CN106701808A - Dna聚合酶i缺陷型菌株及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种构建DNA聚合酶I缺陷型菌株的方法，该方法基于CRISPR系统进行DNA聚合酶I缺陷型菌株构建，该方法以klenow1、klenow2和klenow3中的至少之一作为靶序列，klenow1、klenow2和klenow3分别为SEQ ID NO：1所示klenow片段基因序列中的第30-52位、第370-390位和第1048-1068位中的任意连续的20bp。本发明还公开一种DNA聚合酶I缺陷型菌株、一种CRISPR系统和一种用于构建DNA聚合酶I缺陷型菌株的试剂盒等。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体的，本发明涉及一种构建DNA聚合酶I缺陷型菌株的方法、一种DNA聚合酶I缺陷型菌株、一种sgRNA表达质粒、一种CRISPR系统、该CRISPR系统在构建DNA聚合酶I缺陷型菌株中的用途和一种试剂盒。
背景技术
CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)最早发现于原核生物的免疫系统中，这些成簇规则间隔的短回文重复序列旁边经常伴随出现保守基因，而这些保守基因编码的蛋白统称为CRISPR相关蛋白(Cas，CRISPR-associated proteins)。CRISPR系统和TALEN(transcription activator-like effector nucleases)系统、ZFN(zinc finger nucleases)系统是现在常用的三种基因组编辑工具，可以用于复杂的基因组编辑。目前CRISPR系统成功已应用于细菌、酵母、斑马鱼、小鼠及人细胞的基因组精确修饰，以及基因转录翻译调控以及其他方面。由于其突变效率高、突变成本低、作用物种广泛，是一种非常有前景的基因组定点改造分子工具。
CRISPR系统主要由两个部分组成：sgRNA(single guide RNA)和Cas9蛋白。sgRNA序列也是由两部分组成：1)靶序列，长20bp，和基因组上目标序列互补，位于PAM(Protospacer-Adjacent Motif)序列之前，需要自行设计；2)crRNA-tracrRNA，由原核生物上的序列改造而成，形成可以被Cas9蛋白识别的茎环结构。Cas9是一种核酸酶。当sgRNA和Cas9共转化受体细胞时，sgRNA可以将Cas9带到基因组上靶序列的位置，在PAM序列上游2-3碱基处由Cas9将靶基因的DNA双链切断。如果新的DNA模板也一并导入的话，断裂的DNA双链会发生同源重组，如果没有DNA模板导入，则在非同源末端连接修复机制下，会产生Indel突变。
DNA聚合酶I缺陷型菌株可以用来作为聚合酶突变体筛选的宿主细胞。市面上现有的DNA聚合酶I缺陷型菌株是Addgene的JS200温度敏感型DNA聚合酶I缺陷菌株。此菌株非常容易老化，Pol I缺陷型基因型很容易丢失，很难用来作为宿主细胞。传统缺陷型菌株的获得是通过从自然界中分离或者通过传统的同源重组的方法来获得，这些方法耗时久，成功率低。
发明内容
本发明旨在解决上述问题至少之一或者至少提供一种商业选择。为此，本发明通过设计构建出一种适于构建DNA聚合酶缺陷型菌株的CRISPR系统，来获得DNA聚合酶缺陷型菌株。
依据本发明的第一方面，本发明提供一种构建DNA聚合酶I缺陷型菌株的方法，该方法基于CRISPR系统进行DNA聚合酶I缺陷型菌株的构建，该方法以klenow1、klenow2和klenow3中的至少之一作为靶序列，所述klenow1为SEQ ID NO：1所示klenow片段中的第30-52位中的任意连续的20bp，所述klenow2为SEQ ID NO：1所示klenow片段中的第370-390位中的任意连续的20bp，所述klenow3为SEQ ID NO：1所示klenow片段中的第1048-1068位中的任意连续的20bp。klenow1、klenow2和klenow3是发明人经过多次模拟和试验确定的，目标基因序列上的这三个位置的至少之一都能使利用的CRISPR系统高成功率的获得目标缺陷型菌株。
本发明的这一方面的构建DNA聚合酶I缺陷型菌株的方法，步骤简单、敲除效率高、特异性好，可以很好的对菌株的基因组进行编辑，例如对大肠杆菌中的DNA聚合酶I序列的至少一部分进行编辑，即利用对发明人多次筛选确定出的Klenow片段基因序列上的特定位置——klenow1、klenow2和klenow3至少之一进行切割，使菌株突变成DNA聚合酶I缺陷。通过该方法的利用CRISPR系统来获得DNA聚合酶缺陷型菌株，耗时短，成功率高，且CRISPR系统构建好后，目标缺陷型菌株容易获得。
根据本发明的一个实施例，所述klenow1为SEQ ID NO：1所示klenow片段基因序列中的第33-52位，所述klenow2为SEQ ID NO：1所示klenow片段基因序列中的第371-390位，所述klenow3为SEQ ID NO：1所示klenow片段基因序列中的第1049-1068位。klenow1、klenow2和klenow3是发明人多次模拟和试验确定的，目标基因序列上的这三个位置的至少之一都能使其对应的CRISPR系统高成功率的获得目标缺陷型菌株。
