CN111394350B - 圆红冬孢酵母rna聚合酶iii型启动子及其应用 - Google Patents

圆红冬孢酵母rna聚合酶iii型启动子及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明通过扩增一段圆红冬孢酵母DNA序列，进行生物学功能验证，获得可广泛用于红酵母中红冬孢酵母属(Rhodosoporidium)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)和红酵母属(Rhodotorula)，进行非编码RNA转录、遗传工程操作和菌株改良的RNA聚合酶III型启动子，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。本发明还涉及含有此DNA序列表达盒或重组载体，及利用相关元件构建红冬孢酵母属、锁掷酵母属和红酵母属基因工程菌株的方法及相应的菌株。

Description

圆红冬孢酵母RNA聚合酶III型启动子及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)的RNA聚合酶III型启动子及其用途，包括基因工程菌株构建所必需的转化方法等。
背景技术
微生物是自然界中分布最广泛的物种之一，其中一部分微生物能够在特定条件下(如氮源、磷源缺乏)在胞内贮存超过其细胞干重20％的油脂，其中以甘油三酯为主，具有这种表型的微生物称为产油微生物，包括细菌、酵母、霉菌、藻类等(Ratledge C and WynnJP.Adv Appl Microbiol 2002, 51:1–51.)。利用微生物转化生物质资源生产油脂，可发展成基本不依赖耕地、可连续生产、降低农业污染、资源综合利用的新技术，是形成化学品的石化资源替代品新的生产途径(赵宗保.中国生物工程杂志2005,25:8–11.)。
圆红冬孢酵母属于担子菌门异宗配合型真菌，是发酵工业中一种极为重要的微生物，并且对环境具有很强的抗逆性和鲁棒性。除了常规的碳源，它还可以利用一些其它的底物作为碳源进行发酵，包括粗甘油(Yang XB,et al.Biochem Eng 2014,91:86–91.)、离子液体(Huang QT,et al.Bioresour Technol 2013,130:339–344.)以及海带渣水解液(Zhang XB,et al.RSC Adv 2016,6:26752–26756.)等。在氮源限制条件下，胞内油脂可达细胞干重的60％以上(Li YH,et al.Enzyme Microb Technol 2007,41: 312–317.)。此外，圆红冬孢酵母的异戊二烯途径非常发达，可以作为微生物细胞工厂生产β-胡萝卜素等萜类化合物。目前在圆红冬孢酵母中，功能基因的研究主要通过基因克隆、异源表达和酿酒酵母功能互补分析来进行。但要从分子水平上对圆红冬孢酵母进行油脂积累机制、遗传发育、生长代谢和菌株遗传改造研究，必须具备相应的遗传操作系统。然而对于广泛分布、工业应用前景良好的圆红冬孢酵母而言，由于其特殊分类地位和生化特性以及遗传操作系统的缺乏，使得其遗传改良和分子机制研究进展缓慢。在真核细胞，包括圆红冬孢酵母中存在着三类启动子：RNA聚合酶I、II、 III型启动子，分别转录不同的基因。RNA聚合酶I启动子主要转录核糖体RNA基因；II型启动子主要转录能够编码蛋白质的基因(信使RNA基因)；III型启动子主要转录具有结构功能的非编码RNA 基因，并且能够识别六个或六个以上连续的碱基T作为终止信号。圆红冬孢酵母没有可用的RNA聚合酶III型启动子的相关报道。
虽然曾有人分离酿酒(Saccharomyces cerevisiae)的RNA聚合酶III启动子用于转录成熟的sgRNA，引导Cas9蛋白对靶位点进行切割，从而产生基因编辑(DiCarlo JE,etal.Nucleic Acids Research 2013, 41:4336–4343.)，但未见该类启动子用于红冬孢酵母属(Rhodosoporidium)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)和红酵母属(Rhodotorula)中基因表达、遗传工程操作和菌株改良的基因工程操作的报道。同时，本领域技术人员周知“不同的微生物在遗传背景、基因表达模式、生理生化特征方面存在大的差异，即使同为酵母，不同的种属间也存在很大的差异，例如，同属子囊菌门的酿酒酵母、毕赤酵母、耶氏解脂酵母，必须分别构建其遗传体系，选择自身来源启动子”。然而，启动子对于遗传操作系统来说必不可少。因此，获得能够在这些红酵母中转录非编码RNA的启动子成为目前研究的焦点。
发明内容
鉴于上述现有技术瓶颈，本发明的主要目的是提供可通用于红冬孢酵母属(Rhodosoporidium)、锁掷酵母属(Sporidiobolus)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)和红酵母属(Rhodotorula)中能够转录非编码RNA的启动子(命名为RNA聚合酶III型启动子)，以及采用合适的转化技术对这些红酵母菌株进行改良的方法。
为实现本发明的目的，本发明通过对圆红冬孢酵母的基因组序列进行分析预测，获得6段疑似能够转录非编码RNA的DNA序列，并进一步通过PCR技术从圆红冬孢酵母染色体DNA中成功扩增对应的6段序列，采用合适的连接方法将6段DNA序列分别与非编码RNA连接并导入红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属中，通过RT-PCR以及目的片段测序，发现其中一段DNA序列能够转录RNA，并将其命名为一种RNA聚合酶III启动子，完成了本发明。
本发明成功分离了能够在红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属酵母中转录非编码RNA的RNA聚合酶III型的启动子，并构建了其表达载体。
具体讲，本发明包含下述技术方案(A)到(H)：
(A)一种具有红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属转录启动子活性的DNA片段，所述DNA片段：
(1)具有如SEQ ID NO：1所示DNA序列的全部序列或包含该DNA序列自3’-末端起500bp以内的部分序列，
(2)具有可与如SEQ ID NO：1所示序列的全部或其DNA序列3’-末端起500bp以内的部分序列杂交的、且保持转录启动子活性的序列，或
(3)对SEQ ID NO：1所示的脱氧核苷酸序列进行一个或50个碱基以内的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQ ID NO：1所示序列具有70％以上同源性、且具有启动子活性的序列。
(B)一种可完成非编码RNA在红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属酵母中转录的DNA分子，它具有上述(A)所述的具有红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属酵母转录启动子活性的DNA序列，或同时具有上述(A)所述的具有红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属酵母转录启动子活性的DNA序列。
(C)一种可将非编码RNA序列与(A)-(B)任一种所述的DNA分子连接的DNA表达盒，以便于非编码RNA能够在红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属酵母中表达。
