诱导型启动子的分离及应用领域。
背景技术
真核生物巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统以高密度发酵、发酵工艺成熟、发酵成本低、产物易分离等优点而广泛用于外源蛋白的表达(Damasceno等人，2012，AppliedMicrobiologyandBiotechnology，93:31-39)。基于甲醇氧化酶1基因启动子开发的pPIC9系列载体得以最广泛使用(Nie等人，2013，ProteinExpressionandPurification92：88-93；Hao等人，2013，ProteinExpressionandPurification，90：178-185)，然而应用这类载体生产重组蛋白时存在较多弊端：实验室小规模发酵时，涉及到菌体扩增培养基置换为诱导培养基的繁琐过程；大规模发酵时，涉及大量甲醇存放、使用等，存在较大的安全风险；甲醇作为有毒物质，难以应用于医药级和食品级的基因工程产品的生产。另外，基于组成型强启动子—三磷酸甘油醛脱氢酶启动子的表达载体也得以广泛应用，但这类表达系统也存在诸多弊端：目的蛋白在整个发酵期间持续表达，难以实现外源蛋白表达时序性精确控制；目的蛋白对宿主细胞生长有毒害时，无法实现目的蛋白的高效表达。因此，开发基于无毒诱导物的强启动子的表达载体是克服以上两种表达载体弊端的有效途径。
鼠李糖代谢基因的转录受到严格调控，相关基因的启动子为目前报道的最为严谨的分解代谢基因的启动子，基于此类启动子的表达系统和改良工作也不断涌现。应用基于E.coli鼠李糖诱导型启动子的表达载体实现了重组蛋白N-氨甲酰氨基酸水解酶高水平表达(3.85g/L)(Wilms等人，2001，BiotechnologyandBioengineering，73:95-103)。Wagner构建的由鼠李糖诱导型启动子调控T7RNAP抑制蛋白T7Lys表达的载体，只需简单地改变鼠李糖浓度来调节T7Lys表达量进而调控T7RNAP活性，实现了多个难以表达的膜蛋白在大肠杆菌中成功表达(Wagner等人，2008，PNAS，105：14371-14376)。2012年，Lucigen公司则开发了基于E.coli为宿主和E.coli鼠李糖诱导型启动子的ExpressoRhamnose表达系统，表达强度稍弱于常用的T7表达系统；但对于易于集聚的蛋白来说，这种适量低表达的系统有良好的应用效果。构建基于鼠李糖诱导启动子的表达系统可时序性调控目的基因的表达，在基础理论(如基因功能的阐明)和生产实践(如构建高效表达系统)以及抗生素等细胞毒性物质的筛选上均有良好应用。
2009年和2011年，DeSchutter和Kuberl相继完成P.pastoris基因组测序和基因注释，其中基因PAS_chr1_4-0075被注释为鼠李糖脱水酶基因。构建基于PAS_chr1_4-0075启动子的P.pastoris表达载体，不仅可避免使用危险物甲醇，还可通过控制诱导物的添加量和添加时间来调控重组蛋白适时地表达，将在基础研究和生产实践上均有重要价值。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种从毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115中分离的鼠李糖诱导型启动子。
本发明的目的之二是提供一种含有上述鼠李糖诱导型启动子的重组真核表达载体及含有该表达载体的重组宿主细胞。
本发明的目的之三是将所述的鼠李糖诱导型启动子以及含有该鼠李糖诱导型启动子的重组真核表达载体应用于外源基因适度表达和基础研究等方面。
本发明首先提供了一种从毕赤酵母GS115中分离鉴定的鼠李糖诱导型启动子，其多核苷酸为(a)、(b)、(c)或(d)所示：
(a)、SEQIDNo.5所示的多核苷酸；或
(b)、与SEQIDNO.5的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸所编码蛋白质仍具有启动子功能；或
(c)、与SEQIDNo.5所示的多核苷酸至少有90％或以上同源性的多核苷酸；或
(d)、在SEQIDNO.5所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有启动子的功能或活性。
本发明对基因PAS_chr1_4-0075及该基因启动子(P0075)进行生物学功能分析，分离鉴定出一种鼠李糖诱导型启动子。具体的，本发明首先通过Real-timePCR测定基因PAS_chr1_4-0075在不同碳源培养基中的转录水平，结果显示PAS_chr1_4-0075在毕赤酵母GS115以鼠李糖为唯一碳源的培养基(RM)中的转录水平分别为毕赤酵母GS115在以葡萄糖为唯一碳源的培养基(GM)和以葡萄糖和鼠李糖为碳源的培养基(GRM)中转录水平的4200倍和26倍，表明PAS_chr1_4-0075的转录受鼠李糖诱导、被葡萄糖抑制。进一步研究结果表明，在RM培养基中PAS_chr1_4-0075的转录水平为组成型转录的三磷酸甘油醛脱氢酶基因转录水平的75％，表明基因PAS_chr1_4-0075的启动子(P0075)具有较强的启动能力，可用于启动外源基因在毕赤酵母中进行高强度表达。
为进一步验证鼠李糖诱导型启动子P0075启动外源基因表达的强度，本发明首先进行了PAS_chr1_4-0075的启动子(P0075)启动乳糖酶表达的实验，即以乳糖酶为报告基因，构建了鼠李糖诱导型启动子调控乳糖酶基因表达的质粒pPIC0075αlacb及由三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(PGAP)调控乳糖酶基因表达的质粒pPICGAPαlacb。按Invitrogen公司毕赤酵母表达手册的电击转化方法将将线性化的质粒pPIC0075αlacb和pPICGAPαlacb导入毕赤酵母GS115中，质粒经同源臂Gas1L和Gas1R与染色体上同源序列双交换而整合于毕赤酵母GS115染色体的Gas1位点，从而得到染色体整合由P0075和PGAP调控乳糖酶基因表达的转化子GS115-P0075LacB和GS115-PGAPLacB。测定酵母GS115-P0075LacB及GS115-PGAPLacB在不同碳源培养基中发酵液上清中乳糖酶活力。结果表明，GS115-P0075LacB只在以鼠李糖为碳源时才表达乳糖酶；而GS115-PGAPLacB在多种糖为碳源时均可表达乳糖酶。以上结果进一步表明，P0075为诱导型启动子且仅受鼠李糖诱导；另一方面，在鼠李糖作为碳源时，GS115-P0075LacB发酵上清中乳糖酶的活力为GS115-PGAPLacB发酵上清中乳糖酶活力的75％，表明P0075为强启动子。结果表明，转化子GS115-P0075gfp和GS115-PGAPgfp在鼠李糖为碳源时均可表达乳糖酶。