根据本发明的一个实施例，所述方法包括以下步骤：(1)基于所述靶序列，获得能够与所述靶序列结合的双链DNA序列；(2)构建以获得所述CRISPR系统，所述CRISPR系统包括sgRNA表达质粒和Cas9表达质粒，其中，构建所述sgRNA表达质粒包括，将(1)中的双链DNA序列连接到sgRNA-载体1上，以获得所述sgRNA表达质粒，构建所述Cas9表达质粒包括，将Cas9连接到载体2上，以获得所述Cas9表达质粒；(3)利用(2)中的CRISPR系统染所述菌株的感受态细胞，以获得所述DNA聚合酶I缺陷型菌株。较佳的，所述sgRNA-载体1所使用的载体1和所述载体2具有不同的复制起始子，这样，利于避开共转染两个质粒时两个质粒之间的竞争，避免感受态细胞中只存留一个质粒。
根据本发明的一个实施例，载体1和载体2中的其中的一个可以为PSB1A2和PSB1C3中的一个，另一个为PSB2K3，因为PSB1A2和PSB1C3的复制起始子都是pMB1，而PSB2K3的复制起始子与它们不同。
根据本发明的一个实施例，所述菌株为大肠杆菌，包括但不限于XL-10和DH5a。在筛选聚合酶突变体时，一般需要把菌株本身的聚合酶给突变掉，而大肠杆菌的聚合酶I和要筛选的聚合酶klenow片段结构功能相似，并且实验证明失活聚合酶I后大肠杆菌细胞不会死亡，只会生长缓慢，因此可以选用大肠杆菌。
根据本发明的一个实施例，能够与klenow1结合的双链DNA序列的互补的两条链分别为SEQ ID NO：2和3，能够与klenow2结合的双链DNA序列的两条链分别为SEQ ID NO：4和5，能够与klenow3结合的双链DNA序列的两条链分别为SEQ ID NO：6和7。根据本发明的另一个实施例，能够与klenow1结合的双链DNA序列的两条链分别为SEQ ID NO：8和9，能够与klenow2结合的双链DNA序列的两条链分别为SEQ ID NO：10和11，能够与klenow3结合的双链DNA序列的两条链分别为SEQ ID NO：12和13。其中，SEQ ID NO：8和9分别对应于SEQ ID NO：2和3——在SEQ ID NO：2的左侧加上TAGC、在其右侧加上G碱基即为SEQ ID NO：8，在SEQ ID NO：3的左侧加上AAAC四个碱基，在其右侧加上一个G碱基即为SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：8和9退火形成的双链DNA序列相较于SEQ ID NO：2和3带有BspQI酶切位点；类似的，SEQ ID NO：10和11分别对应于SEQ ID NO：4和5——在SEQ ID NO：4的左侧加上TAGC、在其右侧加上G碱基即为SEQID NO：8，在SEQ ID NO：5的左侧加上AAAC四个碱基，在其右侧加上一个G碱基即为SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：10和11退火形成的双链DNA序列相较于SEQ ID NO：4和5带有BspQI酶切位点；类似的，SEQ ID NO：12和13分别对应于SEQ ID NO：6和7——在SEQ ID NO：6的左侧加上TAGC、在其右侧加上G碱基即为SEQ ID NO：12，在SEQ ID NO：7的左侧加上AAAC四个碱基，在其右侧加上一个G碱基即为SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：12和13退火形成的双链DNA序列相较于SEQ ID NO：6和7带有BspQI酶切位点。
根据本发明的一个实施例，在进行步骤(1)时，分别基于靶序列klenow1、klenow2和klenow3，设计合成能够分别与klenow1、klenow2和klenow3结合的双链DNA序列SEQID NO：2和3、SEQ ID NO：4和5以及SEQ ID NO：6和7；而考虑到后续需要通过酶切连接的方式将双链DNA序列插入到sgRNA质粒骨架(sgRNA-载体1)上去，因此分别在SEQ ID NO：2、4和6的左侧加上TAGC，右侧加上G碱基，分别在SEQ ID NO：2、4和6各自的反向互补序列左侧需加上AAAC四个碱基，右侧加上一个G碱基，即相应获得SEQ ID NO：8和9、SEQ ID NO：10和11以及SEQ ID NO：12和13，磷酸化各链，以期退火形成的双链DNA序列带有BspQI酶切位点，帮助将SEQ ID NO：2、4和6分别插入到sgRNA质粒骨架上。
依据本发明的第二方面，本发明提供一种DNA聚合酶I缺陷型菌株，其利用上述本发明一方面或者任一实施例的方法构建获得。DNA聚合酶I缺陷型菌株可以用来作为聚合酶突变体筛选的宿主细胞。相较于市面上现有的DNA聚合酶I缺陷型菌株，例如Addgene公司的JS200温度敏感型DNA聚合酶I缺陷菌株，本发明这一方面的菌株不易老化，Pol I缺陷型基因型不易丢失，能很好的作为宿主细胞。
依据本发明的第三方面，本发明提供一种sgRNA表达质粒，该sgRNA表达质粒包含能够结合上述本发明一方面或者任一实施例的方法中的靶序列的序列，即包含能结合klenow1、klenow2和klenow3至少之一的序列。在本发明的一些实施例中，构建该sgRNA表达质粒，包括：基于所述靶序列，获得能够与所述靶序列结合的双链DNA序列；将双链DNA序列连接到sgRNA-载体1上，以获得所述sgRNA表达质粒。sgRNA-载体1由sgRNA质粒骨架或者说sgRNA序列和载体连接构成，可以预先连接获得保存，可以在构建该表达质粒时同时获得，也可以通过市售获得。该sgRNA表达质粒可用于编辑宿主细胞靶序列区域，使宿主细胞的DNA聚合酶I突变。在本发明的一个实施例中，载体1为PSB1C3。
