CN109706148A - 一种用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增强子的gRNA、gRNA组合物以及电转方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增强子的gRNA、gRNA组合物、表达载体、CRISPR‑Cas9 RNP、CRISPR‑Cas9 RNP组合物、CRISPR‑Cas9系统、电转方法和试剂盒及其用途,本发明使用CRISPR‑Cas9技术,对造血干细胞的BCL11A基因进行靶向切割,使得BCL11A基因表达量下降,从而使胎儿血红蛋白表达量提高,有望作为地中海贫血和镰刀型贫血症治疗的新手段。使用CRISPR‑Cas9技术实现BCL11A基因的突变,设计简单、使用便捷、成本低且效率高。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增强子的gRNA、 gRNA组合物以及电转方法。
背景技术
血红蛋白病是影响新生儿健康甚至存活率的遗传性疾病,每年新生患儿超过330000例,主要有镰刀型贫血和地中海贫血两种地中海贫血是一种珠蛋白基因缺陷而引起的遗传性慢性贫血,以β和α型较为常见。目前发现α-地贫的基因突变型至少有81种(46种点突变,35种缺失突变);β-地贫的基因突变型至少有186种,主要为点突变。我国是地贫高发国之一,病例分布于广东、广西、海南、贵州、云南、四川、重庆、福建、湖南、湖北、江西等地,其中广东和广西两省地贫基因缺陷率分别高达10%和20%,病例数占全国总数的2/5以上,已成为社会性的公共卫生问题。并由于多省尚未将地贫筛查纳入孕检常规项目,且近年取消了强制性婚检,加上部分地区基层医务人员对该病认知水平不高,导致近年地贫患儿出生率有上升趋势。镰刀型贫血症为常染色体隐性遗传病。患者因β-肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸所代替,使镰状血红蛋白(HbS)取代了正常Hb(HbA)。在氧分压下降时HbS分子间相互作用,成为溶解度很低的螺旋形多聚体,使红细胞扭曲成镰状细胞(镰变)。临床表现为慢性溶血性贫血、易感染和再发性疼痛危象以致慢性局部缺血导致器官组织损害。镰刀型贫血主要见于非洲黑人,也见于中东、希腊、意大利等地中海沿岸国家以及印度、印第安等,还有与上述地区和民族长期通婚的人群,我国南方也有发现。杂合子状态者占非洲黑人的20%,占美国黑人的8%,杂合子之间通婚子女有1/4几率为纯合子,即导致镰刀型贫血症。该病严重危害母子健康,可使胎儿死亡率达 5%,孕妇死亡率达4.62%。
地中海贫血和镰刀型贫血患者主要通过规范性长期输血和去铁治疗来缓解病症,但这种方式不但不能治愈,也带来较高的临床安全隐患。造血干细胞移植是目前唯一能根治地中海贫血和镰刀型贫血的治疗技术,多以骨髓造血干细胞和脐血干细胞异体移植为主。骨髓配型是限制干细胞异体移植的关键问题,即使配型成功还是有产生免疫排斥的风险,在临床上难以大范围应用。虽然理论上脐血配型相较骨髓简单,同胞脐血移植能够彻底治愈重型地中海贫血和镰刀型贫血症,非同胞脐血干细胞移植配型成功的几率也相对较大,但在我国公共脐血库不完善的环境下,要在临床上大规模推广仍然是困难重重。
自体造血干细胞移植无疑可以完全解决上述配型和免疫排斥问题,但是患者自身的造血干细胞也同样存在基因缺陷,无法直接用于治疗。然而,在体外通过基因编辑手段修正自体干细胞的基因缺陷或者对相关调控基因进行编辑,然后将基因修正后的干细胞移植回患者体内,不仅可以修复患者天生的基因缺陷或改变相关基因的表达调控,还避免了免疫排斥的安全风险,是最直接有效的治疗方式。更重要的是,体外遗传工程改造的自体造血干细胞移植,可以挽回众多地贫和镰刀型贫血症患者在无尽的配型等待中消逝的生命,使得配型不再是阻碍地贫和镰刀型贫血症治疗的关键问题。
然而,地中海贫血和镰刀型贫血的基因突变型有很多种,要针对每位患者的突变型设计一套基因修正方案,理论上可行,但在实际开发工作中难以实现所有突变类型的全覆盖,况且就目前基因编辑技术的发展水平而言,对其中某些突变点的修正还是难以实现的。如何研究开发一种对所有类型的地中海贫血和镰刀型贫血都适用的基因修正方案用于自体造血干细胞移植,已成为迫切的主题。
BCL11A基因,编码一个C2H2型锌指结构蛋白,具有抑制胎儿血红蛋白的表达的功能。研究发现,下调或抑制BCL11A的表达可提高胎儿血红蛋白的表达量,从而对地中海贫血和镰刀型贫血症有治疗作用。
近几年基因编辑技术获得突破性的发展,目前发展相对成熟的基因编辑技术有ZFN(锌指核酸酶)、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶)和CRISPR(规律成簇间隔短回文重复)-Cas9。其中,CRISPR-Cas9被称为第三代基因编辑技术,相比ZFN和TALEN,其构建简单,突变效率高、使用成本低。目前开发出来的CRISPR系统主要由来源于Streptococcuspyogenes、Staphylococcus aureus、 Neisseria meningitidis、Streptococcusthermophilus等微生物,相对应的酶分别为 Sp Cas9、Sa Cas9、Nm Cas9、St Cas9。CRISPR系统均包含以下几个部分:1) PAM位点,位于靶序列的下游,只有几个nt(例如Sp CAS9/NGG;Sa CAS9/NNGRRT),根据此位点来选取靶序列;2)识别靶序列的RNA(gRNA 或sgRNA),与切割位点识别并结合的序列,一般在20nt左右;3)tracrRNA, 靶序列之后的一段回文RNA序列;4)Cas9内切酶,具有独立核酸酶活性,Cas9 含有2个独特的活性位点,分别为氨基末端的RuvC和蛋白质中部的HNH。Cas9 中的HNH活性位点剪切gRNA的互补DNA链,RuvC活性位点剪切非互补链。其工作原理为:gRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体,识别并结合于gRNA互补的序列,然后解开DNA双链,形成R-loop,使gRNA与互补链杂交,另一条链保持游离的单链状态,然后由Cas9中的HNH活性位点剪切gRNA的互补DNA 链,RuvC活性位点剪切非互补链,最终引入DNA双链断裂(DSB)。