另外，为进一步确证P0075启动外源基因表达的强度，本发明还进行了PAS_chr1_4-0075的启动子(P0075)启动绿色荧光蛋白基因表达的实验，即以乳糖酶为报告基因，构建了鼠李糖诱导型启动子调控乳糖酶基因重组表达质粒pPIC0075gfp及由三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(PGAP)调控乳糖酶基因表达的质粒pPICGAPgfp，按Invitrogen公司毕赤酵母表达手册的电击转化方法将线性化的质粒pPIC0075gfp和pPICGAPgfp导入毕赤酵母GS115中，质粒经同源臂Gas1L和Gas1R与染色体上同源序列双交换而整合于毕赤酵母GS115染色体的Gas1位点，从而得到染色体整合由P0075和PGAP调控绿色荧光蛋白基因表达的转化子GS115-P0075gfp和GS115-PGAPgfp。测定GS115-P0075gfp和GS115-PGAPgfp在以鼠李糖为主要碳源的培养基细胞内绿色荧光强度，结果表明，整合有P0075调控绿色荧光蛋白基因表达原件的转化子GS115-P0075gfp和由组成型强启动子PGAP调控绿色荧光蛋白基因表达原件的转化子GS115-PGAPgfp在鼠李糖为碳源时均可表达乳糖酶；与前面乳糖酶表达实验结果相似，转化子GS115-P0075gfp中绿色荧光蛋白的表达强度稍弱于转化子GS115-PGAPgfp中绿色荧光蛋白的表达强度。
为进一步确证PAS_chr1_4-0075的最小启动子，以乳糖酶为报告基因，构建了重组表达质粒pPIC0075(258)αlacb、pPIC0075(210)αlacb、pPIC0075(140)αlacb、pPIC0075(120)αlacb、pPIC0075(100)αlacb、pPIC0075(85)αlacb、pPIC0075(48)αlacb。按Invitrogen公司毕赤酵母表达手册的电击转化方法将线性化的质粒pPIC0075(256)αlacb、pPIC0075(210)αlacb、pPIC0075(140)αlacb、pPIC0075(120)αlacb、pPIC0075(100)αlacb、pPIC0075(85)αlacb、pPIC0075(48)αlacb和pPICGAPαlacb导入毕赤酵母GS115中，质粒经同源臂Gas1L和Gas1R与染色体上同源序列双交换而整合于毕赤酵母GS115染色体的Gas1位点，从而得到染色体整合由不同长度的P0075调控乳糖酶基因表达的转化子，测定发酵液上清中乳糖酶活力。结果表明，当PAS_chr1_4-0075启动子长度为210bp(其多核苷酸序列为SEQIDNO.4所示)时就能实现乳糖酶基因的高效表达，当然，超过210bp时表达效果会更好；启动子长度缩短为140bp(其多核苷酸序列为SEQIDNO.3所示)时，乳糖酶的表达效率降低了接近50％；启动子长度进一步缩短时，乳糖酶表达效率下降，但当启动子长度缩短为120bp(其多核苷酸序列为SEQIDNO.2所示)，乳糖酶的表达效率接近30％，当启动子长度缩短为100bp(其多核苷酸序列为SEQIDNO.1所示)，乳糖酶的表达效率接近10％，仍然具有启动子的活性，能实现乳糖酶基因的表达。以上结果表明，启动子长度为210bp就能有效调控目的基因表达，启动子长度越长基因表达效果越好。
本发明进一步提供了构建含有所述鼠李糖诱导型启动子的重组真核表达载体的方法，包括以下步骤：将所述鼠李糖诱导型启动子可操作的与目的异源性DNA相连接得到表达盒；将所述表达盒插入真核表达载体的多克隆位点得到重组真核表达载体。
本发明还提供了一种调控目的异源性基因在毕赤酵母中进行适时表达的方法，包括：将所述的鼠李糖诱导型启动子与待表达的目的异源性基因可操作的连接后插入到真核表达载体中构建得到重组真核表达载体；将所构建的重组真核表达载体转化到酵母中，得到重组酵母；以含有鼠李糖的诱导培养基诱导培养重组酵母，通过控制诱导培养基中鼠李糖的添加量和添加时间控制目的异源性基因在毕赤酵母中进行适时的表达，实现外源蛋白表达的精确控制。因此，本发明分离的鼠李糖诱导型启动子在外源基因适度表达和基础研究等方面具有重要应用价值。
本发明所涉及到的术语定义除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍)。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen,TechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicProbes,"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(Tm)约5-10℃。Tm为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在Tm下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。
术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。
