CN114107299B - 一种用于靶向敲除鸭cGAS基因的sgRNA及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于靶向敲除鸭cGAS基因的sgRNA及其应用，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.2所示，所述sgRNA对应的互补链序列如SEQ ID NO.3所示。本发明利用特异性靶向敲除鸭cGAS基因的sgRNA重组慢病毒质粒cGAS‑pSpCas9(BB)‑2A‑Puro(PX459)，利用CRISPR/Cas9系统达到基因位点精准敲除，通过药物筛选获得稳定敲除鸭cGAS基因的细胞株，并利用测序验证鸭cGAS基因的敲除效果。本发明提供的sgRNA能精准敲除鸭cGAS基因，为cGAS在水禽抗病毒天然免疫中的功能研究奠定基础。

Description

一种用于靶向敲除鸭cGAS基因的sgRNA及其应用
技术领域
本发明主要涉及生物技术领域，具体涉及一种用于靶向敲除鸭cGAS基因的sgRNA及其应用，还涉及一种通过CRISPR/cas9技术敲除鸭cGAS基因的基因编辑技术及其应用。
背景技术
CRISPR/Cas9基因编辑技术是指通过向目的细胞引入整合好Cas9蛋白、gRNA序列及其其他表达元件的质粒，从而使目的细胞产生带有特定基因识别位点的Cas限制性核酸内切酶对细胞特定基因组进行切割，进而使目的基因出现缺失、插入引起移码突变等现象，在蛋白翻译水平上使目的蛋白构象发生改变并让目的蛋白失去生理活性。CRISPR/Cas9技术高效、特异性强，现已广泛用于基因功能的探索和生物医学领域的研究。该项技术发现者Emmanuelle Charpentier和Jennifer A.Doudna博士于2020年获得诺贝尔化学奖。
环GMP-AMP合酶(cGAS)于2014年被证实为DNA细胞质传感器，隶属于核苷酸转移酶(Ntases)家族。cGAS识别细菌、DNA病毒和逆转录病毒的DNA/RNA并通过催化ATP和GTP合成第二信使cGAMP与STING结合诱导I型IFN产生，实现细胞抗病毒天然免疫。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于精确敲除鸭cGAS基因的sgRNA及其应用。为cGAS在水禽抗病毒天然免疫中的功能研究奠定基础。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种用于靶向敲除鸭cGAS基因的sgRNA，所述sgRNA位于cGAS基因序列的第一个外显子(Exon1)区域；所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.2所示，所述sgRNA对应的互补链序列如SEQ ID NO.3所示。
一种包含所述sgRNA的表达载体。
优选的，所述表达载体为cGAS-pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)，所述表达载体cGAS-pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)的构建方法为：
在所述序列SEQ ID NO.2的5’端加上CACC得到正义链，在所述序列SEQ ID NO.3的5’端加上AAAC、3’端加上C得到负义链；分别合成上述正义链和负义链，并将合成的正义链和负义链通过退火杂交形成双链复合物；双链复合物与经过BbsI酶切的pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)载体连接，从而得到表达载体cGAS-pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)。
一种cGAS基因敲除的DEF细胞系，其构建方法为：以所述的表达载体cGAS-pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)作为cGAS基因的打靶载体，转染DEF细胞，获得鸭cGAS基因缺失细胞株。
一种特异性靶向敲除鸭cGAS基因的CRISPR/Cas9系统，所述系统包括所述的sgRNA以及Cas9蛋白序列。
一种利用CRISPR/Cas9系统敲除鸭cGAS基因的方法，它包括如下大致步骤：
步骤一、构建一种特异性靶向鸭cGAS基因的sgRNA，所述的sgRNA位于鸭cGAS基因的第一个外显子，且靶序列唯一。
在步骤一中，对鸭cGAS基因设计了一条sgRNA，所述的sgRNA位于cGAS基因的第一个外显子编码区域，该外显子序列如SEQ ID NO.1所示；
所述的特异性靶向鸭cGAS基因第一个外显子的sgRNA编码链以及互补链序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。
步骤一中，靶向鸭cGAS基因的sgRNA制备方法，包括将合成的sgRNA编码链和互补链退火形成双链DNA，通过T4连接酶将退火配对产物通过BbsI酶切位点拼接至PX459质粒。
步骤二、准备一种特异性靶向敲除鸭cGAS基因的CRISPR/Cas9系统，CRISPR/Cas9系统中含有Cas9蛋白序列和上述特异性靶向鸭cGAS基因的sgRNA，利用的质粒为pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)。
