JP2019500036A - 原核生物におけるdna末端修復経路の再構築 - Google Patents
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Abstract
(i)原核細胞の培養物を提供すること、
(ii)少なくとも1のプログラム可能なDNA結合性および開裂性タンパク質を含む発現系を含むベクターを調製すること、
(iii)原核細胞のゲノム中の特定のDNA配列を標的とするために該原核細胞中へ該ベクターを導入すること
を含む、原核生物のゲノムを操作する、および/または編集するための方法が提案される。
Description
本発明は、原核生物におけるゲノム操作および編集、とりわけ、プログラム可能なヌクレアーゼと組み合わせて原核生物中のDNA末端修復システムを再構築するためのベクターシステムを使用し得る遺伝子機能の破壊(ノックアウト)、遺伝子座の欠失またはDNA要素の挿入のような原核生物ゲノムの標的修飾に関する。
標的ゲノム操作および編集は、目的の遺伝子座で正確なDNA開裂を導入する能力および開裂部位を修復する宿主細胞の能力に依存する。該開裂部位に隣接するDNA配列を修飾するために、目的の特異的遺伝子座で二本鎖DNA切断(DSB)の正確な導入を可能にする数個のプログラム可能なDNA結合性および開裂性タンパク質が開発されてきた。かかるプログラム可能なDNA切断酵素の例は、Zn−フィンガーまたはTALヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼおよびCRISPR−Cas9を包含する(1、2)。真核生物中で、DSBは、内因性非相同末端結合(NHEJ)または相同組換え(HR)経路のいずれかによって修復される。NHEJ経路において、DNA切断は、リガーゼを該開裂部位に動員するDNA末端結合性タンパク質Kuを包含するタンパク質のセットにより酵素的に封じられる。ヘテロ二量体Kuタンパク質は、とりわけ、DNA末端に結合し、DNA末端シナプスの形成およびDNAリガーゼを包含する組換えタンパク質の動員を促進することによりDSBの修復を仲介する。NHEJ修復は、本質的に誤りがあり、2、3個の塩基の欠失または挿入を引き起こす。これらのindel(insertion−deletion)(挿入−欠失)変異は、修復部位がオープンリーディングフレーム(ORF)内にある場合、フレームシフト変異を引き起こし、故に、タンパク質コーディング遺伝子をノックアウトすることができる(2)。故に、目的の遺伝子をノックアウトする簡単な方法は、誤りが発生しやすいNHEJ経路を誘導するために、プログラム可能なDNA切断タンパク質を用いてそのORF内にDSBを導入することである。
単一細胞中で多重遺伝子修飾を同時に行う能力、および、
ゲノム−ワイド「機能喪失(loss−of−function)」スクリーニングアッセイのためのCRISPR−RNAライブラリの適用
を提供する。
DSBにより引き起こされる細胞死を防ぐこと、および、
CRISPR−Cas9のようなプログラム可能なDNA開裂性タンパク質により生み出されるDSBの(誤りのある)修復を可能にすること
にある。
本発明の客体は、以下のステップ:
(i)原核細胞の培養物を提供すること、
(ii)少なくとも1のプログラム可能なDNA結合性および開裂性タンパク質を含む発現系を含むベクターを調製すること、
(iii)該原核細胞のゲノム中の特定のDNA配列を標的とするために該原核細胞中へ該ベクターを導入すること
を含む、原核生物(細菌または古細菌)のゲノムを操作する、および/または編集するための方法である。
(i)原核細胞の培養物を提供すること、
(ii)(a)DNA末端に結合している少なくとも1のタンパク質、
(b)DNAリガーゼ活性を有する少なくとも1のタンパク質
を含むDNA二本鎖切断修復システムのための発現カセットを含むベクターを提供すること、
(iii)該原核細胞のゲノム中で請求項1に記載の二本鎖DNA切断の導入を可能にするために、該原核細胞中へ該ベクターを導入すること
を含む。
(i)原核細胞の培養物を提供すること、
(ii)少なくとも1のタイプの単一ガイドRNA(sgRNA)を設計すること、ここで、該sgRNAの10〜50ヌクレオチド(nt)ガイド配列は、該原核細胞の少なくとも1の遺伝子の翻訳開始コドンの上流の非コーディングおよび/または推定上の調節領域内の所望の範囲に対して相補的である;
(iii)(a)少なくとも1のプログラム可能なDNA結合性および開裂性タンパク質、
(b)少なくとも1の修飾されていてもよいsgRNA;および、
(c)少なくとも1のDNA末端結合性タンパク質
を含む発現カセットを含むベクターを調製すること;および、
(iv)標準的な方法(例えば、化学変換、エレクトロポレーション、接合または形質導入)により、該原核細胞の培養物を該ベクターで形質転換して、該sgRNAの10〜50ntガイド配列またはTAL−もしくはZn−フィンガータンパク質のようなタンパク質をベースとしたヌクレアーゼに対して相補的なDNA配列の存在についてゲノムを標的化すること
を含む方法である。
(a)少なくとも1のCas9、修飾Cas9、またはCpf1タンパク質、
(b)少なくとも1の修飾されていてもよいsgRNAまたはcrRNA;または、
(c)タンパク質Kuおよび/またはLigD
を含む発現系を示す。