术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,NucleicAcidRes.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,MolCell.Probes8:91-98(1994))。
术语“启动子”意指存在于目的基因编码序列的上游，提供RNA聚合酶和正确转录起始所必需的其它因子的识别位点，启动或指导目的基因转录为mRNA。
术语“诱导型启动子”意指在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平。
术语“转化”意指将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。
术语“异源性DNA序列”意指该DNA序列对该特定的宿主细胞而言属于外来的来源，或若来自相同的原始来源但对该原始序列进行了修饰或改造。
术语“同源重组”意指发生在姐妹染色单体之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
术语“表达”意指内源性基因或转基因在细胞中的转录和/或翻译。
术语“报告基因”意指一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是指，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成融合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。
术语“融合基因”意指将两个或多个基因的编码区首尾相连，置于同一套调控序列(包括启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子等)控制之下，构成的嵌合基因。
附图说明
图1PAS_chr1_4-0075基因在不同培养基中的相对转录水平；其中GM中转录水平设定为1；
图2PAS_chr1_4-0075基因在RM培养基中的相对转录水平；其中三磷酸甘油醛脱氢酶基因(gap)转录水平设定为100％；
图3转化子GS115-PGAPLacB和GS115-P0075LacB在不同碳源培养基中乳糖酶表达情况；
图4转化子GS115-PGAPLacB和GS115-P0075LacB启动绿色荧光蛋白基因表达情况；
图5不同长度P0075启动乳糖酶基因表达强度情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实验例1Real-timePCR检测毕赤酵母GS115染色体基因PAS_chr1_4-0075在不同碳源条件下的转录水平实验
1、实验方法
1.1不同碳源培养基的配制
A、葡萄糖为唯一碳源的培养基GM
1.34％YNB、0.004％组氨酸、4×10-5％生物素、2％葡萄糖、K2HPO4·3H2O0.9％、KH2PO43.54％。
B、鼠李糖为唯一碳源的培养基RM
1.34％YNB、0.004％组氨酸、4×10-5％生物素、2％鼠李糖、K2HPO4·3H2O0.9％、KH2PO43.54％。
C、葡萄糖和鼠李糖为碳源的培养基GRM
1.34％YNB、0.004％组氨酸、4×10-5％生物素、1％葡萄糖、1％鼠李糖、K2HPO4·3H2O0.9％、KH2PO43.54％。
1.2毕赤酵母GS115的培养及处理
挑取毕赤酵母GS115单菌落接入20ml液体YPD培养基中，于28℃、200rpm培养16～20h；离心(12000rpm×5min)收集菌体后，用无菌水洗涤菌体2次后，将菌体重悬于20ml无菌水中。以0.5％接种量将菌体分别接入100mlGM、RM和GRM培养基中，于28℃、200rpm培养至OD6001.2～1.4；离心(12000rpm×5min)收集菌体。
1.3RNA提取及反转录PCR
按Invitrogen公司的Trizol法提取毕赤酵母细胞中总RNA，提取的RNA经DnaseI处理以去除残留的DNA。使用Fermentas反转录试剂盒合成cDNA(K1631；MBIFermentas,St.Leon-Roth,Germany)。
以反转录的DNA为模板，设定引物检测预测的鼠李糖代谢相关基因PAS_chr1_4-0075的转录水平。
检测PAS_chr1_4-0075转录水平的引物为：
PAS_chr1_4-0075-F：5-TTCAGTGTCATCTGGGTGCAAC-3
PAS_chr1_4-0075-R：5-CCTGACTTCCCACTGATGGTAGAC-3
检测三磷酸甘油醛脱氢酶基因(内参基因)的引物为：
GAPDH-F:5-CGGAAGCAGCCTTGATAACAG-3
GAPDH-R1:5-CAAGAAGGTCGTCATCACTGCTC-3
2、实验结果
Real-timePCR检测结果显示，PAS_chr1_4-0075在毕赤酵母GS115以鼠李糖为唯一碳源的培养基(RM)中的转录水平分别为毕赤酵母GS115在以葡萄糖为唯一碳源的培养基(GM)和以葡萄糖和鼠李糖为碳源的培养基(GRM)中转录水平的4200倍和26倍(图1)，表明PAS_chr1_4-0075的转录受鼠李糖诱导、被葡萄糖抑制。
进一步研究结果表明，在RM培养基中PAS_chr1_4-0075的转录水平为组成型转录的三磷酸甘油醛脱氢酶基因转录水平的75％(图2)，表明基因PAS_chr1_4-0075的启动子(P0075)(其多核苷酸序列为SEQIDNO.5所示)具有较强的启动能力，可用于启动外源基因在毕赤酵母中进行高强度表达。
实验例2PAS_chr1_4-0075的启动子(P0075)启动乳糖酶表达的实验
1、实验方法
1.1P0075调控乳糖酶表达的质粒构建及转化子的筛选
为进一步确证P0075(其多核苷酸序列为SEQIDNO.5所示)启动外源基因表达的强度，以乳糖酶为报告基因进行了相关的实验，并进行相关质粒的构建。
1)以下列序列为引物：
0075-Pro-F：5-GTAACGGCGCGCCAATTTCGGAAAAACTTTTGGAATTA-3；
0075-Pro-R：5-GCAGTAAAAATTGAAGGAAATCTCATATTTTTAGGAGATAAAAATTCTGGGG-3；
