TWI608100B

TWI608100B - Ｃａｓ９表達質體、大腸桿菌基因剪輯系統及其方法

Info

Publication number: TWI608100B
Application number: TW106103730A
Authority: TW
Inventors: 胡育誠; 鍾沐恩; 葉懿心; 李泓; 宋立瑜
Original assignee: 國立清華大學
Priority date: 2017-02-03
Filing date: 2017-02-03
Publication date: 2017-12-11
Also published as: TW201829773A

Description

Cas9表達質體、大腸桿菌基因剪輯系統及其方法

本發明是有關於一種編碼微生物蛋白質的DNA重組技術，特別是一種編碼大腸桿菌蛋白質的DNA重組技術。

近年來，新一代基因工程的目標已從利用微生物表現單一蛋白發展至從基因層次全面性的操控微生物的代謝路徑，使其能夠分解或生產特定物質。因此，選擇性增刪大片段的基因序列，以及同時針對基因組上多個位置進行基因嵌入或基因敲除成為基因工程研究上非常重要的課題。

目前被廣泛應用的基因剪輯系統包含源於噬菌體，發展成熟且常應用於大腸桿菌的同源重組系統(homologous recombination system)，以及近年來興起的類轉錄活化因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases；TALENs)。然而，源自噬菌體的同源重組系統在染色體嵌入外源基因時有其長度限制，無法嵌入大於3.5kb的DNA片段。而TALENs則牽涉到酵素的設計與更動，執行上較為繁複、耗時。此外，若欲使用質體做為載體來生產目標蛋白，質體的不穩定性及其對抗生素的需求會影響基因表現的穩定性，並增加生產成本。

新興的CRISPR/Cas9基因剪輯系統，在進行基因編輯時僅需設計DNA序列，且已被證實可在真核生物中造成染色體指定位置雙股斷裂，進而提升外源基因透過同源重組嵌入染色體指定位置的效率。然而在過去CRISPR/Cas9基因剪輯系統應用於大腸桿菌的研究中，可嵌入至大腸桿菌的外源DNA片段大小仍受限制，最長的嵌入片段為8.0kb，且同源互換的效率只有14%。而當嵌入的DNA片段大小為5kb時，其效率也只有35%。因此，如何改善上述應用於大腸桿菌的基因剪輯系統的缺失，為目前所欲解決的重要課題之一。

本發明之一態樣是在提供一種Cas9表達質體，其具有如序列辨識編號1所示序列，其中包含tracrRNA序列、Cas9基因及抵抗氯黴素(chloramphenicol resistance,Cm^R)基因。

藉此，本發明之Cas9表達質體可有效增加CRISPR/Cas9系統用於大腸桿菌基因剪輯時切割目標基因序列的正確率，並大幅降低雜訊，使得後續之外源DNA可嵌入至目標基因序列中。

本發明之另一態樣是在提供一種大腸桿菌(Escherichia coli)基因剪輯系統，包含大腸桿菌、Cas9表達質體、λ-red重組酶表達質體、crRNA表達質體和線性DNA。Cas9表達質體具有如序列辨識編號1所示序列，其中包含tracrRNA序列、Cas9基因及抵抗氯黴素基因。λ-red重組酶表達質體包含依序排列之ParaB啟動子、Gam基因、Bet基因及Exo基因。crRNA表達質體包含依序排列之啟動子、crRNA序列及間隔序列，其中所述間隔序列與大腸桿菌之染色體之第一特定序列互補。線性DNA包含同源互換左臂、外源DNA及同源互換右臂，同源互換左臂和同源互換右臂構成同源互換區，且同源互換區之序列與大腸桿菌之染色體之第二特定序列相對應。

依據前述之大腸桿菌基因剪輯系統，其中所述crRNA表達質體可更包含一tracrRNA序列，且所述tracrRNA序列與間隔序列相接構成一sgRNA序列。

依據前述之大腸桿菌基因剪輯系統，其中所述同源互換左臂之長度和所述同源互換右臂之長度相同，且可為40bp至80bp。

依據前述之大腸桿菌基因剪輯系統，其中所述線性DNA可更包含一抵抗第一抗生素基因，所述抵抗第一抗生素基因可為抵抗四環黴素(Tetracycline resistance,Tc^R)基因。

依據前述之大腸桿菌基因剪輯系統，其中所述大腸桿菌可為K-12品系或W品系，較佳地可為MG1655菌株、W△5菌株或W△5#1菌株。

本發明之又一態樣是在提供一種大腸桿菌基因剪輯方法，包含下述步驟：先提供大腸桿菌、構築Cas9表達質體、λ-red重組酶表達質體和crRNA表達質體以及製備線性DNA。所述Cas9表達質體具有如序列辨識編號1所示序列，其中包含tracrRNA序列、Cas9基因及抵抗氯黴素基因。所述λ-red重組酶表達質體包含依序排列之ParaB啟動子、Gam基因、Bet基因及Exo基因。所述crRNA表達質體包含依序排列之啟動子、crRNA序列和間隔序列，所述間隔序列與大腸桿菌之染色體之第一特定序列互補。所述線性DNA包含同源互換左臂、外源DNA及同源互換右臂，所述同源互換左臂和所述同源互換右臂構成一同源互換區，且所述同源互換區之序列與大腸桿菌之染色體之第二特定序列相對應。將Cas9表達質體和λ-red重組酶表達質體共轉型至大腸桿菌中，以得到第一轉型株。再加入阿拉伯糖誘導第一轉型株之λ-red重組酶表達質體表現Gam蛋白、Exo蛋白和Beta蛋白。再將crRNA表達質體和線性DNA共轉型至第一轉型株中，以得到一第二轉型株。培養所述第二轉型株，其中所述Cas9表達質體表現一tracrRNA和一Cas9蛋白，所述crRNA表達質體表現一crRNA，tracrRNA、Cas9蛋白和crRNA形成一Cas9蛋白複合體對第二轉型株之第一特定序列進行雙股斷裂，且線性DNA之同源互換區與第二轉型株之第二特定序列進行同源交換，將外源DNA嵌入第二轉型株之第一特定序列中。