目前公开的现有技术采用ZFN(锌指核酸酶)技术敲除BCL11A基因。ZFN 由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。DNA识别域一般由3个锌指蛋白串联组成,每个锌指蛋白特异性识别并结合一个三联体碱基,整个识别域共识别9个碱基;非特异性核酸内切酶来自FokI的C端96个氨基酸组成的DNA剪切域,只在二聚体状态时才有酶切活性。每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN,识别特定的位点,当两个识别位点距离恰当时,两个FokI单体结合才能产生酶切功能,达到DNA定点剪切的目的。
采用CRISPR Sp Cas9技术敲除BCL11A基因增强子。通过使用单转技术将单个载体电转进入HSC细胞,该载体中含有Sp Cas9基因序列和单个gRNA序列,电转后的敲除效率仅为10%左右。现有技术的缺点及原因:
要实现切割功能,ZFN二聚体的两个DNA识别域必须识别正义链上9个碱基和反义链上9个碱基,且正反义链的识别区域之间必须间隔适当距离,才能给两个FokI单体的结合提供适当的空间。虽然能够保证较高的特异性,但是设计和使用较为繁琐和复杂,必须针对识别位点的碱基序列合成使用的识别域,该识别域为蛋白质,合成的费用也较高。另外,两个FokI单体必须二聚化才能发挥剪切功能,两个识别域的距离对FokI的功能有决定性影响,因此ZFN的使用效率也较低。
采用CRISPR Sp Cas9技术敲除BCL11A基因增强子。筛选到的gRNA通过使用单转技术将单个载体电转进入HSC细胞敲除效率仅为10%左右,该载体中含有Sp Cas9基因序列和单个gRNA序列,电转效率和编辑效率较低,难以达到有效敲除的目的。载体中携带的其它序列会对细胞造成一定毒性。
发明内容
本发明提供了一种用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增强子的 gRNA、gRNA组合物、表达载体、CRISPR-Cas9RNP、CRISPR-Cas9RNP组合物、CRISPR-Cas9系统、电转方法和试剂盒及其用途,本发明采用CRISPR-Cas9 技术靶向敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增强子,与上述现有技术相比,设计和使用简单、便捷、成本低且效率高。使用CRISPR-Cas9技术靶向敲除 BCL11A基因或者BCL11A基因增强子,只需要针对BCL11A基因的序列,选取在下游带有PAM序列的长度为20nt左右的靶序列,设计起来非常简单。靶序列为DNA序列,合成成本低廉。将含有靶序列的gRNA-tracrRNA嵌合体,和 Cas9蛋白共同转入目的细胞中,便可实现基因切割,使用效率高。
为实现上述目的,所采取的技术方案:一种用于敲除BCL11A基因或者 BCL11A基因增强子的gRNA,所述gRNA的靶序列如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24~SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:31~SEQ ID NO:34中的一种所示。
本发明提供了一种用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增强子的gRNA组合物,所述gRNA组合物由靶序列如SEQ ID NO:24所示的gRNA和靶序列如SEQ ID NO:27所示的gRNA组成,或由靶序列如SEQ ID NO:25所示的 gRNA和靶序列如SEQ ID NO:27所示的gRNA组成,或由靶序列如SEQ ID NO:26所示的gRNA和靶序列如SEQ ID NO:27所示的gRNA组成,或由靶序列如SEQ ID NO:31所示的gRNA和靶序列如SEQ ID NO:34所示的gRNA组成,或由靶序列如SEQ ID NO:31所示的gRNA和靶序列如SEQ ID NO:32所示的 gRNA组成,或由靶序列如SEQID NO:32所示的gRNA和靶序列如SEQ ID NO:34所示的gRNA组成。
本发明提供了一种用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增强子的表达载体,所述表达载体是将上述所述的gRNA对应的DNA序列连接到基础载体上而得的,所述表达载体表达得到上述所述的gRNA。
本发明提供了一种用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增强子的表达载体,所述表达载体是将上述所述的gRNA组合物对应的DNA序列连接到基础载体上而得的,所述表达载体表达得到上述所述的gRNA组合物。
优选地,所述基础载体为pX458质粒或pX601质粒。
本发明提供了一种用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增强子的 CRISPR-Cas9系统,包括上述所述的gRNA和上述所述的gRNA组合物中的至少一种,和Cas9蛋白。
优选地,所述cas9蛋白为来源于Streptococcus pyogenes的Cas9蛋白或来源于Staphylococcus aureus的Cas9蛋白。
本发明提供了一种CRISPR-Cas9RNP,所述CRISPR-Cas9RNP是由如权利要求1所述的gRNA与Cas9蛋白在体外形成的。
本发明提供了一种CRISPR-Cas9RNP组合物,所述CRISPR-Cas9RNP组合物包括SEQID NO:31RNP和SEQ ID NO:32RNP的组合物、SEQ ID NO:31 RNP和SEQ ID NO:34RNP的组合物或者SEQ ID NO:32RNP和SEQ ID NO:34RNP的组合物。所述SEQ ID NO:31RNP由靶序列如SEQ ID NO:31所示的gRNA和Cas9蛋白在体外形成,所述SEQ ID NO:32RNP由靶序列如SEQID NO:32所示的gRNA和Cas9蛋白在体外形成。所述SEQ ID NO:34RNP由靶序列如SEQ IDNO:34所示的gRNA和Cas9蛋白在体外形成。本发明提供了一种用于敲除造血干细胞BCL11A基因或者BCL11A基因增强子的电转方法,所述方法是采用细胞电转仪将上述所述的CRISPR-Cas9RNP或者上述所述的 CRISPR-Cas9RNP组合物导入造血干细胞。
本发明提供了一种采用上述所述的电转方法得到的造血干细胞。
本发明提供了一种用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增强子的试剂盒,包括:
(1)表达cas9蛋白的载体、cas9蛋白和cas9蛋白对应的mRNA中的至少一种;以及
(2)上述所述的gRNA、上述所述的gRNA组合物、表达上述所述的gRNA 的载体和上述所述的gRNA组合物的载体中的至少一种。
本发明提供了上述所述的gRNA组合物以CRISPR-Cas9RNP组合物的形式高效电转染进入造血干细胞后在制备治疗地中海贫血或者镰刀型贫血的药物中的用途。
本发明提供了上述所述的gRNA或所述的gRNA组合物、上述所述的表达载体、上述所述的CRISPR-Cas9系统、上述所述CRISPR-Cas9RNP、上述所述 CRISPR-Cas9RNP组合物、或者上述所述的造血干细胞在制备治疗地中海贫血或者镰刀型贫血的药物中的用途。
本发明的有益效果在于:本发明使用CRISPR-Cas9技术,对造血干细胞的 BCL11A基因或者BCL11A基因增强子进行靶向切割,使得BCL11A基因表达量下降,从而使胎儿血红蛋白表达量提高,有望作为地中海贫血和镰刀型贫血症治疗的新手段。使用CRISPR-Cas9技术实现BCL11A基因的突变,设计简单、使用便捷、成本低且效率高。本发明所筛选的gRNA或者gRNA组合物,相比于现有技术,对BCL11A基因或者BCL11A基因增强子具有更高的切割效率。本发明所采用的造血干细胞电转技术,相较于现有技术具有更高的转染效率,且相比于现有技术中使用的慢病毒载体转染,具有更高的安全性。
附图说明
图1为pX458质粒图谱;
图2为实施例1中酶切效果的琼脂糖凝胶电泳图;
图3为实施例1中酶切效果的琼脂糖凝胶电泳图;
图4为pX601质粒图谱;
图5为实施例2中酶切效果的琼脂糖凝胶电泳图;
图6为实施例3中采用SEQ ID NO:16的gRNA获得的突变类型图;
图7为实施例3中采用SEQ ID NO:31的gRNA获得的突变类型图;
图8为实施例3中采用SEQ ID NO:32的gRNA获得的突变类型图;
图9为实施例3中采用SEQ ID NO:34的gRNA获得的突变类型图;
图10为实施例3中采用SEQ ID NO:25的gRNA获得的突变类型图;
图11为实施例3中采用SEQ ID NO:27的gRNA获得的突变类型图;
图12为实施例4中酶切效果的琼脂糖凝胶电泳图;
图13为实施例4中酶切效果的琼脂糖凝胶电泳图;
图14为实施例5中酶切效果的琼脂糖凝胶电泳图;
图15为实施例5中CRISPR-Sp Cas9RNP组合物突变BCL11A基因增强子的结果;
图16为实施例5中CRISPR-Sp Cas9RNP组合物突变BCL11A基因增强子的结果;
图17为实施例5中CRISPR-Sp Cas9RNP组合物突变BCL11A基因增强子的结果。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点,下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1采用CRISPR-Sp Cas9技术突变BCL11A基因或BCL11A基因增强子
1.1 gRNA准备
(1)根据BCL11A基因和BCL11A基因增强子的序列设计20nt的gRNA 序列,所述gRNA的靶序列如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:31- SEQ ID NO:34中的一种所示;
(2)分别合成gRNA对应的DNA序列正义链和反义链(正义链的5’- 端加cacc,若正义链5’-端第一个核苷酸不是鸟嘌呤G,则在正义链的5’-端加caccG;在反义链的5’-端加aaac,若正义链5’-端第一个核苷酸不是鸟嘌呤G,则在反义链的3’-端加C);
(3)将上述gRNA对应的DNA序列正义链和反义链混合,90℃处理后自然冷却至室温进行退火处理,合成带粘性末端的双链DNA,所述双链DNA 用于转录出相应的gRNA。
针对BCL11A基因和BCL11A基因增强子所设计的gRNA的DNA序列正义链如表1所示:
表1针对BCL11A基因和BCL11A基因增强子所设计的gRNA对应的DNA序列正义链(或gRNA的靶序列)。
1.2载体准备
(1)pX458质粒(图1)扩增和提取,并测定质粒浓度;
(2)采用限制性内切酶Bbs I对pX458进行酶切,37℃酶切1h后加 loading buffer终止反应。
(3)琼脂糖凝胶电泳后切胶回收线性化质粒pX458,并测定回收产物浓度,-20℃保存备用。
1.3连接转化
(1)将切胶回收的线性化pX458载体与退火后的双链DNA进行连接反应;
(2)连接产物热击法转化大肠杆菌感受态细胞TOP10,转化后向每个离心管加入无菌的LB液体培养基(不含抗生素),混匀后置于恒温摇床37℃ 200rpm振荡培养45min使菌体复苏。
(3)将复苏后的TOP10细胞涂布LB固体平板(Amp+),倒置于恒温培养箱37℃静置培养12-16h。
(4)从上述平板上分别挑取单菌落接种到LB液体培养基(Amp+)中扩大培养。
(5)使用引物SeqF(5’-ATTTTTGTGATGCTCGTCAG-3’)(SEQ ID NO:19),对上述菌液分别测序;
(6)将测序正确的菌液提取质粒并测定质粒浓度后至-20℃保存备用。
1.4细胞转染
(1)HEK293T细胞铺板;
(2)采用Lipofectamine 3000试剂盒将1.3(6)中提取的质粒分别转染 HEK293T细胞;
(3)转染后的细胞培养48小时,离心收集细胞。
1.5 T7E1酶切分析突变效率
(1)将上述1.4(3)收集的细胞提取细胞基因组,并检测基因组浓度;
(2)分别在gRNA结合位点上下游设计PCR引物,如表2所示;
表2 T7E1酶切分析引物列表
(3)分别使用PCR法扩增带有靶位点的目的片段;
(4)纯化回收PCR产物,并测定产物浓度;
(5)将上述纯化的PCR产物退火处理,即先加热至95℃,保温10min,然后以每30s下降2~3℃的速度降温至室温;
(6)上述每管退火产物分别加入T7核酸内切酶1(T7E1),设置mock 组(未转化的细胞)和空白对照组CK(不加T7E1,用ddH2O代替),37℃酶切1h。
(7)2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果(见图2)。