以毕赤酵母GS115染色体为模板扩增含P0075的DNA片段1。
2)以9r-a-sigal-F：5-ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGC-3、3-AOXTT-R：5-GATCATTAATTAACGATAAGCTTGCACAAACGAAC-3为引物、重组表达质粒pPIC9(Invitrogen公司，美国)为模板扩增带有a信号肽和AOX1终止序列的DNA片段2。
3)应用Overlap-PCR将DNA片段1和片段2融合从而构建由P0075调控乳糖酶基因表达的DNA片段3。
4)将片段3插入质粒pUCGH01的AscI和PacI位点得到可整合至GS115染色体上的质粒pPIC0075α。
5)内切酶SnaBI和NotI酶切重组表达质粒pPIC9-lacb’(张伟等人，2005，微生物学报，45:247-252)，将亮白曲霉的乳糖酶基因插入至质粒pPIC0075α的SnaBI和NotI酶切位点之间，从而得到重组表达质粒pPIC0075αlacb。
质粒pUCGH01的构建方法如下：
(a)以gas1-F1：5-GTAACGGCGCGCCGCACAACAATAAACCGCTTCG-3、
gas1-R1：5-CGATGCTGTCGGAATGGACCAAGCACAGCAGTGTAACCGTC-3为引物、毕赤酵母GS115染色体为模板扩增用于同源重组的DNA片段4。
(b)以gas1-F2：5-GGGAGAGCGTCGAGTATCTATGATTGAAGTTATCACCAACAAGTCCAAT-3、
gas1-R2：5-GGATCATTAATTAAACTGGCAAGCAGCCTGTTCT-3为引物、毕赤酵母GS115染色体为模板扩增用于同源重组的DNA片段5。
(c)以his4-F：5-GTCCATTCCGACAGCATCG-3、his4-R:5-ATCATAGATACTCGACGCTCTCCC-3为引物、质粒pPIC9(Invitrogen公司，USA)为模板扩增含组氨醇脱氢酶基因(HIS4)的DNA片段6。
(d)应用Overlap-PCR将DNA片段4、片段5和片段6融合从而构建DNA片段7。
(d)将DNA片段7插入质粒pBlunt-simple(Transgen公司，中国)，得到质粒pUCGH01。
由三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(PGAP)调控乳糖酶基因表达的质粒pPICGAPαlacb的构建过程同质粒pPIC0075αlacb的构建过程。
按Invitrogen公司毕赤酵母表达手册的电击转化方法将线性化的质粒pPIC0075αlacb和pPICGAPαlacb导入毕赤酵母GS115中，质粒经同源臂Gas1L和Gas1R与染色体上同源序列双交换而整合于毕赤酵母GS115染色体的Gas1位点，从而得到染色体整合由P0075和PGAP调控乳糖酶基因表达的转化子。将转化后的毕赤酵母GS115涂布于仅含X-Gal的固体RM培养基上，于28℃培养48～72h，周围出现蓝斑的菌落即为阳性转化子。
1.2P0075启动乳糖酶基因表达强度的验证
1.2.1不同碳源培养基的配制
A、葡萄糖为主要碳源的培养基GLM
1.34％YNB、4×10-5％生物素、2％葡萄糖、酵母浸出物1％、蛋白胨2％、K2HPO4·3H2O0.9％、KH2PO43.54％。
B、鼠李糖为主要碳源的培养基RHM
1.34％YNB、4×10-5％生物素、2％鼠李糖、酵母浸出物1％、蛋白胨2％、K2HPO4·3H2O0.9％、KH2PO43.54％。
C、甘露醇为主要碳源的培养基MAM
1.34％YNB、4×10-5％生物素、2％甘露醇、酵母浸出物1％、蛋白胨2％、K2HPO4·3H2O0.9％、KH2PO43.54％。
D、山梨醇为主要碳源的培养基SOM
1.34％YNB、4×10-5％生物素、2％山梨醇、酵母浸出物1％、蛋白胨2％、K2HPO4·3H2O0.9％、KH2PO43.54％。
E、甘油为主要碳源的培养基GLYM
1.34％YNB、4×10-5％生物素、2％甘油、酵母浸出物1％、蛋白胨2％、K2HPO4·3H2O0.9％、KH2PO43.54％。
1.2.2毕赤酵母GS115的培养及处理
挑取阳性转化子单菌落接入20ml液体YPD培养基中，于28℃、200rpm培养16～20h，分别以0.5％接种量将菌体接入GLM、RHM、MAM、SOM、GLYM培养基中，于28℃、200rpm培养72h后，测定发酵液上清中乳糖酶活力。
2、实验结果
实验结果表明，整合有P0075调控乳糖酶基因表达原件的转化子GS115-P0075LacB只在以鼠李糖为碳源时才表达乳糖酶；而整合有组成型强启动子PGAP调控乳糖酶基因表达原件的转化子GS115-PGAPLacB在多种糖为碳源时均可表达乳糖酶(图3)。以上结果进一步表明，P0075为诱导型启动子且仅受鼠李糖诱导；另一方面，在鼠李糖作为碳源时，GS115-P0075LacB发酵上清中乳糖酶的活力为GS115-PGAPLacB发酵上清中乳糖酶活力的75％，表明P0075为强启动子。
实验例3PAS_chr1_4-0075的启动子(P0075)启动绿色荧光蛋白基因表达的实验
1、实验方法
1.1P0075调控绿色荧光蛋白表达的质粒构建及转化子的筛选
为进一步确证P0075启动外源基因表达的强度，以乳糖酶为报告基因进行了相关的实验，并进行相关质粒的构建。
1)以以下序列为引物：
0075-Pro-F：5-GTAACGGCGCGCCAATTTCGGAAAAACTTTTGGAATTA-3；
0075-Pro-R：5-CGCCCTAGGGAATTCTACGTACATATTTTTAGGAGATAAAAATTCTGGGG-3；
以毕赤酵母GS115染色体为模板扩增含P0075的DNA片段8。
2)以3-AOXTT-F：5-ATGTACGTAGAATTCCCTAGGGCG-3、3-AOXTT-R：5-GATCATTAATTAACGATAAGCTTGCACAAACGAAC-3为引物、为引物、重组表达质粒pPIC9(Invitrogen公司，美国)为模板扩增AOX1终止序列的DNA片段9。