步骤三、合成以pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)为骨架，含有缺失cGAS基因所需的供体质粒，命名为cGAS-pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)。
即将步骤一构建的特异性靶向敲除鸭cGAS基因的sgRNA连接至带有Cas9基因的pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)质粒上，构建形成阳性质粒cGAS-pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)。
步骤四、将步骤三构建的阳性质粒转染至DEF细胞中，利用CRISPR/Cas9系统达到基因位点精准敲除，通过嘌呤霉素筛选获得阳性敲除细胞株。
步骤五、提取阳性敲除细胞株的DNA，cGAS敲除验证引物进行高保真PCR扩增，其验证上游和下游引物序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。
步骤四中构建好的DEF基因缺失细胞靶基因测序如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。
上述利用CRISPR/Cas9系统敲除鸭cGAS基因的方法，用于非疾病治疗目的，它包含如下具体步骤：
(1)在所述sgRNA的序列SEQ ID NO.2的5’端加上CACC得到正义链，在所述序列SEQID NO.3的5’端加上AAAC、3’端加上C得到负义链；分别合成上述正义链和负义链，将合成的正义链和负义链通过退火杂交形成双链复合物；
优选的，步骤(1)中正义链和负义链通过退火杂交形成双链复合物的反应体系为：
所述退火杂交的反应条件为：先95℃下反应5min；之后在95℃的基础上以每分钟降5℃的速度，持续反应3min；最后25℃下反应3min；反应形成的双链复合物于4℃永久保存；
其中，正义链与负义链的序列如下：
sgRNA-F：5’-CACCgtcggggctggtgaaccagg-3’，
sgRNA-R：5’-AAACcctggttcaccagccccgaC-3’。
其中，sgRNA序列合成的方法为：
据GeneBank数据库获得鸭cGas基因组序列，利用BenchlingCrispr/Cas9在线设计网站(https://benchling.com/)在第一个外显子中选取高特异性，低脱靶率，GC含量在35％-50％的sgRNA，再将所挑选的sgRNA通过NCBI blast功能GeneBank数据库收录的鸭基因组序列进行比对，排除具有同源性的sgRNA，送商业公司化学合成sgRNA序列。
所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.2所示，所述sgRNA对应的互补链序列如SEQ IDNO.3所示。接着在所述sgRNA的序列SEQ ID NO.2的5’端加上CACC得到正义链，在所述序列SEQ ID NO.3的5’端加上AAAC、3’端加上C得到负义链；其中，正义链、负义链的序列如上所述。
(2)将步骤(1)制得的双链复合物与经过BbsI酶切的载体pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)连接，得到表达载体即阳性质粒cGAS-pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)；所述阳性质粒cGAS-pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)的具体构建方法如下：
取空载体pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)1μg，使用BbsI核酸内切酶酶切，共50μL体系，其中酶切体系如表1所示，酶切反应条件为：先在37℃下反应15min，再在65℃下反应20min。
将已酶切的空载体质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)与sgRNA双链复合物通过T4连接酶，在25℃下连接15min，其中，连接反应体系(10μL)如表2所示。连接后转化Trans109感受态大肠杆菌，接种带Amp+抗性的固体LB平板，在37℃、CO2细菌培养箱中孵育16h，挑取单菌落接种于带Amp+抗性液体LB，在37℃摇床16h后，将菌液进行测序(利用PX459通用引物)。将含有正确sgRNA序列的pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)质粒的细菌接种于200ml带Amp+抗性的液体LB，在37℃摇床孵育16h，用质粒大提提取试剂盒提取获得阳性质粒cGAS-pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)。
表1
表2
(3)将步骤(2)所得的表达载体转染至培养的DEF细胞中，筛选细胞，获得鸭cGAS基因缺失细胞株，再提取鸭cGAS基因缺失细胞的基因组；具体方法如下：