结果如图2所示,(a)为BCL11A基因T1区的检测结果,(b)(c)为 BCL11A基因T2区的检测结果,各泳道编号对应靶序列编号,即泳道1对应 SEQ ID NO:1,以此类推。根据T7E1酶切分析的原理,酶切效率越高代表 gRNA对应的靶序列对目的基因的突变效率越高。由电泳结果得知,T1区的 SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:12,T2区的SEQ ID NO:13-SEQID NO:18、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6,上述靶序列对应的gRNA对BCL11A 基因的突变效率较高。
结果如图3所示,为BCL11A基因增强子的检测结果,各泳道名称对应各靶序列编号。根据T7E1酶切分析的原理,PCR获得的含靶序列的DNA片段被 T7E1酶酶切的越多,说明该靶序列对应的gRNA对目的基因的突变效率越高。如图3所示,SEQ ID NO:31-SEQ ID NO:34均具有较高的突变效率。
实施例2采用CRISPR-Sa Cas9技术突变BCL11A基因增强子
2.1 gRNA准备
(1)根据BCL11A基因增强子的序列设计20nt的gRNA序列,所述gRNA 的靶序列如SEQ ID NO:24-SEQ ID NO:27中的一种所示;
(2)分别合成gRNA对应的DNA序列正义链和反义链(正义链的5’- 端加cacc,若正义链5’-端第一个核苷酸不是鸟嘌呤G,则在正义链的5’-端加caccG;在反义链的5’-端加aaac,若正义链5’-端第一个核苷酸不是鸟嘌呤G,则在反义链的3’-端加C);
(3)将上述gRNA对应的DNA序列正义链和反义链混合,90℃处理后自然冷却至室温进行退火处理,合成带粘性末端的双链DNA,所述双链DNA 用于转录出相应的gRNA。
针对BCL11A基因增强子所设计的Sa-gRNA的DNA序列正义链如表3所示:
表3针对BCL11A基因所设计的Sa-gRNA对应的DNA序列反义链(或靶序列)
SEQ ID NO:24 | aggaagggtttggcctctgat |
SEQ ID NO:25 | gcctctgattagggtgggggc |
SEQ ID NO:26 | tgattagggtgggggcgtggg |
SEQ ID NO:27 | tgaccctggtgtgttatgtct |
2.2载体准备
(1)pX601质粒(图4)扩增和提取,并测定质粒浓度;
(2)采用限制性内切酶Bsa I对pX601进行酶切,37℃酶切1h后加 loading buffer终止反应。
(3)琼脂糖凝胶电泳后切胶回收线性化质粒pX601,并测定回收产物浓度,-20℃保存备用。
2.3连接转化
(1)将切胶回收的线性化pX601载体与退火后的双链DNA进行连接反应;
(2)连接产物热击法转化大肠杆菌感受态细胞TOP10,转化后向每个离心管加入无菌的LB液体培养基(不含抗生素),混匀后置于恒温摇床37℃ 200rpm振荡培养45min使菌体复苏。
(3)将复苏后的TOP10细胞涂布LB固体平板(Amp+),倒置于恒温培养箱37℃静置培养12-16h。
(4)从上述平板上分别挑取单菌落接种到LB液体培养基(Amp+)中扩大培养。
(5)使用引物601SaF(5’-TTCCTTgACCCTggAAggTg-3’)(SEQ ID NO:28),对上述菌液分别测序;
(6)将测序正确的菌液提取质粒并测定质粒浓度后至-20℃保存备用。
2.4细胞转染
(1)HEK293T细胞铺板;
(2)采用Lipofectamine 3000试剂盒将2.3(6)中提取的质粒分别转染 HEK293T细胞;
(3)转染后的细胞培养48小时,离心收集细胞。
2.5 T7E1酶切分析突变效率
(1)将上述2.4(3)收集的细胞提取细胞基因组,并检测基因组浓度;
(2)分别在gRNA结合位点上下游设计PCR引物,如表4所示;
表4 T7E1酶切分析引物列表
(3)分别使用PCR法扩增带有靶位点的目的片段;
(4)纯化回收PCR产物,并测定产物浓度;
(5)将上述纯化的PCR产物退火处理,即先加热至95℃,保温10min,然后以每30s下降2~3℃的速度降温至室温;
(6)上述每管退火产物分别加入T7核酸内切酶1(T7E1),设置mock 组(未转化的细胞)和空白对照组CK(不加T7E1,用ddH2O代替),37℃酶切1h。
(7)2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果。
结果如图5所示,泳道名称对应各靶序列编号。根据T7E1酶切分析的原理,PCR获得的含靶序列的DNA片段被T7E1酶酶切的越多,说明该靶序列对应的gRNA对目的基因的突变效率越高。如图4所示,SEQ ID NO:24-SEQ ID NO:27均具有较高的突变效率。
实施例3测序分析BCL11A基因突变效率和突变类型
选取实施例1或者实施例2中突变效率较高的gRNA,进一步分析突变效率和突变类型。以实施例1中SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32 和SEQ ID NO:34;实施例2中SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27为例进行以下实验操作。
3.1将实施例1中1.5(4)或实施例2中2.5(4)所得的纯化后的PCR 产物,测定浓度备用;
3.2选用康为世纪Master PCR Mix给PCR产物3’-末端加一个腺嘌呤(A):取3.1中的PCR产物2μg按照1:1(V:V)比例与Master PCR Mix混合,72℃反应30min;
3.3用1%琼脂糖凝胶电泳3.2中的反应产物,切胶回收目的片段并测定回收产物浓度;
3.4用TaKaRa pMDTM18-T Vector Cloning Kit进行连接反应:按下表5配制反应体系,16℃反应30min;
表5连接pMDTM18-T载体的反应体系
ddH<sub>2</sub>O | 补齐至10μL |
pMD18-T Vector(5×) | 1μL(10ng) |
目的片段 | 0.1pmol~0.3pmol |
Solution I | 5μL |
3.5上述连接产物热击法转化大肠杆菌感受态细胞TOP10,转化后向每个离心管加入无菌的LB液体培养基(不含抗生素),混匀后置于恒温摇床 37℃200rpm振荡培养45min使菌体复苏;
3.6将复苏后的TOP10细胞涂布LB固体平板(Amp+),倒置于恒温培养箱37℃静置培养12-16h;
3.7随机挑取平板上长出来的单菌落,进行sanger测序,结果如下:
SEQ ID NO:16对应的单菌落随机挑选70个进行sanger测序,载体自连的假阳性单菌落为20个,阳性单菌落50个,其中发生突变的35个,突变效率为70%,突变类型如图6所示。由图6可见,共有21个单菌落(2、3、 4、5、6、7、13、17、27、29、33、36、48、50、54、63、64、66、68、70、 23号菌)为缺失突变,其中23号菌为大片段缺失;6个单菌落(14、15、 32、35、45、52号菌)同时存在缺失突变和碱基替换突变;2个单菌落(16、 25号菌)为单位点碱基替换突变;6个单菌落(8、12、28、30、37、57号菌)为插入突变。整体突变效率为70%,突变均发生在靶序列SEQ ID NO:16 附近,判断为CRISPR-Cas9系统对BCL11A基因靶向切割引起。
SEQ ID NO:31对应的单菌落随机挑选54个进行sanger测序,载体自连的假阳性单菌落为4个,阳性单菌落50个,其中发生突变的15个,突变效率为30%,突变类型如图7所示。由图7可见,共有11个单菌落(4、9、 14、15、20、23、27、35、36、39、46号菌)为缺失突变;1个单菌落(53 号菌)同时存在缺失突变和碱基替换突变;1个单菌落(7号菌)同时存在插入突变和碱基替换突变;2个单菌落(10、32号菌)为插入突变。整体突变效率为30%,突变均发生在靶序列SEQ ID NO:31附近,判断为 CRISPR-Cas9系统对BCL11A基因增强子靶向切割引起。
SEQ ID NO:32对应的单菌落随机挑选30个进行sanger测序,载体自连的假阳性单菌落为0个,阳性单菌落30个,其中发生突变的7个,突变效率为23.33%,突变类型如图8所示。由图8可见,共有4个单菌落(9、19、 23、27号菌)为缺失突变,;3个单菌落(5、12、22号菌)为插入突变。整体突变效率为23.33%,突变均发生在靶序列SEQ ID NO:32附近,判断为CRISPR-Cas9系统对BCL11A基因增强子靶向切割引起。
SEQ ID NO:34对应的单菌落随机挑选52个进行sanger测序,载体自连的假阳性单菌落为2个,阳性单菌落50个,其中发生突变的14个,突变效率为28%,突变类型如图9所示。由图9可见,共有11个单菌落(1、16、 20、22、25、27、33、38、40、46、50号菌)为缺失突变;1个单菌落(28 号菌)同时存在缺失突变和碱基替换突变;2个单菌落(43、47号菌)为碱基插入突变。整体突变效率为28%,突变均发生在靶序列SEQ ID NO:34附近,判断为CRISPR-Cas9系统对BCL11A基因增强子靶向切割引起。
SEQ ID NO:25对应的单菌落随机挑选59个进行sanger测序,载体自连的假阳性单菌落为10个,阳性单菌落49个,其中发生突变的43个,突变效率为88.8%,突变类型如图10所示。由图10可见,共有29个单菌落(3、 4、6、9、11、14、16、17、18、19、20、27、31、37、39、40、41、43、 46、47、49、50、52、56、59、62、63、64、65号菌)为缺失突变,;1个单菌落(45号菌)为碱基替换突变;1个单菌落(7号菌)为同时存在缺失突变和碱基替换突变和插入突变;3个单菌落(8、10、51号菌)同时存在缺失突变和碱基替换突变;6个单菌落(2、22、30、61、25、55号菌)为插入突变,其中2、22、30和61号菌为单碱基插入,25和55号菌为长片段插入;此外,还有2个单菌落为序列颠换,1个单菌落为大片段丢失。整体突变效率为88.8%,突变均发生在靶序列SEQ ID NO:25附近,判断为 CRISPR-Cas9系统对BCL11A基因靶向切割引起。
SEQ ID NO:27对应的单菌落随机挑选68个进行sanger测序,载体自连的假阳性单菌落为18个,阳性单菌落50个,其中发生突变的15个,突变效率为30%,突变类型如图11所示。由图11可见,共有14个单菌落(13、17、18、23、27、29、34、35、36、40、45、58、61、64号菌)为缺失突变; 1个单菌落(33号菌)为单碱基插入突变。整体突变效率为30%,突变均发生在靶序列SEQ ID NO:27附近,判断为CRISPR-Cas9系统对BCL11A基因靶向切割引起。
图6、图7、图8、图9、图10、图11第一栏数字代表随机挑选的菌落编号,wild type或w为未经基因编辑处理的原始BCL11A基因或BCL11A 基因增强子序列,*表示gRNA识别靶定基因所必需的PAM区,灰色区域为 gRNA识别的靶序列,-表示碱基缺失,□表示插入序列;Δ表示碱基替换突变。
实施例4 gRNA组合物联合CRISPR-Sp Cas9系统或者CRISPR-Sa Cas9 系统突变BCL11A基因增强子
4.1 gRNA组合物联合CRISPR-Sp Cas9系统突变BCL11A基因增强子
4.1.1将实施例1中1.3(6)制备的连接有SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、 SEQ IDNO:34的pX458载体,进行如下组合:pX458-SEQ ID NO:31和 pX458-SEQ ID NO:34、pX458-SEQ ID NO:32和pX458-SEQ ID NO:34。将上述2个组合按照1.4的方法共同转化HEK 293T细胞,再按照1.5的步骤进行T7E1 酶切分析切割效率,结果如图12所示:(a)为在T7E1酶切前对转染组和对照组 mock(没有转染的HEK 293T细胞)的含有靶序列的片段进行PCR的结果,泳道“31+34”和“32+34”分别表示SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:32 和SEQ IDNO:34以1:1的摩尔比混合共转HEK 293T细胞。由于SEQ ID NO:31 和SEQ ID NO:34对应的靶序列在BCL11A基因增强子上距离为82bp,两个 guide RNA共转染会造成大片段缺失,因此在电泳图上可见转染组PCR结果呈现两个条带,其中分子量较大的条带与mock组PCR条带迁移率相同,判断为未发生大片段缺失的PCR产物;而转染组分子量较小的PCR条带与 mock组的PCR条带相比略小,判断为发生大片段缺失的PCR产物。而SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:34对应的靶序列在BCL11A基因增强子上距离为33 bp,未完全在琼脂糖凝胶上分离开,需进行T7E1酶切分析。图12中(b) 为对照组mock和转染组的T7E1酶切结果电泳图,根据T7E1酶切分析的原理,两种gRNA组合物均能对BCL11A基因增强子进行有效切割,“31+34”组合突变效率更高。
