CN103525854A - 高基因敲除效率的谢瓦氏曲霉间型变种工程菌株的构建方法 - Google Patents
高基因敲除效率的谢瓦氏曲霉间型变种工程菌株的构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高基因敲除效率的谢瓦氏曲霉间型变种工程菌株的构建方法，本发明由克隆ku70基因3’端和5’端DNA片段，构建ku70基因敲除载体，根癌农杆菌介导的转化，ku70基因敲除突变菌株的鉴定，本发明获得的谢瓦氏曲霉间型变种的工程菌株与亲本谢瓦氏曲霉间型变种相比，生长速率略慢，其他表型未见明显变化，并且遗传稳定，可以作为受体菌株进行基因功能的敲除验证。本发明的谢瓦氏曲霉间型变种的工程菌株作为受体菌株，基因敲除效率较高，易于获得基因敲除突变菌株，减少了繁重的筛选工作。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物技术，尤其是一种高基因敲除效率的谢瓦氏曲霉间型变种工程菌株的构建方法。
背景技术
谢瓦氏曲霉间型变种俗称“金花”菌，是茯砖茶发花过程中的优势菌种，其闭囊壳即“金花”数量决定着茯砖茶的品质(彭小赟，赵运林，何小书，雷存喜，刘石泉，周晓梅，董萌，胡志远 2011)。目前，谢瓦氏曲霉间型变种的命名还存在争议，这可能是由于取材和鉴定方法的差异造成的(丁婷，吕嘉枥 2012; 胡治远，赵运林，刘石泉，李燕子，许永立 2012)，其中1990年刘作易等采用电镜的方法将“金花”菌鉴定为谢瓦氏曲霉间型变种(刘作易，秦京，王迺亮 1990)。茯砖茶是一种重要的“边销茶”，在西南和西北少数民族地区很受欢迎。谢瓦氏曲霉间型变种在茯砖茶上生长使茯砖茶具有一定的保健功能，主要体现在降脂减肥、促进消化、抗肿瘤功能和安全性可靠等方面(邓放明，龚舒莉，杨伟丽 2007; 黄群，陈林杰，李颜坡，车科 2007; 丁婷，吕嘉枥，侯蓓 2011; 袁勇 2011)。谢瓦氏曲霉间型变种在低渗条件下培养只产生子囊孢子，在高渗条件下培养只产生分生孢子，是研究丝状真菌有性繁殖和无性繁殖发生机制的良好材料(刘作易，秦京，李乃亮 1991)。因此，对谢瓦氏曲霉间型变种展开分子生物学研究既具有生产价值有具有理论意义。目前，谢瓦氏曲霉间型变种的分子生物学研究工作主要包括构建了根癌农杆菌介导的遗传转化体系和基因表达的差减文库以及产孢相关基因的克隆(马权，刘永翔，刘作易 2011; 王海，谭玉梅，刘永翔，王阶平，刘作易 2012; 谭玉梅，王海，刘永翔，刘作易 2013)。谢瓦氏曲霉间型变种有性产孢相关基因功能的研究工作以及全基因组和转录组测序工作已经开展。然而，较低的基因敲除效率阻碍了谢瓦氏曲霉间型变种的基因功能的研究工作。
作为外源DNA片段，基因敲除盒是通过DSBs修复机制整合到宿主细胞基因组上的。真核细胞的DSBs修复主要有两个途径：同源重组（homologous recombination，HR）和非同源末端交联（non-homologous end joining，NHEJ）。HR需要同源序列，当基因敲除盒通过HR途径整合到宿主细胞基因组上时便发生基因敲除。NHEJ不依赖同源序列，基因敲除盒通过NHEJ随机整合到宿主细胞基因组。一般认为，NHEJ与HR是竞争的，主要体现在Ku蛋白对HR的抑制(Krappmann 2007; Kass and Jasin 2010)。丝状真菌偏爱NHEJ途径，因此基因敲除效率较低。为提高HR的频率，得到较高的基因敲除效率，通常采用阻断NHEJ途径的策略，主要是敲除NHEJ途径的关键基因ku70或ku80。
发明内容
本发明的目的是：提供一种高基因敲除效率的谢瓦氏曲霉间型变种工程菌株的构建方法，通过本发明获得的工程菌株的基因敲除效率较高，能减少从大量转化子中获得基因敲除突变菌株的筛选工作。
本发明是这样实现的：高基因敲除效率的谢瓦氏曲霉间型变种工程菌株的构建方法，具体包括以下步骤：
步骤（1）：以谢瓦氏曲霉间型变种基因组DNA为模板，采用引物P12和P13扩增Ku70基因3’端DNA片段D，用引物P10和P11扩增Ku70基因5’端DNA片段U；引物对P12的序列为5’-CTAGTCTAGACCCGACAAGCCTGAGGACAA-3’；引物对P13的序列为5’-TCCTGAGCTCACGCTCTCTTCTATCAGACCCT-3’；引物P10的序列为5’-CCCAAGCTTTCAACCACCACCATCCGTCTC-3’；引物P11的序列为5’-CGGAATTCAATGTGACCTGCTCGCCTCC-3’；
步骤（2）：XbaⅠ和SacⅠ双酶切DNA片段D和质粒pDHt/sknt，纯化后连接得到重组质粒pDHt/sknt-D；HindⅢ和EcoRⅠ双酶切DNA片段U和质粒pDHt/sknt-D，纯化后连接得到重组质粒pDHt/sknt-D-U，即为ku70基因敲除载体；
步骤（3）：将Ku70基因敲除载体通过冻融法转入根癌农杆菌LBA4404菌株；含正确Ku70基因敲除载体的根癌农杆菌LBA4404菌株在含50μg/ml卡那霉素的LB平板上划线，在28℃下培养48h；挑取根癌农杆菌单菌落接种于含50μg/ml卡那霉素的基础培养基中，在28℃下，220r/min 培养48h；取1-2ml菌液用诱导培养基稀释到吸光度为0.15，然后在28℃下，220 r/min诱导培养至OD600为0.45-0.50；取100 μl诱导活化的根癌农杆菌菌液和100μl 1×106个/ml的分生孢子液混匀，涂布在共培养培养基平板上，在28℃下共培养48h；将融化的MYA固体培养基，MYA固体培养基含8 μg/ml的G418以及300μg/ml的氨苄青霉素，均匀倒在共培养平板上，在28℃下培养至出现抗性菌落；挑取转化子单菌落转接到含200μg/ml G418的固体培养基平板上，MYA培养基中NaCl的质量百分比为5%，在28℃下培养5天，然后收集转化子菌丝；
步骤（4）：提取G418抗性转化子基因组DNA，用引物P14和P15进行PCR验证，引物P14的序列为5’-GCGAAGAGCCTCAGATTGC-3’，引物P15的序列为5’-GCCACTGCTTACCTTGTCTATC-3’； 筛选出PCR产物为2611bp的转化子菌株，初步鉴定为Ku70基因敲除突变菌株；筛选出PCR产物为2611bp的Ku70基因敲除突变菌株；
步骤（5）制备初步鉴定为Ku70基因敲除突变菌株；的分生孢子，进行单孢分离；提取单孢分离后菌株的基因组DNA，用引物P14和P15进行PCR验证； PCR产物为2611bp的菌株初步鉴定为Ku70基因敲除突变菌株，提取基因组DNA，分别用EcoRⅠ和SacⅠ酶切，然后电泳并进行southern blot验证；采用引物nptF（5’-ATCGACTCGAGATGATTGAACAAGATGGATTG-3’）和nptRV(5’- GACGATATCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3’)，以质粒pUR5750为模板，制备southern blot探针；采用CTAB法提取基因组DNA，分别用EcoRⅠ和SacⅠ酶切酶切基因组DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳；EcoRⅠ和SacⅠ分别酶切基因组DNA的southern blot条带均为一条带，表明再次鉴定的Ku70基因敲除突变菌株为 Ku70基因敲除突变菌株。
为了验证本发明的效果进行了如下实验：
1、 材料与方法
材料：谢瓦氏曲霉间型变种菌株（GZAAS20.1004）由本实验室分离保存。根癌农杆菌菌株LBA4404和大肠杆菌DH5α菌株由本实验室保存。质粒flbA基因敲除载体pDHt/sk-FA和veA基因敲除载体pDHt/sk-VF由本实验室保存。
方法：1 根癌农杆菌介导的基因敲除
取-70℃保存的含基因敲除载体的根癌农杆菌LBA4404菌株，在含50 μg/mL kan的LB平板上划线，28℃培养48 h；挑取根癌农杆菌单菌落接种于含50 μg/mL kan的MM培养基中，28℃ 220 r/min 培养48h；取1-2ml菌液用IM培养基稀释到OD600=0.15，28℃ 220 r/min诱导培养至OD600=0.4-0.5；取100 μL诱导活化的根癌农杆菌菌液和100 μL 浓度为每毫升1×106个的分生孢子液混匀，涂布在共培养培养基平板上，28℃共培养48h；采用MYA培养基（60 μg/mL HygB, 300 μg/mL Amp）做选择培养基；将融化的选择培养基均匀倒在共培养平板上，28℃培养至出现HygB抗性菌落；挑取转化子单菌落转接到含含60 μg/mL HygB的MYA（5% NaCl）平板上，28℃培养5天，收集菌丝。
2 veA和flbA基因敲除菌株的鉴定
采用CTAB法提取转化子基因组DNA，veA基因敲除菌株PCR验证引物为P16和P17，野生型菌株的PCR产物为715bp， veA基因敲除菌株PCR产物为2153bp。flbA基因敲除菌株PCR验证引物为P27和P28，野生型菌株的PCR产物为897bp，flbA基因敲除菌株的PCR产物为2236bp。引物P16的序列为：5’-GTCTCAGGCTGGCTACTTCA-3’；引物P17的序列为：5’-TGACAGATGAGGCGAGTATGG-3’；引物P27的序列为：5’-GCGTGCGATTCACCCGTTATG-3’；引物P28的序列为：5’-TGCTGGAGACGGGCGTTGTTC-3’。
3 基因敲除效率的验证
采用方法2中的根癌农杆菌介导的基因敲除法，分别以野生型谢瓦氏曲霉间型变种菌株和Ku70基因敲除突变菌株为受体菌株敲除veA基因和flbA菌株，并采用方法3中的方法鉴定veA基因敲除菌株和flbA基因敲除菌株。
4 基因敲除效率的比较
根据上述实验得知，
由于采用了上述技术方案，本发明由克隆ku70基因3’端和5’端DNA片段，构建ku70基因敲除载体，根癌农杆菌介导的转化，ku70基因敲除突变菌株的鉴定，本发明获得的谢瓦氏曲霉间型变种的工程菌株与亲本谢瓦氏曲霉间型变种相比，生长速率略慢，其他表型未见明显变化，并且遗传稳定，可以作为受体菌株进行基因功能的敲除验证。本发明的谢瓦氏曲霉间型变种的工程菌株作为受体菌株，基因敲除效率较高，易于获得基因敲除突变菌株，减少了繁重的筛选工作。
具体实施方式
本发明的实施例：高基因敲除效率的谢瓦氏曲霉间型变种工程菌株的构建方法，具体包括以下步骤：
步骤（1）：以谢瓦氏曲霉间型变种基因组DNA为模板，采用引物P12和P13扩增Ku70基因3’端DNA片段D，用引物P10和P11扩增Ku70基因5’端DNA片段U；引物对P12的序列为5’-CTAGTCTAGACCCGACAAGCCTGAGGACAA-3’；引物对P13的序列为5’-TCCTGAGCTCACGCTCTCTTCTATCAGACCCT-3’；引物P10的序列为5’-CCCAAGCTTTCAACCACCACCATCCGTCTC-3’；引物P11的序列为5’-CGGAATTCAATGTGACCTGCTCGCCTCC-3’；
步骤（2）：XbaⅠ和SacⅠ双酶切DNA片段D和质粒pDHt/sknt，纯化后连接得到重组质粒pDHt/sknt-D；HindⅢ和EcoRⅠ双酶切DNA片段U和质粒pDHt/sknt-D，纯化后连接得到重组质粒pDHt/sknt-D-U，即为ku70基因敲除载体；
步骤（3）：将Ku70基因敲除载体通过冻融法转入根癌农杆菌LBA4404菌株；含正确Ku70基因敲除载体的根癌农杆菌LBA4404菌株在含50μg/ml卡那霉素的LB平板上划线，在28℃下培养48h；挑取根癌农杆菌单菌落接种于含50μg/ml卡那霉素的基础培养基中，在28℃下，220r/min 培养48h；取1-2ml菌液用诱导培养基稀释到吸光度为0.15，然后在28℃下，220 r/min诱导培养至OD600为0.45-0.50；取100 μl诱导活化的根癌农杆菌菌液和100μl 1×106个/ml的分生孢子液混匀，涂布在共培养培养基平板上，在28℃下共培养48h；将融化的MYA固体培养基，MYA固体培养基含8 μg/ml的G418以及300μg/ml的氨苄青霉素，均匀倒在共培养平板上，在28℃下培养至出现抗性菌落；挑取转化子单菌落转接到含200μg/ml G418的固体培养基平板上，MYA培养基中NaCl的质量百分比为5%，在28℃下培养5天，然后收集转化子菌丝；
步骤（4）：提取G418抗性转化子基因组DNA，用引物P14和P15进行PCR验证，引物P14的序列为5’-GCGAAGAGCCTCAGATTGC-3’，引物P15的序列为5’-GCCACTGCTTACCTTGTCTATC-3’； 筛选出PCR产物为2611bp的转化子菌株，初步鉴定为Ku70基因敲除突变菌株；筛选出PCR产物为2611bp的Ku70基因敲除突变菌株；
步骤（5）制备初步鉴定为Ku70基因敲除突变菌株；的分生孢子，进行单孢分离；提取单孢分离后菌株的基因组DNA，用引物P14和P15进行PCR验证； PCR产物为2611bp的菌株初步鉴定为Ku70基因敲除突变菌株，提取基因组DNA，分别用EcoRⅠ和SacⅠ酶切，然后电泳并进行southern blot验证；采用引物nptF（5’-ATCGACTCGAGATGATTGAACAAGATGGATTG-3’）和nptRV(5’- GACGATATCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3’)，以质粒pUR5750为模板，按照深圳莱伯克DIG DNA标记试剂盒II说明书制备southern blot探针；采用CTAB法提取基因组DNA，分别用EcoRⅠ和SacⅠ酶切酶切基因组DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳；DNA转膜参照《分子克隆实验指南》第三版碱性转移法；杂交过程参照深圳莱伯克地高辛杂交检测试剂盒I说明书；EcoRⅠ和SacⅠ分别酶切基因组DNA的southern blot条带均为一条带，表明再次鉴定的Ku70基因敲除突变菌株为 Ku70基因敲除突变菌株。
本发明采用的基础培养基与诱导培养基均采用本领域技术人员公知的基础培养基与诱导培养基。
SEQUENCE LISTING
序列表
<110> 生物技术研究所
<120> 高基因敲除效率的谢瓦氏曲霉间型变种工程菌株的构建方法
<130> nm:
<160> 12
<170> PatentIn version
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 根据ku70基因DNA序列，应用prime premier 6.0软件设计，用于扩增ku70基因的3’端DNA序列。
<400> 1
CTAGT CTAGA CCCGA CAAGC CTGAG GACAA 30
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 根据ku70基因DNA序列，应用prime premier 6.0软件设计，用于扩增ku70基因的3’端DNA序列。
<400> 2
TCCTG AGCTC ACGCT CTCTT CTATC AGACC CT 32
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 根据ku70基因DNA序列，应用prime premier 6.0软件设计，用于扩增ku70基因的5’端DNA序列。
<400> 3
CCCAA GCTTT CAACC ACCAC CATCC GTCTC 30
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 根据ku70基因DNA序列，应用prime premier 6.0软件设计，用于扩增ku70基因的5’端DNA序列。
<400> 4
CGGAA TTCAA TGTGA CCTGC TCGCC TCC 28
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 根据ku70基因DNA序列，应用prime premier 6.0软件设计，用于扩增ku70基因的敲除区域的DNA序列。
<400> 5
GCGAA GAGCC TCAGA TTGC 19
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 根据ku70基因DNA序列，应用prime premier 6.0软件设计，用于扩增ku70基因的敲除区域的DNA序列。
<400> 6
GCCAC TGCTT ACCTT GTCTA TC 22
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 根据质粒pUR5750的DNA序列，应用prime premier 6.0软件设计，用于扩增nptⅡ基因的DNA序列，制备nptⅡ基因的探针。
<400> 7
ATCGACTCGA GATGA TTGAA CAAGA TGGAT TG 32
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 根据质粒pUR5750的DNA序列，应用prime premier 6.0软件设计，用于扩增nptⅡ基因的DNA序列，制备nptⅡ基因的探针。
<400> 8
GACGA TATCT CAGAA GAACT CGTCA AGAAG GC 32
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据veA基因DNA序列，应用prime premier 6.0软件设计，用于扩增veA基因的敲除区域的DNA序列。
<400> 9
GTCTC AGGCT GGCTA CTTCA 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据veA基因DNA序列，应用prime premier 6.0软件设计，用于扩增veA基因的敲除区域的DNA序列。
<400> 10
TGACA GATGA GGCGA GTATG G 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据flbA基因DNA序列，应用prime premier 6.0软件设计，用于扩增flbA基因的敲除区域的DNA序列。
<400> 11
GCGTG CGATT CACCC GTTAT G 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>根据flbA基因DNA序列，应用prime premier 6.0软件设计，用于扩增flbA基因的敲除区域的DNA序列。
<400> 12
TGCTG GAGAC GGGCG TTGTT C 21
Claims (1)
1.一种高基因敲除效率的谢瓦氏曲霉间型变种工程菌株的构建方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
步骤（1）：以谢瓦氏曲霉间型变种基因组DNA为模板，采用引物P12和P13扩增Ku70基因3’端DNA片段D，用引物P10和P11扩增Ku70基因5’端DNA片段U；引物对P12的序列为5’-CTAGTCTAGACCCGACAAGCCTGAGGACAA-3’；引物对P13的序列为5’-TCCTGAGCTCACGCTCTCTTCTATCAGACCCT-3’；引物P10的序列为5’-CCCAAGCTTTCAACCACCACCATCCGTCTC-3’；引物P11的序列为5’-CGGAATTCAATGTGACCTGCTCGCCTCC-3’；
步骤（2）：XbaⅠ和SacⅠ双酶切DNA片段D和质粒pDHt/sknt，纯化后连接得到重组质粒pDHt/sknt-D；HindⅢ和EcoRⅠ双酶切DNA片段U和质粒pDHt/sknt-D，纯化后连接得到重组质粒pDHt/sknt-D-U，即为ku70基因敲除载体；
步骤（3）：将Ku70基因敲除载体通过冻融法转入根癌农杆菌LBA4404菌株；含正确Ku70基因敲除载体的根癌农杆菌LBA4404菌株在含50μg/ml卡那霉素的LB平板上划线，在28℃下培养48h；挑取根癌农杆菌单菌落接种于含50μg/ml卡那霉素的基础培养基中，在28℃下，220r/min 培养48h；取1-2ml菌液用诱导培养基稀释到吸光度为0.15，然后在28℃下，220 r/min诱导培养至OD600为0.45-0.50；取100 μl诱导活化的根癌农杆菌菌液和100μl 1×106个/ml的分生孢子液混匀，涂布在共培养培养基平板上，在28℃下共培养48h；将融化的MYA固体培养基，MYA固体培养基含8 μg/ml的G418以及300μg/ml的氨苄青霉素，均匀倒在共培养平板上，在28℃下培养至出现抗性菌落；挑取转化子单菌落转接到含200μg/ml G418的固体培养基平板上，MYA培养基中NaCl的质量百分比为5%，在28℃下培养5天，然后收集转化子菌丝；
步骤（4）：提取G418抗性转化子基因组DNA，用引物P14和P15进行PCR验证，引物P14的序列为5’-GCGAAGAGCCTCAGATTGC-3’，引物P15的序列为5’-GCCACTGCTTACCTTGTCTATC-3’； 筛选出PCR产物为2611bp的转化子菌株，初步鉴定为Ku70基因敲除突变菌株；筛选出PCR产物为2611bp的Ku70基因敲除突变菌株；
步骤（5）制备初步鉴定为Ku70基因敲除突变菌株；的分生孢子，进行单孢分离；提取单孢分离后菌株的基因组DNA，用引物P14和P15进行PCR验证；PCR产物为2611bp的菌株初步鉴定为Ku70基因敲除突变菌株，提取基因组DNA，分别用EcoRⅠ和SacⅠ酶切，然后电泳并进行southern blot验证；采用引物nptF和nptRV，以质粒pUR5750为模板，制备southern blot探针；采用CTAB法提取基因组DNA，分别用EcoRⅠ和SacⅠ酶切酶切基因组DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳；EcoRⅠ和SacⅠ分别酶切基因组DNA的southern blot条带均为一条带，表明再次鉴定的Ku70基因敲除突变菌株为 Ku70基因敲除突变菌株。
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| CN (1) | CN103525854A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107119063A (zh) * | 2017-05-17 | 2017-09-01 | 上海市农业科学院 | 一种提高蛹虫草中虫草素含量的方法 |
| CN110438018A (zh) * | 2019-08-21 | 2019-11-12 | 江南大学 | 一种快速构建曲霉重组菌株的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101117639A (zh) * | 2007-06-28 | 2008-02-06 | 贵州省生物技术研究所 | 农杆菌介导马铃薯转hrap基因获得抗病性表达的方法 |
-
2013
- 2013-10-10 CN CN201310467876.2A patent/CN103525854A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101117639A (zh) * | 2007-06-28 | 2008-02-06 | 贵州省生物技术研究所 | 农杆菌介导马铃薯转hrap基因获得抗病性表达的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| SVEN KRAPPMANN ET AL.: "Gene targeting in Aspergillus fumigatus by homologous recombination is facilitated in a nonhomologous end-joining-deficient genetic background", 《EUKARYOTIC CELL》 * |
| VERA MEYER ET AL.: "Highly efficient gene targeting in the Aspergillus niger kusA mutant.", 《JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》 * |
| 王海等: "根癌农杆菌介导谢瓦氏曲霉间型变种的遗传转化", 《西南农业学报》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107119063A (zh) * | 2017-05-17 | 2017-09-01 | 上海市农业科学院 | 一种提高蛹虫草中虫草素含量的方法 |
| CN110438018A (zh) * | 2019-08-21 | 2019-11-12 | 江南大学 | 一种快速构建曲霉重组菌株的方法 |
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