(D)一种携带(A)-(C)任一所述的DNA分子中的任意一个的重组载体。所述载体可以是游离型载体或整合型载体，所述游离型载体包括，但不限于，pMD18-T、pUC18、pYES2c/t或pYX212 等，所述整合型载体为农杆菌介导的双元表达载体，包括，但不限于，PZPK或pZP200等。
(E)一种将(C)所述的DNA分子或如(D)所述的载体转入红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属菌株的转化方法。
(F)一种转入了如(C)所述的DNA表达盒或如(D)所述的重组载体的红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属的基因工程菌株。
(G)转录非编码RNA的启动子，其特征在于：其来源为圆红冬孢酵母，可启动目的基因在红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属酵母中的转录和表达，所述启动子：(1)具有如 SEQ ID NO：1所示DNA序列的全部序列或包含该DNA序列自3’-末端起500bp以内的部分序列，(2) 具有可与如SEQ ID NO：1所示序列的全部或其DNA序列3’-末端起500bp以内的部分序列杂交的、且保持转录启动子活性的序列，或(3)对SEQ ID NO：1所示的脱氧核苷酸序列进行一个或50个碱基以内的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQ IDNO：1所示序列具有70％以上同源性、且具有启动子活性的序列。
(H)其中(A)-(G)所述的圆红冬孢酵母菌株选自圆红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)、贝吉维红冬孢酵母(Rhodosporidium babjevae)，所述锁掷酵母属(Sporidiobolus)菌株选自拟粉红锁掷孢酵母(Sporidiobolus pararoseus)，所述掷孢酵母属(Sporobolomyces)菌株选自粉红掷孢酵母 (Sporobolomyces roseus)，所述红酵母属(Rhodotorula)菌株选自深红酵母(Rhodotorula rubra)、胶红酵母(Rhodotorulamucilaqinosa)、海滨红酵母(Rhodotorula marina)、禾本红酵母(Rhodotorula graminis)和粘红酵母(Rhodotorula glutinis)。
使用本发明的具有启动子活性的DNA分子，可实现非编码RNA在红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属酵母中的表达。
本发明提供了用于红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属酵母菌株遗传工程改造的RNA聚合酶III启动子。为红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属酵母菌株开启了一条转录外源RNA的新途径，并因此可以提供具有工业用途的新型酵母菌株。
本领域技术人员应该理解，术语“表达系统”是指包括重组载体、待表达的目标蛋白的编码核苷酸序列、适合的宿主细胞或宿主菌株等的组合物体系，用来在所述宿主细胞或宿主菌株中表达所述目标蛋白。
本发明的有益效果是：
为红冬孢酵母属、锁掷酵母属和红酵母属的酵母菌提供了能够转录非编码RNA的启动子，将有力促进今后的红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属酵母菌的基因编辑和代谢工程研究。
附图说明
图1.R.toruloides CGMCC 2.1389中启动子b’转录非编码RNA。A:79bp miRNA；B:267bp核RNA；C:99 bp sgRNA(人工合成)；-:R.toruloides CGMCC 2.1389。
图2.R.toruloides ATCC 10788中启动子b’转录非编码RNA。A:79bp miRNA；B:267bp核RNA；C:99bp sgRNA(人工合成)；-:R.toruloides ATCC 10788。
图3.启动子b’在锁掷孢酵母属S.pararoseus JCM 3765与掷孢酵母属Sporobolomyces roseus中转录79 bp的miRNA。1、2、3代表锁掷孢酵母属S.pararoseus JCM3765的三个转化子；4代表锁掷孢酵母属S.pararoseus JCM 3765；5、6、7代表掷孢酵母属Sporobolomyces roseus的三个转化子；8代表掷孢酵母属Sporobolomyces roseus。
图4.启动子b’在红酵母属深红酵母CGMCC 2.279、红酵母属胶红酵母CGMCC 2.22与红酵母属海滨红酵母中转录267bp的核RNA。1、2、3代表红酵母属深红酵母CGMCC 2.279三个转化子；4代表红酵母属深红酵母CGMCC 2.279；5、6、7代表红酵母属胶红酵母CGMCC 2.22的三个转化子；8代表红酵母属胶红酵母CGMCC 2.22。9、10、11代表红酵母属海滨红酵母三个转化子；12代表红酵母属海滨红酵母。
图5.启动子b’在红酵母属禾本红酵母CGMCC 2.4202与红酵母属粘红酵母中转录99bp的sgRNA。1、 2、3代表红酵母属禾本红酵母CGMCC 2.4202的三个转化子；4代表红酵母属禾本红酵母CGMCC 2.4202；5、6、7代表红酵母属粘红酵母的三个转化子；8代表红酵母属粘红酵母。
序列表说明
SEQ ID NO：1 转录非编码RNA启动子b，来源于圆红冬孢酵母
SEQ ID NO：2 sgRNA序列
SEQIDNo.1的信息
(a)序列特征
长度：246核苷酸
类型：核苷酸
链型：单链
(b)分子类型：DNA
序列描述：SEQ ID NO：1
GTTGAAGTCCTCCGTGAAGCTCACCCTCGCCTGACCGGGGGCTCTCACCGTCGTCGGCTGCGCTCGCTCGAGACGAC GCCGCCGACTGGCCGCGTTACCACTTGTCGTCGCCGCACACAAAAGCACTTCTAATATGTACGTTCTCGTGTCTGATCG ACTTTCTCTCAGCACCCCTACGGGGGTTGCATACAATAAACTTGTTCGTCGAGCCACATGCACGGATATCTTCCAGCGA CTTCGGTCTTG
SEQIDNo.2的信息
(a)序列特征
长度：99核苷酸
类型：核苷酸
链型：单链
(b)分子类型：DNA
序列描述：
SEQ ID NO：2
GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGGTG CTTTTTTTGTTTTTTATGTCT
具体实施方式
在本文中，“RNA聚合酶III启动子”是指能够被RNA III型聚合酶识别、结合并能转录非编码RNA 的DNA序列。术语“启动子”还可理解为：包括5’非编码区、顺式作用元件(如增强子)以及其它能与转录因子结合的核苷酸序列。
RNA聚合酶III启动子的存在或强度通常是通过启动子活性表示，其测定方法：将非编码RNA连接于所述启动子的下游，并将该DNA构建体转化相应宿主细胞，通过RT-PCR检测非编码RNA是否转录。如果人们观察到连接于所述启动子下游非编码RNA的转录，就可以认为所述启动子在它所转化的宿主细胞内有活性。
“终止子”是指染色体上提供终止信号使RNA聚合酶与DNA模板分离而使转录终止的一段DNA 序列。在验证RNA聚合酶III型启动子是否有活性的表达盒中六个连续的碱基T即可作为终止信号。在本发明中，非编码RNA 3’端都已经添加六个连续的碱基T作为终止信号。