4.2 gRNA组合物联合CRISPR-Sa Cas9系统突变BCL11A基因增强子
4.2.1将实施例2中2.3(6)制备的连接有SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:25 的pX601载体,按照2.4的方法共同转化HEK 293T细胞,再按照2.5的步骤进行T7E1酶切分析切割效率,结果如图13所示:(a)为在T7E1酶切前对转染组和对照组mock(没有转染的HEK 293T细胞)的含有靶序列的片对进行PCR的结果,泳道“27:25=1:1”和“27:25=3:1”表示SEQ IDNO:27和SEQ ID NO:25 分别以1:1和3:1的摩尔比混合共转HEK 293T细胞。由于SEQ ID NO:27和 SEQ ID NO:25对应的靶序列在BCL11A基因上距离为122bp,两个guide RNA共转染会造成大片段缺失,因此在电泳图上可见转染组PCR结果呈现两个条带,其中分子量较大的条带与mock组PCR条带迁移率相同,判断为未发生大片段缺失的PCR产物;而转染组分子量较小的PCR条带与mock 组的PCR条带相比略小,判断为发生大片段缺失的PCR产物。图13中(b)为对照组mock和转染组的T7E1酶切结果电泳图,根据T7E1酶切的原理,两种比例的gRNA联合使用都能对BCL11A基因进行有效切割,其中“27:25=3:1”的切割效率更高。
4.2.2将4.2.1中SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:25摩尔比为3:1的组合按照实施例3中3.2~3.6步骤制备平板,随机挑选平板上的单菌落进行Sanger测序分析,结果如下:
随机挑选54个进行sanger测序,载体自连的假阳性单菌落为3个,阳性单菌落51个,其中发生突变的50个,突变效率为98%,突变类型为:菌落1~6、8~17、20~23、25、26、28、29、31、32、34、36~38、41~43、45、 46、48~50、52~55在靶位点SEQ ID NO:27和SEQ IDNO:25之间发生 102~112bp的长片段缺失;菌落24、33、40、51在靶位点SEQ ID NO:27和SEQID NO:25附近产生两个片段(或碱基)缺失;菌落30在靶位点SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:25之间和附近同时发生碱基突变、插入和缺失;菌落 7在靶位点SEQ ID NO:25中间插入一段序列;菌落18和19在该区域发生大片段的颠换和删除。上述结果表明,SEQ ID NO:27和SEQID NO:25组合物能对BCL11A基因进行高效突变。
实施例5 CRISPR-Sp Cas9RNP组合物电转染HSC系统突变BCL11A基因增强子
5.1根据实施例1SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:34检测结果,分别合成SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:34gRNA体外转录模板Target F1和Target R1(如表6所示),选用Invitrogen GeneArtTM Precision gRNA Synthesis Kit体外转录SEQID NO:31-sgRNA、SEQ ID NO:32-sgRNA、SEQ ID NO:34-sgRNA。
表6 SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:34sgRNA体外转录模板
5.2 CRISPR-Sp Cas9RNP制备
(1)选用Lonza P3Primary Cell Solution Box进行电转。20μL Solution A制备:将16.4μL P3Primary Cell Solution与3.6μL Supplement 1移液枪吹打混合,静置备用。
(2)CRISPR-Sp Cas9RNP制备:分装2μL Solution A于200μL RNase-free PCR管底部,加入InvitrogenTrueCutTMCas9Protein v2(CRISPR-Sp Cas9蛋白)和5.1中体外转录的sgRNA(CRISPR-Sp Cas9蛋白与sgRNA摩尔比为 1:1~1:5),充分混匀,室温静置10min。
5.3 CRISPR-Sp Cas9RNP组合物电转染HSC
(1)将5.2中CRISPR-Sp Cas9RNP进行如下组合:SEQ ID NO:31 RNP 和SEQ ID NO:32RNP、SEQ ID NO:31RNP和SEQ ID NO:34RNP、SEQ ID NO:32RNP和SEQ ID NO:34RNP,每组CRISPR-Sp Cas9蛋白总用量为 6~10μg。
(2)取16μL Solution A重悬HSC,将HSC与(1)中CRISPR-Sp Cas9 RNP 组合物吹打混匀。
(3)将(2)中混合液转移至16-well NucleocuvetteTMStrip,选择Lonza 4D 核转仪电转程序,将NucleocuvetteTMStrip放置电转仪内,启动程序完成电转。
(4)电转结束后,加入100μL HSC培养基至NucleocuvetteTMStrip,轻轻吹打,将HSC转移至24孔板,补齐HSC培养基至500μL/孔。
(5)电转染后的细胞培养48小时,离心收集细胞。
