CN108277231B

CN108277231B - 一种用于棒状杆菌基因组编辑的crispr系统

Info

Publication number: CN108277231B
Application number: CN201710009784.8A
Authority: CN
Inventors: 杨晟; 蒋宇; 钱峰慧
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2017-01-06
Filing date: 2017-01-06
Publication date: 2021-02-02
Anticipated expiration: 2037-01-06
Also published as: CN108277231A

Abstract

本发明公开了一种用于棒状杆菌基因组编辑的CRISPR系统，其包括：可表达V型CRISPR核酸酶的V型CRISPR核酸酶表达元件，其包含启动子、V型CRISPR核酸酶基因序列、终止子，所述V型CRISPR核酸酶选自Cpf1、c2c1、c2c3；可表达crRNA的crRNA表达元件，其包含启动子、crRNA基因序列；所述crRNA是根据基因组上预期进行定向编辑的靶序列设计的碱基配对序列，所述crRNA用于将V型CRISPR核酸酶引导到基因组上的靶序列，靶序列包含5’‑TTN‑3’等特征的PAM序列作为核酸酶识别位点，其中N表示碱基A、T、C或G。该CRISPR系统可实现基因组的基因突变、基因框内插入或基因片段缺失。

Description

一种用于棒状杆菌基因组编辑的CRISPR系统

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体地说，涉及一种用于棒状杆菌基因组编辑的CRISPR系统，特别涉及一种用于谷氨酸棒杆菌基因组编辑的V型CRISPR/Cas系统，尤其涉及一种用于谷氨酸棒杆菌基因组编辑的CRISPR/Cpf1系统。

背景技术

谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum，简称为谷棒)是一种从土壤分离出来的高GC含量的革兰氏阳性细菌，用于生产氨基酸。谷氨酸棒杆菌基因组操作工具自上世纪90年代开始开发，策略大致可分为基于同源重组的等位基因交换和单链寡核苷酸重组。经典的基于同源重组的等位基因交换依赖于两个连续的事件，第一步整合到基因组的质粒通过单交换整合到基因组上，第二步在基因组上发生双交换。其中第二步双交换筛选效率可通过一系列反筛标记来提高，比如sacB、rpsLmut、upp或I-sceI。整个过程效率低且费时，并需要辅以相应的特殊条件并配置特殊培养基。基于同源重组的等位基因交换可以和Cre/loxP系统结合用于一步筛选双交换，后续需要将基因组上的筛选标记，通常是抗生素基因删除，同时基因组会残留loxP序列从而引起极性效应。改进的方法是将Cre/loxP系统和I-SceI核酸内切酶结合，可以将基因组残留loxP序列删除，从而实现无痕编辑。单链寡核苷酸重组依赖用于DNA重组和DNA修复的重组蛋白RecT。由于单链重组效率很低，通常需要结合高通量筛选手段，如在细胞内设置可以感受某种产物的生物感应器，并通过流式细胞仪进行筛选。这种单链重组可用于基因组点突变，而没有基因删除或插入的报道。

基于规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR)/CRISPR相关(CAS)的基因组编辑技术已被开发用于众多原核和真核生物。CRISPR/Cas系统在原核生物抗病毒防御中发挥重要功能，分别存在于90％和40％的古细菌及细菌基因组中，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas系统被分为两大类(class)共五个类型(type)：其中，第一大类包括I型、III型和IV型；第二大类包括II型和V型，并且II型和V型又分别包含数个亚型。其中II型进行DNA干扰需要一个源于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9蛋白。近年来，II型CRISPR/Cas系统被用于高等真核生物中在细胞和生物体水平上实现基因组编辑，在过去的几年里CRISPR/Cas9技术在全球的应用呈爆炸性增长。此系统的工作原理是成熟的crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与反式激活tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，并引导核酸酶Cas9蛋白识别基因组上前间区序列邻近基序(protospacer-adjacentmotif，PAM)，其特征是NGG，N代表任意碱基，从而发生基因组切割。

V型CRISPR/Cas(或表示为CRISPR-Cas)系统中使用的核酸酶包括V-A型CRISPR的核酸酶Cpf1、V-B型CRISPR的核酸酶c2c1和V-C型CRISPR的核酸酶c2c3。其中CRISPR/Cpf1的特征是只由crRNA引导Cpf1识别基因组上胸苷丰富的PAM序列(5’-TTN-3’，N代表任意碱基)，从而发生切割，无需tracrRNA参与。V-B型CRISPR的c2c1核酸酶也可以在crRNA引导下发生基因组切割。

CRISPR/Cpf1系统相比CRISPR/Cas9系统的应用优势主要体现在如下几个方面：1.Cpf1复合物识别不同于Cas9的PAM序列，提高靶点选择的灵活性。适用于GC含量低的生物和靶点。2.Cpf1酶剪切后形成粘性末端，让DNA插入更容易(Cas9核酸酶剪切后形成平末端)。3.Cpf1切割位点远离PAM，即使靶基因在切割位点发生突变，不会破坏PAM区的功能，仍然能被切割，允许被多次编辑。有报道CRISPR/Cpf1系统已被应用于人类和小鼠细胞编辑。

发明内容

CRISPR/Cas系统被用于多种细菌的基因组编辑。然而，尚没有报道CRISPR/Cas9系统用于棒状杆菌比如谷氨酸棒杆菌的基因组编辑，因为携带有Cas9表达盒的谷氨酸棒杆菌/大肠杆菌穿梭质粒不能够被转化入谷氨酸棒状杆菌ATCC13032。为了克服现有技术的障碍，实现对于棒状杆菌比如谷氨酸棒杆菌的基因组编辑，本发明人开发了一种V型CRISPR/Cas系统包括CRISPR/Cpf1系统，其能够在棒状杆菌的基因改造中发挥作用。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种用于棒状杆菌基因组编辑的CRISPR系统。

本发明的第二个目的在于提供一种编辑棒状杆菌基因组的方法。

本发明的第三个目的在于提供上述CRISPR系统在细胞基因组编辑中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于棒状杆菌基因组编辑的CRISPR系统，其包括：

可表达V型CRISPR核酸酶的V型CRISPR核酸酶表达元件，其包含启动子、V型CRISPR核酸酶基因序列、终止子，所述V型CRISPR核酸酶选自Cpf1、c2c1、c2c3；

可表达crRNA的crRNA表达元件，其包含启动子、crRNA基因序列；所述crRNA是根据基因组上预期进行定向编辑的靶序列设计的碱基配对序列，所述crRNA用于将V型CRISPR核酸酶引导到基因组上的靶序列，靶序列包含5’-TTN-3’等特征的PAM序列作为核酸酶识别位点，其中N表示碱基A、T、C、G中的任意一种。

上述表达元件包括V型CRISPR核酸酶表达元件和crRNA表达元件都可以是表达盒。

上述V型CRISPR核酸酶表达元件中的启动子可以是诱导型启动子比如Ptac，或者是组成型启动子比如PlacM。

上述V型CRISPR核酸酶表达元件中的终止子可以是rrnB终止子(rrnBterminator)。

上述crRNA表达元件中的启动子可以是诱导型启动子或者组成型启动子，比如是Pj23119。

上述crRNA表达元件中的终止子可以是rrnB终止子。

优选地，上述V型CRISPR核酸酶是Cpf1例如FnCpf1。

在上述CRISPR系统的一种实施方式中，所述V型CRISPR核酸酶表达元件和crRNA表达元件分别位于不同的质粒上，形成由V型CRISPR核酸酶表达质粒和crRNA表达质粒组成的CRISPR双质粒系统。

在上述CRISPR系统的另一种实施方式中，所述V型CRISPR核酸酶表达元件和crRNA表达元件整合在同一个质粒上，构成用于V型CRISPR核酸酶和crRNA共表达的一体化CRISPR质粒(all-in-one CRISPR plasmid)比如一体化CRISPR/Cpf1质粒(all-in-one CRISPR/Cpf1 plasmid)，形成CRISPR单质粒系统。

上述V型CRISPR核酸酶表达质粒或一体化CRISPR质粒上可以包含筛选标记基因，包括但不局限于氯霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因等，更优选卡那霉素抗性基因。

上述V型CRISPR核酸酶表达质粒、crRNA表达质粒和一体化CRISPR质粒的质粒骨架是任何可在棒状杆菌比如谷氨酸棒杆菌内复制的质粒，使得不同的质粒可在棒状杆菌比如谷氨酸棒杆菌中兼容，各自实现目的基因的转录表达。优选是谷氨酸棒杆菌/大肠杆菌穿梭质粒。

优选地，上述V型CRISPR核酸酶表达质粒上包含用于DNA重组和DNA修复的重组蛋白recT基因。优选recT基因上游为启动子Ptac、Ptet或Peftu。

上述核酸酶Cpf1可以是来自Francisella novicida比如Francisella novicidaU112的FnCpf1蛋白、LbCpf蛋白(包括来自Lachnospiraceae bacterium ND2006的LbCpf1蛋白、来自Lachnospiraceae bacterium MA2020的Lb2Cpf1蛋白)、和来自Acidaminococcussp.BV3L6的AsCpf1，优选FnCpf1。

优选地，上述V型CRISPR核酸酶表达质粒和一体化Crispr质粒上可以各自包含大肠杆菌复制子pSC101片段和温敏复制子pBL1^ts。

一种编辑棒状杆菌基因组的方法，包括如下步骤：

使用上述的CRISPR双质粒系统，将V型CRISPR核酸酶表达质粒和crRNA表达质粒共转化入棒状杆菌比如谷氨酸棒杆菌感受态细胞中，或者先将V型CRISPR核酸酶表达质粒转化入棒状杆菌感受态细胞中得到转化子、再将crRNA表达质粒转化入该转化子，培养克隆菌株，实现基因编辑功能，尤其是对棒状杆菌比如谷氨酸棒杆菌基因组的基因点突变或基因片段缺失；或者

使用上述的CRISPR单质粒系统，将一体化Crispr质粒转化入棒状杆菌比如谷氨酸棒杆菌感受态细胞中，培养克隆菌株，实现基因编辑功能，尤其是对棒状杆菌比如谷氨酸棒杆菌基因组的基因片段框内插入或基因片段缺失。

优选地，当使用上述的CRISPR双质粒系统进行棒状杆菌比如谷氨酸棒杆菌基因组编辑时，在棒状杆菌中导入覆盖切割区的ssDNA，以使其重组到基因组切口而使靶点不再被crRNA识别、并使其修复基因组的切口。

本发明的上述CRISPR系统除了可以用于棒状杆菌比如谷氨酸棒杆菌的基因组编辑，还可以用于其他原核细胞的基因组编辑。因此，本发明还提供上述CRISPR系统在原核细胞基因组编辑中的应用，所述原核细胞包括棒状杆菌属，尤其包括CRISPR/Cas9基因组编辑无效的谷氨酸棒状杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌、钝齿棒杆菌、北京棒杆菌、停滞棒杆菌、产氨棒杆菌等。

作为CRISPR系统的具体应用方式，其可以呈CRISPR系统试剂盒形式，包括CRISPR双质粒系统试剂盒、CRISPR单质粒系统试剂盒，即，

一种用于细胞基因组编辑的试剂盒，其包括如前所述的CRISPR系统(包括上述的CRISPR双质粒系统和上述的CRISPR单质粒系统)，用于实现基因组的基因突变、基因框内插入或基因片段缺失，所述细胞选自原核细胞、尤其是CRISPR/Cas9基因组编辑无效的(Cas9-resistant)原核细胞。其中所述原核细胞至少包括大肠杆菌，棒状杆菌比如谷氨酸棒状杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌、钝齿棒杆菌、北京棒杆菌、停滞棒杆菌(Corynebacteriumstationis)、产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)等。

本发明的结合了单链DNA(ssDNA)重组的V型CRISPR/Cas系统比如CRISPR/Cpf1系统能够精细地改变谷氨酸棒状杆菌基因组，效率达86-100％。由Cpf1、crRNA和同源臂组成的温敏质粒实现了谷氨酸棒状杆菌基因组中最大7.5-kb的缺失或1-kb的插入，最大效率分别为10％或13.3％。两个CRISPR/Cpf1辅助系统能够在3N+3或3N+1天内连续地进行N轮基因组编辑。研究结果表明，CRISPR/Cpf1基因组编辑有潜力改变棒状杆菌和其他CRISPR/Cas9无效的(Cas9-resistant)原核生物的基因组。

附图说明

图1A和图1B是本发明的CRISPR双质粒系统中两种Cpf1表达质粒的结构示意图。其中图1A所示pJYS1Ptac质粒中使用了诱导型启动子Ptac用于转录recT；图1B所示pJYS1Peftu质粒中使用了组成型启动子Peftu用于转录recT。

图2是本发明的CRISPR双质粒系统实例中一种crRNA表达质粒pJYS2_crtYf的结构示意图。

图3是本发明的CRISPR单质粒系统实例中一种一体化CRISPR/Cpf1质粒pJYS3_ΔcrtYf的结构示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

在本文中，有时为了描述简便，会将crRNA与其编码基因(DNA)名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。例如，crRNA基因指的是可转录为crRNA的基因DNA。

在本文中，有时为了描述简便，会将V型CRISPR核酸酶比如Cpf1蛋白质名称与其编码基因(DNA)名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。例如，对于FnCpf1(基因)，用于描述核酸酶功能或类别时，指的是蛋白质；在作为一种基因描述时，指的是编码该FnCpf1的基因，以此类推。

在本文中，术语“原核细胞”和“原核生物”表示含义相同的微生物。

在本发明中，术语“谷氨酸棒状杆菌”、“谷氨酸棒杆菌”、“谷棒”表示相同的含义。类似地，术语“谷氨酸棒状杆菌ATCC13032”、“谷棒ATCC13032”、“ATCC13032”和“13032”表示相同的含义，是指实施例3-7中使用的基因组被编辑的宿主菌株。

本发明中所述表达元件指整合于质粒序列上的基因转录表达元件。基因转录表达元件可以包含操纵子、启动子、目的基因序列、终止序列、和复制子等基因功能元件。例如，在本发明的一个CRISPR双质粒系统具体实施例中，Cpf1基因表达元件优选包含复制子pSC101；crRNA基因转录表达元件优选包含复制子pMB1。

本发明设计的CRISPR双质粒系统可以省去克隆同源臂的步骤。

本发明设计的CRISPR双质粒系统和CRISPR单质粒系统都可以对原核生物细胞进行基因组编辑，但功能各有侧重点。比如，CRISPR单质粒系统主要用于基因插入和大片段缺失，CRISPR双质粒系统主要用于基因点突变和小片段缺失。本领域技术人员可根据实际操作目的进行灵活选择。

本发明设计的CRISPR双质粒系统和CRISPR单质粒系统除了适用于谷氨酸棒状杆菌基因组编辑，还可以用于其他原核生物细胞比如大肠杆菌和棒状杆菌。例如，实施例显示了本发明设计的CRISPR系统可推广应用于多种谷氨酸棒状杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌、钝齿棒杆菌、北京棒杆菌的基因组编辑。

实施例

材料和方法

本文中的全基因合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成、引物合成及测序皆由Invitrogene完成。

本文中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

实施例1菌株、质粒及培养条件

在本申请中，所有质粒构建通过化学转化法转入大肠杆菌DH5α宿主菌中，获得的转化子菌株在LB培养基中37℃培养(加入相应的抗生素，卡那霉素25mg/L，壮观霉素50mg/L)。

谷氨酸棒杆菌重组菌株通过电转获得，谷氨酸棒杆菌在BHI或者BHI/LB(各加入一半成分)的培养基中30℃培养(加入相应的抗生素)。固体培养基中加入1.5g/L琼脂粉。所有的菌株在20％甘油中于-80℃保存。

实施例2pJYS1系列、pJYS2系列和pJYS3系列质粒克隆

本发明中的pXMJ19ts-Pncas9质粒由一个温敏的pBL1^ts谷氨酸棒杆菌复制子序列片段、卡纳霉素抗性基因片段、大肠杆菌复制子pSC101片段和带天然启动子的cas9基因片段通过等温组装方法(Gibson拼接)构建。pXMJ19ts-Plcas9、pXMJ19ts-Plcas9n、pXMJ19ts-Plcpf1的构建是以pXMJ19ts-Pncas9质粒为模板PCR扩增pSC101-pBL1^ts-Kn^r片段，再分别通过OE-PCR扩增PlacM-cas9、PlacM-cas9D10A、或PlacM-cpf1片段，再分别与pSC101-pBL1^ts-Kn^r片段两两通过等温组装方法(Gibson拼接)获得。

质粒克隆实验中所用引物的序列参见表1。

表1引物序列

引物对P1/P2和P3/P4以谷氨酸棒杆菌/大肠杆菌穿梭质粒pXMJ19(Biovector公司，货号BiovectorpXMJ19，中国科学院微生物研究所刘双江教授惠赠)为模板，PCR(PCR体系：模板1μl，KOD FX 1μl，2×KOD FX buffer 25μl，上/下游引物各3μl(10mmol)，dNTP3μl，ddH20 15μl，共计50μl。PCR扩增条件：首先98℃变性3min，然后98℃ 15s，55℃ 1min30s，68℃ 1min30s，共30个循环，最后68℃延伸10min。)扩增约1.5kb片段和1.3kb片段，两片段进行OE-PCR(PCR条件同上，模板加入上述纯化回收1.5kb和1.3kb片段各1μl，30个循环中68℃延伸时间变为2min40s，按照1kb/min标准设定延伸时间，下述PCR条件基本相同)，获得温敏型谷氨酸棒杆菌pBL1^ts复制子序列；引物对P5/P6以pTRCmob质粒(中国科学院微生物研究所刘双江教授惠赠)为模板扩增得到约1.2kb的卡纳霉素抗性基因片段；引物对P7/P8以pMW119(WAKO公司，货号313-01581)为模板，PCR(PCR扩增条件同上)扩增获得约1.8kb大肠杆菌复制子pSC101；引物对P9/P10以pCas(Addgene公司，ID#62225)为模板，PCR扩增获得约4.6kb带天然启动子的Pncas9片段；上述4片段通过等温组装方法(Gibson拼接)获得pXMJ19ts-Pncas质粒。

引物对P11/P12和P13/P14分别以pXMJ19ts-Pncas9为模板，PCR扩增约5.7kbpSC101-pBL^ts-Kn^r片段和4.2kb PlacM-Cas9片段；上述两片段通过等温组装方法(Gibson拼接)获得pXMJ19ts-Plcas9质粒。

引物对P15/P16和P17/P18/P19以pXMJ19ts-Plcas9质粒为模板，分别扩增5.7kb和4.2kb大小片段，两片段通过等温组装方法(Gibson拼接)获得pXMJ19ts-Plcas9n质粒。

引物对P20/P21以pXMJ19ts-Pncas9质粒为模板，PCR扩增约5.7kb pSC101-pBL1^ts-Kn^r片段；引物对P22/P23以密码子优化的FnCpf1(南京金斯瑞生物科技有限公司)为模板，PCR扩增3.9kb PlacM-FnCpf1片段；上述两片段以等温组装方法(Gibson拼接)获得pXMJ19ts-Plcpf1质粒。

pXMJ19ts-Plcpf1-crRNAcrtYf质粒构建通过HindIII酶切pXMJ19ts-Plcpf1获得线性化片段，引物对P24/P25以pXMJ19为模板扩增得到的295bp rrnB转录终止子片段，引物对P26/P27PCR扩增获得93bp Pj23119-crRNA片段，三片段通过等温组装方法(Gibson拼接)获得目的质粒pXMJ19ts-Plcpf1-crRNAcrtYf。

pXMJ19ts-Plcpf1-crRNAcrtYf质粒通过SawI/XbaI酶切去除crRNA_crtYf获得9828bp线性化片段，引物对P28/P29以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组为模板扩增得到361bpPeftu启动子片段，引物对P30/P31以大肠杆菌MG1655基因组为模板扩增获得924bprecT片段，三片段通过等温组装方法(Gibson拼接)获得pJYS1Peftu质粒(如图1B所示)。pJYS1Ptac和pJYS1Ptet质粒通过用Ptac和Ptet启动子替换pJYS1Peftu质粒上recT基因Peftu启动子获得。引物对P32/P33以pEKEx2质粒(BioVector，货号Shuttle-expressionvector pEKEx2，中国科学院微生物研究所刘双江教授惠赠)为模板，PCR扩增1676bplacIq-Ptac片段；引物对P34/P31以大肠杆菌MG1655基因组为模板扩增得到920bp recT基因片段；pXMJ19-Plcpf1-crRNAcrtYf用SawI/XbaI酶切去除crRNA_crtYf片段；上述三片段纯化回收，通过等温组装方法(Gibson拼接)获得pJYS1Ptac质粒(如图1A所示)。

引物对P35/P36以全基因合成Pgap-tetR(南京金斯瑞生物科技有限公司)为模板，PCR扩增1156bp Pgap-tetR片段；多引物P35/P37/P38/P39用来通过多步延伸PCR扩增Pgap-tetR-Ptet片段；引物对P40/P31以大肠杆菌MG1655基因组为模板，PCR扩增925bp recT片段；上述三片段通过等温组装方法(Gibson拼接)获得pJYS1Ptet质粒(未图示)。

引物对P41/P42以质粒pSenlys-Spec(德国尤里希研究所Lothar Eggeling教授惠赠)为模板，PCR扩增获得1309bp卡那霉素抗性基因Kn^r片段；引物对P43/P44以质粒pTRCmob为模板，PCR扩增获得1997bp rep复制子片段；引物对P45/P46以质粒pXMJ19ts-Plcpf1-crRNAcrtYf为模板，PCR扩增获得386bp的crtYf基因crRNA片段；引物对P47/P48以质粒pTRCmob为模板，PCR扩增获得941bp pMB1复制子片段；上述4个片段通过等温组装方法(Gibson拼接)获得pJYS2_crtYf质粒(如图2所示)。

pJYS2_argR、pJYS2_proB1、pJYS2_proB2和pJYS2_proB3通过引物对P49/P50、P51/P52、P53/P54和P55/P56分别以pJYS2_crtYf为模板，进行反向PCR替换目标位点crRNA获得。

pXMJ19ts-Plcpf1-crRNAcrtYf质粒XbaI酶切线性化；引物对P57/P58和P59/P60以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组分别扩增上下游987bp同源片段；上述三个片段通过等温组装方法(Gibson拼接)获得pJYS3_ΔcrtYf质粒(如图3所示)。

pJYS3_Δcg0716/0723或者pJYS3_ΔcrtYf::tdcB质粒构建通过替换pJYS3_ΔcrtYf上下游同源臂序列获得。引物对P61/P62和P63/P64以谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组为模板，分别进行PCR扩增获得1kb左右上下游同源臂片段；pXMJ19ts-Plcpf1-crRNAcrtYf质粒XbaI酶切获得线性化片段；上述三片段纯化回收，通过等温组装方法(Gibson拼接)获得pJYS3_Δcg0716/0723质粒。

实施例3谷氨酸棒状杆菌电转感受态细胞的制备及电转化方法

电转感受态细胞的制备步骤如下：谷氨酸棒状杆菌及其衍生菌株在BHIS平板上划线，挑菌落接种到到4ml BHIS试管中在220rpm摇床中30℃培养过夜；然后取500μl接种到50ml BHIS摇瓶中，同时加入终浓度1ml/L吐温80和4g/L甘氨酸，带有pJYS1Ptac或pJYS1Ptet质粒的菌株还需添加终浓度为0.5mM的IPTG或250ng/L脱水四环素为启动Ptac或Ptet来诱导重组酶基因recT的表达，同样置于30℃摇床中220rpm震荡培养，当摇瓶中菌液浓度OD₆₀₀达到1.0左右时，准备收集菌株，制备感受态细胞；培养摇瓶首先在冰水中放置20min左右，然后在4℃下4500rpm离心10min收集菌体，并用50ml左右冰浴10％甘油洗涤两遍，然后用500μl 10％甘油重悬，每管分转90μl于1.5ml EP管中，-80℃冻存。

pJYS1系列质粒转化谷氨酸棒杆菌前先冰浴溶化，然后加入5μl(约500ng)pJYS2系列质粒和5μl(1-10μg)ssDNA混合，pJYS3系列质粒取10μl(大约1μg)加入谷氨酸棒状杆菌感受态细胞后混合，然后转移到4℃预冷的电转杯中。电转条件设置为：25μF，200Ω和2.5kV。电转化后立即加入900μl预热的BHIS培养基到电转杯中，然后将其转移到1.5ml EP管中，立即放入46℃金属浴中热激6min，然后在30℃摇床170rpm复苏1-2h，然后离心涂BHI/LB平板(添加相应抗生素)，放置30℃培养箱培养2天获得转化子菌落。阴性对照使用与谷氨酸棒状杆菌基因组无同源性的ssDNA替换靶点ssDNA。同时，用100ngpTRCmob_sp或者pXMJ19ts进行感受态细胞转化效率验证。

实施例4 Cpf1辅助CRIPSR系统可切割谷氨酸棒状杆菌ATCC13032基因组

首先将来源于化脓性链球菌MGAS5005的带天然启动子的Cas9蛋白克隆入更换了温敏复制子pBL1^ts的谷氨酸棒状杆菌穿梭载体pXMJ19ts中，并转化谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，没有获得转化子。我们将cas9天然启动子换成组成型启动子PlacM，也无转化子。我们将cas9换成cas9nickase也无法获得转化子。当将cas9换成来自Francisellanovicida U112的cpf1(即Fncpf1)，获得了3.1±0.2x 10⁷CFU，和转化对照pXMJ19ts质粒的CFU相当。我们接着插入使用Pj23119转录的靶向crtYf的一段crRNA形成pXMJ19-Plcpf1-crRNAcrtYf，转化谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，获得了转化子37.3±2.3CFU，转化子下降大约10⁶倍。

将分别都是组成型表达的cpf1和crRNA分至两个不同质粒。我们将Pj23119转录的靶向crtYf的crRNA_crtYf插入只含pGA1复制蛋白rep复制子而无分配蛋白per的质粒骨架pTRCmod_spc形成pJYS2_crtYf，转化含pXMJ19-Plcpf1的重组谷氨酸棒状杆菌ATCC13032细胞，和转化空载的pTRCmod_spc相比，转化子下降大约10⁴倍，提示是由pJYS2_crtYf中的crRNA_crtYf引导pXMJ19-Plcpf1中的cpf1切割谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的基因组造成的。结果证明，无论是将cpf1和crRNA放在一个质粒还是分别放至两个质粒都可以实现基因组的有效切割。

实施例5 CRISPR双质粒系统实现基因点突变

我们将recT置于诱导型Ptac、Ptet或者组成型启动子Peftu之后并克隆入pXMJ19-Plcpf1中形成pJYS1Ptac、pJYS1Ptet或pJYS1Peftu(参见图1)。和crtYf配对的寡聚核苷酸上含两个突变，将距离PAM区-1位置的第4和5位的GC突变成TT，形成一个HpaI酶切位点。设计的两条不同链长的反链寡聚核苷酸同源臂分别长59bp或75bp，分别为O_crtYf59-1和O_crtYf75-以及59bp正链寡聚核苷酸oligoO_crtYf59+。我们在含有pJYS1Ptac、pJYS1Peftu、pJYS1Ptet的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中诱导或组成型表达recT后，转入500ng pJYS2_crtYf和相应量的反链oligoO_crtYf59-1和O_crtYf75-，我们测试了两个浓度分别为1μg和10μg。谷氨酸棒状杆菌的感受态细胞的活细胞数每次测试在10⁸个左右。

转入1μg反链O_crtYf59-1、Ptac和组成型启动子Peftu转录的recT能获得≥80％的突变率，Ptet转录recT诱导获得20±0％的突变率。

使用诱导型启动子Ptac和组成型启动子Peftu转录recT，在转入59bp的反链oligoO_crtYf59-1时，仅1μg即可获得≥80％的突变率，再增加到10μg，突变率相当。

在Peftu转录recT的情况下，转入10μg反链oligo，链长从59bp增加到75bp时突变率分别为85±5％和90±10％；而在Ptac转录recT情况下，转入10μg反链oligo，链长从59bp增加到75bp时突变率从85±5％降低至20±0％。

转入pJYS1Ptac/pJYS2_crtYf双质粒系统，使用1μg 59bp的反链oligoO_crtYf59-1，阳性率88.9±1.6％；使用1μg 59bp的正链oligoO_crtYf59+的阳性率19.1±10％。

我们将HpaI酶切正确的突变子5个测序均证实序列符合预期。

实施例6 CRISPR单质粒系统实现基因框内缺失和插入

我们尝试使用上述pJYS1Ptac/pJYS2_crtYf双质粒以及59bp的反链ssDNA O_crtYf59-2删除crtYf阅读框内部长度50bp，阳性率5/30和4/30，当删除基因长度在500bp时，随机挑选30个转化子没有挑到阳性克隆。我们构建了一套基于双链重组的一体化CRISPR/Cpf1质粒(all-in-one CRISPR/Cpf1plasmid)。我们在前述已实现切割基因组的质粒pXMJ19-Plcpf1-crRNA上插入上下游同源臂各1kb，用于敲除crtYf阅读框内部705bp的片段，形成pJYS3_ΔcrtYf(图3)。转化质粒浓度上调到1μg，转入谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，转化子个数在5.4±0.4x 10²CFU。随机挑选30个转化子，我们获得了5/30和7/30的阳性克隆。我们进一步测试了一体化CRISPR/Cpf1质粒删除大片段基因的可能性。将用于删除从crtYf(cg0716)至cg0723共7.5kb的pJYS3_Δcg0716/0723转化谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，获得3/30的阳性率。下一步将pJYS3应用于基因插入，我们在上述pJYS3_ΔcrtYf同源臂中插入一段长约1kb的基因tdcB形成质粒pJYS3_ΔcrtYf::tdcB，转化子个数在5.1±1.1×10²CFU，随机挑选30个转化子，阳性克隆是(1～2)/30。

实施例7质粒丢失

含pJYS1系列和pJYS2系列双质粒或pJYS3系列的重组谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，在缺少相应抗生素或无抗培养基上30℃或升温34℃过夜培养，即可获得相应目标质粒近100％的丢失效率。方便实施第二轮操作。

实施例8 CRISPR系统在其它棒状杆菌中的扩展应用

pJYS1Ptac/pJYS2_argR双质粒和oligoO_argR59-1用于argR的点突变或O_argR59-2用于argR内部的17bp的框内缺失，突变率分别为100％和80％，参见表2。

表2 CRIPSR-Cpf1系统基因突变总览

*(n/N)：n是阳性转化子数量；N是测试的转化子数量。

我们在多种棒状杆菌，包括谷氨酸棒状杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌(C.acetoacidophilam)、钝齿棒杆菌(C.crenatum)、北京棒杆菌(C.pekinense)中分别测试了本发明的CRISPR系统编辑crtYf基因，导入O_crtYf59-1，随机挑选5个转化子，突变率全部是100％(参见表2)。

上述实施例对本发明的CRISPR双质粒系统和CRISPR单质粒系统用于棒状杆菌比如谷氨酸棒状杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌、钝齿棒杆菌、北京棒杆菌的基因组编辑功效进行了验证，本领域的技术人员应理解，在不违背本发明的思想下，本领域技术人员可以在此基础上做出各种改动或者修改，所做的各种变形或者修改的等价形式，同样应属于本发明的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 一种用于棒状杆菌基因组编辑的CRISPR系统

<130> SHPI1600978

<160> 64

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggtgaccgcc tcgatgatcg ccgggtgggc gtggcccaag gaggatcatc cagccattc 59

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caattcagcc agagatgacc cccagcgaga gtgagag 37

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctgcaaaact ctcactctcg ctgggggtca tctctggctg aattggaagt c 51

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggtctgacgc tcagtggaac 20

<210> 5

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccacgcccac ccggcgatca tcgaggcggt caccggaagc ggaacacgta gaaag 55

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tactctgact gcaaaccctg caggctcaga agaactcgtc 40

<210> 7

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccttga tgataccgct gccttac 57

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gatgaagatt atttcttaat ctagacaagc ttcggtgaac ag 42

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cttctgagcc tgcagggttt gcagtcagag tagaatagaa g 41

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctgttcaccg aagcttgtct agattaagaa ataatcttca tc 42

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atttcttaat ctagacaagc ttcggtgaac agttgttcta c 41

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gagtatttct tatccatcgt tcaagtcctt tccaattcca c 41

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggaaaggact tgaacgatgg ataagaaata ctcaataggc 40

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ctgttcaccg aagcttgtct agattaagaa ataatcttca tc 42

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

aagcttcggt gaacagttgt tctac 25

<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gatagagtgt caacaagctc agaagaactc gtcaagaagg c 41

<210> 17

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tctgagcttg ttgacactct atcattgata gagttatttt accactccct atcagtg 57

<210> 18

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tttaccactc cctatcagtg atagagaaaa gtgaaatgga taagaaatac tcaataggc 59

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

acacccccgt gaatcattac cctgttatcc ctagtctaga 40

<210> 20

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

atttcttaat ctagacaagc ttcggtgaac agttgttcta c 41

<210> 21

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cacacatggt accacacgat gattaattgt aaacagctca ggtcatgatt ccgcgaacc 59

<210> 22

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

atcgtgtggt accatgtgtg gaattggaaa ggacttgaac gatgtccatc taccaagag 59

<210> 23

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

ctgttcaccg aagcttgcat gcctgcaggt cgacttagtt attgcggttc tggac 55

<210> 24

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

caataactaa gtcgacctgc aggcatgcaa gcttaagagt ttgtagaaac gcaaaaagg 59

<210> 25

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

actgttgtag atcaggcaac catagggcag gaaatttaaa taaaacgaaa ggctcagtc 59

<210> 26

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

ggttgcctga tctacaacag tagaaattcg gatccattat acctaggact gagctagct 59

<210> 27

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

caaaagtaga acaactgttc acctctagat tgacagctag ctcagtccta ggtataatg 59

<210> 28

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

tctttcgact gagcctttcg ttttatttaa attctagatc agtaggcgcg tagggtaag 59

<210> 29

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

cagatcggct tttgcgattg gtggttgctt agtcattgta tgtcctcctg gacttcgtg 59

<210> 30

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

aagtcgtagc caccacgaag tccaggagga catacaatga ctaagcaacc accaatcgc 59

<210> 31

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

aagactaaca aacaaaagta gaacaactgt tcacctgtta actttcaagt tggcggtgc 59

<210> 32

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

gactgagcct ttcgttttat ttaaattcta gaaagcttat cgatgataag ctgtc 55

<210> 33

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

cggcttttgc gattggtggt tgcttagtca tggatcctct agagtcgacc tgcag 55

<210> 34

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

ttgcatgcct gcaggtcgac tctagaggat ccatgactaa gcaaccacca atcgc 55

<210> 35

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

gactgagcct ttcgttttat ttaaattcta gactgatgaa tcccctaatg atttttatc 59

<210> 36

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

aatgatagag tgtcaatatt ttttttagtt tttggaattc gattcacggg ggtgtaatg 59

<210> 37

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

tatcaatgat agagtggatc ccgttaatta tactctatca atgatagagt gtcaatatt 59

<210> 38

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

agtgtatcaa caagctgggg atcccaagct tggcgactct atcaatgata gagtggatc 59

<210> 39

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

tcatagtagt tcaccacctt ttccctatat aaaagcatta gtgtatcaac aagctgggg 59

<210> 40

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

ctaatgcttt tatataggga aaaggtggtg aactactatg actaagcaac caccaatcg 59

<210> 41

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaac taataacgta acgtgactg 59

<210> 42

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

ccttgttaaa cgtggcaaat aggcaggatt gatgggatct gtacatcgat atcatatgc 59

<210> 43

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

caataaaccc ttgcatatga tatcgatgta cagatcccat caatcctgcc tatttgcc 58

<210> 44

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

ccattatacc taggactgag ctagctgtca atctagactc gaggagattt ttgaggggg 59

<210> 45

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atatgaagct taagagtttg tagaaacgc 59

<210> 46

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

tcctcgactc cctccccctc aaaaatctcc tcgagtctag attgacagct agctcagtc 59

<210> 47

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

ggatggcctt tttgcgtttc tacaaactct taagcttcat atgcggtgtg aaataccgc 59

<210> 48

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

tcatgaccaa aatcccttaa cgtg 24

<210> 49

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

ggaatgatct gtaatctaca acagtagaaa ttggatccat tatacctagg actgag 56

<210> 50

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

gttgtagatt acagatcatt ccggcaacat cgctgtacaa ataaaacgaa aggctcag 58

<210> 51

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

ctactgttgt agatgtgaca acgaccgact tgctgattta aataaaacga aaggctcag 59

<210> 52

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

tttcgtttta tttaaatcag caagtcggtc gttgtcacat ctacaacagt agaaattcg 59

<210> 53

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

ctactgttgt agatacaccg gtggttgcca cggtgattta aataaaacga aaggctcag 59

<210> 54

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

tttcgtttta tttaaatcac cgtggcaacc accggtgtat ctacaacagt agaaattcg 59

<210> 55

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 55

ctgttgtaga tccacggtgt cattttcatt gacgaattta aataaaacga aaggctcag 59

<210> 56

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 56

cgttttattt aaattcgtca atgaaaatga caccgtggat ctacaacagt agaaattcg 59

<210> 57

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 57

cattatacct aggactgagc tagctgtcaa tctagcctat ccagcagtct tcctgtc 57

<210> 58

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 58

gcttttctgg ctcagattgc gtggtggtgg atcgcaccca atgagaacta ggag 54

<210> 59

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 59

gatccaccac cacgcaatct g 21

<210> 60

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 60

ctaacaaaca aaagtagaac aactgttcac cgggcccgtg ggtggctagg caagttac 58

<210> 61

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 61

cattatacct aggactgagc tagctgtcaa tctagagccc gcctccaagt ggtgggacg 59

<210> 62

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 62

caattatcgc cttcgctcga gatactgcta aatggactgc cagcatgttc aaggagaac 59

<210> 63

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 63

aaacaggttc tgggtttgtt ctccttgaac atgctggcag tccatttagc agtatctcg 59

<210> 64

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 64

caagactaac aaacaaaagt agaacaactg ttcaccatta tttttatgga cccaaattc 59

Claims

1.一种编辑棒状杆菌基因组的方法，包括如下步骤：

使用一种CRISPR双质粒系统，将V型CRISPR核酸酶表达质粒和crRNA表达质粒共转化入棒状杆菌感受态细胞中，或者先将V型CRISPR核酸酶表达质粒转化入棒状杆菌感受态细胞中得到转化子、再将crRNA表达质粒转化入该转化子，培养克隆菌株，实现对棒状杆菌基因组的基因点突变或基因片段缺失；

其中V型CRISPR核酸酶表达元件和crRNA表达元件分别位于不同的质粒上，形成由V型CRISPR核酸酶表达质粒和crRNA表达质粒组成的所述CRISPR双质粒系统，其中所述V型CRISPR核酸酶表达元件包含启动子、V型CRISPR核酸酶基因序列、终止子，所述V型CRISPR核酸酶是Cpf1；所述crRNA表达元件包含启动子、crRNA基因序列；所述crRNA是根据基因组上预期进行定向编辑的靶序列设计的碱基配对序列，所述crRNA用于将V型CRISPR核酸酶引导到基因组上的靶序列，靶序列包含5’-TTN-3’在内的PAM序列作为核酸酶识别位点，其中N表示碱基A、T、C、G中的任意一种；或者

使用一种CRISPR单质粒系统，将一体化CRISPR质粒转化入棒状杆菌感受态细胞中，培养克隆菌株，实现对棒状杆菌基因组的基因片段框内插入或基因片段缺失，

其中所述CRISPR单质粒系统是由所述V型CRISPR核酸酶表达元件和所述crRNA表达元件整合在同一个质粒上而构成的一体化CRISPR质粒，用于V型CRISPR核酸酶和crRNA的共表达。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述棒状杆菌选自谷氨酸棒状杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌、钝齿棒杆菌、北京棒杆菌、停滞棒杆菌、产氨棒杆菌。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸酶Cpf1选自FnCpf1、LbCpf1、Lb2Cpf1或AsCpf1。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，V型CRISPR核酸酶表达质粒或一体化CRISPR质粒上包含筛选标记基因，所述筛选标记基因选自下组：卡纳霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质粒是谷氨酸棒杆菌/大肠杆菌穿梭质粒。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述V型CRISPR核酸酶表达质粒上包含重组蛋白recT基因。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，使用CRISPR双质粒系统进行棒状杆菌基因组编辑时，在棒状杆菌中导入覆盖切割区的ssDNA，以使其重组到基因组切口而使靶点不再被crRNA识别、并使其修复基因组的切口。

8.如权利要求1-6中任一项中所述的CRISPR双质粒系统或者CRISPR单质粒系统在原核细胞基因组编辑中的应用，所述原核细胞选自谷氨酸棒状杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌、钝齿棒杆菌、北京棒杆菌。