本发明中的“圆红冬孢酵母”，包括属于该“物种”的任何二倍体和单倍体，野生型菌株和营养缺陷型菌株。本发明中的“红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属”，没有具体限制，实施例包括圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、贝吉维红冬孢酵母(Rhodosporidium babjevae)，粉红锁掷孢酵母(Sporidiobolus pararoseus)，粉红掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)，深红酵母(Rhodotorula rubra)，胶红酵母(Rhodotorula mucilaqinosa)，海滨红酵母(Rhodotorula marina)，禾本红酵母(Rhodotorula graminis)和粘红酵母(Rhodotorula glutinis)。
本发明的“非编码RNA”，包括在红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属属菌株中不同长度的(<300bp)能够转录但不翻译蛋白质的RNA。能够在红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属菌株中转录的非编码RNA包括核RNA序列、miRNA、SiRNA等并不局限于此，还包括其它人工合成的非编码RNA序列。
本发明中的启动子：(1)具有如SEQ ID NO：1所示DNA序列的全部序列或包含该DNA序列自3’- 末端起500bp以内的部分序列，(2)具有可与如SEQ ID NO：1所示序列的全部或其DNA序列3’-末端起500bp以内的部分序列杂交的、且保持转录启动子活性的序列，或(3)对SEQ ID NO：1所示的脱氧核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQ ID NO：1所示序列具有70％以上同源性、且具有启动子活性的序列。
本发明中的启动子-非编码RNA的构建体，可以直接或经载体介导转化红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属和红酵母属菌株，以便于非编码RNA转录，可以优选质粒载体作为介导载体。
下面结合附图及实施例对本发明作进一步说明，将有助于本领域的普通技术人员理解本发明，但不以任何形式限制本发明。下述实施例中所有引物合成及测序工作，如无特别说明则均由大连 TakaRa公司完成。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。
R.toruloides CGMCC 2.1389：中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，源自东京大学应用微生物研究所(IFO 8766)，由IFO 0559和IFO 0880经配合而成的二倍体，等同于CBS 6016或NBRC 8766 或NRRL Y-6987。
R.toruloides ATCC 10788：美国标准生物品收藏中心(ATCC)，源自CBS-KNAWfungal biodiversity centre，等同于IFO 0559或JCM 3792或CCRC 20306或DBVPG 6740或IAM 13469或IGC4416或MUCL 30249或NCYC 921或NRRL Y-1091或VKM Y-334或PYCC4416。
Rhodosporidium babjevae NCYC 2630购自英国国家酵母菌种保藏中心(National Collection of Yeast Cultures，NCYC)。
拟粉红锁掷孢酵母(Sporidiobolus pararoseus)JCM 3765购自于购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。
粉红掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)JCM 8242购自于日本微生物菌种保藏中心(JCM)。
深红酵母(Rhodotorula rubra)CGMCC 2.279购自于酵母菌种保藏中心(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。
胶红酵母CGMCC 2.22购自于酵母菌种保藏中心(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心 (CGMCC)。
海滨红酵母(Rhodotorula marina)CGMCC 2.4203购自于酵母菌种保藏中心(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。
粘红酵母(Rhodotorula glutinis)NCYC 2666购自于英国国家酵母菌种保藏中心(National Collection of Yeast Cultures，NCYC)。
实施例1:圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)CGMCC 2.1389基因组DNA的提取
将圆红冬孢酵母(R.toruloides)CGMCC 2.1389(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC))由斜面接种到10mL YEPD液体培养基(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH6.0)中，于30℃摇床培养24h，再以1:50 的体积比例将菌液分别转接到100mL YEPD液体培养基中，于30℃摇床培养24h达对数生长期。按照文献中的方法进行圆红冬孢酵母基因组DNA的提取(Lin XP,et al.FEMS Yeast Res 2014, 14:547–555.)。RNA进行1.5％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳，使用荧光-紫外分析仪观察鉴定，可见清晰的一条带。用NanoDrop测定基因组DNA的质量与浓度，测得浓度为500ng/μL, OD260/OD280＝1.90，表明总DNA质量很好。基因组DNA样品冻存于-80℃，备用。
实施例2:圆红冬孢酵母CGMCC 2.1389疑似启动子序列扩增
以圆红冬孢酵母CGMCC 2.1389基因组DNA为模板，扩增得到6条疑似的启动子序列，分别命名为a、b’、c、d、e、f。首先，进行a片段的PCR扩增：5×PCR缓冲液10.0μL，dNTPs(10mM)1.0 μL，上游引物(a-F:5’-TGGAGTTCGACGTTCTCCTCGC-3’50mmol/L)1.0μL，下游引物(a-R:5’- TGTGACTGATCTGGTGTTGTT-3’50mmol/L)1.0μL，PrimeSTAR DNA聚合酶(大连TakaRa)0.5μL，1.0μL 基因组DNA作为模板，ddH2O补加至50μL，于94℃保温3min，然后于98℃保温10s，62℃ 10s，72℃1min，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。b’、c、d、e、f片段的扩增与扩增 a片段方法相同，所用引物分别为b’-F:5’-GGCGGGATGACCCAGCGCTTTCA-3’/b’-R:5’-CAAGACCGAAGTCGCTGGAAG-3’、c-F:5’-CCAGACGGACCTTGAGAACCC-3’/c-R: 5’-CCTCGCAAGCGGCCGACGCAGCC-3’、d-F:5’-GTCGCAGTTTTGCAAGGTCACGC-3’/d-R: 5’-GGGGTAGTCGAGCGCCTGTGTTGC-3’、e-F:5’-CGGACAGCAACTCTGGCTCTGG-3’/e-R: 5’-GTTCGTGGGTCGTTCTTCT-3’、f-F:5’-CTCTGCTCTCGCTCGCTGTGG-3’/f-R: 5’-CGGCGAGAGCCGAAAAGTCCTCCT-3’。扩增产物进行2％(质量/体积浓度,2g/100ml)琼脂糖凝胶电泳，利用DNA回收试剂盒(购自上海生工)，按照供应商建议步骤纯化PCR产物。PCR产物参照大连TakaRa公司提供的方法克隆到pMD18-T载体(购自大连TakaRa)，转化入E.coli DH5α感受态细胞，其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至大连TakaRa公司测序，测序结果经比对，确定是扩增的6条DNA片段。其中b’片段的序列为SEQ ID NO：1。