(I)上記で説明したような発現系を含む、または、からなるベクター、
(II)上記で説明した方法を含む、原核生物中での遺伝子ノックアウト、遺伝子または単一塩基対の欠失、置換、編集、および/またはゲノムワイドノックアウトスクリーニングのための方法、
(III)原核生物中でのゲノム操作および編集のための方法、とりわけ、DNA二本鎖切断の導入を介して働くプログラム可能なヌクレアーゼと組み合わせた原核生物中での遺伝子機能の破壊(ノックアウト)、ゲノム遺伝子座の欠失またはDNA要素の挿入のような原核生物ゲノムの標的修飾における、DNA末端結合性および修復タンパク質の使用
をカバーする。
[1]HU JHら.“Chemical Biology Approaches to Genome Editing: Understanding, Control−ling and Delivering Programmable Nucleases”,Cell Chem.Biol.23:47−73(2016)
[2]HSU PDら.“Development of CRISPR−Cas9 for genome engineering”,Cell 157:1262−78(2014)
[3]JIANG Wら.“RNA−guided editing of bacterial genomes using CRISPR−Cas9 systems”Nat.Biotechnol 31:233−9(2014)
[4]LI Yら.“Metabolic engineering of E.coli genome via the CRISPR−Cas9 mediated ge−nome editing”Metab.Engin.31:13−21(2015)
[5]SHALEM Oら.“Genome−scale CRISPR Cas−9 knockout screening in human cells”SCIENCE 343:84−7(2014)
[6]SETUBAL JCら.“Genome sequence of Azotobacter vinelandii,an obligate aerobe spcialized to support diverse anaerobic metabolic processes”J.Bacteriol.191:4534−45(2009)
図2に示すように、Ku−LigDの存在は、A.vinelandii中の自己標的性sgRNAを搭載されたCas9により誘導されたDSBの修復を促進する。図3に示すように、クローンの単離および標的領域のシークエンシングは、PAM配列の3nt上流の特異的Cas9誘導DNA切断、エキソヌクレアーゼによる分解およびDNA末端のライゲーションを示した。
(A)特異的ガイド配列を用いずにCas9およびsgRNAをコードするプラスミドpB5−Para−Cas9−PsacB−sgRNA−emptyを用いて形質転換されたA.vinelandii。該形質転換体は、カナマイシンを含有する寒天プレート上に播種された。
(B)Cas9およびupp遺伝子を標的とするsgRNAをコードするプラスミドpB5−Para−Cas9−PsacB−sgRNA−uppS5を用いて形質転換された以外は(A)と同様。
(C)触媒的に不活性なCas9およびupp遺伝子を標的とするsgRNAをコードするプラスミドpB5−Para−dCas9−PsacB−sgRNA−uppS5を用いて形質転換された以外は(B)と同様。
(D)Cas9−MtLigD−MtKuおよびupp遺伝子を標的とするsgRNAをコードするプラスミドpB5−CLK_PsacB−sgRNA−uppS5を用いて形質転換された以外は(B)と同様。
該プラスミドのA.vinelandii中への運搬は、ドナー細胞としてE.coli S17−1λpirを使用する接合により達成された。
(A)Cas9およびupp遺伝子を標的とするsgRNAをコードするプラスミドpB5−Para−Cas9−PsacB−sgRNA−uppS15を用いて形質転換されたP.putida。
(B)Cas9−MtLigD−MtKuおよびupp遺伝子を標的とするsgRNAをコードするプラスミドpB5−CLK_PsacB−sgRNA−uppS5を用いて形質転換された以外は(A)と同様。
該プラスミドのP.putida中への運搬は、ドナー細胞としてE.coli S17−1λpirを使用する接合により達成された。
pB5−Para−Cas9−PsacB−sgRNA−bgalまたはpB5−CLK_PsacB−sgRNA−bgalのいずれかを用いて、化学的コンピテントE.coli MG1655を形質転換した。両方のベクターは、野生型Cas9およびlacZ遺伝子を標的とするsgRNAをコードする。ベクターpB5−CLK_PsacB−sgRNA−bgalは、M.tuberculosis由来のタンパク質LigDおよびKuをも発現する。選択的寒天プレート上に該形質転換体を播種し、コロニー形成ユニット数を決定した。
pB5−Para−Cas9_Pveg−LigD_KuまたはpB5−Para−Cas9_Pveg−LigD_PsacB_Kuのいずれかを用いて、化学的コンピテントE.coli MG1655を形質転換した。両方のベクターは、野生型Cas9およびlacZ遺伝子を標的とするsgRNAをコードし、M.tuberculosis由来のタンパク質LigDおよびKuを発現する。エレクトロコンピテントセルの調製のために、該形質転換体の単一コロニーを培養した。lacZ−標的性sgRNA転写ユニットを含有するプラスミドpUCP−PsacB−sgRNA−bgalのエレクトロポレーション後、アンピシリン(100μg/ml)、カナマイシン(25μg/ml)、0.2%(W/V)アラビノースおよびX−gal(80μg/ml)を補足した選択的寒天プレート上に形質転換体を播種した。lacZ−遺伝子のフレームシフト変異は、白色コロニーをもたらす。
Claims (17)
- 以下のステップ:
(i)原核細胞の培養物を提供すること、
(ii)少なくとも1のプログラム可能なDNA結合性および開裂性タンパク質を含む発現系を含むベクターを調製すること、
(iii)該原核細胞のゲノム中の特定のDNA配列を標的とするために、該原核細胞中へ該ベクターを導入すること
を含む、原核生物のゲノムを操作する、および/または編集するための方法。 - 以下のステップ:
(i)原核細胞の培養物を提供すること、
(ii)(a)DNA末端に結合している少なくとも1のタンパク質、
(b)DNAリガーゼ活性を有する少なくとも1のタンパク質
を含むDNA二本鎖切断修復システムのための発現カセットを含むベクターを調製すること、
(iii)該原核細胞のゲノム中で請求項1に記載の二本鎖DNA切断の導入を可能にするために、該原核細胞中へ該ベクターを導入すること
を含む、原核生物における再構築されたDNA末端修復のための方法。 - 以下のステップ:
(i)原核細胞の培養物を提供すること、
(ii)少なくとも1のタイプの単一ガイドRNA(sgRNA)を設計すること、ここで、該sgRNAの10〜50ヌクレオチド(nt)ガイド配列は、該原核細胞の少なくとも1の遺伝子の翻訳開始コドンの上流の非コーディングおよび/または推定上の調節領域内の所望の範囲に対して相補的である;
(iii)(a)少なくとも1のプログラム可能なDNA結合性および開裂性タンパク質、
(b)少なくとも1の修飾されていてもよいsgRNA;および、
(c)少なくとも1のDNA末端結合性タンパク質
を含む発現カセットを含むベクターを調製すること;および、
(iv)標準的な方法(例えば、化学変換、エレクトロポレーション、接合、形質導入)により、該原核細胞の培養物を該ベクターで形質転換して、該sgRNAの10〜50ntガイド配列またはTAL−もしくはZn−フィンガータンパク質のようなタンパク質をベースとしたヌクレアーゼに対して相補的なDNA配列の存在についてゲノムを標的化すること
を含む、原核生物における再構築されたDNA末端修復のための方法。 - 原核細胞が細菌に属する、請求項1、2または3に記載の方法。
- ベクターがプラスミドまたはファージDNAである、請求項1、2または3に記載の方法。
- 形質転換、形質導入または接合によってベクターが原核細胞中へ導入される、請求項1、2または3に記載の方法。
- プログラム可能なDNA結合性および開裂性タンパク質が、Zn−フィンガー、TALヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼおよびRNA依存CRISPR関連ヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項1、2または3に記載の方法。
- プログラム可能なDNA結合性および開裂性タンパク質が、クラス2タイプII CRISPRシステムに属するCRISPR−Casタンパク質の群から選択される、請求項7に記載の方法。
- プログラム可能なDNA結合性および開裂性タンパク質がCas9またはCrf1である、請求項7に記載の方法。
- DNA末端修復タンパク質が、その一次配列中で原核生物のタンパク質Ku、および/またはLigDに対して少なくとも30%同一性を示しているタンパク質からなる群から選択される、請求項1、2または3に記載の方法。
- DNA末端修復タンパク質が、グラム陽性細菌によりコードされるタンパク質Kuおよび/またはLigDからなる群から選択される、請求項1、2または3に記載の方法。
- DNA末端修復タンパク質が、マイコバクテリアによりコードされるタンパク質Kuおよび/またはLigDからなる群から選択される、請求項1、2または3に記載の方法。
- DNA末端修復タンパク質が、Mycobacterium tuberculosisによりコードされるタンパク質Kuおよび/またはLigDからなる群から選択される、請求項1、2または3に記載の方法。
- (a)少なくとも1のCas9、修飾Cas9またはCpf1タンパク質、
(b)少なくとも1の修飾されていてもよいsgRNAまたはcrRNA;および、
(c)タンパク質Kuおよび/またはLigD
を含む発現系。 - 請求項14に記載の発現系を含む、または、からなるベクター。
- 請求項1、2または3に記載の方法を含む、原核生物中での遺伝子ノックアウト、欠失、置換、編集、および/またはゲノムワイドノックアウトスクリーニングのための方法。
- DNA二本鎖切断の導入を介して働くプログラム可能なヌクレアーゼと組み合わせた、原核生物中での遺伝子機能の破壊(ノックアウト)、遺伝子座の欠失またはDNA要素の挿入のような、原核生物におけるゲノム操作および編集、特に原核生物ゲノムの標的修飾のための方法における、DNA末端結合性および修復タンパク質の使用。
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