依据本发明的第四方面，本发明提供一种CRISPR系统，其包括上述本发明一方面的sgRNA表达质粒，任选的还包括Cas9表达质粒。在本发明的一个实施例中，Cas表达质粒是由Cas9组蛋白连接在PSB1A2载体或者PSB2K3载体上构成的。CRISPR系统能够用于编辑宿主细胞中的DNA聚合酶I，使宿主突变，获得DNA聚合酶I缺陷型菌株。因为该CRISPR系统以质粒的形式存在，后续可以很方便获得缺陷型菌株。
依据本发明的第五方面，本发明提供上述本发明一方面的CRISPR系统在构建DNA聚合酶I缺陷型菌株中的用途。
依据本发明的第六方面，本发明提供一种用于构建DNA聚合酶I缺陷型菌株的试剂盒，其包括上述本发明一方面的CRISPR系统，任选的还包括宿主细胞。利用本发明这一方面的试剂盒构建得的缺陷型菌株，不易老化，Pol I缺陷型基因型不易丢失，能很好的作为宿主细胞。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施方式的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是本发明一个实施例中的CRISPR系统的sgRNA质粒图谱；
图2是本发明一个实施例中的CRISPR系统的Cas9质粒图谱；
图3是本发明一个实施例中的对照组的CRISPR系统转染效率结果图；图3A显示阴性对照结果，其左边图片为PSB1C3质粒阴性对照，其右边图片为PSB2K3-J04450质粒阴性对照；图3B显示阳性对照结果；
图4是本发明一个实施例中的实验组的CRISPR系统转染效率结果图；图4A、4B和4C分别显示实验组1、2和3结果，图4A、4B和4C各自的右图分别为各自的左图的局部示意图；
图5是本发明一个实施例中的实验组1获得的菌株的klenow1区域的序列与原始序列的比对结果示意图；
图6是本发明一个实施例中的实验组2获得的菌株的klenow2区域的序列与原始序列的比对结果示意图；
图7是本发明一个实施例中的实验组3获得的菌株的klenow3区域的序列与原始序列的比对结果示意图。
具体实施方式
根据本发明的一个实施例提供的构建DNA聚合酶I缺陷型菌株的方法，该方法基于CRISPR系统进行DNA聚合酶I缺陷型菌株的构建，该方法以klenow1、klenow2和klenow3中的至少之一作为靶序列，所述klenow1为SEQ ID NO：1所示klenow片段中的第30-52位中的任意连续的20bp，所述klenow2为SEQ ID NO：1所示klenow片段中的第370-390位中的任意连续的20bp，所述klenow3为SEQ ID NO：1所示klenow片段中的第1048-1068位中的任意连续的20bp。所称klenow1、klenow2和klenow3都是klenow片段(Klenowfragment)基因序列中的一段。Klenow片段，又名DNA聚合酶I大片段、克列诺片段(Klenowfragment)或克列诺酶(Klenow enzyme)，是E.coli DNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端605个氨基酸残基片段。该片段保留了DNA聚合酶I的5ˊ-3ˊ聚合酶和3ˊ-5ˊ外切酶活性，但缺少完整酶的5ˊ-3ˊ外切酶活性。DNA聚合酶I(DNA-pol I)断开后的存在另一个323个氨基酸残基片段，保留5‘-3’外切酶活性。
所称靶序列与CRISPR系统中的sgRNA靶序列是互补的，即如果靶序列在基因序列上，sgRNA靶序列则选择其反义链。sgRNA靶序列一般长度为20bp，在PAM序列上游。在确定靶序列的过程中，发明人经过多次设计和试验摸索发现，使靶序列上的种子序列，即靠近3’端的12bp，不与目标基因上其他位置的序列完全一致，能够获得较好的工作效率；进一步的，靶序列选择目标基因序列上面-35到1/10基因序列全长区域内的位置能够获得较好的工作效率。在本发明的一个实施例中，根据DNA聚合酶I不同区域的DNA序列设计sgRNA靶序列，每个区域设计一条sgRNA靶序列。klenow1、klenow2和klenow3是发明人经过多次模拟和试验确定的，目标基因序列上的这三个位置的至少之一都能使其对应的CRISPR系统高成功率的获得目标缺陷型菌株。
上述构建DNA聚合酶I缺陷型菌株的方法，步骤简单、敲除效率高、特异性好，可以很好的对菌株的基因组进行编辑，通过利用CRISPR系统对宿主菌株，例如大肠杆菌中的DNA聚合酶I序列的至少一部分进行编辑，即利用对多次筛选确定出的Klenow片段基因序列上的特定位置——klenow1、klenow2和klenow3中的至少之一进行切割，使菌株突变成DNA聚合酶I缺陷。通过该方法的利用CRISPR系统来获得DNA聚合酶缺陷型菌株，耗时短，成功率高，且CRISPR系统构建好后，目标缺陷型菌株容易获得。
根据本发明的一个实施例，所述klenow1为SEQ ID NO：1所示klenow片段基因序列中的第33-52位，所述klenow2为SEQ ID NO：1所示klenow片段基因序列中的第371-390位，所述klenow3为SEQ ID NO：1所示klenow片段基因序列中的第1049-1068位。klenow1、klenow2和klenow3是发明人多次模拟和试验确定的，目标基因序列上的这三个位置的至少之一都能使利用的CRISPR系统高成功率的获得目标缺陷型菌株。
根据本发明的一个实施例，所述方法包括以下步骤：(1)基于所述靶序列，获得能够与所述靶序列结合的双链DNA序列；(2)构建以获得所述CRISPR系统，所述CRISPR系统包括sgRNA表达质粒和Cas9表达质粒，其中，构建所述sgRNA表达质粒包括，将(1)中的双链DNA序列连接到sgRNA-载体1上，以获得所述sgRNA表达质粒，构建所述Cas9表达质粒包括，将Cas9连接到载体2上，以获得所述Cas9表达质粒；(3)利用(2)中的CRISPR系统染所述菌株的感受态细胞，以获得所述DNA聚合酶I缺陷型菌株。较佳的，所述sgRNA-载体1所使用的载体1和所述载体2具有不同的复制起始子，这样，利于避开共转染两个质粒时两个质粒之间的竞争，避免感受态细胞中只存留一个质粒。
较佳的，载体1和载体2是不同的。在本发明的一个实施例中，其中的一个可以为PSB1A2和PSB1C3中的一个，另一个为PSB2K3，因为PSB1A2和PSB1C3的复制起始子都是pMB1，而PSB2K3的复制起始子与它们不同。
根据本发明的一个实施例，所述菌株为大肠杆菌，包括但不限于XL-10和DH5a。在筛选聚合酶突变体时，一般需要把菌株本身的聚合酶给突变掉，而大肠杆菌的聚合酶I和要筛选的聚合酶klenow片段结构功能相似，并且实验证明失活聚合酶I后大肠杆菌细胞不会死亡，只会生长缓慢，因此可以选用大肠杆菌。
根据本发明的一个实施例，能够与klenow1结合的双链DNA序列的互补的两条链分别为SEQ ID NO：2和3，能够与klenow2结合的双链DNA序列的两条链分别为SEQ ID NO：4和5，能够与klenow3结合的双链DNA序列的两条链分别为SEQ ID NO：6和7。根据本发明的另一个实施例，能够与klenow1结合的双链DNA序列的两条链分别为SEQ ID NO：8和9，能够与klenow2结合的双链DNA序列的两条链分别为SEQ ID NO：10和11，能够与klenow3结合的双链DNA序列的两条链分别为SEQ ID NO：12和13。其中，SEQ ID NO：8和9分别对应于SEQ ID NO：2和3——在SEQ ID NO：2的左侧加上TAGC、在其右侧加上G碱基即为SEQ ID NO：8，在SEQ ID NO：3的左侧加上AAAC四个碱基，在其右侧加上一个G碱基即为SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：8和9退火形成的双链DNA序列相较于SEQ ID NO：2和3带有BspQI酶切位点；类似的，SEQ ID NO：10和11分别对应于SEQ ID NO：4和5——在SEQ ID NO：4的左侧加上TAGC、在其右侧加上G碱基即为SEQID NO：8，在SEQ ID NO：5的左侧加上AAAC四个碱基，在其右侧加上一个G碱基即为SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：10和11退火形成的双链DNA序列相较于SEQ ID NO：4和5带有BspQI酶切位点；类似的，SEQ ID NO：12和13分别对应于SEQ ID NO：6和7——在SEQ ID NO：6的左侧加上TAGC、在其右侧加上G碱基即为SEQ ID NO：12，在SEQ ID NO：7的左侧加上AAAC四个碱基，在其右侧加上一个G碱基即为SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：12和13退火形成的双链DNA序列相较于SEQ ID NO：6和7带有BspQI酶切位点。
根据本发明的一个实施例，在进行步骤(1)时，分别基于靶序列klenow1、klenow2和klenow3，设计合成能够分别与klenow1、klenow2和klenow3结合的双链DNA序列SEQID NO：2和3、SEQ ID NO：4和5以及SEQ ID NO：6和7；而考虑到后续需要通过酶切连接的方式将双链DNA序列插入到sgRNA质粒骨架或者sgRNA-载体1上去，因此分别在SEQ ID NO：2、4和6的左侧加上TAGC，右侧加上G碱基，分别在SEQ ID NO：2、4和6各自的反向互补序列左侧需加上AAAC四个碱基，右侧加上一个G碱基，即相应获得SEQ ID NO：8和9、SEQ ID NO：10和11以及SEQ ID NO：12和13，磷酸化各链，以期退火形成的双链DNA序列带有BspQI酶切位点，帮助将SEQ ID NO：2、4和6分别插入到sgRNA质粒骨架上。本领域技术人员能够理解，也可以在序列的左右两端加上其它碱基，使得退火形成的序列具有相对应的酶切位点，较佳的，所利用的酶的酶切位点和识别位点相同。
根据本发明的一个实施例，提供一种DNA聚合酶I缺陷型菌株，其利用上述本发明任一实施例的方法构建获得。DNA聚合酶I缺陷型菌株可以用来作为聚合酶突变体筛选的宿主细胞。相较于市面上现有的DNA聚合酶I缺陷型菌株，例如Addgene公司的JS200温度敏感型DNA聚合酶I缺陷菌株，本发明这一方面的菌株不易老化，Pol I缺陷型基因型不易丢失，能很好的作为宿主细胞。
根据本发明的的一个实施例，提供一种sgRNA表达质粒，该sgRNA表达质粒包含能够结合上述本发明任一实施例的方法中的靶序列的序列，即其sgRNA靶序列为能结合klenow1、klenow2和klenow3中的至少之一。在本发明的一些实施例中，构建该sgRNA表达质粒，包括：基于所述靶序列，获得能够与所述靶序列结合的双链DNA序列；将双链DNA序列连接到sgRNA-载体1上，以获得所述sgRNA表达质粒。sgRNA-载体1由sgRNA质粒骨架或者说sgRNA序列和载体连接构成，可以预先连接获得保存，可以在构建该表达质粒时同时获得，也可以通过市售获得。该sgRNA表达质粒可用于编辑宿主细胞靶序列区域，使宿主细胞的DNA聚合酶I突变。在本发明的一个实施例中，载体1为PSB1C3。
根据本发明的一个实施例，提供一种CRISPR系统，其包括上述本发明的实施例中的sgRNA表达质粒，任选的还包括Cas9表达质粒。sgRNA表达质粒可参照上述实施例获得。在本发明的一个实施例中，Cas表达质粒是由Cas9组蛋白连接在PSB1A2载体或者PSB2K3载体上构成的。CRISPR系统能够用于编辑宿主细胞中的DNA聚合酶I，使宿主突变，获得DNA聚合酶I缺陷型菌株。因为该CRISPR系统以质粒的形式存在，后续可以很方便获得缺陷型菌株。
根据本发明的一个实施例，提供上述本发明实施例的CRISPR系统在构建DNA聚合酶I缺陷型菌株中的用途。
根据本发明的一个实施例，提供一种用于构建DNA聚合酶I缺陷型菌株的试剂盒，其包括上述本发明上述实施例中的CRISPR系统，任选的还包括宿主细胞，例如大肠杆菌。利用本发明这一方面的试剂盒构建得的缺陷型菌株，不易老化，Pol I缺陷型基因型不易丢失，能很好的作为聚合酶突变体筛选的宿主细胞。
以下结合附图和具体实施例对本发明的构建DNA聚合酶I缺陷型菌株的方法、CRISPR系统、sgRNA表达质粒、试剂盒等进行详细的描述。下面示例，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
除另有交待，以下实施例中涉及的未特别交待技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品说明书进行，未特别交待的试剂、序列、载体和细胞等也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公职的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例一
构建DNA聚合酶I缺陷型菌株的方法，一般包括：
1.sgRNA靶序列设计及双链DNA序列合成
根据DNA聚合酶I不同区域的DNA序列设计sgRNA靶序列，每个区域设计一条sgRNA靶序列。sgRNA靶序列要求：长度为20bp，在PAM序列上游；如果靶序列在基因序列上，sgRNA靶序列需要选择反义链；靶序列上的种子序列(靠近3’端的12bp)必须不能和基因组上其他位置的序列完全一致；靶序列最好选择基因上面-35到1/10基因全长区域内的位置来获得最好的工作效率。
2.CRISPR系统构建
2.1sgRNA组件构建
sgRNA组件的质粒上靶序列区域可以通过酶切连接置换掉。因此在合成靶序列时，左右两端要加上合适的酶切位点。
在收到合成的靶序列后，合成的单链序列要进行磷酸化处理，然后进行退火处理。然后通过酶切连接，将靶序列插入到sgRNA质粒骨架上。
2.2Cas9组件构建
将Cas9组件通过酶切连接换到合适的载体上，以便能完成和sgRNA组件的质粒共转化。
3.CRISPR系统转化XL-10感受态细胞，检测CRISPR系统的工作效率
sgRNA组件和Cas9组件共转化DH5a和XL-10感受态细胞，通过对Cas9表达量的调控来检测CRISPR系统的工作效率。
4.测序验证缺陷型菌株是否成功构建
利用上述CRISPR系统能够快速、有效、高精度的获得DNA聚合酶I缺陷型大肠杆菌菌株。该方法步骤简单、敲除效率高、特异性好，可以很好的对大肠杆菌的基因组进行编辑，且因为CRISPR系统以质粒的形式存在，后续可以很方便获得缺陷型菌株。
实施例二
1.sgRNA靶序列设计及合成
因为想要用缺陷型大肠杆菌作为宿主细胞来筛选聚合酶突变体，因此需要把大肠杆菌本身的聚合酶给突变掉。大肠杆菌的聚合酶I和要筛选的聚合酶结构功能相似，并且实验证明失活聚合酶I后细胞不会死亡，只会生长缓慢，因此考虑突变大肠杆菌聚合酶I。
从klenow fragment的前中部分分别选取了三个位置作为靶序列，标记为klenow1、klenow2、klenow3。
klenow片段全场1818bp，klenow片段DNA序列如下所示：5’-GTGATTTCTTATGACAACTACGTCACCATCCTTGATGAAGAAACACTGAAAGCGTGGATTGCGAAGCTGGAAAAAGCGCCGGTATTTGCATTTGATACCGAAACCGACAGCCTTGATAACATCTCTGCTAACCTGGTCGGGCTTTCTTTTGCTATCGAGCCAGGCGTAGCGGCATATATTCCGGTTGCTCATGATTATCTTGATGCGCCCGATCAAATCTCTCGCGAGCGTGCACTCGAGTTGCTAAAACCGCTGCTGGAAGATGAAAAGGCGCTGAAGGTCGGGCAAAACCTGAAATACGATCGCGGTATTCTGGCGAACTACGGCATTGAACTGCGTGGGATTGCGTTTGATACCATGCTGGAGTCCTACATTCTCAATAGCGTTGCCGGGCGTCACGATATGGACAGCCTCGCGGAACGTTGGTTGAAGCACAAAACCATCACTTTTGAAGAGATTGCTGGTAAAGGCAAAAATCAACTGACCTTTAACCAGATTGCCCTCGAAGAAGCCGGACGTTACGCCGCCGAAGATGCAGATGTCACCTTGCAGTTGCATCTGAAAATGTGGCCGGATCTGCAAAAACACAAAGGGCCGTTGAACGTCTTCGAGAATATCGAAATGCCGCTGGTGCCGGTGCTTTCACGCATTGAACGTAACGGTGTGAAGATCGATCCGAAAGTGCTGCACAATCATTCTGAAGAGCTCACCCTTCGTCTGGCTGAGCTGGAAAAGAAAGCGCATGAAATTGCAGGTGAGGAATTTAACCTTTCTTCCACCAAGCAGTTACAAACCATTCTCTTTGAAAAACAGGGCATTAAACCGCTGAAGAAAACGCCGGGTGGCGCGCCGTCAACGTCGGAAGAGGTACTGGAAGAACTGGCGCTGGACTATCCGTTGCCAAAAGTGATTCTGGAGTATCGTGGTCTGGCGAAGCTGAAATCGACCTACACCGACAAGCTGCCGCTGATGATCAACCCGAAAACCGGGCGTGTGCATACCTCTTATCACCAGGCAGTAACTGCAACGGGACGTTTATCGTCAACCGATCCTAACCTGCAAAACATTCCGGTGCGTAACGAAGAAGGTCGTCGTATCCGCCAGGCGTTTATTGCGCCAGAGGATTATGTGATTGTCTCAGCGGACTACTCGCAGATTGAACTGCGCATTATGGCGCATCTTTCGCGTGACAAAGGCTTGCTGACCGCATTCGCGGAAGGAAAAGATATCCACCGGGCAACGGCGGCAGAAGTGTTTGGTTTGCCACTGGAAACCGTCACCAGCGAGCAACGCCGTAGCGCGAAAGCGATCAACTTTGGTCTGATTTATGGCATGAGTGCTTTCGGTCTGGCGCGGCAATTGAACATTCCACGTAAAGAAGCGCAGAAGTACATGGACCTTTACTTCGAACGCTACCCTGGCGTGCTGGAGTATATGGAACGCACCCGTGCTCAGGCGAAAGAGCAGGGCTACGTTGAAACGCTGGACGGACGCCGTCTGTATCTGCCGGATATCAAATCCAGCAATGGTGCTCGTCGTGCAGCGGCTGAACGTGCAGCCATTAACGCGCCAATGCAGGGAACCGCCGCCGACATTATCAAACGGGCGATGATTGCCGTTGATGCGTGGTTACAGGCTGAGCAACCGCGTGTACGTATGATCATGCAGGTACACGATGAACTGGTATTTGAAGTTCATAAAGATGATGTTGATGCCGTCGCGAAGCAGATTCATCAACTGATGGAAAACTGTACCCGTCTGGATGTGCCGTTGCTGGTGGAAGTGGGGAGTGGCGAAAACTGGGATCAGGCGCACTAA-3’(SEQ ID NO：1)。
klenow1片段距离其起始密码子约30bp，sgRNA靶序列为5’-CTTTCAGTGTTTCTTCATCA-3’(SEQ ID NO：2)，反向互补序列为5’-TGATGAAGAAACACTGAAAG-3’(SEQ ID NO：3)；klenow2片段距离起始密码子约370bp，靶序列为5’-GGCAACGCTATTGAGAATGT-3’(SEQ ID NO：4)，反向互补序列为5’-ACATTCTCAATAGCGTTGCC-3’(SEQ ID NO：5)；klenow3片段距离起始密码子约1048bp，靶序列为5’-AATGTTTTGCAGGTTAGGAT-3’(SEQ ID NO：6)，反向互补序列为5’-ATCCTAACCTGCAAAACATT-3’(SEQ ID NO：7)。因为后续需要通过酶切连接的方式将靶序列oligo插入到sgRNA质粒骨架上去，因此sgRNA靶序列左侧需要加上TAGC，右侧加上G碱基，反向互补序列左侧需加上AAAC四个碱基，右侧加上一个G碱基，即对应获得5’-TAGCCTTTCAGTGTTTCTTCATCAG-3’(SEQ ID NO：8)，反向互补序列为5’-AAACTGATGAAGAAACACTGAAAGG-3’(SEQ ID NO：9)；klenow2片段距离起始密码子约370bp，靶序列为5’-TAGCGGCAACGCTATTGAGAATGTG-3’(SEQ ID NO：10)，反向互补序列为5’-AAACACATTCTCAATAGCGTTGCCG-3’(SEQ ID NO：11)；klenow3片段距离起始密码子约1048bp，靶序列为5’-TAGCAATGTTTTGCAGGTTAGGATG-3’(SEQID NO：12)，反向互补序列为5’-AAACATCCTAACCTGCAAAACATTG-3’(SEQ ID NO：13)。这样后期经退火后可以组成BspQI酶切位点，帮助将sgRNA靶序列oligo插入到sgRNA质粒骨架上。
2.CRISPR系统构建
通过以下构建得的sgRNA表达质粒和Cas9表达质粒各自的质粒图谱分别如图1和图2所示。
2.1sgRNA组件构建
2.1.1合成的靶序列oligo和反向互补序列磷酸化处理、退火处理