3)应用Overlap-PCR将DNA片段8和片段9融合从而构建由P0075调控乳糖酶基因表达的DNA片段10。
4)将片段10插入质粒pUCGH01的AscI和PacI位点得到可整合至GS115染色体上的质粒pPIC0075。
5)人工合成载体pR18GFP(GenBank:KP701018.1)中绿色荧光蛋白基因序列，并在基因两端添加AscI和PacI位点。
6)将经SnaBI和NotI酶切的绿色荧光蛋白基因插入至质粒pPIC0075的SnaBI和NotI酶切位点之间，从而得到重组表达质粒pPIC0075gfp。
由三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(PGAP)调控乳糖酶基因表达的质粒pPICGAPgfp的构建过程同质粒pPIC0075gfp的构建过程。
按Invitrogen公司毕赤酵母表达手册的电击转化方法将线性化的质粒pPIC0075gfp和pPICGAPgfp导入毕赤酵母GS115中，质粒经同源臂Gas1L和Gas1R与染色体上同源序列双交换而整合于毕赤酵母GS115染色体的Gas1位点，从而得到染色体整合由P0075和PGAP调控绿色荧光蛋白基因表达的转化子。
1.2P0075启动绿色荧光蛋白基因表达强度的验证
1.2.1培养基的配制
鼠李糖为主要碳源的培养基RHM
1.34％YNB、4×10-5％生物素、2％鼠李糖、酵母浸出物1％、蛋白胨2％、K2HPO4·3H2O0.9％、KH2PO43.54％。
1.2.2毕赤酵母GS115的培养及处理
挑取阳性转化子单菌落接入20ml液体YPD培养基中，于28℃、200rpm培养16～20h，以0.5％接种量将菌体接入RHM培养基中，于28℃、200rpm培养48h后，荧光显微镜观察细胞内绿色荧光强度。
2、实验结果
实验结果表明，整合有P0075调控绿色荧光蛋白基因表达原件的转化子GS115-P0075gfp和由组成型强启动子PGAP调控绿色荧光蛋白基因表达原件的转化子GS115-PGAPgfp在鼠李糖为碳源时均可表达乳糖酶(图4)；与前面乳糖酶表达实验结果相似，转化子GS115-P0075gfp中绿色荧光蛋白的表达强度稍弱于转化子GS115-PGAPgfp中绿色荧光蛋白的表达强度。
实验例4PAS_chr1_4-0075的最小启动子确定
1、实验方法
1.1P0075调控乳糖酶表达的质粒构建及转化子的筛选
为进一步确证PAS_chr1_4-0075的最小启动子，以乳糖酶为报告基因进行了相关的实验，并进行相关质粒的构建。
1)分别以以下序列为正向引物：
0075-Pro-F1：5-GTAACGGCGCGCCAAACTGAAAGAACAAAGAACCAGTG-3；
0075-Pro-F2：5-GTAACGGCGCGCCAACTGACAGAATGACTGACTCCCTA-3；
0075-Pro-F3：5-GTAACGGCGCGCCGAGAAACCTCCATACGGATGATAGT-3；
0075-Pro-F4：5-GTAACGGCGCGCCATAGTTAGCCCGTTCCCACCACT-3；
0075-Pro-F5：5-GTAACGGCGCGCCACTTCGGCTGATTGTTAGGTTACG-3；
0075-Pro-F6：5-GTAACGGCGCGCCTAGGTTACGTGGGGTTGAAAGAT-3；
0075-Pro-F7：5-GTAACGGCGCGCCCTGATCCAAAGAAGGCCATTTAC-3；
以反向引物3-AOXTT-R：5-GATCATTAATTAACGATAAGCTTGCACAAACGAAC-3、DNA片段3为模板扩增含不同长度的PAS_chr1_4-0075启动子和AOX1终止序列的DNA片段。
2)将上述不同DNA片段插入质粒pUCGH01的AscI和PacI位点得到可整合至GS115染色体上的质粒pPIC0075(258)α、pPIC0075(210)α、pPIC0075(140)α、pPIC0075(120)α、pPIC0075(100)α、pPIC0075(85)α、pPIC0075(48)α。
3)内切酶SnaBI和NotI酶切重组表达质粒pPIC9-lacb’(张伟等人，2005，微生物学报，45:247-252)，将亮白曲霉的乳糖酶基因插入至质粒pPIC0075α的SnaBI和NotI酶切位点之间，从而得到重组表达质粒pPIC0075(258)αlacb、pPIC0075(210)αlacb、pPIC0075(140)αlacb、pPIC0075(120)αlacb、pPIC0075(100)αlacb、pPIC0075(85)αlacb、pPIC0075(48)αlacb
按Invitrogen公司毕赤酵母表达手册的电击转化方法将线性化的质粒pPIC0075(256)αlacb、pPIC0075(210)αlacb、pPIC0075(140)αlacb、pPIC0075(120)αlacb、pPIC0075(100)αlacb、pPIC0075(85)αlacb、pPIC0075(48)αlacb和pPICGAPαlacb导入毕赤酵母GS115中，质粒经同源臂Gas1L和Gas1R与染色体上同源序列双交换而整合于毕赤酵母GS115染色体的Gas1位点，从而得到染色体整合由不同长度的P0075调控乳糖酶基因表达的转化子。将转化后的毕赤酵母GS115涂布于仅含X-Gal的固体RM培养基上，于28℃培养48～72h，周围出现蓝斑的菌落即为阳性转化子。
1.2不同长度P0075启动乳糖酶基因表达强度的验证
1.2.1培养基的配制
鼠李糖为主要碳源的培养基RHM
1.34％YNB、4×10-5％生物素、2％鼠李糖、酵母浸出物1％、蛋白胨2％、K2HPO4·3H2O0.9％、KH2PO43.54％。
1.2.2毕赤酵母GS115的培养及处理
挑取阳性转化子单菌落接入20ml液体YPD培养基中，于28℃、200rpm培养16～20h，分别以0.5％接种量将菌体接入RHM培养基中，于28℃、200rpm培养72h后，测定发酵液上清中乳糖酶活力。