5.4按照3.5的步骤进行T7E1酶切分析切割效率,结果如图14所示,对转染组和对照组mock(没有电转染的HSC细胞)的含有靶序列的片段进行PCR 的结果,泳道“31+34”表示电转SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:34RNP组合物,“31+32”表示电转SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:32RNP组合物,“32+34”表示电转SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:34RNP组合物。由于SEQ IDNO:31和SEQ ID NO:34对应的靶序列在BCL11A基因增强子上距离为82bp,SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32对应的靶序列在BCL11A基因增强子上距离为49bp, SEQ ID NO:32和SEQ IDNO:34对应的靶序列在BCL11A基因增强子上距离为33bp,两个guide RNA共转染会造成大片段缺失,因此在电泳图上可见转染组PCR结果呈现两个条带,其中分子量较大的条带与mock组PCR条带迁移率相同,判断为未发生大片段缺失的PCR产物;而转染组分子量较小的PCR条带与mock组的PCR条带相比略小,判断为发生大片段缺失的 PCR产物。
5.5按照实施例3中3.2~3.6步骤制备平板,随机挑选平板上的单菌落进行Sanger测序分析,结果如下:
SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:34RNP组合物对应的单菌落随机挑选56 个进行sanger测序,载体自连的假阳性单菌落为11个,阳性单菌落45个,其中发生突变的39个,突变效率为86.67%,突变类型如图15所示。由图 16可见,菌落11、12、15~18、20、27、28、31、34、35、37、40、42、43、 45、46、48、54、55在靶位点SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:34之间发生69~92 bp的长片段缺失;菌落53在靶位点SEQ ID NO:31后发生大片段缺失;菌落4、52在靶位点SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:34附近产生两个片段(或碱基)缺失;菌落7、23、25、29、50在靶位点SEQ ID NO:31处发生缺失;菌落8、32、38、39、49在靶位点SEQ ID NO:34处发生缺失;菌落13和 41在靶位点SEQ ID NO:34处插入一段序列;菌落3和22在该区域发生大片段的颠换和删除;菌落36突变序列混乱。
SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32RNP组合物对应的单菌落随机挑选41 个进行sanger测序,载体自连的假阳性单菌落为8个,阳性单菌落33个,其中发生突变的19个,突变效率为57.58%,突变类型如图16所示。由图 17可见,菌落3、4、6、8、10、25、26、27、28、29、31、32、39在靶位点SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32之间发生44~49bp的长片段缺失;菌落35在靶位点SEQ ID NO:32前发生大片段缺失;菌落37、38、43、45在靶位点SEQ ID NO:31处发生缺失;菌落41在靶位点SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32之间发生67bp的长片段缺失和17bp插入。
SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:34RNP组合物对应的单菌落随机挑选41 个进行sanger测序,载体自连的假阳性单菌落为3个,阳性单菌落38个,其中发生突变的31个,突变效率为81.58%,突变类型如图17所示。由图 18可见,菌落5、7、14、17、18、20、21、22、23、25、26、29、31、33、 35、36、41、42、44在靶位点SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:34之间发生32~47bp的长片段缺失;菌落34在靶位点SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:34之间发生119bp的长片段缺失和6bp插入;菌落16在靶位点SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:34附近产生两个片段(或碱基)缺失;菌落1、6、10、11、39在靶位点SEQ ID NO:34处发生缺失;菌落8在靶位点SEQ ID NO:34处发生缺失和替换;菌落19、37在靶位点SEQ ID NO:34前发生大片段缺失;菌落12、 28突变序列混乱。
上述结果表明,CRISPR-Sp Cas9蛋白与SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:34、 SEQ IDNO:31和SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:34对应的 sgRNA组合使用,通过电转技术能有效转导进入HSC,且都能对BCL11A 基因增强子进行高效突变,其中SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:34RNP组合物、 SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:34RNP组合物切割效率明显高于SEQID NO:31 和SEQ ID NO:32RNP组合物。
最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 广东赤萌医疗科技有限公司
<120> 一种用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增强子的gRNA、gRNA组合物以及电转方法
<130> 2018
<160> 40
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
accatgtctc gccgcaagca 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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caaaagcgag ggggagagag 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cccgttggga gctccagaag 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gtgccagatg aacttcccat 20
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<213> 人工序列
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tcccgtggag gttggcatcc 20
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tggcatccag gtcacgccag 20
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gcggcgggcg gacgacggct 20
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cggcgagaca tggtgggctg 20
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gctggggttt gccttgcttg 20
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ggcttcaaga ggctcggctg 20
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atttttgtga tgctcgtcag 20
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taatacgact cactataggt ttggcctctg att 33
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<213> 人工序列
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ttctagctct aaaaccccta atcagaggcc aaa 33
Claims (12)
1.一种用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增强子的gRNA,其特征在于,所述gRNA的靶序列如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24~SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:31~SEQ ID NO:34中的一种所示。
2.一种用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增强子的gRNA组合物,其特征在于,所述gRNA组合物由靶序列如SEQ ID NO:24所示的gRNA和靶序列如SEQ ID NO:27所示的gRNA组成,或由靶序列如SEQ ID NO:25所示的gRNA和靶序列如SEQ ID NO:27所示的gRNA组成,或由靶序列如SEQ ID NO:26所示的gRNA和靶序列如SEQ ID NO:27所示的gRNA组成,或由SEQID NO:31所示的gRNA和靶序列如SEQ ID NO:32所示的gRNA组成,或由靶序列如SEQ ID NO:31所示的gRNA和靶序列如SEQ ID NO:34所示的gRNA组成,或由靶序列如SEQ ID NO:32所示的gRNA和靶序列如SEQ ID NO:34所示的gRNA组成。
3.一种用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增强子的表达载体,其特征在于,所述表达载体是将如权利要求1所述的gRNA对应的DNA序列连接到基础载体上而得的,所述表达载体表达得到如权利要求1所述的gRNA。
4.一种用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增强子的表达载体,其特征在于,所述表达载体是将如权利要求2所述的gRNA组合物对应的DNA序列连接到基础载体上而得的,所述表达载体表达得到如权利要求2所述的gRNA组合物。
5.一种用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增强子的CRISPR-Cas9系统,其特征在于,包括如权利要求1所述的gRNA、如权利要求2所述的gRNA组合物中的至少一种,以及Cas9蛋白。
6.根据权利要求5所述的CRISPR-Cas9系统,其特征在于,所述Cas9蛋白为来源于Streptococcus pyogenes的Cas9蛋白或来源于Staphylococcus aureus的Cas9蛋白。
7.一种CRISPR-Cas9 RNP,其特征在于,所述CRISPR-Cas9 RNP是由如权利要求1所述的gRNA与Cas9蛋白在体外形成的。
8.一种CRISPR-Cas9 RNP组合物,其特征在于,所述CRISPR-Cas9 RNP组合物包括SEQID NO:31 RNP和SEQ ID NO:32 RNP的组合物、SEQ ID NO:31 RNP和SEQ ID NO:34 RNP的组合物或者SEQ ID NO:32 RNP和SEQ ID NO:34 RNP的组合物。
9.一种用于敲除造血干细胞BCL11A基因或者BCL11A基因增强子的的电转方法,其特征在于,所述方法是采用细胞电转仪将权利要求7所述的CRISPR-Cas9 RNP或者权利要求8所述的CRISPR-Cas9 RNP组合物导入造血干细胞。
10.一种采用如权利要求9所述的电转方法得到的造血干细胞。
11.一种用于敲除BCL11A基因或者BCL11A基因增强子的试剂盒,其特征在于,包括:
(1)表达Cas9蛋白的载体、Cas9蛋白和Cas9蛋白对应的mRNA中的至少一种;
(2)如权利要求1所述的gRNA、如权利要求2所述的gRNA组合物、表达如权利要求1所述的gRNA的载体和表达如权利要求2所述的gRNA组合物的载体中的至少一种。
12.如权利要求1所述的gRNA、如权利要求2所述的gRNA组合物、如权利要求3或4所述的表达载体、如权利要求5或6所述的CRISPR-Cas9系统、如权利要求7所述的CRISPR-Cas9RNP、如权利要求8所述的CRISPR-Cas9 RNP组合物、如权利要求10所述的造血干细胞在制备治疗地中海贫血或者镰刀型贫血的药物中的用途。
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