反应体系为：
55℃反应30min后，将PCR管放于80℃水浴中10min，终止磷酸化反应，然后放置于室温进行退火，使PCR管温度恢复至室温，完成退火处理。其中的sgRNA-Primer-F为SEQID NO：8、10或12，相应的sgRNA-Primer-R为SEQ ID NO：9、11或13。
2.1.2sgRNA质粒骨架BspQI酶切
sgRNA质粒骨架连在PSB1C3载体(来自iGEM，氯霉素抗性)上，所有来自iGEM的载体都有EcoRI、PstI、SpeI、XbaI四个通用酶切位点，以便DNA插入片段在不同的载体上进行切换。而sgRNA质粒骨架上靶序列的位置有BspQI酶切位点，方便将不同的上步退火得的靶序列连入该质粒骨架上。
反应体系为：
BspQI 2ul
10xCutsmart Buffer 2ul
pSB1C3-sgRNA cassette 1ug
ddH2O 补充至20ul
50℃反应2h。1％琼脂糖胶跑电泳(150V，30min)，EB染色10min，切胶回收。
2.1.3靶序列oligo连接入上步的酶切开的sgRNA质粒骨架
通过T4 DNA ligase的作用将靶序列oligo连接到PSB1C3-sgRNA质粒骨架上。
反应体系为：
2x Rapid ligation buffer 10ul
T4 DNA ligase 1ul
PSB1C3-sgRNA质粒骨架 10ng
靶序列oligo 50ng
ddH2O 补足至20ul
20℃反应2h。
2.1.4连接产物转化DH5a感受态细胞
从-80℃冰箱拿出DH5a感受态细胞(100ul)，置于冰上10min。然后向感受态细胞中加入10ul连接产物，轻轻混匀，置于冰上静置30min。然后42℃热击90s，再置于冰上5min，后在超净台内加入800ul SOC无抗培养基。37℃，200rpm培养45min，使细胞恢复。然后取100ul，涂氯霉素平板。平板置于37℃培养箱过夜培养。
2.1.5提质粒，送样测序
从平板上挑单菌落，置于5ml氯霉素液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养，sgRNA表达质粒小提，送样测序。
2.2Cas9组件构建
Cas9组件连接在PSB1A2载体(来自iGEM，氨苄抗性)上，而PSB1A2和PSB1C3的复制起始子都是pMB1，如果将两个质粒共转化的话，因为它们使用相同的复制机制，可能会引起质粒之间的竞争，而导致感受态细胞中只存留一个质粒。因此考虑将Cas9组件连接到PSB2K3载体上(来自iGEM，卡那抗性，P1及F’复制起始子)。
2.2.1PSB1A2-Cas9骨架及PSB2K3载体酶切
载体骨架反应体系：
PSB2K3 1ug
SpeI 3ul
PstI 2ul
NEB 2.1 2ul
ddH2O 补足至20ul
PSB1A2-Cas9酶切体系：
PSB1A2-Cas9 1ug
PstI 2ul
XbaI 1.5ul
NEB2.1 2ul
ddH2O 补足至20ul
37℃反应2h。1％琼脂糖胶跑电泳(150V，30min)，EB染色10min，切胶回收。
2.2.2Cas9组件连接PSB2K3载体
反应体系为：
2xRapid ligation buffer 10ul
T4 DNA ligase 1ul
PSB2K3 10ng
Cas9 30ng
ddH2O 补足至20ul
20℃，反应2h。
2.2.3连接产物转化DH5a感受态细胞
从-80°冰箱拿出DH5a感受态细胞(100ul)，置于冰上10min。然后向感受态细胞中加入10ul连接产物，轻轻混匀，置于冰上静置30min。然后42℃热击90s，再置于冰上5min，后在超净台内加入800ul SOC无抗培养基。37℃，200rpm培养45min，使细胞恢复。然后取100ul，涂卡那抗性平板。平板置于37℃培养箱过夜培养。
2.2.4提质粒，送样测序
从平板上挑单菌落，置于5ml卡那霉素液体培养基中，37℃，200rpm过夜培养，质粒小提，送样测序。测序结果如预期。
3.CRISPR系统转化XL-10感受态细胞，检测CRISPR系统的工作效率
配制Kan/Chl双抗板，Kan终浓度为50ug/ml，Chl终浓度为17ug/ml。
共转化体系：
阴性对照：PSB1C3质粒，PSB2K3-J04450质粒
阳性对照：PSB1C3&PSB2K3-J04450质粒共转化
实验组1：PSB2K3-Cas9&PSB1C3-klenow1共转化
实验组2：PSB2K3-Cas9&PSB1C3-klenow2共转化
实验组3：PSB2K3-Cas9&PSB1C3-klenow3共转化
转化时质粒各转50ng，从-80°冰箱拿出XL-10感受态细胞(100ul)，置于冰上10min。然后向感受态细胞中加入50ng质粒，轻轻混匀，置于冰上静置30min。然后42℃热击90s，再置于冰上5min，后在超净台内加入800ul SOC无抗培养基。37℃，200rpm培养45min，使细胞恢复。然后取100ul，涂卡那/氯霉素双抗性平板，涂板时，实验组的平板上加上终浓度为0.1mM的IPTG，以及aTc来启动PSB2K3载体的高拷贝复制(PSB2K3载体上有两个复制起始子，在一般情况下，受F’起始子调控，产生低拷贝质粒，而在IPTG的诱导下，P1起始子被启动，产生高拷贝质粒)以及解除对Cas9组件的抑制(Cas9组件本身受PLtetO-1启动子调控，此启动子受TetR抑制子的抑制，在aTc存在的情况下，TetR不能再抑制PLtetO-1启动子，Cas9组件被表达)。平板置于37℃培养箱过夜培养。
实验结果如图3和图4所示，图3显示对照组的菌落生长情况。图3A显示阴性对照无菌落长出，图3A的左图为PSB1C3质粒阴性对照，图3A的右图为PSB2K3-J04450质粒阴性对照；图3B显示阳性对照菌落生长情况，由图3B可看出阳性对照有大量菌落长出，说明抗性板正常，质粒共转化效率正常。图4显示实验组菌落生长情况，图示显示实验组也有菌落长出，只是相较阳性对照，菌落极小，说明CRISPR系统发挥作用，菌落生长受到限制，生长缓慢。图4A-C分别对应实验组1-3，图4A-C的右图分别为左图的局部放大，对比图4A、4B和4C，可看出和klenow1、klenow2相比，klenow3的菌落虽然不及阳性对照菌落大小，但是比klenow1、klenow2菌落都大，说明它对DNA聚合酶I的作用小于klenow1/klenow2。
4.测序验证缺陷型菌株是否成功构建
对各实验组的菌株的目标区域进行测序。
测序结果证明了各实验组获得的菌株均为DNA聚合酶I缺陷型菌株。
图5-7分别显示各测序结果与参考序列(原始序列)的比对结果。图5显示实验组1获得的菌株的klenow1区域的测序序列与原始序列(DNA Pol I区域)的比对情况。图6显示实验组2获得的菌株的klenow2区域的测序序列与原始序列(DNA Pol I区域)的比对情况。图7显示实验组3获得的菌株的klenow3区域的测序序列与原始序列(DNA Pol I区域)的比对情况。图5-7中显示的每两行序列比对，上边一行是测序结果，下边一行是DNA PolI原始序列，带下划线标记的位点表示突变位点，这些单核苷酸个位点的突变编码终止密码子，使菌株失去全部或部分DNA Pol I酶功能。
实施例三
sgRNA表达质粒。可参照实施例二中的2.1构建获得该sgRNA表达质粒。
实施例四
可用于构建DNA聚合酶I缺陷型菌株的试剂盒，该试剂盒包括CRISPR系统。CRISPR系统参照实施例二构建。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (12)
1.一种构建DNA聚合酶I缺陷型菌株的方法，其特征在于，所述方法基于CRISPR系统进行所述构建，所述方法以klenow1、klenow2和klenow3中的至少之一作为靶序列，
所述klenow1为SEQ ID NO：1所示klenow片段基因序列中的第30-52位中的任意连续的20bp，
所述klenow2为SEQ ID NO：1所示klenow片段基因序列中的第370-390位中的任意连续的20bp，
所述klenow3为SEQ ID NO：1所示klenow片段基因序列中的第1048-1068位中的任意连续的20bp。
2.权利要求1的方法，其特征在于，所述klenow1为SEQ ID NO：1所示klenow片段基因序列中的第33-52位，
所述klenow2为SEQ ID NO：1所示klenow片段基因序列中的第371-390位，
所述klenow3为SEQ ID NO：1所示klenow片段基因序列中的第1049-1068位。
3.权利要求1或2的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)基于所述靶序列，获得能够与所述靶序列结合的双链DNA序列；
(2)构建以获得所述CRISPR系统，所述CRISPR系统包括sgRNA表达质粒和Cas9表达质粒，其中，
构建所述sgRNA表达质粒包括，
将(1)中的双链DNA序列连接到sgRNA-载体1上，以获得所述sgRNA表达质粒，
构建所述Cas9表达质粒包括，
将Cas9连接到载体2上，以获得所述Cas9表达质粒；
(3)利用(2)中的CRISPR系统转染所述菌株的感受态细胞，以获得所述DNA聚合酶I缺陷型菌株。
4.权利要求3的方法，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌。
5.权利要求3的方法，其特征在于，能够与klenow1结合的双链DNA序列的两条链分别为SEQ ID NO：2和3，
能够与klenow2结合的双链DNA序列的两条链分别为SEQ ID NO：4和5，
能够与klenow3结合的双链DNA序列的两条链分别为SEQ ID NO：6和7。
6.权利要求3的方法，其特征在于，能够与klenow1结合的双链DNA序列的两条链分别为SEQ ID NO：8和9，
能够与klenow2结合的双链DNA序列的两条链分别为SEQ ID NO：10和11，
能够与klenow3结合的双链DNA序列的两条链分别为SEQ ID NO：12和13。
7.权利要求3的方法，其特征在于，所述sgRNA-载体1的载体1和所述载体2具有不同的复制起始子。
8.一种DNA聚合酶I缺陷型菌株，其利用权利要求1-7任一方法构建获得。
9.一种sgRNA表达质粒，其包含能够结合权利要求1-7任一方法中的靶序列的序列。
10.一种CRISPR系统，其包括权利要求9的sgRNA表达质粒，任选的包括Cas9表达质粒。
11.权利要求10的CRISPR系统在构建DNA聚合酶I缺陷型菌株中的用途。
12.一种用于构建DNA聚合酶I缺陷型菌株的试剂盒，其包括权利要求10的CRISPR系统，任选的包括所述菌株的感受态细胞。
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