2、实验结果
实验结果表明(图5)，当PAS_chr1_4-0075启动子长度为210bp(其多核苷酸序列为SEQIDNO.4所示)时就能实现乳糖酶基因的高效表达，当然，超过210bp时表达效果会更好；启动子长度缩短为140bp(其多核苷酸序列为SEQIDNO.3所示)时，乳糖酶的表达效率降低了接近50％；启动子长度进一步缩短时，乳糖酶表达效率下降，但当启动子长度缩短为120bp(其多核苷酸序列为SEQIDNO.2所示)，乳糖酶的表达效率接近30％，当启动子长度缩短为100bp(其多核苷酸序列为SEQIDNO.1所示)，乳糖酶的表达效率接近10％，仍然具有启动子的活性，能实现乳糖酶基因的表达。以上结果表明，启动子长度为210bp就能有效调控目的基因表达，启动子长度越长基因表达效果越好。

Claims (10)

1.从毕赤酵母(Pichiapastoris)中分离的鼠李糖诱导型启动子，其特征在于：其多核苷酸为SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示。
2.从毕赤酵母(Pichiapastoris)中分离的鼠李糖诱导型启动子，其特征在于：其多核苷酸为(a)、(b)、(c)或(d)所示：
(a)、SEQIDNo.5所示的多核苷酸；或
(b)、与SEQIDNO.5的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸，该多核苷酸所编码蛋白质仍具有启动子功能；或
(c)、与SEQIDNo.5所示的多核苷酸至少有90％或以上同源性的多核苷酸；或
(d)、在SEQIDNO.5所示的多核苷酸的基础上进行一个或多个碱基的缺失、取代或插入的多核苷酸变体，且该多核苷酸变体所编码的蛋白仍具有启动子的功能或活性。
3.一种表达盒，其特征在于，包括：权利要求1或2所述的鼠李糖诱导型启动子和目的异源性基因。
4.按照权利要求3所述的表达盒，其特征在于：所述的目的异源性基因是待研究的外源蛋白基因。
5.含有权利要求1或2所述的鼠李糖诱导型启动子的重组真核表达载体。
6.含有权利要求5所述的重组真核表达载体的重组宿主细胞。
7.权利要求1或2所述的鼠李糖诱导型启动子在调控、指导或启动目的异源性基因表达中的用途。
8.权利要求1或2所述的鼠李糖诱导型启动子调控目的异源性基因以高强度在真核细胞中表达中的应用。
9.权利要求1或2所述的鼠李糖诱导型启动子调控目的异源性基因在真核细胞中适时表达中的应用。
10.一种调控目的异源性基因在毕赤酵母中表达的方法，包括：将权利要求1或2所述的鼠李糖诱导型启动子与待表达的目的异源性基因可操作的连接后插入到真核表达载体中构建得到重组真核表达载体；将所构建的重组真核表达载体转化到酵母中，得到重组酵母；以含有鼠李糖的诱导培养基培养重组酵母，通过控制诱导培养基中鼠李糖的添加量和添加时间控制目的异源性基因在毕赤酵母中进行适时的表达。
CN201610179949.1A 2016-03-25 2016-03-25 从毕赤酵母中分离的鼠李糖诱导型启动子及其应用 Active CN105734061B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610179949.1A CN105734061B (zh) 2016-03-25 2016-03-25 从毕赤酵母中分离的鼠李糖诱导型启动子及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610179949.1A CN105734061B (zh) 2016-03-25 2016-03-25 从毕赤酵母中分离的鼠李糖诱导型启动子及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105734061A true CN105734061A (zh) 2016-07-06
CN105734061B CN105734061B (zh) 2019-07-23

Family

ID=56251584

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610179949.1A Active CN105734061B (zh) 2016-03-25 2016-03-25 从毕赤酵母中分离的鼠李糖诱导型启动子及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105734061B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113528527A (zh) * 2021-07-29 2021-10-22 华东理工大学 一种用于重组蛋白表达的启动子及其应用
CN114657197A (zh) * 2022-04-06 2022-06-24 暨南大学 Gsm1p作为正调控因子在提高宿主细胞中蛋白表达中的应用
CN114773441A (zh) * 2022-04-06 2022-07-22 暨南大学 Hot1p作为正调控因子在提高宿主细胞中蛋白表达中的应用
CN116286941A (zh) * 2023-05-22 2023-06-23 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种毕赤酵母基因编辑单一质粒及改进的基因编辑方法
CN116589542A (zh) * 2023-07-04 2023-08-15 四川大学华西医院 基于AmpR蛋白突变的转录因子、启动子及构建方法
CN117126875A (zh) * 2023-10-20 2023-11-28 中国农业科学院生物技术研究所 一种适用于毕赤酵母的4-异丙基苯甲酸诱导表达系统及诱导表达方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004050877A1 (de) * 2002-12-02 2004-06-17 Basf Aktiengesellschaft L-rhamnose-induzierbare expressionssysteme