ATCC MEM(含10％胎牛血清)完全培养基用于细胞培养，在转染前天将ATCC DEF(鸭胚成纤维细胞)传代铺于6孔板内，每孔2ml。待第二天细胞生长至40-60％密度时，按先前构建成功的阳性质粒cGAS-pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)通过非脂质体FuGENE HDTransfection Reagent转染试剂转染至生长细胞内，更换培养基为ATCC MEM(10％胎牛血清)培养基在37℃、6％CO2恒温箱中继续培养24h，24h后换成新鲜的完全培养基(含10％胎牛血清)继续孵化24h。加入Puromycin Dihydrochloride将最终浓度定量至1μg/μL，筛选48h后更换新鲜培养基在37℃、6％CO2恒温箱中继续培养24h。向六孔板中加入0.25％EDTA的胰酶消化液将贴壁细胞消化后置入收集管离心、用PBS溶液重悬，用细胞基因组提取试剂盒(购自QIAGEN)提取鸭胚成纤维细胞基因。
(4)突变基因序列检测：将提取的鸭胚成纤维细胞基因组进行突变位点检测。具体方法为：
将提取的鸭胚成纤维细胞基因组通过cGAS敲除验证引物进行高保真PCR扩增后，回收胶产物连接TA克隆载体，将连接好的载体转化感受态DH5α，涂于带Amp+抗性的固体LB平板，在37℃、CO2细菌培养箱中孵育16h，挑取单菌落接种于带Amp+抗性液体LB，在37℃摇床16h后将菌液进行测序，对突变位点的测序信号进行分析，其中cGAS敲除验证引物序列如下：
cGAS验证引物-正义链：5’-GGTGCTGTCGCAGCTCAG-3’，
cGAS验证引物-负义链：5’-TCTTGACGCGCTCGTAGTAG-3’。
所述的sgRNA在靶向敲除鸭cGAS基因中的应用。
所述的sgRNA在水禽抗病毒天然免疫研究中的应用。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：本发明利用特异性靶向敲除鸭cGAS基因的sgRNA重组慢病毒质粒cGAS-pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)，利用CRISPR/Cas9系统达到基因位点精准敲除，通过药物筛选获得稳定敲除鸭cGAS基因的细胞株，并利用测序验证序鸭cGAS基因的敲除效果。本发明提供的sgRNA能精准敲除鸭cGAS基因，为cGAS在水禽抗病毒天然免疫中的功能研究奠定基础。
附图说明
图1是本发明敲除细胞株提取其基因组通过PCR将产物连于TA载体测序的结果
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
现将通过以下的具体实施例对本发明作进一步的解释，以下所有实施例所设计到的分子生物技术包括细胞的培养、PCR、电泳、细胞转染、等均为本领域研究人员所知的常规技术，所涉及的有关设备及仪器也均为从事本领域研究人员可通过公共途径获取。
实施例一：合成sgRNA
据GeneBank数据库获得鸭cGas基因组序列，利用Benchling在线设计网站(https://benchling.com/)对鸭cGAS基因的第一个外显子区域选取高特异性，低脱靶率，GC含量在35％-50％的sgRNA，再将所挑选的sgRNA通过NCBI blast功能GeneBank数据库收录的鸭基因组序列进行比对，排除具有同源性的sgRNA，送商业公司化学合成sgRNA序列(本发明的sgRNA等序列均委托福州尚亚生物技术有限公司合成)。
所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.2所示，所述sgRNA对应的互补链序列如SEQ IDNO.3所示。
接着，在所述sgRNA的序列SEQ ID NO.2的5’端加上CACC得到正义链，在所述序列SEQ ID NO.3的5’端加上AAAC、3’端加上C得到负义链；
通过化学合成上述正义链和负义链，将合成的正义链和负义链序列引物通过退火杂交形成双链复合物；
其中，正义链和负义链通过退火杂交形成双链复合物的反应体系(50μL体系)为：
所述退火杂交的反应条件为：先95℃下反应5min；之后在95℃的基础上以每分钟降5℃的速度，持续反应3min；最后25℃下反应3min；反应形成的双链复合物于4℃永久保存；
所述正义链与负义链的序列如下所示：
sgRNA-F：5’-CACCgtcggggctggtgaaccagg-3’，
sgRNA-R：5’-AAACcctggttcaccagccccgaC-3’。
实施例二：cGAS-pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)质粒构建及其质粒提取
取空载体pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)1μg使用BbsI核酸内切酶(购自NEWENGLAND BioLabs Inc.)酶切，共50μL体系。其中，酶切体系如表1所示，酶切反应条件为：先在37℃下反应15min，再在65℃下反应20min。