依據前述之大腸桿菌基因剪輯方法，其中所述crRNA表達質體可更包含一tracrRNA序列，且所述tracrRNA序列與間隔序列相接構成一sgRNA序列。

依據前述之大腸桿菌基因剪輯方法，其中所述線性DNA可更包含一抵抗第一抗生素基因。

依據前述之大腸桿菌基因剪輯方法，其中更包含一回養步驟，係將所述第二轉型株培養於不含抗生素之培養基中2小時至3小時。

依據前述之大腸桿菌基因剪輯方法，其中可更包含一篩選步驟，係於回養步驟後以含有第一抗生素之培養基培養所述第二轉型株，所述第一抗生素可為四環黴素(Tetracycline)。

依據前述之大腸桿菌基因剪輯方法，其中線性DNA之製備包含下述步驟：提供模板質體。以一引子對與模板質體進行PCR，以獲得PCR產物，其中所述引子對由一順向引子和一反向引子所組成，所述順向引子之5’端具有同源互換左臂之序列，且所述反向引子之5’端具有與同源互換右臂互補之序列。對PCR產物進行膠體純化，以得到一DNA溶液，將DNA溶液進行隔水透析，以得到所述線性DNA。其中DNA溶液可利用0.025μm之透析膜進行隔水透析。

藉此，本發明之大腸桿菌基因剪輯系統和大腸桿菌基因剪輯方法，可高效率嵌入外源DNA至大腸桿菌的染色體中，其可選擇性增刪大片段的基因序列，以及同時針對基因組上多個位置進行基因嵌入或基因敲除。若欲操控大腸桿菌的代謝路徑以表現目標產物時，可以將整段表現匣同源重組嵌入大腸桿菌之染色體中，降低分次嵌入基因的成本。

上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

100‧‧‧大腸桿菌基因剪輯方法

110、120、130、140、150、160、170、180、190‧‧‧步驟

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖為本發明之Cas9表達質體-pCas9’的圖譜；第2圖繪示本發明之大腸桿菌基因剪輯方法之步驟流程圖；第3圖為本發明之Cas9表達質體-pCas9’與習知之Cas9表達質體-pCas9用於本發明之大腸桿菌基因剪輯方法之菌落圖；第4A圖和第4B圖為本發明之大腸桿菌基因剪輯方法之不同回養條件之菌落圖；第5圖為不同製備方法之線性DNA用於本發明之大腸桿菌基因剪輯方法之菌落圖；第6A圖繪示具有不同長度之線性DNA之構築示意圖；第6B圖繪示本發明之大腸桿菌基因剪輯系統之一實施例之構築及轉型示意圖；第7A圖為利用本發明之大腸桿菌基因剪輯方法將具有不同長度之線性DNA嵌入大腸桿菌之染色體的菌落圖；第7B圖為第7A圖之同源互換效率統計圖；第8A圖和第8B圖為利用菌落PCR確認本發明之大腸桿菌基因剪輯系統將外源基因嵌入大腸桿菌之染色體之結果圖；第9A圖為利用菌落PCR確認本發明之大腸桿菌基因剪輯系統造成大腸桿菌之gltA基因點突變之結果圖；第9B圖為利用定序分析確認本發明之大腸桿菌基因剪輯系統造成大腸桿菌之gltA基因點突變之結果圖；以及第10圖為利用菌落PCR確認本發明之大腸桿菌基因剪輯系統嵌入外源lpdA基因至大腸桿菌之染色體之結果圖。

本說明書中所述之「λ-red重組酶表達質體」為利用λ噬菌體蛋白的同源重組系統(λ-Red系統)，其包含三個蛋白-Gam蛋白、Exo蛋白和Beta蛋白。Gam蛋白可抑制大腸桿菌內核酸酶RecBCD的活性，避免雙股外源線性DNA被降解，以延長其在細胞內停留的時間。Exo可利用其核酸內切酶活性，在外源線性DNA的兩端製造出一段懸垂的3’單股DNA。而Beta則可與懸垂的單股DNA結合，保護外源線性DNA不被RecBCD降解，並引導外源線性DNA 在目標位置與染色體發生同源重組。

本說明書中所述之「CRISPR/Cas9」係指Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPRs)和CRISPR-associated protein(Cas9)系統，為源自於原核生物的後天免疫系統，可抑制外來核酸片段在胞內的活性，消滅外來的質體或者噬菌體。依機制的不同可分為三型，CRISPR/Cas9系統為源自於化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的第二型CRISPR系統。第二型CRISPR/Cas9系統的作用機制可分為兩階段。第一階段為獲得免疫，CRISPR/Cas9系統將藉由病毒或接合作用(conjugation)入侵細胞內的外來核酸片段加以處理後，將之嵌入CRISPR基因位之中，稱為「間隔序列(spacer)」。第二階段為抑制外來核酸片段活性，CRISPR基因位含有多個與目標核酸序列互補的間隔序列，而每個間隔序列各編碼一段CRISPR RNA(crRNA)，並被一段固定的重複序列(direct repeats)所包夾。首先，CRISPR基因位轉錄出pre-crRNA，並與trans-activating crRNAs(tracrRNAs)結合。接著，pre-crRNA-tracrRNA複合物經過RNase III的處理，成為成熟的crRNA。隨後Cas9蛋白會與tracrRNA及成熟的crRNA螯合，形成核醣蛋白共聚體，並藉著crRNA上的間隔序列將核醣蛋白共聚體引導至與間隔序列互補的目標基因序列(protospacer)。最後藉由Cas9蛋白上HNH以及RuvC核酸酶結構域在目標基因序列3’端上游3bp處造成平滑末端(blunt-ended)雙股斷裂 (double strand break,DSB)。而目標基因序列除了含有與間隔序列互補的序列外，其3’端下游必須存在特定之protospacer-adjacent motif(PAM)-在化膿性鏈球菌第二型CRISPR/Cas9系統中其序列為NGG(N代表任意DNA密碼子)-才會造成雙股斷裂。

茲以下列具體試驗例進一步示範說明本發明，用以有利於本發明所屬技術領域通常知識者，可在不需過度解讀的情形下完整利用並實踐本發明，而不應將這些試驗例視為對本發明範圍的限制，但用於說明如何實施本發明的材料及方法。

<試驗例> 一、本發明之Cas9表達質體

本發明之Cas9表達質體-pCas9’係以習知之Cas9表達質體-pCas9(購自Addgene,Plasmid #42876)的骨架，以Eco31I/SalI切除第6515-7227bp中間之序列後，再以Klenow酵素處理，補齊5’端的黏狀末端(sticky end)並切除3’端懸垂的單股DNA，使DNA兩端成為平滑末端。最後，以T4 DNA接合酶重新接合，完成本發明之Cas9表達質體pCas9’的建構，其完整序列如序列辨識編號1所示。

請參照第1圖，為本發明之Cas9表達質體-pCas9’的圖譜。本發明之Cas9表達質體pCas9’的origin為p15A，為一低複本數質體，且含有源自於化膿性鏈球菌的tracrRNA序列和Cas9基因，以及抵抗氯黴素 (chloramphenicol resistance,Cm^R)基因。

二、本發明之大腸桿菌基因剪輯系統

本發明之大腸桿菌(Escherichia coli)基因剪輯系統包含大腸桿菌、Cas9表達質體pCas9’、λ-red重組酶表達質體、crRNA表達質體和線性DNA。

大腸桿菌可為K-12品系或W品系，較佳地可為MG11655菌株、W△5菌株或W△5#1菌株。

Cas9表達質體pCas9’具有如序列辨識編號1所示序列，其中包含tracrRNA序列、Cas9基因及抵抗氯黴素基因。

λ-red重組酶表達質體包含依序排列之ParaB啟動子、Gam基因、Beta基因及Exo基因。於本發明中所示之一實施例，λ-red重組酶表達質體為pKD46(序列如GenBank：AY048746.1所示)，其origin為oriR101w/repA101ts，為一對溫度敏感的origin，因此pKD46只會在30℃的環境下複製，在37℃下則停止複製。pKD46含有抵抗氨苄青黴素(ampicillin resistant,Amp^R)基因、ParaB啟動子以及由ParaB所調控(以阿拉伯糖誘導)的λ-Red基因組，依序為Gam基因、Bet基因和Exo基因，以及內源性終止子tL3。

crRNA表達質體包含依序排列之啟動子、crRNA序列及間隔序列，其中所述間隔序列與大腸桿菌之染色體之第一特定序列互補。此外，crRNA表達質體可更包含一tracrRNA序列，且所述tracrRNA序列與所述間隔序列相接構成一sgRNA序列。於本發明之不同實施方式中所使用的crRNA表達質體包含特異性辨識大腸桿菌染色體中LacZ基因的pCRISPR：：LacZ、特異性辨識大腸桿菌染色體中gltA基因的pCRISPR：：gltA和特異性辨識大腸桿菌染色體中lpdA基因的pCRISPR：：lpdA。pCRISPR：：LacZ和pCRISPR：：gltA係以pCRISPR：：Φ(由Addgene購入)為骨架，再以切位Eco311將不同的間隔序列接入pCRISPR：：Φ，以建構完成pCRISPR：：LacZ和pCRISPR：：gltA。pCRISPR：：Φ含有源自於化膿性鏈球菌的crRNA序列(由PLtetO1啟動子調控，可藉由切位Eco311將間隔序列接入兩個相鄰的重複序列中間)以及抵抗卡納黴素(kanamycin resistant,Km^R)基因。而pCRISPR：：LacZ之間隔序列如序列辨識編號2所示，pCRISPR：：gltA之間隔序列如序列辨識編號3所示。pCRISPR：：lpdA係以pgRNA-bacteria(由Addgene購入，內含J23119啟動子串接sgRNA骨幹序列)為模板，將如序列辨識編號4所示之間隔序列設計於引子端，經由PCR反應黏合後得到含lpdA成熟sgNRA表達系統(具有J23119啟動子、tracrRNA序列和序列辨識編號4所示之間隔序列)的質體pgRNA-lpdA，再以EcoRI/BamHI將質體pgRNA-lpdA中lpdA成熟sgRNA表達系統切下接入pCRISPR：：Φ，以建構完成pCRISPR：：lpdA。

線性DNA包含同源互換左臂、外源DNA及同源互換右臂，同源互換左臂和同源互換右臂構成同源互換區，且同源互換區之序列與大腸桿菌之染色體之第二特定序列相對應。其中所述同源互換左臂之長度和所述同源互換右臂之長度相同，且可為40bp至80bp。此外，線性DNA可更包含一抵抗第一抗生素基因，所述抵抗第一抗生素基因可為抵抗四環黴素(Tetracycline resistance,Tc^R)基因。於本發明中共構築了不同長度的線性DNA，所使用之模板質體和引子對如表一所示，其中引子對係由順向引子和反向引子所組成，而順向引子和反向引子前20bp與模板的序列互補，後50bp則與大腸桿菌染色體上線性DNA預計插入位置兩側的染色體序列互補。而表一中pET-21b(+)-Tc-EGFP係由pET-21b(+)(由Addgene購入)為骨架，插入抵抗四環黴素基因和EGFP基因而得。pET-Tc-EG-1565stuff係以pET-21b(+)-Tc-EGFP為骨架，插入phaCAB基因組中長1565bp片段而得。pET-Tc-EG-3121stuff係以pET-21b(+)-Tc-EGFP為骨架，插入phaCAB基因組中長3121bp片段而得。pET-Tc-EG-3121-SH係以pET-Tc-EG-3121stuff為骨架，再插入sucD基因與4-hbd基因而得。

三、本發明之大腸桿菌基因剪輯方法

請參照第2圖為本發明之大腸桿菌基因剪輯方法100之步驟流程圖。第2圖中，大腸桿菌基因剪輯方法100包含步驟110、步驟120、步驟130、步驟140、步驟150、步驟160、步驟170、步驟180、步驟190。

步驟110為提供大腸桿菌，大腸桿菌可為K-12品系或W品系，較佳地可為MG1655菌株、W△5菌株或W△5#1菌株。

步驟120為構築Cas9表達質體，Cas9表達質體具有如序列辨識編號1所示序列，其中包含tracrRNA序列、Cas9基因及抵抗氯黴素基因。

步驟130為構築λ-red重組酶表達質體，λ-red重組酶表達質體包含依序排列之ParaB啟動子、Gam基因、Bet基因及Exo基因。

步驟140為構築crRNA表達質體，所述crRNA表達質體包含依序排列之啟動子及間隔序列，間隔序列與大腸桿菌之染色體之第一特定序列互補。此外，crRNA表達質體可更包含一tracrRNA序列，且tracrRNA序列與間隔序列相接構成一sgRNA序列。

步驟150為製備線性DNA，線性DNA包含同源互換左臂、外源DNA及同源互換右臂，同源互換左臂和所述同源互換右臂構成一同源互換區，且同源互換區之序列與大腸桿菌之染色體之第二特定序列相對應。此外，線性DNA可更包含一抵抗第一抗生素基因，所述抵抗第一抗生素基因可為抵抗四環黴素基因。線性DNA可由人工合成寡核苷酸，或由下述步驟製備：提供模板質體。以一引子對與模板質體進行PCR，以獲得PCR產物，其中所述引子對由一順向引子和一反向引子所組成，所述順向引子之5’端具有同源互換左臂之序列，且所述反向引子之5’端具有與同源互換右臂互補之序列。對PCR產物進行膠體純化，以得到一DNA溶液，將DNA溶液進行隔水透析，以得到所述線性DNA。其中DNA溶液可利用0.025μm之透析膜進行隔水透析。

步驟160為將Cas9表達質體和λ-red重組酶表達質體共轉型至大腸桿菌中，以得到第一轉型株。共轉型之方法可為電穿孔轉型法或其他習知之轉型法。

步驟170為再加入阿拉伯糖誘導第一轉型株之λ-red重組酶表達質體表現Gam蛋白、Exo蛋白和Beta蛋白。

步驟180為將crRNA表達質體和線性DNA共轉型至第一轉型株中，以得到第二轉型株。共轉型之方法可為電穿孔轉型法或其他習知之轉型法。

步驟190為培養第二轉型株，其中第二轉型株中的Cas9表達質體表現一tracrRNA和一Cas9蛋白，而crRNA表達質體表現一crRNA，tracrRNA、Cas9蛋白和crRNA形成一Cas9蛋白複合體對第二轉型株之第一特定序列進行雙股斷裂，且線性DNA之同源互換區與第二轉型株之第二特定序列進行同源交換，將外源DNA嵌入第二轉型株之第一特定序列中。

本發明之大腸桿菌基因剪輯方法100可更包含一回養步驟，係將所述第二轉型株培養於不含抗生素之培養基中2小時至3小時。

此外，本發明之大腸桿菌基因剪輯方法100另可更包含一篩選步驟，係於回養步驟後以含有第一抗生素之培養基培養所述第二轉型株，所述第一抗生素可為四環黴素(Tetracycline)。

四、本發明之大腸桿菌基因剪輯方法之試驗條件

為了使本發明之大腸桿菌基因剪輯方法達到最佳之同源重組效率，本試驗例分別針對Cas9表達質體、回養條件和線性DNA之製備方法進行改良和試驗。

1.本發明之Cas9表達質體與習知之Cas9表達質體

本發明之Cas9表達質體-pCas9’構築方式如前試驗例一所示，在此不再贅述。習知之Cas9表達質體-pCas9係購自Addgene(Plasmid #42876)。於本試驗例中λ-red重組酶表達質體為pKD46，crRNA表達質體為pCRISPR：：LacZ，線性DNA之長度為1.4kb。

試驗時，將pCas9與pKD46共同電穿孔轉型置入大腸桿菌中作為pCas9組別之第一轉型株，以及將pCas9’與pKD46共同轉型置入大腸桿菌中作為pCas9’組別之第一轉型株後，加入阿拉糖誘導pKD46表現Gam蛋白、Exo蛋白和Beta蛋白。再分別將pCRISPR：：LacZ與線性DNA同時以電穿孔轉型送入pCas9組別之第一轉型株以得到pCas9組別之第二轉型株，以及pCas9’組別之第一轉型株以得到pCas9’組別之第二轉型株。再將pCas9組別之第二轉型株和pCas9’組別之第二轉型株，將pCas9組別和pCas9’組別之第二轉型株以SOC培養基(購自New England Biolab^TM，不含抗生素)於37℃回養。回養後，將回養液塗佈於含有IPTG、X-gal和抗生素(卡納黴素、氯黴素或四環黴素)的培養皿上，以37℃培養20~24小時，再定量白色菌落(白色菌落代表線性DNA片段成功嵌入並破壞lacZ基因)與藍色菌落的數目。

請參照第3圖，為本發明之Cas9表達質體-pCas9’與習知之Cas9表達質體-pCas9用於本發明之大腸桿菌基因剪輯方法的菌落圖。第3圖的結果顯示，pCas9組別塗盤佈滿藍色菌落的背景雜訊，顯示利用習知之Cas9表達質體-pCas9會產生嚴重的雜訊。而pCas9’組別塗盤的菌落數雖然較少，但皆為白色菌落，顯示利用本發明之Cas9表達質體-pCas9’可以大幅降低背景雜訊，進而提高本發明之大腸桿菌基因剪輯方法將外源DNA嵌入目標基因序列的正確性。

2.回養條件

在本發明之大腸桿菌基因剪輯方法中，大腸桿菌在轉型時遭遇一定的壓力，在回養過程中被CRISPR/Cas9系統切割染色體，對菌體的健康而言是雙重傷害。因此，為了進一步提升本發明之大腸桿菌基因剪輯方法之同源重組效率，於本試驗中分別將回養步驟的時間由文獻標準程序的1小時改為2小時至3小時，以及將回養步驟中所使用的SOC培養基體積從1ml增加至2ml，使大腸桿菌於更好的恢復環境，以進行同源重組並修復斷裂的染色體。

試驗回養步驟時間時，先將pCas9’與pKD46共同轉型置入大腸桿菌中以得到第一轉型株後，加入阿拉糖誘導pKD46表現Gam蛋白、Exo蛋白和Beta蛋白。再分別將pCRISPR：：LacZ與5.4kb的線性DNA同時以電穿孔轉型送入第一轉型株以得到第二轉型株，再將第二轉型株分別以SOC培養基於37℃回養1小時或2.5小時。回養後，將回養液塗佈於含有IPTG、X-gal和抗生素(卡納黴素、氯黴素或四環黴素)的培養皿上，以37℃培養20~24小時，再以藍/白篩選測試確認。試驗回養培養基體積時，先將pCas9’與pKD46共同轉型置入大腸桿菌中以得到第一轉型株後，加入阿拉糖誘導pKD46表現Gam蛋白、Exo蛋白和Beta蛋白。再分別將pCRISPR：：LacZ與3.9kb的線性DNA同時以電穿孔轉型送入第一轉型株以得到第二轉型株，再將第二轉型株分別以1ml或2ml SOC培養基於37℃回養2.5小時。回養後，將回養液塗佈於含有IPTG、X-gal和抗生素(卡納黴素、氯黴素或四環黴素)的培養皿上，以37℃培養20~24小時，定量白色菌落與藍色菌落的數目。

請參照第4A圖和第4B圖，為本發明之大腸桿菌基因剪輯方法之不同回養條件之菌落圖，其中第4A圖為調整回養步驟的時間，第4B圖為調整回養培養基的體積。第4A圖的結果顯示，回養時間為2.5小時的組別生成17個白色菌落與1個藍色菌落，回養時間為1小時的組別則生成0個白色菌落與5個藍色菌落。相較於回養時間為1小時的組別，回養時間為2.5小時的組別的藍色菌落數目顯著減少，並且白色菌落的數目卻從0個大幅增加到17個。而第4B圖的結果顯示，以2ml SOC培養基回養的組別生成20個白色菌落與12個藍色菌落，以1ml SOC培養基回養的組別則生成0個白色菌落與19個藍色菌落。相較於1ml組別，2ml組的藍色菌落數目沒有顯著減少，但是白色菌落的數目卻從0個大幅增加到20個，與第4A圖的結果相同，證實大腸桿菌需要更好的回養環境以藉由同源重組修復染色體損傷。

3.線性DNA之製備方法

使線性DNA的品質更好以利後續電穿孔的效率，本發明在製備線性DNA時，會將切膠純化後的DNA溶液以透析膜隔水透析，所使用的透析膜為0.025μm VSWP透析膜(MF-Millipore)，以去除溶液中部份的雜質，使得DNA溶液的260/230比值提昇至2左右，於電穿孔實驗時，可以增加電穿孔的時間常數，達到5.5ms以上的高水準。於本試驗例中將進一步測試透析處理的線性DNA是否會影響本發明之大腸桿菌基因剪輯方法的同源互換率。

試驗時，先將pCas9’與pKD46共同轉型置入大腸桿菌中以得到第一轉型株後，加入阿拉糖誘導pKD46表現Gam蛋白、Exo蛋白和Beta蛋白。再分別將pCRISPR：：LacZ與經隔水透析處理或未經隔水透析處理的10kb線性DNA同時以電穿孔轉型送入第一轉型株以得到第二轉型株，再將第二轉型株分別以SOC培養基於37℃回養2.5小時。回養後，將回養液塗佈於含有IPTG、X-gal和抗生素(卡納黴素、氯黴素或四環黴素)的培養皿上，以37℃培養20~24小時，再定量白色菌落與藍色菌落的數目。

請參照第5圖，為不同製備方法之線性DNA用於本發明之大腸桿菌基因剪輯方法之菌落圖，結果顯示，線性DNA未經隔水透析處理的組別生成2個白色菌落，而線性DNA經隔水透析處理的組別則生成8個白色菌落，顯示DNA溶液經隔水透析降低其中雜質所得到的線性DNA可大幅提升本發明之大腸桿菌基因剪輯方法的同源互換率。

經上述測試後可得到本發明之大腸桿菌基因剪輯方法的最佳試驗條件，後續之實施方式皆以上述最佳試驗條件進行試驗。

五、實施方式一

為測試本發明之大腸桿菌基因剪輯方法是否可嵌入長片段外源DNA至大腸桿菌的染色體中，於本試驗例中製備不同長度的線性DNA測試其用於本發明之大腸桿菌基因剪輯方法之同源互換率。請參照第6A圖，其繪示具有不同長度之線性DNA之構築示意圖，所製備的線性DNA長度分別為1.4、2.4、3.9、5.4、7.0與10kb，其兩端帶有50bp的同源互換臂，製備不同長度線性DNA所使用的模板質體和引子對如試驗例二所述，在此不再贅述。

實施方式一所使用之大腸桿菌為MG1655菌株(購自食品工業發展研究所)，其為分子生物與微生物研究中常用的K-12品系，須培養於含嘧啶的培養基中方能生長良好，可以LB培養基培養。於實施方式一中所使用之λ-red重組酶表達質體為pKD46，crRNA表達質體為pCRISPR：：LacZ。

請再參照第6B圖，繪示本發明之大腸桿菌基因剪輯系統之一實施例之構築及轉型示意圖。試驗時，試驗組先將pCas9’與pKD46共同轉型至大腸桿菌MG1655菌株中以得到第一轉型株後，加入阿拉糖誘導pKD46表現Gam蛋白、Exo蛋白和Beta蛋白，其可協助維持後續送入第一轉型株的線性DNA的穩定性。再分別將pCRISPR：：LacZ與不同長度的線性DNA同時以電穿孔轉型送入第一轉型株，以得到第二轉型株，此時CRSIRP/Cas9系統會在lacZ基因位置造成切割，並促進線性DNA嵌入至lacZ基因中。於37℃回養2.5小時後，將回養液全部塗佈於含有IPTG、X-gal、卡納黴素和四環黴素的培養皿上。而對照組則僅轉型pKD46至大腸桿菌MG1655菌株中以得到對照第一轉型株，並且只導入不同長度的線性DNA至對照第一轉型株以得到對照第二轉型株，經由回養2.5小時後，並將菌液塗佈於含有 IPTG、X-gal和四環黴素的培養皿。共同於37℃培養16-24小時後，定量白色菌落與藍色菌落的數目，並計算同源互換的效率，即基因編輯效率，其計算方式：白色菌落數/總菌落數(白點加藍點數量)。

請參照第7A圖，為利用本發明之大腸桿菌基因剪輯方法將具有不同長度之線性DNA嵌入大腸桿菌之染色體的菌落圖，。結果顯示在對照組中，平均白色菌落數依1.4、2.4、3.9、5.4、7.0與10kb組別分別為223、37、3、2、0與0個。在試驗組中，平均白色菌落數依1.4、2.4、3.9、5.4、7.0與10kb組別分別為781、480、105、68、8、5個。顯示不論線性DNA的長度，本發明之大腸桿菌基因剪輯方法都使白色菌落的數目顯著增加(p<0.05)，說明本發明之大腸桿菌基因剪輯方法在目標基因序列位置的專一性切割確實能夠促進大腸桿菌MG1655的同源重組。特別是在對照組中，當線性DNA大於3.9kb時，白色菌落數大幅減少至3個以下，顯示單靠傳統的λ-Red同源重組系統，一旦線性DNA長度超過3.9kb以上，將導致嵌入的效率低落。

請在參照第7B圖，為第7A圖之同源互換效率統計圖。結果顯示，於對照組中1.4與2.4kb組別成功重組的效率分別為39%與81%，而3.9kb組則降為19%。然而當線性DNA長度大於3.9kb時，挑到成功重組菌落的機率大幅降至1%以下。在試驗組中，1.4、2.4與3.9kb組別挑到成功重組菌落的機率約為90%，而5.4、7.0與10.0kb組別的機率則分別為71%、61%與57%。顯示本發明之大腸桿菌基因剪輯方法在進行長片段的基因剪輯時，可大幅提升同源互換效率，特別是當線性DNA長度大於3.9kb時，挑選到正確菌落的機率<1%提升至57%-71%。

為了進一步確認線性DNA插入大腸桿菌的染色體上的正確位置，於本試驗例中設計兩組引子，在試驗組中各別隨機挑取3-5個白色菌落，對線性DNA插入染色體後的左右接縫處進行菌落PCR，若線性DNA正確插入，則產生約1kb的PCR訊號。請參照第8A圖，為利用菌落PCR確認本發明之大腸桿菌基因剪輯系統將外源基因嵌入大腸桿菌之染色體之結果圖，PCR分析結果顯示，在所有不同長度線性DNA的組別中，都得到正確的PCR訊號。

此外，本試驗例也利用與接縫外側的染色體序列互補的引子，PCR整段插入染色體的線性DNA，確認線性DNA完整插入染色體。請參照第8B圖，為利用菌落PCR確認本發明之大腸桿菌基因剪輯系統將外源基因嵌入大腸桿菌之染色體之結果圖。第8B圖的結果顯示，在試驗組中，不同長度線性DNA都能夠正確嵌入大腸桿菌染色體上的lacZ基因位置。

六、實施方式二

為測試本發明之大腸桿菌基因剪輯方法是否亦可用於置備大腸桿菌點突變株，於本試驗例中製備具有點突變序列的線性DNA，測試其用於本發明之大腸桿菌基因剪輯方法之同源互換率。實施方式二所使用之大腸桿菌為W△5菌株，W△5菌株係將W菌株(購自食品工業發展研究所，為分子生物與微生物研究中常用的W品系)剔除mdh基因、ldhA基因、pflB基因、adhE基因和araC基因所得之菌株。於實施方式二中所使用之λ-red重組酶表達質體為pKD46，crRNA表達質體為pCRISPR：：gltA，所使用的線性DNA如序列辨識編號9所示，其前後2端各40bp與大腸桿菌染色體上線性DNA預計插入位置兩側的染色體序列互補，第41-43bp為點突變序列。

試驗時，先將pCas9’與pKD46共同轉型至大腸桿菌W△5菌株中以得到第一轉型株後，加入阿拉糖誘導pKD46表現Gam蛋白、Exo蛋白和Beta蛋白。再分別將pCRISPR：：gltA與線性DNA同時以電穿孔轉型送入第一轉型株以得到第二轉型株，此時CRSIRP/Cas9系統會在gltA基因位置造成切割，並促進線性DNA嵌入至gltA基因中，以得到點突變株(命名為W△5#1)。於37℃回養2.5小時後，於37℃培養16-24小時後，隨機挑取數個白色菌落，以線性DNA插入染色體後的接縫外側的染色體序列互補的引子進行菌落PCR，PCR整段插入染色體的線性DNA，確認線性DNA完整插入染色體，若線性DNA正確插入，則產生約500bp的PCR訊號。請參照第9A圖為利用菌落PCR確認本發明之大腸桿菌基因剪輯系統造成大腸桿菌之gltA基因點突變之結果圖，結果顯示，對所挑選到的白色菌落進行菌落PCR，皆可得到正確的PCR訊號。

本試驗例進一步將上述菌落PCR所得到的PCR產物進行定序分析，以確認點突變的存在。請參照第 9B圖，為利用定序分析確認本發明之大腸桿菌基因剪輯系統造成大腸桿菌之gltA基因點突變之結果圖，結果顯示，利用本發明之大腸桿菌基因剪輯方法嵌入線性DNA的大腸桿菌W△5#1菌株確實存在點突變。

七、實施方式三

為進一步測試本發明之大腸桿菌基因剪輯方法是否亦可用於置換大腸桿菌原有之基因為不同菌株來源的相同基因，於本試驗例中以lpdA基因為例，製備具有外源lpdA基因的線性DNA，測試其用於本發明之大腸桿菌基因剪輯方法之同源互換率。實施方式三所使用之大腸桿菌為W△5#1菌株，其為前述實施方式二所得之點突變株。於實施方式三中所使用之λ-red重組酶表達質體為pKD46，crRNA表達質體為pCRISPR：：lpdA，所使用的線性DNA如序列辨識編號10所示，其前後2端各50bp與大腸桿菌染色體上線性DNA預計插入位置兩側的染色體序列互補，並具有外源lpdA基因和抵抗四環黴素基因。

試驗時，先將pCas9’與pKD46共同轉型至大腸桿菌W△5#1菌株中以得到第一轉型株。再分別將pCRISPR：：lpdA與線性DNA同時以電穿孔轉型送入第一轉型株以得到第二轉型株，此時CRSIRP/Cas9系統會在lpdA基因位置造成切割，並促進線性DNA嵌入至lpdA基因中，以得到突變株。於37℃回養2.5小時後，於37℃培養16-24小時後，隨機挑取數個白色菌落，以線性DNA插入染色體後的接縫外側的染色體序列互補的引子進行菌落 PCR,PCR整段插入染色體的線性DNA，確認線性DNA完整插入染色體，若線性DNA正確插入，則產生約3.3kb的PCR訊號。

請參照第10圖，為利用菌落PCR確認本發明之大腸桿菌基因剪輯系統嵌入外源lpdA基因至大腸桿菌之染色體之結果圖，結果顯示，對所挑選到的白色菌落進行菌落PCR，皆可得到正確的PCR訊號，顯示以本發明之大腸桿菌基因剪輯方法確實可將大腸桿菌之原有基因正確置換為不同來源的相同基因。

結果可知，本發明之Cas9表達質體可有效增加CRISPR/Cas9系統用於大腸桿菌基因剪輯時切割目標基因序列的正確率，並大幅降低雜訊，使得後續之外源DNA可嵌入至目標基因序列中。而本發明之大腸桿菌基因剪輯系統和大腸桿菌基因剪輯方法，可高效率嵌入外源DNA至大腸桿菌的染色體中，其可選擇性增刪大片段的基因序列，以及同時針對基因組上多個位置進行基因嵌入或基因敲除。若欲操控大腸桿菌的代謝路徑以表現目標產物時，可以將整段表現匣同源重組嵌入大腸桿菌之染色體中，降低分次嵌入基因的成本。此外，習知大腸桿菌基因剪輯系統所使用之同源互換臂長度約於500bp，無法直接利用引子的設計直接以PCR方法來製備線性DNA，而是需要再進行兩步驟的質體接合反應以及一個步驟的切割反應，才能製備出線性的DNA，製備流程相當繁鎖。而本發明之大腸桿菌基因剪輯系統於現性DNA上所使用之同源互換臂長度僅為40bp至 80bp，是以可利用引子的設計直接以PCR方法製備線性DNA，或直接以人工合成寡核苷酸序列以製備線性DNA。因此，藉由本發明之大腸桿菌基因剪輯系統和大腸桿菌基因剪輯方法可以增加大腸桿菌基因剪輯的便利性，並可加快大腸桿菌基因剪輯的運作速度，未來更可應用於調控基因代謝路徑，達到生產生質化學品的目的。

然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。

<110> 國立清華大學

<120> Cas9表達質體、大腸桿菌基因剪輯系統及其應用

<160> 10

<210> 1

<211> 8618

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> pCas9’

<400> 1

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> pCRISPR：：LacZ之間隔序列

<400> 2

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> pCRISPR：：gltA之間隔序列

<400> 3

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> pCRISPR：：lpdA之間隔序列

<223> Artificial Sequence

<400> 4

<210> 5

<211> 68

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> 增幅線性DNA之反向引子

<400> 5

<210> 6

<211>

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> 增幅線性DNA之反向引子

<400> 6

<210> 7

<211> 74

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> 增幅線性DNA之反向引子

<400> 7

<210> 8

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> 增幅線性DNA之反向引子

<400> 8

<210> 9

<211> 83

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> 線性DNA

<400> 9

<210> 10

<211> 3014

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> 線性DNA

<400> 10

Claims

一種Cas9表達質體，其具有如序列辨識編號1所示序列，其中包含一tracrRNA序列、一Cas9基因及一抵抗氯黴素(chloramphenicol resistance,Cm^R)基因。
一種大腸桿菌(Escherichia coli)基因剪輯系統，包含：一大腸桿菌；一如申請專利範圍第1項所述之Cas9表達質體；一λ-red重組酶表達質體，其中該λ-red重組酶表達質體包含依序排列之一ParaB啟動子、一Gam基因、一Bet基因及一Exo基因；一crRNA表達質體，其中該crRNA表達質體包含依序排列之一啟動子、一crRNA序列及一間隔序列，該間隔序列與該大腸桿菌之一染色體之一第一特定序列互補；以及一線性DNA，該線性DNA包含一同源互換左臂、一外源DNA及一同源互換右臂，該同源互換左臂和該同源互換右臂構成一同源互換區，且該同源互換區之序列與該大腸桿菌之該染色體之一第二特定序列相對應。
如申請專利範圍第2項所述之大腸桿菌基因剪輯系統，其中該crRNA表達質體更包含一tracrRNA序列，且該tracrRNA序列與該間隔序列相接構成一 sgRNA序列。
如申請專利範圍第2項所述之大腸桿菌基因剪輯系統，其中該同源互換左臂之長度和該同源互換右臂之長度相同，且為40bp至80bp。
如申請專利範圍第2項所述之大腸桿菌基因剪輯系統，其中該線性DNA更包含一抵抗第一抗生素基因。
如申請專利範圍第5項所述之大腸桿菌基因剪輯系統，其中該抵抗第一抗生素基因為抵抗四環黴素(Tetracycline resistance,Tc^R)基因。
如申請專利範圍第2項所述之大腸桿菌基因剪輯系統，其中該大腸桿菌為K-12品系或W品系。
如申請專利範圍第7項所述之大腸桿菌基因剪輯系統，其中該大腸桿菌為MG1655菌株、W△5菌株或W△5#1菌株。
一種大腸桿菌(Escherichia coli)基因剪輯方法，包含：提供一大腸桿菌；構築一Cas9表達質體，該Cas9表達質體具有如序列辨識編號1所示序列，其中包含一tracrRNA序列、一Cas9基因及一抵抗氯黴素(chloramphenicol resistance,Cm^R)基因；構築一λ-red重組酶表達質體，其中該λ-red重組酶表達質體包含依序排列之一ParaB啟動子、一Gam基因、一Bet基因及一Exo基因；構築一crRNA表達質體，其中該crRNA表達質體包含依序排列之一啟動子、一crRNA序列及一間隔序列，該間隔序列與該大腸桿菌之一染色體之一第一特定序列互補；製備一線性DNA，該線性DNA包含一同源互換左臂、一外源DNA及一同源互換右臂，該同源互換左臂和該同源互換右臂構成一同源互換區，且該同源互換區之序列與該大腸桿菌之該染色體之一第二特定序列相對應；將該Cas9表達質體和該λ-red重組酶表達質體共轉型至該大腸桿菌中，以得到一第一轉型株；加入一阿拉伯糖誘導該第一轉型株之該λ-red重組酶表達質體表現一Gam蛋白、一Exo蛋白和一Beta蛋白；將該crRNA表達質體和該線性DNA共轉型至該第一轉型株中，以得到一第二轉型株；以及培養該第二轉型株，其中該Cas9表達質體表現一tracrRNA和一Cas9蛋白，該crRNA表達質體表現一crRNA，該tracrRNA、該Cas9蛋白和該crRNA形成一Cas9蛋白複合體對該第二轉型株之該第一特定序列進行雙股斷裂，且該線性DNA之該同源互換區與該第二轉型株之該第二特定序列進行同源交換，將該外源DNA嵌入該第二轉型株之該第一特定序列中。
如申請專利範圍第9項所述之大腸桿菌基因剪輯方法，其中該crRNA表達質體更包含一tracrRNA序列，且該tracrRNA序列與該間隔序列相接構成一sgRNA序列。
如申請專利範圍第9項所述之大腸桿菌基因剪輯方法，其中該線性DNA更包含一抵抗第一抗生素基因。
如申請專利範圍第11項所述之大腸桿菌基因剪輯方法，其中更包含一回養步驟，係將該第二轉型株培養於不含一抗生素之一培養基中2小時至3小時。
如申請專利範圍第12項所述之大腸桿菌基因剪輯方法，其中更包含一篩選步驟，係於該回養步驟後以含有一第一抗生素之該培養基培養該第二轉型株。
如申請專利範圍第13項所述之大腸桿菌基因剪輯方法，其中該第一抗生素為四環黴素(Tetracycline)。
如申請專利範圍第9項所述之大腸桿菌基因剪輯方法，其中該線性DNA之製備更包含：提供一模板質體；以一引子對與該模板質體進行PCR，以獲得一PCR產物，其中該引子對由一順向引子和一反向引子所組成，該順向引子之5’端具有該同源互換左臂之序列，且該反向引子之5’端具有與該同源互換右臂互補之序列；對該PCR產物進行膠體純化，以得到一DNA溶液；以及將該DNA溶液進行隔水透析，以得到該線性DNA。
如申請專利範圍第15項所述之大腸桿菌基因剪輯方法，其中該DNA溶液係利用0.025μm之一透析膜進行隔水透析。