US7871815B2 (en) * 2001-05-24 2011-01-18 Vaxiion Therapeutics, Inc. Rhamnose-inducible expression constructs and methods
US7977068B2 (en) * 2002-02-13 2011-07-12 Xoma Technology Ltd. Eukaryotic signal sequences for polypeptide expression and polypeptide display libraries
CN103068995A (zh) * 2010-06-10 2013-04-24 基因桥有限责任公司 直接克隆
US20140112975A1 (en) * 2012-10-22 2014-04-24 Wisconsin Alumni Research Foundation Lipid-Conjugated Rhamnose for Immune System Recruitment and Oncotherapy
CN104651357A (zh) * 2014-05-13 2015-05-27 中国农业科学院生物技术研究所 鼠李糖诱导型启动子及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7871815B2 (en) * 2001-05-24 2011-01-18 Vaxiion Therapeutics, Inc. Rhamnose-inducible expression constructs and methods
US7977068B2 (en) * 2002-02-13 2011-07-12 Xoma Technology Ltd. Eukaryotic signal sequences for polypeptide expression and polypeptide display libraries
WO2004050877A1 (de) * 2002-12-02 2004-06-17 Basf Aktiengesellschaft L-rhamnose-induzierbare expressionssysteme
EP1570060A1 (de) * 2002-12-02 2005-09-07 Basf Aktiengesellschaft L-rhamnose-induzierbare expressionssysteme
CN103068995A (zh) * 2010-06-10 2013-04-24 基因桥有限责任公司 直接克隆
US20140112975A1 (en) * 2012-10-22 2014-04-24 Wisconsin Alumni Research Foundation Lipid-Conjugated Rhamnose for Immune System Recruitment and Oncotherapy
CN104651357A (zh) * 2014-05-13 2015-05-27 中国农业科学院生物技术研究所 鼠李糖诱导型启动子及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
，张淑平，武耀廷主编: "《分子生物学实验指导》", 30 September 2006, 高等教育出版社 *
DE SCHUTTER ET AL.: "Pichia pastoris GS115 L-rhamnonate dehydratese(PAS_chr1-4_0075)mRNA,complete cds", 《GENBANK》 *
OUTI M. KOIVISTOINEN ET AL.: "Characterisation of the gene cluster for L-rhamnose catabolism in the yeast Scheffersomyces(Pichia) stipitis.", 《GENE》 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113528527A (zh) * 2021-07-29 2021-10-22 华东理工大学 一种用于重组蛋白表达的启动子及其应用
CN113528527B (zh) * 2021-07-29 2023-09-29 华东理工大学 一种用于重组蛋白表达的启动子及其应用
CN114657197A (zh) * 2022-04-06 2022-06-24 暨南大学 Gsm1p作为正调控因子在提高宿主细胞中蛋白表达中的应用
CN114773441A (zh) * 2022-04-06 2022-07-22 暨南大学 Hot1p作为正调控因子在提高宿主细胞中蛋白表达中的应用
CN114773441B (zh) * 2022-04-06 2023-06-02 暨南大学 Hot1p作为正调控因子在提高宿主细胞中蛋白表达中的应用
CN114657197B (zh) * 2022-04-06 2023-07-21 暨南大学 Gsm1p作为正调控因子在提高宿主细胞中蛋白表达中的应用
CN116286941A (zh) * 2023-05-22 2023-06-23 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种毕赤酵母基因编辑单一质粒及改进的基因编辑方法
CN116286941B (zh) * 2023-05-22 2023-09-29 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种毕赤酵母基因编辑单一质粒及改进的基因编辑方法
CN116589542A (zh) * 2023-07-04 2023-08-15 四川大学华西医院 基于AmpR蛋白突变的转录因子、启动子及构建方法