将已酶切的空载体质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)与sgRNA双链复合物通过T4连接酶(购自NEW ENGLAND BioLabs Inc.)，在25℃下连接15min，其中，连接反应体系(10μL)如表2所示，连接产物可于4℃永久保存。连接后进行对Trans109(购自TransZ)感受态大肠杆菌转化，接种带Amp+抗性的固体LB平板，在37℃CO2细菌培养箱中孵育16h挑取单菌落接种于带Amp+抗性液体LB，在37℃摇床16h后将菌液送至福州尚亚生物技术有限公司进行测序(利用PX459通用引物)。将含有正确gRNA序列的pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)质粒的细菌接种于200ml带Amp+抗性的液体LB，在37℃摇床孵育16h，用质粒大提提取试剂盒(购自南京诺维赞生物公司)提取阳性质粒cGAS-pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)。
表1
表2
具体实施例三：细胞转染、细胞基因组提取
ATCC MEM(含10％胎牛血清)完全培养基用于细胞培养，在转染前天将ATCC DEF(鸭胚成纤维细胞)传代铺于6孔板内，每孔2ml。待第二天细胞生长至40-60％密度时，按先前构建成功的质粒cGAS-pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)通过非脂质体FuGENE HDTransfection Reagent转染试剂(购自Promega)转染至生长细胞内，更换培养基为ATCCMEM(10％胎牛血清)培养基在37℃、6％CO2恒温箱中继续培养24h，24h后换成新鲜的完全培养基(含10％胎牛血清)继续孵化24h。加入Puromycin Dihydrochloride将最终浓度定量至1μg/μL，筛选48h后更换新鲜培养基在37℃、6％CO2恒温箱中继续培养24h。向六孔板中加入0.25％EDTA的胰酶消化液将贴壁细胞消化后置入收集管离心、用PBS溶液重悬用细胞基因组提取试剂盒(购自QIAGEN)提取基因组。
具体实施例四：突变基因序列检测
将提取的鸭胚成纤维细胞基因组通过cGAS敲除验证引物进行高保真PCR扩增(高保真酶购自南京诺维赞生物公司)后回收胶产物连接TA克隆载体(购自南京诺维赞生物公司)，将连接好的载体转化感受态DH5α(购自TransZ)后涂于带Amp+抗性的固体LB平板，在37℃、CO2细菌培养箱中孵育16h挑取单菌落接种于带Amp+抗性液体LB，在37℃摇床16h后将菌液送至福州尚亚生物技术有限公司进行测序，对突变位点的测序信号进行分析。敲除细胞株提取其基因组通过PCR连于TA载体测序结果如图1所示。
其中，cGAS敲除验证引物序列如下：
cGAS验证引物-正义链：5’-GGTGCTGTCGCAGCTCAG-3’，
cGAS验证引物-负义链：5’-TCTTGACGCGCTCGTAGTAG-3’。
需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
序列表
<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一种用于靶向敲除鸭cGAS基因的sgRNA及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 384
<212> DNA
<213> 北京鸭源cGAS exon1 序列(cGAS exon1 sequence of Pekin Ducks )
<400> 1
atggagggcc ccggggagcg gcggcagcgg gcggtgcgga gcaaggggag cgccgggcgc 60
ggctcctccg gcggcggcga gccgagggag agggagggcg gccccgcggg cagcgggcgc 120
ggccgccccg ccagggcagc cccgggagga gggaggcggc cggggggctc cgcggagagc 180
ggcggggaag cggcggtggc ggtgcccccg ctgaggctgc gggcggtgct gtcgcagctc 240
agcctgggcc ggagggacgt gtccgaggcg tcggggctgg tgaaccaggt ggtgtcgcac 300
ctcatccagg ccatccgcgg cagggacggc ggcttcggca ccatcagcag gctgggagcc 360
ggcagctact acgagcgcgt caag 384
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 7
<211> 152
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggtgctgtcg cagctcagcc tgggccggcg ggacgtgtcc gaggcgtcgg ggctggtgaa 60
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tgggagccgg cagctactac gagcgcgtca ag 152
<210> 8
<211> 155
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggtgctgtcg cagctcagcc tgggccggcg ggacgtgtcc gaggcgtcgg ggctggtgaa 60
ccaggtcgca cctcatccag gccatccgcg gcagggacgg cggcttcggc accatcagca 120
ggctgggagc cggcagctac tacgagcgcg tcaag 155

Claims (9)

1.一种用于靶向敲除鸭cGAS基因的sgRNA，其特征在于：所述sgRNA位于cGAS基因序列的第一个外显子区域；所述sgRNA的序列如SEQ ID NO.2所示，所述sgRNA对应的互补链序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种包含权利要求1所述sgRNA的表达载体。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体为cGAS-pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) ，所述表达载体cGAS-pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) 的构建方法为：
在权利要求1所述序列SEQ ID NO.2的5’端加上CACC得到正义链，在所述序列SEQ IDNO.3的5’端加上AAAC、3’端加上C得到负义链；分别合成上述正义链和负义链，并将合成的正义链和负义链通过退火杂交形成双链复合物；双链复合物与经过BbsI酶切的pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459)载体连接，从而得到表达载体cGAS-pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) 。
4.一种特异性靶向敲除鸭cGAS基因的CRISPR/Cas9系统，其特征在于：所述系统包括如权利要求1所述的sgRNA以及Cas9蛋白。
5.一种利用CRISPR/Cas9系统敲除鸭cGAS基因的方法，所述的方法用于非疾病治疗目的，其特征在于：它包含如下步骤：
（1）在权利要求1所述序列SEQ ID NO.2的5’端加上CACC得到正义链，在所述序列SEQID NO.3的5’端加上AAAC、3’端加上C得到负义链；分别合成上述正义链和负义链，将合成的正义链和负义链通过退火杂交形成双链复合物；
（2）将步骤（1）制得的双链复合物与经过BbsI酶切的载体pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)连接，得到表达载体；
（3）将步骤（2）所得的表达载体转染至培养的DEF细胞中，筛选细胞，提取鸭胚成纤维细胞基因组；
（4）突变基因序列检测：将提取的鸭胚成纤维细胞基因组进行突变位点检测。
6.根据权利要求5所述的利用CRISPR/Cas9系统敲除鸭cGAS基因的方法，其特征在于：所述正义链与负义链的序列如下：
sgRNA-F：5’- CACCgtcggggctggtgaaccagg- 3’，
sgRNA-R：5’- AAACcctggttcaccagccccgaC -3’。
7.根据权利要求5所述的利用CRISPR/Cas9系统敲除鸭cGAS基因的方法，其特征在于：步骤（4）的具体方法为：
将提取的鸭胚成纤维细胞基因组通过cGAS敲除验证引物进行高保真PCR扩增后，回收胶产物连接TA克隆载体，将连接好的载体转化感受态DH5α，涂于带Amp+抗性的固体LB平板，在37°C CO2细菌培养箱中孵育16h，挑取单菌落接种于带Amp+抗性液体LB，在37°C摇床16h后将菌液进行测序，对突变位点的测序信号进行分析，其中cGAS敲除验证引物序列如下：
cGAS验证引物- 正义链：5’-GGTGCTGTCGCAGCTCAG-3’，
cGAS验证引物-负义链：5’-TCTTGACGCGCTCGTAGTAG -3’。
8.如权利要求1所述的sgRNA在靶向敲除鸭cGAS基因中的应用。
9.如权利要求1所述的sgRNA在鸭抗病毒天然免疫研究中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chicken DNA Sensing cGAS-STING Signal Pathway Mediates Broad Spectrum Antiviral Functions;S. Li等;Vaccines;第8卷(第3期);第2.3节和第2页最后一段 *
Duck cGAS inhibits DNA and RNA virus replication by activating IFNs and antiviral ISGs;C. Lin等;Frontiers in Immunology;第14卷;全文 *
GenBank：XM_027455182.2;NCBI;NCBI;ORIGIN部分 *

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