实施例3：圆红冬孢酵母CGMCC 2.1389非编码RNA核苷酸序列的扩增
以圆红冬孢酵母CGMCC 2.1389基因组DNA为模板，分别扩增2段不同长度miRNA、小核RNA 的DNA序列，分别命名为A(59bp)、B(267bp)。由于siRNA片段较小(35bp)，直接通过引物合成，命名为D。首先，进行A片段的PCR扩增：5×PCR缓冲液10.0μL，dNTPs(10mM)1.0μL，上游引物(A-F:5’-AAGCGCAACTACATCCTCG-3’50mmol/L)1.0μL，下游引物(A-R: 5’-CTCGTAGTCGATGATGCCGT-3’50mmol/L)1.0μL，PrimeSTAR DNA聚合酶(大连TakaRa)0.5μL，1.0 μL基因组DNA作为模板，ddH2O补加至50μL，于94℃保温3min，然后于98℃保温10s，62℃10s，72℃1min，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。B片段的扩增与扩增A片段方法相同，所用引物分别为B-F:5’-CGTCATCGACGCCGGCGTCC-3’/B-R:5’-GACCTCGTTGACGTTGTGGA-3’。经过上海生工合成sgRNA片段(99bp)，作为外源的非编码RNA序列，命名为C,利用引物C-F:5’-GTTTTAGAGCTAGAAATAG-3’/C-R:5’-AGACATAAAAAACAAAAAA-3’进行扩增，PCR条件与扩增体系与扩增A、B片段相同。扩增产物进行2％(质量/体积浓度,2g/100ml)琼脂糖凝胶电泳，利用DNA回收试剂盒(购自上海生工)，按照供应商建议步骤纯化PCR产物。PCR产物参照大连TakaRa公司提供的方法克隆到pMD18-T载体(购自大连TakaRa)，转化入E.coli DH5α感受态细胞，其中感受态细胞按氯化钙法制备。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至大连TakaRa 公司测序，测序结果经比对，确定是扩增的3条DNA片段。其中C片段的序列为SEQ ID NO：2。
非编码RNA信息见下表：
本文中命名 长度 代表意义
A 59bp miRNA
B 267bp 核RNA
C 99bp sgRNA(人工合成)
D 35bp SiRNA
实施例4：启动子序列与非编码RNA序列通过融合PCR连接
根据实施例2和实施例3中获得的启动子和非编码RNA序列，重新设计一对引物进行启动子序列与非编码RNA融合连接。以a-A为例，设计引物的原则为启动子a序列3’段的30bp与非编码 RNA A序列5’段的30bp连接，分别设计正向引物a-A-F与反向引物a-A-R(正向引物a-A-F与反向引物a-A-R反向互补)。
扩增上游片段：5×PCR缓冲液10.0μL，dNTPs(10mM)1.0μL，上游引物(a-F: 5’-AAGCGCAACTACATCCTCG-3’50mmol/L)1.0μL，下游引物(a-A-R 50mmol/L)1.0μL，PrimeSTARDNA 聚合酶(大连TakaRa)0.5μL，1.0μL基因组DNA作为模板，ddH2O补加至50μL，于94℃保温3min，然后于98℃保温10s，62℃10s，72℃1min，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。
扩增下游片段：5×PCR缓冲液10.0μL，dNTPs(10mM)1.0μL，上游引物(a-A-F50mmol/L) 1.0μL，下游引物(A-R:5’-CTCGTAGTCGATGATGCCGT-3’50mmol/L)1.0μL，PrimeSTAR DNA聚合酶(大连TakaRa)0.5μL，1.0μL基因组DNA作为模板，ddH2O补加至50μL，于94℃保温3min，然后于98℃保温10s，62℃10s，72℃1min，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。
将上下游扩增产物进行2％(质量/体积浓度,2g/100ml)琼脂糖凝胶电泳，利用DNA回收试剂盒(购自上海生工)，按照供应商建议步骤纯化PCR产物。
融合第一步：片段a与A进行连接：5×PCR缓冲液10.0μL，dNTPs(10mM)1.0μL，片段a1.0 pmol，片段A 1.0pmol，PrimeSTAR DNA聚合酶(大连TakaRa)0.5μL，ddH2O补加至50μL，于94℃保温3min，然后于98℃保温10s，62℃10s，72℃1min，15个循环，72℃10min，4℃结束反应。
融合第二步：扩增片段a-A：5×PCR缓冲液10.0μL，dNTPs(10mM)1.0μL，上游引物(a-F 50 mmol/L)1.0μL，下游引物(A-R:50mmol/L)1.0μL，融合第一步的反应体系取5.0μL作为模板， PrimeSTAR DNA聚合酶(大连TakaRa)0.5μL，ddH2O补加至50μL，于94℃保温3min，然后于 98℃保温10s，62℃10s，72℃1min，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。
对于融合片段a-D，由于D片段较小，直接通过一条反向引物D-R(5’为D片段碱基)，通过引物a-F与D-R直接扩增得到融合片段a-D。
扩增产物进行1.5％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳，利用DNA回收试剂盒(购自上海生工)，按照供应商建议步骤纯化PCR产物。PCR产物参照大连TakaRa公司提供的方法克隆到pMD18-T载体 (购自大连TakaRa)，转化入E.coli DH5α感受态细胞，其中感受态细胞按氯化钙法制备。挑选Amp 抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至大连TakaRa公司测序，测序结果经比对正确。将对应的载体命名为T-a-A。
其余17种T载体也按照相同步骤进行连接。其余17种载体有T-a-B、T-a-C、T-b’-A、T-b’-B、T-b’-C、 T-c-A、T-c-B、T-c-C、T-d-A、T-d-B、T-d-C、T-e-A、T-e-B、T-e-C、T-f-A、T-f-B、T-f-C。
实施例5：RF克隆法构建双表达盒载体
选择pZPK-pPGK-hyg-Tnos载体(Lin XP,et al.FEMS Yeast Res 2014,14:547–555)作为模板，将实施例4中连接的片段通过RF克隆插入到模板的Tnos序列之后。参考RF克隆原理，上游引物5’端为与插入位置载体上游同源的30bp，3’端为扩增启动子-非编码RNA片段的5’端19bp，序列为a-A-RF-F: GCAGCATGCAAGCTTGGAGCTTGAGCTTGGAAGCGCAACTACATCCTCG；下游引物5’端为与插入位置载体下游同源的30bp，3’端为扩增启动子-非编码RNA片段的3’端20bp,序列为a-A-RF-R: TAAACTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGATCTCGTAGTCGATGATGCCGT。利用RF克隆引物扩增片段：扩增连接片段a-A：5×PCR缓冲液10.0μL，dNTPs(10mM)1.0μL，上游引物(a-A-RF-F 50mmol/L)1.0 μL，下游引物(a-A-RF-R:50mmol/L)1.0μL，质粒T-a-A 1.0μL作为模板，PrimeSTAR DNA聚合酶(大连TakaRa)0.5μL，ddH2O补加至50μL，于94℃保温3min，然后于98℃保温10s，62℃10 s，72℃1min，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。扩增产物进行1％(质量/体积浓度,1g/100 ml)琼脂糖凝胶电泳，利用DNA回收试剂盒(购自上海生工)，按照供应商建议步骤纯化PCR产物。
RF克隆：5×PCR缓冲液10.0μL，dNTPs(10mM)1.0μL，上述扩增的片段300ng作为大引物 (mega-primer)，20ng质粒pZPK-pPGK-hyg-Tnos作为模板，PrimeSTAR DNA聚合酶(大连TakaRa) 0.5μL，ddH2O补加至50μL，于94℃保温3min，然后于98℃保温10s，62℃10s，72℃10 min，15个循环，72℃15min，4℃结束反应。
DpnI消化和电击转化：取8μL RF反应产物加入1μL DpnI(购自TaKaRa)和1μL DpnIbuffer，混匀后在37℃作用120min去除原pZPK-pPGK-hyg-Tnos质粒后，取2μL电击转化DH10B感受态细胞，感受态细胞按标准方法制备(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)，电击转化参数：2200-2500V，400Ω，25μF，0℃，4-8ms。挑选Kan抗性转化子进行增菌培养、质粒提取，并利用引物Hspt-F和PZPK-R进行菌落PCR鉴定，鉴定阳性的重组载体送大连 TakaRa进行测序，得到正确的载体。同时，该重组载体命名为pZPK-pPGK-hyg-Tnos-a-A。
其余17种农杆菌双元表达载体按照相同方法构建成功，有pZPK-pPGK-hyg-Tnos-a-B、 pZPK-pPGK-hyg-Tnos-a-C、pZPK-pPGK-hyg-Tnos-b’-A、pZPK-pPGK-hyg-Tnos-b’-B、pZPK-pPGK-hyg-Tnos-b’-C、pZPK-pPGK-hyg-Tnos-c-A、pZPK-pPGK-hyg-Tnos-c-B、pZPK-pPGK-hyg-Tnos-c-C、 pZPK-pPGK-hyg-Tnos-d-A、pZPK-pPGK-hyg-Tnos-d-B、pZPK-pPGK-hyg-Tnos-d-C、pZPK-pPGK-hyg-Tnos-e-A、 pZPK-pPGK-hyg-Tnos-e-B、pZPK-pPGK-hyg-Tnos-e-C、pZPK-pPGK-hyg-Tnos-f-A、pZPK-pPGK-hyg-Tnos-f-B、 pZPK-pPGK-hyg-Tnos-f-C。
实施例6：在圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)CGMCC 2.1389中，分离的启动子b’转录非编码RNA
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)在自然条件下可以通过病斑或伤口进入寄主组织，将其体内的一段DNA转入植物基因组中，最终刺激寄主在侵染部位形成冠瘿瘤。农杆菌这种特性最早被应用于植物基因组的改造，称为ATMT技术。随后ATMT技术广泛应用于多种真菌和酵母遗传改造和T-DNA插入突变文库构建。
ATMT转化过程大致可以分为载体构建、农杆菌活化、宿主材料制备、共转化和转化子筛选这五个步骤。首先在双元载体的T-DNA区域间插入合适的选择标记，并转入农杆菌；含有双元载体的农杆菌工程菌株活化后用乙酰丁香酮(AS)诱导；宿主菌株经过活化后稀释到一定的浓度；将活化并诱导后的农杆菌与宿主材料混合，涂布于铺有载体介质的共培养平板上，在适宜的温度下进行共转化；将共培养的混菌转移到筛选平板上，置于宿主菌最适宜的温度下培养，至转化子出现。
1.含有pZPK质粒的农杆菌工程菌株的构建
所获得的18个农杆菌双元表达载体(见实施例5)采用电击转化法转化至根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciems)AGL1(购自美国标准生物品收藏中心(ATCC))中，于含有50ng/μL 卡那霉素的LB平板上挑取转化子。农杆菌转化子首先采用菌落PCR的方法进行验证。验证正确的转化子，提取其中的质粒，转化至大肠杆菌中。双元载体通过大肠杆菌大量富集后送测序验证。含有测序正确质粒的农杆菌菌株为工程菌株，保存备用。
2.双元载体通过ATMT导入到圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)CGMCC2.1389中
取一环活化后的Rhodosporidium toruloides CGMCC 2.1389，接于5mL YEPD(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)培养液中，30℃，200r/min，过夜培养24h。用无菌水洗涤一遍后，调节至OD600＝0.1-0.8，备用。含有pZPK质粒的18株农杆菌活化后，分别接于5mL 含有卡那霉素(50ng/μL)和利福平(50ng/μL)的LB液体中，30℃，200r/min，培养16h。用无菌水洗涤一遍，调节至OD600＝0.1-1.6，备用。
取上述酵母及18种携带双元载体的农杆菌稀释液各400μL，分别一一混匀，直接滴于诱导平板 (5mmol/L葡萄糖，0.5％甘油，1.45g/L磷酸二氢钾，2.05g/L磷酸氢二钾，0.15g/L氯化钠，0.5g/L 七水硫酸镁，66mg/L二水氯化钙，2.48g/L七水硫酸铁，0.5g/L硫酸铵，40mmol/L MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)，2％琼脂粉，200μmol/L乙酰丁香酮)上(BundockP,et al.EMBO J 1995,14:3206–3214.)， 24-25℃，培养4天。用10mL左右的无菌水将混合菌苔洗下，3000r/min离心5min，弃去上层主要含有农杆菌的液体，剩余的细胞用800μL无菌水重悬，取50-200μL涂布于磷酸盐限制平板(50ng/μL 潮霉素、300μg/mL头孢菌素、30g/L葡萄糖、5g/L硫酸铵、0.64g/L硫酸钾、0.08g/L十二水合磷酸氢二钠、0.94g/L硫酸钠、1.5g/L七水硫酸镁，琼脂粉1.5g/L，PH 6.0)上，于30℃进行培养，直至转化子出现。
3.Rhodosporidium toruloides CGMCC 2.1389转化子的RT-PCR验证
18种转化子，各自任意挑取3个单菌落接种到10mL YEPD液体培养基(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中，于30℃摇床培养24h，再以1:50的体积比例将菌液分别转接到100mL YEPD液体培养基中，于30℃摇床培养14h达对数生长期。在4℃下，5000rpm 离心4min，收集菌体，用液氮迅速冷冻菌体，研磨破壁(Yang F,etal.Mol Biotechnol 2010, 47:144–151.)。使用TakaRa公司RNAiso试剂盒，并按照其标准步骤提取总RNA。RNA进行1.5％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳，使用荧光-紫外分析仪观察鉴定，可见清晰的两条带。用紫外/可见光光谱仪分析总RNA样品，测得OD260/OD280＝1.99，表明总RNA质量很好。取1μg RNA作为模板，按照TakaRa公司PrimeScriptTMRT reagent Kitwith gDNA Eraser试剂盒标准步骤进行反转录。PCR扩增： 2×rTaq mix 25.0μL，上游引物(a-A-F 50mmol/L)1.0μL，下游引物(a-A-R:50mmol/L)1.0μL，反转录混合液1.0μL作为模板，ddH2O补加至50μL，同时GAPDH-F、GAPDH-R扩增GAPDH作为内参对照。94℃保温3min，然后于98℃保温10s，55℃10s，72℃1min，35个循环，72℃ 10min，4℃结束反应。扩增产物进行2％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳。结果显示只有片段 b’为启动子的非编码基因表达菌株样品对应能够扩增出条带(结果见图1)。放大体系至200μL，扩增片段进行测序，测序结果与预测序列完全相同，说明片段b’具有RNA聚合酶III型启动子功能，能够在圆红冬孢酵母中启动转录miRNA、小核RNA、sgRNA等非编码RNA。而其余的启动子a、c、d、 e、f对应的菌株未能扩增出条带(图未显示)，说明不能转录非编码RNA。
实施例7：在圆红冬孢酵母ATCC 10788中启动子b’转录非编码RNA
1.片段pPGK-hyg-Tnos-b’-A、pPGK-hyg-Tnos-b’-B和pPGK-hyg-Tnos-b’-C的扩增
PCR体系(500μL)：10×Speed buffer(大连TakaRa)50.0μL，dNTPs(10mmol/L)10.0μL，上游引物(10μmol/L)20.0μL，下游引物(10μmol/L)20.0μL，SpeedSTAR HS DNA聚合酶(扩增速度快，1kb/10s，购自大连TakaRa公司)5.0μL，质粒pZPK-pPGK-hyg-Tnos-b’-A、pZPK-pPGK-hyg-Tnos-b’-B、pZPK-pPGK-hyg-Tnos-b’-C分别取200ng左右作为模板，ddH2O加至500μL，混匀后分装。反应条件：98℃1min，98℃10s，65℃60s，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。
PCR产物经1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳分析后利用PCR片段纯化试剂盒(购自生工) 进行纯化。纯化后的DNA片段浓度为1000ng/μL左右，共20μL，-20℃保存备用。
2.圆红冬孢酵母ATCC 10788感受态细胞制备
圆红冬孢酵母ATCC 10788感受态细胞的制备：圆红冬孢酵母ATCC 10788挑菌落接种10ml YEPD 培养基(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)，30℃，200rpm，培养 20h；培养物1:50比例转接新鲜YEPD培养基，100mL(500mL锥形瓶，装液量100mL)，30℃， 200rpm，培养6-9h，OD值达到0.6-1.2；培养物冰浴10-30min，4℃，4000r/min离心5min，弃上清；0℃无菌Milli-Q水洗1次；0℃1mol/L山梨醇洗涤2次；冰浴，备用。取100μL圆红冬孢酵母ATCC 10788感受态细胞，加入片段pPGK-hyg-Tnos-b’-A 10μL(总共4μL)，混匀后移入预冷至 0℃的电击杯中，参数：电压0.7千伏，电阻200Ω，电容25μF，时间4-8ms；电击后立即加入1mL 含1M山梨醇的YEPD，30℃温育2h；涂布含1M山梨醇YEPD-Hyg平板(含潮霉素50ng/μL)， 30℃培养5天以上，待转化子出现。
3.转化子的RT-PCR鉴定
从筛选平板上任意挑取3个单菌落接种到10mL YEPD液体培养基(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中，于30℃摇床培养24h，再以1:50的体积比例将菌液分别转接到100mL YEPD液体培养基中，于30℃摇床培养14h达对数生长期。RNA提取方法见实施例6。取1μg RNA作为模板，按照TakaRa公司PrimeScriptTMRT reagent Kitwith gDNA Eraser试剂盒标准步骤进行反转录。PCR扩增：2×rTaq mix 25.0μL，上游引物(b’-A-F 50mmol/L)1.0μL，下游引物(b’-A-R:50mmol/L)1.0μL，反转录混合液1.0μL作为模板，ddH2O补加至50μL，同时GAPDH-F、 GAPDH-R扩增GAPDH作为内参对照。94℃保温3min，然后于98℃保温10s，55℃10s，72℃ 1min，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。扩增产物进行2％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳。结果显示在圆红冬孢酵母ATCC 10788中片段b’具有RNA聚合酶III型启动子功能，能够启动转录miRNA、小核RNA、sgRNA等非编码RNA。结果见图2。
实施例8：启动子b’在锁掷孢酵母属S.pararoseus JCM 3765与掷孢酵母属Sporobolomyces roseus中转录79bp的miRNA
1.含有pZPK-pPGK-hyg-Tnos-b’-A载体的农杆菌工程菌株的构建
构建的pZPK-pPGK-hyg-Tnos-b’-A载体采用电击转化法转化至农杆菌AGL1中，于含有50ng/μL 卡那霉素的LB平板上挑取转化子。卡那霉素抗性农杆菌转化子首先采用菌落PCR的方法进行验证。验证正确的转化子，命名为AGL1/pZPK-HYG-Ppho89-b’-A，保存备用。
2.载体pZPK-pPGK-hyg-Tnos-b’-A经ATMT分别整合到锁掷孢酵母属S.pararoseusJCM 3765、掷孢酵母属Sporobolomyces roseus染色体上
拟粉红锁掷孢酵母(S.pararoseus)JCM 3765购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。粉红掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)JCM 8242购自于日本微生物菌种保藏中心(JCM)。取一环活化后的S.pararoseus JCM 3765、S.roseus JCM 8242，分别接种于5ml YEPD(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中，25℃，200r/min过夜培养。用无菌水洗涤一遍后，调节至OD600＝1-2，备用。
步骤1获得的重组农杆菌AGL1/ZPK-HYG-Ppho89-b’-A接种于5mL含有卡那霉素(100ng/μL)和利福平(80ng/μL)的LB液体中，250℃，200r/min培养过夜。用无菌水洗涤一遍，调节至OD600＝1-3，备用。
取上述拟粉红锁掷孢酵母(S.pararoseus)JCM 3765及农杆菌稀释液各200μL，混匀，按实施例 6步骤2进行ATMT操作，直至转化子出现。粉红掷孢酵母JCM 8242与农杆菌也按照相同步骤进行操作。
3.锁掷孢酵母属S.pararoseus JCM 3765、掷孢酵母属Sporobolomyces roseus转化子的RT-PCR验证
从筛选平板上分别任意挑取3个单菌落接种到10mL YEPD液体培养基(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中，于30℃摇床培养24h，再以1:50的体积比例将菌液分别转接到100mL YEPD液体培养基中，于30℃摇床培养14h达对数生长期。总RNA提取步骤参考实施例6。取1μg RNA作为模板，按照TakaRa公司PrimeScriptTMRTreagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒标准步骤进行反转录。PCR扩增：2×rTaq mix25.0μL，上游引物(a-A-F 50mmol/L)1.0μL，下游引物(a-A-R:50mmol/L)1.0μL，反转录混合液1.0μL作为模板，ddH2O补加至50μL，同时 GAPDH-F、GAPDH-R扩增GAPDH作为内参对照。94℃保温3min，然后于98℃保温10s，55℃ 10s，72℃1min，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。扩增产物进行2％(质量/体积浓度) 琼脂糖凝胶电泳。结果见图3。说明在锁掷孢酵母属S.pararoseus JCM 3765、掷孢酵母属 Sporobolomyces roseus中，片段b’具有RNA聚合酶III型启动子功能，能够启动转录miRNA表达。
实施例9：启动子b’在红酵母属深红酵母CGMCC 2.279、红酵母属胶红酵母CGMCC2.22与红酵母属海滨红酵母中转录267bp的小核RNA
1.含有pZPK-pPGK-hyg-Tnos-b’-B载体的农杆菌工程菌株的构建
构建的pZPK-pPGK-hyg-Tnos-b’-B载体采用电击转化法转化至农杆菌AGL1中，于含有50ng/μL 卡那霉素的LB平板上挑取转化子。卡那霉素抗性农杆菌转化子首先采用菌落PCR的方法进行验证。验证正确的转化子，命名为AGL1/pZPK-HYG-Ppho89-b’-B，保存备用。
2.载体pZPK-pPGK-hyg-Tnos-b’-B经ATMT分别整合到红酵母属深红酵母CGMCC2.279、红酵母属胶红酵母CGMCC 2.22与红酵母属海滨红酵母染色体上
红酵母属深红酵母CGMCC 2.279、红酵母属胶红酵母CGMCC 2.22与红酵母属海滨红酵母分别购自于酵母菌种保藏中心(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。取一环活化后的红酵母属深红酵母CGMCC 2.279、红酵母属胶红酵母CGMCC 2.22与红酵母属海滨红酵母，分别接种于5ml YEPD(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中，25℃，200r/min过夜培养。用无菌水洗涤一遍后，调节至OD600＝1-2，备用。
步骤1获得的重组农杆菌AGL1/pZPK-HYG-Ppho89-b’-B接种于5mL含有卡那霉素(100ng/μL) 和利福平(80ng/μL)的LB液体中，250℃，200r/min培养过夜。用无菌水洗涤一遍，调节至OD600＝1-3，备用。
取上述红酵母属深红酵母CGMCC 2.279及农杆菌稀释液各200μL，混匀，按实施例6步骤2进行ATMT操作，直至转化子出现。红酵母属胶红酵母CGMCC 2.22、红酵母属海滨红酵母与农杆菌也按照相同步骤进行操作。
3.红酵母属深红酵母CGMCC 2.279、红酵母属胶红酵母CGMCC 2.22与红酵母属海滨红酵母转化子的RT-PCR验证
从筛选平板上分别任意挑取3个单菌落接种到10mL YEPD液体培养基(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中，于30℃摇床培养24h，再以1:50的体积比例将菌液分别转接到100mL YEPD液体培养基中，于30℃摇床培养14h达对数生长期。总RNA提取步骤参考实施例6。取1μg RNA作为模板，按照TakaRa公司PrimeScriptTMRTreagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒标准步骤进行反转录。PCR扩增：2×rTaq mix25.0μL，上游引物(a-B-F 50mmol/L)1.0μL，下游引物(a-B-R:50mmol/L)1.0μL，反转录混合液1.0μL作为模板，ddH2O补加至50μL，同时 GAPDH-F、GAPDH-R扩增GAPDH作为内参对照。94℃保温3min，然后于98℃保温10s，55℃ 10s，72℃1min，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。扩增产物进行2％(质量/体积浓度) 琼脂糖凝胶电泳。结果见图4。说明在红酵母属深红酵母CGMCC 2.279、红酵母属胶红酵母CGMCC 2.22 与红酵母属海滨红酵母中，片段b’具有RNA聚合酶III型启动子功能，能够启动小核RNA表达。
实施例10：启动子b’在红酵母属禾本红酵母CGMCC 2.4202与红酵母属粘红酵母中转录99bp的sgRNA
1.含有pZPK-pPGK-hyg-Tnos-b’-C载体的农杆菌工程菌株的构建
构建的pZPK-pPGK-hyg-Tnos-b’-C载体采用电击转化法转化至农杆菌AGL1中，于含有50ng/μL 卡那霉素的LB平板上挑取转化子。卡那霉素抗性农杆菌转化子首先采用菌落PCR的方法进行验证。验证正确的转化子，命名为AGL1/pZPK-HYG-Ppho89-b’-C，保存备用。
2.载体pZPK-pPGK-hyg-Tnos-b’-C经ATMT分别整合到红酵母属禾本红酵母CGMCC2.4202与红酵母属粘红酵母染色体上
禾本红酵母CGMCC 2.4202购自于日本微生物菌种保藏中心(JCM)，粘红酵母NCYC2666购自于英国国家酵母菌种保藏中心(National Collection of Yeast Cultures，NCYC)。取一环活化后的红酵母属禾本红酵母CGMCC 2.4202与红酵母属粘红酵母，分别接种于5ml YEPD(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中，25℃，200r/min过夜培养。用无菌水洗涤一遍后，调节至OD600＝1-2，备用。
步骤1获得的重组农杆菌AGL1/pZPK-HYG-Ppho89-b’-C接种于5mL含有卡那霉素(100ng/μL) 和利福平(80ng/μL)的LB液体中，250℃，200r/min培养过夜。用无菌水洗涤一遍，调节至OD600＝1-3，备用。
取上述红酵母属禾本红酵母CGMCC 2.4202及农杆菌稀释液各200μL，混匀，按实施例6步骤2 进行ATMT操作，直至转化子出现。红酵母属粘红酵母与农杆菌也按照相同步骤进行操作。
3.红酵母属禾本红酵母CGMCC 2.4202与红酵母属粘红酵母转化子的RT-PCR验证
从筛选平板上分别任意挑取3个单菌落接种到10mL YEPD液体培养基(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中，于30℃摇床培养24h，再以1:50的体积比例将菌液分别转接到100mL YEPD液体培养基中，于30℃摇床培养14h达对数生长期。总RNA提取步骤参考实施例6。取1μg RNA作为模板，按照TakaRa公司PrimeScriptTMRTreagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒标准步骤进行反转录。PCR扩增：2×rTaq mix25.0μL，上游引物(a-C-F 50mmol/L)1.0μL，下游引物(a-C-R:50mmol/L)1.0μL，反转录混合液1.0μL作为模板，ddH2O补加至50μL，同时 GAPDH-F、GAPDH-R扩增GAPDH作为内参对照。94℃保温3min，然后于98℃保温10s，55℃ 10s，72℃1min，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。扩增产物进行2％(质量/体积浓度) 琼脂糖凝胶电泳。结果见图5。说明在红酵母属禾本红酵母CGMCC 2.4202与红酵母属粘红酵母中，片段b’具有RNA聚合酶III型启动子功能，能够转录非编码RNA。
实施例11：启动子b’在圆红冬孢酵母ATCC 10788中转录SiRNA
小干扰RNA(Small interfering RNA；siRNA)也被称为短干扰RNA(shortinterfering RNA)或沉默RNA(silencing RNA)，是一个25核苷酸左右的双股RNA，在生物学上有许多不同的用途。目前已知siRNA可在多个特种中调节基因的表达(Drinnenberg IA,et al.RNAi in budding yeast.Science. 2009,326(5952):544–550)。
1.含有pZPK-pPGK-hyg-Tnos-b’-D载体的农杆菌工程菌株的构建
构建的pZPK-pPGK-hyg-Tnos-b’-D载体采用电击转化法转化至农杆菌AGL1中，于含有50ng/μL 卡那霉素的LB平板上挑取转化子。卡那霉素抗性农杆菌转化子首先采用菌落PCR的方法进行验证。验证正确的转化子，命名为AGL1/pZPK-HYG-Ppho89-b’-D，保存备用。
2.载体pZPK-pPGK-hyg-Tnos-b’-D经ATMT整合到圆红冬孢酵母ATCC 10788s染色体上
取一环活化后的圆红冬孢酵母ATCC 10788，分别接种于5ml YEPD(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中，25℃，200r/min过夜培养。用无菌水洗涤一遍后，调节至OD600＝1-2，备用。
步骤1获得的重组农杆菌AGL1/pZPK-HYG-Ppho89-b’-D接种于5mL含有卡那霉素(100ng/μL) 和利福平(80ng/μL)的LB液体中，250℃，200r/min培养过夜。用无菌水洗涤一遍，调节至OD600＝1-3，备用。
取上述圆红冬孢酵母ATCC 10788及农杆菌稀释液各200μL，混匀，按实施例6步骤2进行ATMT 操作，直至转化子出现。
3.圆红冬孢酵母ATCC 10788转化子的RT-PCR验证
从筛选平板上分别任意挑取3个单菌落接种到10mL YEPD液体培养基(葡萄糖20.0g/L，酵母提取物10.0g/L，蛋白胨20.0g/L，pH 6.0)中，于30℃摇床培养24h，再以1:50的体积比例将菌液分别转接到100mL YEPD液体培养基中，于30℃摇床培养14h达对数生长期。总RNA提取步骤参考实施例6。取1μg RNA作为模板，按照TakaRa公司PrimeScriptTMRTreagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒标准步骤进行反转录。PCR扩增：2×rTaq mix25.0μL，上游引物(a-A-F 50mmol/L)1.0μL，下游引物(a-A-R:50mmol/L)1.0μL，反转录混合液1.0μL作为模板，ddH2O补加至50μL，同时 GAPDH-F、GAPDH-R扩增GAPDH作为内参对照。94℃保温3min，然后于98℃保温10s，55℃ 10s，72℃1min，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳发现有目的条带。说明圆红冬孢酵母ATCC 10788中，片段b’具有RNA聚合酶III型启动子功能，能够转录非编码SiRNA。
序列表
<110> 中国科学院大连化学物理研究所
<120> 圆红冬孢酵母RNA聚合酶III型启动子及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 246
<212> DNA
<213> 圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)
<400> 1
gttgaagtcc tccgtgaagc tcaccctcgc ctgaccgggg gctctcaccg tcgtcggctg 60
cgctcgctcg agacgacgcc gccgactggc cgcgttacca cttgtcgtcg ccgcacacaa 120
aagcacttct aatatgtacg ttctcgtgtc tgatcgactt tctctcagca cccctacggg 180
ggttgcatac aataaacttg ttcgtcgagc cacatgcacg gatatcttcc agcgacttcg 240
gtcttg 246
<210> 2
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60
ggcaccgagt cggtggtgct ttttttgttt tttatgtct 99

Claims (10)

1.RNA聚合酶III型启动子，其特征在于：
所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种DNA表达盒，其特征在于：
含有权利要求1所述启动子的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于：所述的表达盒还含有非编码RNA的核苷酸序列，位于SEQ ID NO：1所示的序列的下游并与之直接相连接。
4.一种包含权利要求2-3中任一项所述的DNA表达盒的重组载体，其特征在于：所述载体为游离型或者整合型载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述的整合型载体为农杆菌介导表达载体，或者为携带有靶基因翼侧1500-4000碱基同源重组臂的同源重组载体。
6.权利要求5所述的重组载体，其特征在于：其中所述农杆菌介导的双元表达载体选自pZPK或pPZP200。
7.权利要求4所述的重组载体，其特征在于：其中所述游离型载体选自大肠杆菌克隆载体或酵母穿梭载体。
8.权利要求7所述的重组载体，其特征在于：其中所述游离型载体选自pMD18-T、pUC18、pYES2c/t或pYX212。
9.一种包含权利要求4所述的重组载体的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为大肠杆菌细胞或酵母细胞。
10.一种用于产油酵母遗传表达的表达系统，其特征在于：所述表达系统包含：
（1）能够在红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属或红酵母属菌株中表达的改良载体，所述改良载体通过在能够在上述酵母属中整合表达或游离表达的质粒中插入权利要求1所述启动子的核苷酸序列构建获得，并且所述载体还包含选择性标记基因用于筛选重组子；和
（2）非编码RNA的核苷酸序列中的一种或二种以上，其能够可操作性地插入到（1）所述的改良载体中，且位于权利要求1所述启动子的核苷酸序列的下游并与之直接连接，和
（3）红冬孢酵母属、锁掷酵母属、掷孢酵母属或红酵母属菌株中的一种或二种以上。
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