CN116589542B (zh) * 2023-07-04 2023-09-15 四川大学华西医院 基于AmpR蛋白突变的转录因子、启动子及构建方法
CN117126875A (zh) * 2023-10-20 2023-11-28 中国农业科学院生物技术研究所 一种适用于毕赤酵母的4-异丙基苯甲酸诱导表达系统及诱导表达方法
CN117126875B (zh) * 2023-10-20 2024-02-06 中国农业科学院生物技术研究所 一种适用于毕赤酵母的4-异丙基苯甲酸诱导表达系统及诱导表达方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN105734061B (zh) 2019-07-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105734061A (zh) 从毕赤酵母中分离的鼠李糖诱导型启动子及其应用
Murakami et al. Positional cloning identifies Lotus japonicus NSP2, a putative transcription factor of the GRAS family, required for NIN and ENOD40 gene expression in nodule initiation
US20170088845A1 (en) Vectors and methods for fungal genome engineering by crispr-cas9
Fultz et al. Exogenous transposable elements circumvent identity-based silencing, permitting the dissection of expression-dependent silencing
JP2022548062A (ja) 亢進したｄｎａ産生を有する修飾型細菌レトロエレメント
BRPI0609283A2 (pt) métodos para identificar um ìntron com propriedades intensificadoras de expressão em plantas, para enriquecer o número de ìntrons com propriedades intensificadoras de expressão em plantas, para isolar, fornecer ou produzir um ìntron com propriedades intensificadoras de expressão em plantas, para fornecer um cassete de expressão e para intensificar a expressão de uma seqüência de ácidos nucleicos em uma planta ou uma célula de planta, algoritmo de computador, dispositivo de computador ou dispositivo de armazenamento de dados, construto de expressão de dna recombinante, vetor de expressão, célula transgênica ou organismo não humano transgênico, cultura celular, partes ou material de propagação, e, uso de um organismo transgênico ou de culturas celulares, partes de material de propagação transgênico derivadas destas
CN108118058B (zh) 一种改进的启动子及其应用
KR20220092509A (ko) 트립타민 발현을 조절하는 균류의 유전자 공학
CN101985465B (zh) 大豆GmPHR1基因及其编码的蛋白和应用
CN104651357B (zh) 鼠李糖诱导型启动子及其应用
KR101291668B1 (ko) 미코박테리아―대장균용 셔틀 벡터 및 이의 용도
CN113166768A (zh) 用于真核宿主中真核mRNA生产、输出和翻译的工程细菌系统和方法
CN112481309B (zh) Ago蛋白的用途及组合物和基因编辑方法
CN102229931B (zh) 一种病原丝状真菌特异性启动子及其应用
JP2014140368A (ja) 標的遺伝子のプロモーターを含むカセットおよび該カセットを利用した遺伝子操作方法
CN105316333B (zh) 植物花药特异表达启动子pTaASG005的鉴定和应用
CN110066819B (zh) 一种基于dna磷硫酰化修饰的抗噬菌体和抗病毒系统
CN109207510B (zh) 一种单子叶植物miRNA高效沉默载体的构建方法
JPS5980615A (ja) Ｄｎａおよびその用途
CN107287244B (zh) 一种利用短单链dna抑制昆虫基因表达的方法
Jiang et al. Restriction site-dependent PCR: an efficient technique for fast cloning of new genes of microorganisms
JP5672594B2 (ja) カビの発現誘導型プロモーター
CN105316334B (zh) 植物花药特异表达启动子pTaASG019的鉴定和应用
CN105039338B (zh) 植物花药特异表达启动子pTaASG004的鉴定和应用
CN111394350B (zh) 圆红冬孢酵母rna聚合酶iii型启动子及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant