CN114277047B - 一种使大肠杆菌获得有效nhej系统的高通量筛选工具在大肠杆菌基因编辑中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种使大肠杆菌获得有效NHEJ系统的高通量筛选工具在大肠杆菌基因编辑中的应用，所述使大肠杆菌获得有效NHEJ系统的高通量筛选工具包括：pDual‑Cas9‑Parental质粒载体：含有DNA解旋酶基因、复制子、抗生素抗性基因、核酸酶基因、araC基因、阿拉伯糖启动子和Ⅱs型限制酶识别位点；和pDual‑sgRNA‑lacZ质粒载体：含有靶向lacZ基因的sgRNA序列、组成型表达的强启动子、复制子和抗生素抗性基因。本发明筛选得到的NHEJ系统在大肠杆菌中具有良好的连接效率，并可以进行高效的基因编辑，应用前景广阔。

Description

一种使大肠杆菌获得有效NHEJ系统的高通量筛选工具在大肠 杆菌基因编辑中的应用

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，尤其涉及一种使大肠杆菌获得有效NHEJ系统的高通量筛选工具在大肠杆菌基因编辑中的应用。

背景技术

CRISPR-Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。该系统能够识别靶序列并对靶序列进行切割，形成DSB(double-stranded breaks，双链断裂)。生物体基因组发生断裂形成DSB后，会通过NHEJ(non-homologous end joining，非同源末端连接)途径或在有同源模板存在的情况下通过HR(homologous recombination，同源重组)途径启动DNA修复。CRISPR-Cas9技术已经被广泛用于真核和原核生物的基因组编辑，包括人、小鼠、斑马鱼以及大肠杆菌等，是迄今为止基因组编辑中最有效的革命性工具。

基因敲除是研究基因的生物学功能的常用方法。真核生物本身具有NHEJ系统，因此在真核细胞中，可以通过在基因中引入一个DSB，经过易错的NHEJ系统修复得到单基因突变体；或通过引入两个DSB，基因组外侧的末端可以通过NHEJ系统连接起来，得到删除两个DSB中间序列的突变体。真核生物NHEJ系统比较复杂，由Ku70/Ku80异源二聚体、聚合酶、核酸酶以及连接酶组成，此外可能还需要多种辅助蛋白参与处理DSB末端，使DSB易于修复。

在原核生物中，仅在少数几种细菌被鉴定发现有NHEJ系统，如Mycobacteriumtuberculosis、Mycobacterium smegmatis、Bacillus subtilis以及Pseudomonasaeruginosa等。原核生物的NHEJ系统构成简单，仅由Ku和ligD组成，NHEJ系统修复DSB的过程常常伴随着在DNA断裂处删除或插入不同长度的DNA。

多数原核生物，譬如大肠杆菌，因缺乏NHEJ系统，当基因组发生断裂时，只能通过同源重组的方式修复DSB。基于同源重组的基因组编辑技术以其高效、精确的特点已经被广泛应用于原核生物。目前，主要有三种方法进行大肠杆菌的基因编辑，均使用噬菌体的Rac或Red同源重组系统。(1)经典的基于双链DNA(double-stranded DNA，缩写dsDNA)的重组技术构建的基因敲除或敲入突变体，通常需要向生物体引入选择性的标记用于区分正确的突变体，抗生素抗性基因是常用的选择性标记，但是构建的突变体通常不希望引入额外的序列，因此，该方法往往需要额外的步骤从基因组中消除选择性标记序列，最终获得基因组“无痕”的突变体。(2)在基因组复制过程中，使用人工合成的单链DNA(single-strandedDNA，缩写ssDNA)或双链DNA与染色体互补区域退火，可以在不引入选择性标记的情况下进行基因重组构建突变体。尽管这两种方法能够进行基因组编辑，但是突变率通常比较低。(3)使用CRISPR-Cas9系统，同时表达Red系统的三种蛋白，在同源模板存在的情况下进行同源重组基因编辑，该方法具有基因编辑效率高的优点，但是该方法应用于基因组规模的基因编辑时因其模板质粒构建极其复杂而受到限制。

Tianyuan Su等(T.Su,F.Liu,P.Gu,H.Jin,Y.Chang,Q.Wang,Q.Liang,Q.Qi,ACRISPR-cas9 assisted non-homologous end-joining strategy for one-stepengineering of bacterial genome,Sci.Rep.6(2016)37895.)通过使大肠杆菌异源表达Mycobacterium tuberculosis H37Rv NHEJ蛋白，首次将NHEJ系统成功引入大肠杆菌，成功对线性质粒和断裂的基因组进行了末端连接。尽管大肠杆菌可以通过表达外源NHEJ系统获得非同源末端连接的能力，但是大肠杆菌本身固有的同源重组与引入的NHEJ系统是一种竞争关系，如果NHEJ系统连接效率较低，同源重组修复就会占主导作用，导致NHEJ系统的连接“失效”。

尽管Tianyuan Su等、Xuan Zheng等(X.Zheng,S.Li,G.Zhao,J.Wang.(2017).Anefficient system for deletion of large DNA fragments in Escherichia coli viaintroduction of both Cas9 and the non-homologous end joining system fromMycobacterium smegmatis,BBRC.(2017)1-7)通过使大肠杆菌表达其它微生物来源的Ku和ligD蛋白，成功将NHEJ系统引入大肠杆菌，但是迄今仍然没有高效的能使大肠杆菌获得NHEJ系统并进行基因编辑的方法。

高效的NHEJ系统是基因组规模的基因编辑技术的基础。因此，如何提供一种可在大肠杆菌中对基因组进行高效编辑的系统及方法，已成为亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种使大肠杆菌获得有效NHEJ系统的高通量筛选工具在大肠杆菌基因编辑中的应用，筛选得到的NHEJ系统在大肠杆菌中的连接效率很高，在基因编辑的相关研究中具有广阔的应用前景。

为达此目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种使大肠杆菌获得有效NHEJ系统的高通量筛选工具在大肠杆菌基因编辑中的应用，所述使大肠杆菌获得有效NHEJ系统的高通量筛选工具包括：

pDual-Cas9-Parental质粒载体：含有DNA解旋酶基因、复制子、抗生素抗性基因、核酸酶基因、araC基因、阿拉伯糖启动子和Ⅱs型限制酶识别位点；

和pDual-sgRNA-lacZ质粒载体：含有靶向lacZ基因的sgRNA序列、组成型表达的强启动子、复制子和抗生素抗性基因。

本发明中，通过所述高通量筛选工具可以快速高效地筛选出在大肠杆菌中有效的NHEJ系统，进而将其引入大肠杆菌，提高了基因断裂后的非同源末端连接效率，进而提升了基因编辑的效率，具有很高的应用价值。

优选地，所述DNA解旋酶基因包括Rep101基因。

优选地，所述复制子包括pSC101复制子。

优选地，所述核酸酶基因包括Cas9基因。

优选地，所述阿拉伯糖启动子的数量为2个。

优选地，所述Ⅱs型限制酶识别位点为至少2个，例如可以是2个、3个、4个或5个等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述Ⅱs型限制酶识别位点包括BsaⅠ和/或BbsⅠ。

优选地，所述组成型表达的强启动子包括J23119启动子。

优选地，所述pDual-Cas9-Parental质粒载体和pDual-sgRNA-lacZ质粒载体的抗生素抗性基因不同。

优选地，所述pDual-Cas9-Parental质粒载体的抗生素抗性基因为卡那霉素抗性基因，所述pDual-sgRNA-lacZ质粒载体的抗生素抗性基因为氨苄青霉素抗性基因。

优选地，所述pDual-Cas9-Parental质粒载体顺次连接有DNA解旋酶基因、复制子、抗生素抗性基因、核酸酶基因、araC基因、阿拉伯糖启动子和Ⅱs型限制酶识别位点。

优选地，所述pDual-sgRNA-lacZ质粒载体顺次连接有靶向lacZ基因的sgRNA序列、组成型表达的强启动子、复制子和抗生素抗性基因。

作为优选技术方案，本发明中所述使大肠杆菌获得有效NHEJ系统的高通量筛选工具，包括：

pDual-Cas9-Parental质粒载体：顺次连接有Rep101基因、pSC101复制子、卡那霉素抗性基因、Cas9基因、araC基因、2个阿拉伯糖启动子、用于克隆Ku基因的BsaⅠ限制酶识别位点和用于克隆ligD基因的BbsⅠ限制酶识别位点；

和pDual-sgRNA-lacZ质粒载体：顺次连接有靶向lacZ基因的sgRNA序列、J23119启动子、复制子和氨苄青霉素抗性基因。

第二方面，本发明提供了一种计算NHEJ系统连接效率的方法，所述计算NHEJ系统连接效率的方法包括：

将NHEJ系统转化大肠杆菌，挑取单克隆培养后，制备感受态细胞；

将酶切后与未酶切的质粒分别转染制备的感受态细胞，培养；

统计平板上的克隆数，计算NHEJ系统的连接效率。

优选地，所述NHEJ系统为经过第一方面中所述的使大肠杆菌获得有效NHEJ系统的高通量筛选工具筛选后的NHEJ系统。

优选地，所述NHEJ系统为同时连接有Ku蛋白和ligD蛋白的CDS编码序列的pDual-Cas9-Ku+ligD质粒载体。

优选地，所述酶切包括限制酶酶切。

优选地，所述酶切包括EcoRⅤ限制酶酶切。

优选地，所述质粒包括pUC57-Amp。

优选地，所述NHEJ系统的连接效率的计算公式为：转化1ng酶切后的质粒的克隆数与转化1ng未酶切的质粒的克隆数的比值。

作为优选技术方案，本发明所述计算NHEJ系统连接效率的方法，包括以下步骤：

(1)将pDual-Cas9-Ku+ligD质粒转化大肠杆菌感受态细胞，涂布卡那霉素抗性LB平板，30℃培养过夜；

(2)挑取单克隆至LB培养基于30℃、220rpm条件下培养，当菌液OD₆₀₀值达到0.6时，按照标准的电转感受态细胞制备方法制备感受态细胞；

(3)使用EcoRⅤ限制酶酶切pUC57-Amp质粒，酶切产物使用磁珠回收纯化；

(4)分别转化pUC57-Amp质粒以及EcoRⅤ酶切的pUC57-Amp质粒至步骤(2)制备的感受态细胞，涂布卡那霉素、氨苄青霉素LB平板，30℃培养过夜，同时将EcoRⅤ酶切的pUC57-Amp质粒转化MG1655感受态细胞，菌液离心后涂布氨苄青霉素的LB平板，30℃培养过夜(作为对照)；

(5)统计每个平板的克隆数，计算NHEJ系统的连接效率，其中，所述NHEJ系统的连接效率的计算公式为：转化1ng EcoRⅤ酶切的pUC57-Amp质粒的克隆数与转化1ng pUC57-Amp质粒的克隆数的比值。

第三方面，本发明提供了一种通过NHEJ系统对大肠杆菌进行基因编辑的方法，所述基因编辑的方法包括：

将NHEJ系统转化大肠杆菌，挑取单克隆培养后，制备感受态细胞；

构建靶向目的基因的pDual-sgRNA质粒；

将构建的所述靶向目的基因的pDual-sgRNA质粒转化制备的感受态细胞，培养；

挑取克隆进行验证，分析基因编辑的情况。

优选地，所述NHEJ系统为经过第一方面中所述的使大肠杆菌获得有效NHEJ系统的高通量筛选工具筛选后的NHEJ系统。

优选地，所述NHEJ系统为同时连接有Ku蛋白和ligD蛋白的CDS编码序列的pDual-Cas9-Ku+ligD质粒载体。

优选地，所述感受态细胞包括电转感受态细胞。

优选地，所述靶向目的基因的pDual-sgRNA质粒转化制备的感受态细胞的方法包括电转化。

优选地，所述验证包括PCR扩增验证和/或测序验证。

作为优选技术方案，本发明所述通过NHEJ系统对大肠杆菌进行基因编辑的方法，包括以下步骤：

(1)将pDual-Cas9-Ku+ligD质粒转化大肠杆菌感受态细胞，涂布卡那霉素抗性LB平板，30℃培养过夜，次日，挑取单克隆至LB培养基于30℃、220rpm条件下培养，当菌液OD₆₀₀值达到0.6时，按照标准的电转感受态细胞制备方法制备感受态细胞；

(2)构建靶向目的基因的pDual-sgRNA质粒；

(3)将构建的所述靶向目的基因的pDual-sgRNA质粒电转化步骤(1)制备的感受态细胞，涂布卡那霉素、氨苄青霉素LB平板，30℃培养过夜；

(4)挑单克隆至LB平板培养8小时，通过菌落PCR扩增目的基因，将扩增成功的PCR产物进行Sanger测序验证，并分析基因编辑情况。

相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明通过使大肠杆菌获得有效NHEJ系统的高通量筛选工具，筛选出在大肠杆菌中有效的NHEJ系统，成功将外源NHEJ系统引入大肠杆菌中，促进了断裂后DNA双链的非同源末端连接，进而提高了基因编辑的效率，为大肠杆菌的基因编辑及基因功能的研究创造了条件。

附图说明

图1为本发明实施例3中lacZ基因的扩增结果图片，图中，M-标准DNA分子量Marker，1～192-编号为1～192的菌落的扩增结果；

图2为本发明实施例3中Ku基因的扩增结果图片，图中，M-标准DNA分子量Marker，1～192-编号为1～192的菌落的扩增结果；

图3为本发明实施例3中ligD基因的扩增结果图片，图中，M-标准DNA分子量Marker，1～192-编号为1～192的菌落的扩增结果；

图4为本发明实施例4中不同组别的平板菌落生长情况的结果图片；

图5为本发明实施例5中pcnB基因的PCR扩增的结果图片，图中，M-标准DNA分子量Marker，1～24-转化了pDual-Cas9-Mno-Ku+Mfo-ligD质粒的24个菌落的扩增结果，25～48-转化了pDual-Cas9-Mbr-Ku+Mfo-ligD质粒的24个菌落的扩增结果，49～72-转化了pDual-Cas9-Mno-Ku+Msm-ligD质粒的24个菌落的扩增结果。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

材料：

Top10感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司；

BsaⅠ、SpeⅠ、EcoRⅤ和Gibson Master Mix试剂盒购自NEB公司；

T4 DNA连接酶购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；

MG1655大肠杆菌感受态细胞购自ATCC公司；

X-gal和IPTG购自默克公司；

pUC57-Amp质粒来自安升达生物科技有限公司。

实施例1构建使大肠杆菌获得有效NHEJ系统的高通量筛选工具

本实施例提供一种使大肠杆菌获得有效NHEJ系统的高通量筛选工具，所述使大肠杆菌获得有效NHEJ系统的高通量筛选工具包括：

pDual-Cas9-Parental质粒载体：顺次连接有Rep101基因、pSC101复制子、卡那霉素抗性基因、Cas9基因、araC基因、2个阿拉伯糖启动子、用于克隆Ku基因的BsaⅠ限制酶识别位点和用于克隆ligD基因的BbsⅠ限制酶识别位点；

和pDual-sgRNA-lacZ质粒载体：顺次连接有靶向lacZ基因的sgRNA序列、组成型表达的强启动子J23119启动子、复制子和氨苄青霉素抗性基因。

所述使大肠杆菌获得有效NHEJ系统的高通量筛选工具通过如下方法进行构建：

(1)基因合成pDual-Cas9-Parental质粒载体。

将所述pDual-Cas9-Parental质粒载体的功能原件通过基因合成顺次连接，得到所述pDual-Cas9-Parental质粒载体。

所述质粒具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

所述质粒自5’端151～1101bp为Rep101基因，1149～1371bp为pSC101复制子，2023～2838bp为卡那霉素抗性基因，3368～7471bp为Cas9基因，7604～8482bp为araC基因，8509～8793bp和9243～9527bp为阿拉伯糖启动子，8838～8843bp的反向互补序列和8854～8859bp为BsaⅠ限制酶识别位点，用于克隆Ku基因，9573～9578bp的反向互补序列和9589～9594bp为BbsⅠ限制酶识别位点，用于克隆ligD基因。

SEQ ID NO.1：

aaacagacgaagaatccatgggtatggacatgccgctcgccttccatgggtatggacagttttccctttgatatgtaacggtgaacagttgttctacttttgtttgttagtcttgatgcttcactgatagatacaagagccataagaacctcagatccttccgtatttagccagtatgttctctagtgtggttcgttgtttttgcgtgagccatgagaacgaaccattgagatcatacttactttgcatgtcactcaaaaattttgcctcaaaactggtgagctgaatttttgcagttaaagcatcgtgtagtgtttttcttagtccgttatgtaggtaggaatctgatgtaatggttgttggtattttgtcaccattcatttttatctggttgttctcaagttcggttacgagatccatttgtctatctagttcaacttggaaaatcaacgtatcagtcgggcggcctcgcttatcaaccaccaatttcatattgctgtaagtgtttaaatctttacttattggtttcaaaacccattggttaagccttttaaactcatggtagttattttcaagcattaacatgaacttaaattcatcaaggctaatctctatatttgccttgtgagttttcttttgtgttagttcttttaataaccactcataaatcctcatagagtatttgttttcaaaagacttaacatgttccagattatattttatgaatttttttaactggaaaagataaggcaatatctcttcactaaaaactaattctaatttttcgcttgagaacttggcatagtttgtccactggaaaatctcaaagcctttaaccaaaggattcctgatttccacagttctcgtcatcagctctctggttgctttagctaatacaccataagcattttccctactgatgttcatcatctgaacgtattggttataagtgaacgataccgtccgttctttccttgtagggttttcaatcgtggggttgagtagtgccacacagcataaaattagcttggtttcatgctccgttaagtcatagcgactaatcgctagttcatttgctttgaaaacaactaattcagacatacatctcaattggtctaggtgattttaatcactataccaattgagatgggctagtcaatgataattactagtccttttcctttgagttgtgggtatctgtaaattctgctagacctttgctggaaaacttgtaaattctgctagaccctctgtaaattccgctagacctttgtgtgttttttttgtttatattcaagtggttataatttatagaataaagaaagaataaaaaaagataaaaagaatagatcccagccctgtgtataactcactactttagtcagttccgcagtattacaaaaggatgtcgcaaacgctgtttgctcctctacaaaacagaccttaaaaccctaaaggcttaagtagcaccctcgcaagctcggttgcggccgcaatcgggcaaatcgctgaatattccttttgtctccgaccatcaggcacctgagtcgctgtctttttcgtgacattcagttcgctgcgctcacggctctggcagtgaatgggggtaaatggcactacaggcgccttttatggattcatgcaaggaaactacccataatacaagaaaagcccgtcacgggcttctcagggcgttttatggcgggtctgctatgtggtgctatctgactttttgctgttcagcagttcctgccctctgattttccagtctgaccacttcggattatcccgtgacaggtcattcagactggctaatgcacccagtaaggcagcggtatcatcaacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttacgtttccaaccaattaaccaattctgattagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagcttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgatgatatatttttatcttgtgcaatgtaacatcagagattttgagacacaacgtggctttccctgcagggtttgcagtcagagtagaatagaagtatcaaaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatgctgttttgaatggttccaacaagattattttataacttttataacaaataatcaaggagaaattcaaagaaatttatcagccataaaacaatacttaatactatagaatgataacaaaataaactactttttaaaagaattttgtgttataatctatttattattaagtattgggtaatattttttgaagagatattttgaaaaagaaaaattaaagcatattaaactaatttcggaggtcattaaaactattattgaaatcatcaaactcattatggatttaatttaaactttttattttaggaggcaaaaatggataaaaaatacagtatcggcttagatattggcactaatagcgtgggttgggccgttattaccgatgaatataaagttccgagcaagaaattcaaagttctgggtaataccgatcgccacagtattaagaagaatctgatcggtgcactgctgtttgatagcggcgagacagccgaagccacacgtctgaaacgtaccgcacgtcgccgttatacccgtcgtaaaaatcgtatttgttacctgcaagagatttttagcaatgaaatggccaaagttgatgacagttttttccaccgtctggaagaaagttttttagtggaagaagataagaaacacgaacgccatccgatcttcggcaacatcgttgacgaagttgcctaccacgaaaagtaccctacaatttatcacctgcgcaaaaaactggttgatagcaccgacaaagccgacctgcgcttaatctatctggccctggcccacatgatcaaatttcgcggccactttctgattgaaggtgacttaaaccctgataacagtgacgttgacaaattattcattcagttagttcaaacctataaccagctgtttgaagaaaacccgatcaacgccagtggtgttgacgcaaaagccatcctgagtgcccgcctgagtaaaagccgccgtttagaaaacttaatcgcacaattaccgggtgagaagaaaaatggcttattcggcaacctgattgccctgagtctgggcttaacccctaatttcaaaagtaacttcgacctggccgaggacgccaagttacaactgagtaaagacacttatgatgacgatctggataatttactggcccaaatcggtgaccagtacgccgatctgtttttagccgccaagaatttaagcgatgccatcctgctgagtgatattctgcgtgtgaatacagaaattacaaaagccccgctgagcgcaagcatgattaagcgctatgacgagcaccatcaggacttaaccctgctgaaggccttagttcgccaacagctgccggagaagtataaagaaatcttttttgatcagagcaagaacggttacgccggttatattgacggcggtgccagccaggaagagttttacaagttcatcaaaccgatcctggagaaaatggatggcacagaggaactgttagtgaagctgaaccgtgaagatttactgcgcaagcagcgcaccttcgacaatggcagcattccgcatcaaattcatctgggtgaattacatgccattttacgtcgtcaggaagatttttatccgttcctgaaagacaaccgtgagaagatcgagaagattctgaccttccgcatcccgtactatgtgggcccgttagcacgcggtaacagccgtttcgcatggatgacacgtaaaagtgaagagacaattaccccttggaatttcgaagaggtggtggacaaaggtgccagcgcccagtcttttatcgagcgcatgacaaacttcgataagaatttacctaatgagaaagttttacctaaacatagcctgctgtatgaatacttcacagtttacaatgagttaaccaaagtgaaatatgtgaccgaaggtatgcgtaaaccggccttcttaagcggcgagcaaaagaaggcaatcgtggatctgttattcaaaaccaatcgcaaagttacagtgaaacaactgaaagaggactatttcaagaaaattgaatgcttcgatagcgtggagattagtggcgtggaggaccgttttaatgccagcttaggtacataccatgatctgttaaaaattattaaagataaagattttctggataacgaagaaaatgaagatattctggaagatatcgtgctgaccctgaccctgtttgaagatcgcgaaatgatcgaagagcgtctgaaaacctatgcccatctgttcgacgacaaagtgatgaaacagctgaagcgtcgccgctacaccggttggggtcgcttaagtcgcaagctgatcaacggtattcgtgacaaacagagcggtaaaaccatcctggattttctgaaaagcgatggtttcgccaaccgtaactttatgcagttaatccatgacgatagcctgacatttaaagaagatattcaaaaggcccaggttagcggccaaggtgatagcttacacgaacacattgccaatctggcaggcagtccggccattaaaaaaggtattttacaaaccgttaaggtggttgatgaattagtgaaagtgatgggccgccacaagcctgaaaatatcgtgattgaaatggcccgtgagaaccagaccacccaaaaaggccagaaaaacagtcgtgaacgcatgaagcgtatcgaagaaggtattaaagaactgggcagccaaatcctgaaagagcatccggttgagaacacacagttacaaaacgaaaaactgtatttatactatctgcaaaatggccgcgatatgtatgtggaccaggagctggatattaaccgcctgagtgattatgatgttgatcacattgttccgcagtcttttttaaaggatgatagcatcgacaataaggtgctgacccgtagcgacaagaatcgcggcaagagcgataacgttccgagcgaagaagttgtgaagaaaatgaaaaattactggcgccagttactgaacgccaagctgatcacccaacgcaagttcgacaatctgaccaaagcagagcgtggtggtttaagcgaactggacaaggccggcttcatcaagcgtcagttagtggaaacccgtcagatcacaaaacacgtggcccagattctggatagccgtatgaataccaaatacgacgagaatgataaactgattcgtgaagttaaagttatcaccctgaagagtaagctggtgagcgacttccgtaaagactttcagttctacaaagttcgcgaaattaataattatcatcatgcacatgatgcatacctgaacgccgttgttggcacagccctgatcaagaagtatcctaaactggaaagcgagtttgtttatggcgattacaaggtgtatgatgtgcgcaaaatgatcgccaagagtgagcaggaaatcggtaaagccaccgccaaatactttttctacagtaacattatgaattttttcaagaccgaaatcaccttagcaaacggcgagatccgcaaacgcccgctgatcgaaaccaatggtgaaaccggcgagattgtttgggataagggtcgcgactttgcaaccgttcgcaaggtgctgtctatgcctcaggtgaatattgttaagaaaaccgaagtgcaaaccggcggctttagtaaagaaagcatcctgccgaaacgcaatagcgacaaactgattgcccgtaaaaaagactgggaccctaagaagtacggcggttttgatagccctaccgtggcatacagcgttctggttgtggccaaagtggaaaagggcaagagtaagaagctgaagagtgttaaagagctgctgggcatcaccatcatggaacgtagcagcttcgagaaaaatccgatcgatttcctggaggcaaaaggttacaaagaagttaaaaaagatttaatcatcaaattacctaaatacagcctgttcgagctggagaatggtcgcaaacgtatgctggcaagcgccggcgaattacaaaaaggtaatgaactggcactgccgagcaagtacgttaacttcttatatttagcaagccattacgagaaattaaaaggtagtccggaggataacgagcagaagcagttatttgttgagcagcataaacattacctggatgagattattgagcagattagtgagttcagcaagcgcgtgattctggcagatgccaacctggataaggttctgagcgcctataacaaacaccgcgacaagccgattcgcgaacaagcagagaacattattcatctgttcacactgaccaacctgggcgccccggcagccttcaagtattttgataccaccatcgaccgcaaacgctatacaagcaccaaagaggttctggacgccaccctgattcaccaaagcattaccggcttatatgaaacccgcatcgacctgagtcagttaggcggtgactaaagtatattttagatgaagattatttcttaatctagacatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgcatcgatttattatgacaacttgacggctacatcattcactttttcttcacaaccggcacggaactcgctcgggctggccccggtgcattttttaaatacccgcgagaagtagagttgatcgtcaaaaccaacattgcgaccgacggtggcgataggcatccgggtggtgctcaaaagcagcttcgcctggctgatacgttggtcctcgcgccagcttaagacgctaatccctaactgctggcggaaaagatgtgacagacgcgacggcgacaagcaaacatgctgtgcgacgctggcgatatcaaaattgctgtctgccaggtgatcgctgatgtactgacaagcctcgcgtacccgattatccatcggtggatggagcgactcgttaatcgcttccatgtgccgcagtaacaattgctcaagcagatttatcgccagcagctccgaatagcgcccttccccttgcccggcgttaatgatttgcccaaacaggtcgctgaaatgcggctggtgcgcttcatccgggcgaaagaaccccgtattggcaaatattgacggccagttaagccattcatgccagtaggcgcgcggacgaaagtaaacccactggtgataccattcgcgagcctccggatgacgaccgtagtgatgaatctctcctggcgggaacagcaaaatatcacccggtcggcaaacaaattctcgtccctgatttttcaccaccccctgaccgcgaatggtgagattgagaatataacctttcattcccagcggtcggtcgataaaaaaatcgagataaccgttggcctcaatcggcgttaaacccgccaccagatgggcattaaacgagtatcccggcagcaggggatcattttgcgcttcagccatacttttcatactcccgccattcagagaagaaaccaattgtccatattgcatcagacattgccgtcactgcgtcttttactggctcttctcgctaaccaaaccggtaaccccgcttattaaaagcattctgtaacaaagcgggaccaaagccatgacaaaaacgcgtaacaaaagtgtctataatcacggcagaaaagtccacattgattatttgcacggcgtcacactttgctatgccatagcatttttatccataagattagcggatcctacctgacgctttttatcgcaactctctactgtttctccatacccgtttttttgggaattcgagctctaaggaggttataaaaaagagaccattccattccggtctcaaagcttgggcccgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagtttaaacggtgtccagcttggctgttttggcggatgagagaagattttcagcctgatacagattaaatcagaacgcagaagcggtctgataaaacagaatttgcctggcggcagtagcgcggtggtcccacctgaccccatgccgaactcagaagtgaaacgccgtagcgccgatggtagtgtggggtgtccccatgcgagagtagggaactgccaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaactggatccttactcgagaagaaaccaattgtccatattgcatcagacattgccgtcactgcgtcttttactggctcttctcgctaaccaaaccggtaaccccgcttattaaaagcattctgtaacaaagcgggaccaaagccatgacaaaaacgcgtaacaaaagtgtctataatcacggcagaaaagtccacattgattatttgcacggcgtcacactttgctatgccatagcatttttatccataagattagcggatcctacctgacgctttttatcgcaactctctactgtttctccatacccgtttttttgggaattcgagctctaaggaggttataaaaaaagtcttcattccattccgaagacaacacaaagcatcttctgttgagttaagaacgagtatcgagatggcacatagccttgctcaaattggaatcaggtttgtgccaataccagtag。

(2)基因合成pDual-sgRNA-lacZ质粒载体。

将所述pDual-sgRNA-lacZ质粒载体的功能原件通过基因合成顺次连接，得到所述pDual-sgRNA-lacZ质粒载体。

所述质粒具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

所述质粒自5’端259～278bp为靶向lacZ基因的sgRNA序列，279～313bp为J23119启动子，584～1172bp为复制子，1343～2203bp为氨苄青霉素抗性基因。

SEQ ID NO.2：

tcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaaaagcttctgcaggtcgactctagagaattcaaaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctctaaaactcgttttacaacgtcgtgacactagtattatacctaggactgagctagctgtcaaggatccagcatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtc。

实施例2以pDual-Cas9-Parental为骨架载体构建Ku+ligD质粒文库

本实施例以pDual-Cas9-Parental为骨架载体构建Ku+ligD质粒文库，包括如下步骤：

(1)从NCBI获得微生物来源的Ku蛋白和ligD蛋白的CDS编码序列各11种，GenBank登录号分别为WP_010886496(Bsu-Ku)、ADN57538(Buh-Ku)、GAS86454(Mbr-Ku)、ADU06008(Mms-Ku)、GAT12817(Mno-Ku)、YP_889815(Msm-Ku)、NP_215452(Mtb-Ku)、ACV76561(Nmu-Ku)、ADH67668(Nda-Ku)、ADG15500(Pbh-Ku)、CCQ47782(Psi-Ku)、NP_389223(Bsu-ligD)、ATD76462(Bve-ligD)、CCE75978(Cne-ligD)、SJM32621(Mde-ligD)、ALI25184(Mfo-ligD)、WP_011730625(Msm-ligD)、NP_215453(Mtb-ligD)、BAR68071(Pae-ligD)、AKJ29816(Pbr-ligD)、SUD78454(Ppu-ligD)和SMS10934(Pvi-ligD)。

(2)针对大肠杆菌宿主对Ku蛋白和ligD蛋白的CDS编码序列进行密码子优化，优化后的Ku蛋白的CDS编码序列不含BbsⅠ和BsaⅠ识别序列，序列5’端添加SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列，3’端添加SEQ ID NO.35所示的核苷酸序列；优化的ligD蛋白的CDS编码序列不含BbsⅠ识别序列，序列5’端添加SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列，3’端添加SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO.34：CCCAGTCACGACGGTCTCAAAAA(BsaⅠ识别位点)；

SEQ ID NO.35：AAGCCGAGACCTCCTGTGTGAAA(BsaⅠ识别位点)；

SEQ ID NO.36：CCCAGTCACGACGAAGACGCAAAA(BbsⅠ识别位点)；

SEQ ID NO.37：CACAAGGTCTTCTCCTGTGTGAAA(BbsⅠ识别位点)。

优化后的Ku蛋白的CDS编码序列具有SEQ ID NO.3～13所示的核苷酸序列，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

SEQ ID NO.3(Bsu-Ku)：

CCCAGTCACGACGGTCTCAAAAAatgaatcgcacaccgtctttacacaccaaagagaaaaaaggcttcatcgacatgcacaccatgtggaaaggcagcatcagctttggtttagtgaacatcccgattaagctgtacgcagccaccgaagataaagatattaaattacgctctttacataaagaagatcatgccccgattaaatatgaaaaagtgtgtaccaactgcgagaaaactttaagccccgatgagatcgtgaaaggctatgagtatgtgaaaggcaagtatgtggtgctgaccgatgaggatctgaagagtctgaagcaagaacatgaggaaaaggccgttgagatcgtggacttcgttcagctgcaagaaatcgacccgatctacttcaaccgcagctactttgtgggccccggtgataacggcaccaaagcctataccttactgcgcgaagctttacgcagcaccggtaaaatcggcattgccaacatgaccattcgcagcaagcaacagctggccattctgcgtgtgtacgagaactgcatcgtgatggagagcatccattatccggacgaagtgcgtagcgcagcacaagttccgggtgttccggaccagagcaacgtgaacgacaaagagctgcagaccgcaattactttaattgatgagctgaccgccaagttcgagccggaaaaatacgaggacacctaccgtcaagctttactgcagcgcgtgaacgataagctggaaaacaaggaaaccgcagtgaccccggataaagcaccgccgcgcgaagatgttatcgatctggtgagtgctttacaagctagcattgatcgtacccgtcgcccgaatcgtgaaacacccgctgcagcaccggcacaagctgcagaaccgaagggtgccggtgacaaaaaacagaaaaccacccgcaaaaaagcaagcggcaccagctaaAAGCCGAGACCTCCTGTGTGAAA；

SEQ ID NO.4(Buh-Ku)：

CCCAGTCACGACGGTCTCAAAAAatggcccatatgatctggaaaggcgccattagttttggtttagttcacgtgccggttcagctgtatccggccacccgtagcgagaaagtgggcttcaatttactggacaaacgcaccatcgatccggtgggttataaacagatcaataaacgtaccggtaaagacgtgacccgcgataacattgtgcgcggttttgaatatgaaaaagataaatatgtggtgctgaccgatgaagaaatccgcgccgccaatccggaaagtacccagaccgtggatattctggccttcgttgatgcaccggacatcagctttctgtatttagataccccgtactttctgacaccggaccgcaaaggcgaaaaagtgtacgcactgctgcgtgaggccatgaaaagtagcggcaaagttggtgtggccagcgttgttctgcacaacaaacagcatctggccgctttaattcccgttggtccggttttagctttaaatacactgcgctgggcagaagaagtgcgtgactttgatgagtttaaactgccggccgagggtgcaaaagccgctggtgttagcgcccgcgaactggacatggcccagaaactgatcgatgacatgagcgacacttgggatccgagtaagtatcacgacacctttcgcgacgacatcatggctttagttgatcgtaaggttcgcgagggcaaaaccgaagagatcaccgatattgaagccccgcgtgaggcacgtcaaagcgcagatattctggatttaagcgatctgctgaagcgttctttaggtcgcggcaaaaataaaccggccagcggcagtcgcaaacgtgccgcagatgatgaagccgacgacggcaatgccgatgcagaagatgatggcggtagcaccccggcacgcaagaaacctcgcacagcccgcagtaccggtagcgcacgtacaagccgtagcagcagcggcagtagtagcggtggtcgcgcagcaaccaaaagcacaaccgccgcacgcaaacgtcgtgcagcagcctaaAAGCCGAGACCTCCTGTGTGAAA；

SEQ ID NO.5(Mbr-Ku)：

CCCAGTCACGACGGTCTCAAAAAatgcgcagcatctggaaaggcagtatcgcattcggtttagttaacgtgccggtgaaagtttacagcgccaccgaggatcacgacatcaagttccaccaagttcatgccaaagacaatggccgcatccgctataaacgcgtgtgcgaagtgtgcggcgaagtggtggaatttcgcgatattaataaagcctatgaaagcgacgacggtcagatggtggtgattaccgacgaggatattgctactttaccggaagaacgtagtcgcgagattgaggtggtggagtttatcccggccgaacaactggatccgctgatgtacgataagagctactttctggagccggatagcaaaagcagcaagagctacgtgctgctggcaaaaactttagccgaaactgaacgcgttgccattgtgcacttcagcttacgcaataaaacccgtttagcagcactgcgcgttaaggatttcagcaagcgcaacgtgatggtgatccatactttactgtggccggatgaaattcgtgacccggattttccggtgctggacaaggaagtggagatcaaaccggccgaactgaagatggccggccaagttgtggaaagcatgaccgacgatttccacccggaccagtttcgcgatgattatcaagctcagctgtatgagctggttcaagccaaactggaaggcggcgaagcattcagtgtggaagaacagccggccgatctggatgaaaccgaggatgtttctgatctgctggccaagctggaagccagcgtgaaagcccgtaaaggcggtggtagcgcaaaaagcgataaggacagcgacgaggatagcgataaggatagcgatgacgaggaagcaaagccggccaaaaaggcaccggctaaaaaagcagcagccaagaaagccccggctaaaaaagccgccgccaaaaaataaAAGCCGAGACCTCCTGTGTGAAA；

SEQ ID NO.6(Mms-Ku)：

CCCAGTCACGACGGTCTCAAAAAatgcgcgcaatttggaaaggcgccgttagctttggtttagttagcattggcgtgaaagtgtacagcgccaccgaggaaaaggacatccgtttccaccaagttcatcgtgaagatggcggccgcatccgctataagcgcacatgtagcgtgtgcggcgaagaggttacctacgacgacatcgccaaaggctatgacattggcggtggtgagatggtgattttaaccgacgaggattttgcagatctgccgctgagcaccagtcatgccatcgatgtgctggaattcgtgccggccgagcaagtggacccgattttatacaataaggcctactttttagagccggagggcagcgcaaccaaaccgtacgttctgctgcgtgacgctttaagcgatagcgaacgcgtggccattgtgaaggttgcactgcgtcagcgcgaacagttagccactttacgcgttcgtgagggtgtgctgctgctgaacacaatgctgtggccggatgaaattcgccgcccggatttcggctttctggatgaggatctgaaggtgcgtccgccggaactggcaatggcaagctctttaatcgatagcatggctggtgaatttgaaccggatgccttcaccgatgactatcgcgccgctttacaagaagttattgacgcaaaagtggaaggccgtgaagttgtgcagccggaagaagaagaggccgcacccgctgccgcagttgatctgatggccgcactgaaagccagcgttgaacgtgcacgtgcagcccgcggtgaagcacctagtggtggcggtgccgaaccgacaccgattagcagcgcacgcagcgctaaaaaagctgccaaaaaagcccccgctaaaaaggccgaaccggccaaaaagaccaccgccaaaaaggcaccggcaaagaaaaccgcagccaagaaagccgagccggctaagaaaactgccgccaaaaagactcccgctaagaaaaagaccgcctaaAAGCCGAGACCTCCTGTGTGAAA；

SEQ ID NO.7(Mno-Ku)：

CCCAGTCACGACGGTCTCAAAAAatgcgcagtatttggaagggtagcattgccttcggtttagtgaatgttccggtgaaggtgtatagcgcccagcaagatcacgacgtgaagttccaccaagttcacgccaaagataatggccgcatccgctataagcgtgtgtgcgaaatcgacggtgaagaagttgagtatcgcgatattgcccgcgcctatgaaagcgacgatggtcagaccgtgatcatcacagatgaggacatcgccacactgccggaagagcgtagtcgcgagatcgaggtgctggaatttgttccggccgccgacattgacccgatgatgtacgatcgcagctactttttagagccggaaggtaaaagcagcaagagctacgtgctgctgaccaaaactttaaaggaaaccgatcgcgttgccatcgttcactttgctttacgcaataagacacgtctggcagcactgcgcgtgcaagatttcagcaagcgcgatgtgatggtgatccagactttactgtggccggatgaaatccgtgatccggatttcccggttctggacaaagaagtggatattaaaccggcagaactgaaaatggccacacaagttgtggacagcatgaccgacgactttaacccggatcgctatcacgacgactatcaagaacagctgcgcgaactgattcaagctaaactggaaggcggtgaagcctttacaacagaggaacagccgcaagaactggacgaaaccgaggatgtttctgatctgctggcaaaactggaagccagcgttaaagcacgccgcgaaggtcgtggtggtagcaaaagcagcgacgacgacgataaacccgccaaaaaagctcccgctaagaaatctgccgctaagaaaactgccgccaagaaaactccggctaaaaaagctgccaagaagagtaccgccaaaaagagtccggccaagaagagcgcagccaaaaaataaAAGCCGAGACCTCCTGTGTGAAA；

SEQ ID NO.8(Msm-Ku)：

CCCAGTCACGACGGTCTCAAAAAatgaatcgtgcagtgcgccataccggtctgatgcgcagcatctggaaaggtagcatcgcatttggtttagtgaatgtgccggtgaaagtgtacagcgccaccgaagatcacgatatcaaatttcatcaagttcatgccaaggataacggccgcatccgttacaaacgtgtgtgcgaggtgtgcggcgaagtggtggaatatcgtgatatcaataaagcctttgaaagtgatgacggccagatggtggtgattaccgatgaggacatcgcaactttacccgaagaacgcagccgtgagattgaagtggtggagttcatcccggcagagcaactggatccgctgatgtacgacaagagctacttcttagagccggacagcaagagcagcaagagttatgtgctgctggccaaaaccttagccgaaaccgaccgcatcgcaatcgtgcacttttctttacgcaataaaagccgtttagcagctttacgcgtgaaagacttcagcaagcgcgacgtgatgatgattcacactttactgtggccggatgagatccgcgacccggattttccgattttagataaagaagttcagatcaaaccggccgagctgaaaatggctggtcaagttgtggagagcatgaccgacgacttcaagcccgatctgtaccacgatgactaccaagaacagttacgtgaactggtgcaagctaaactggaaggtggcgaagcattcagcgtggaagaacagccggccgaactggatgaaggtaccgaggacgtgagcgatctgttagccaagctggaagcaagcgtgaaagcccgtaagggcggcaaaagcgatagcaaggacgatagcgacagcgagagcgacagcaaagagagcaaaagcgacagtaagccggccaaaaaagcccccgctaagaaagccgcagccaagaaaagcaccgctaaaaaagccccggctaaaaaagcagccgccaagaaatcttaaAAGCCGAGACCTCCTGTGTGAAA；

SEQ ID NO.9(Mtb-Ku)：

CCCAGTCACGACGGTCTCAAAAAatgcgtgccatttggaccggcagcattgcatttggtttagtgaatgtgccggtgaaagtttacagcgccaccgcagatcacgatattcgtttccaccaagttcatgccaaggataatggccgcatccgctataaacgcgtttgcgaggcatgtggcgaagtggtggattatcgcgatctggcacgtgcctatgagagcggtgatggccagatggtggccattaccgatgacgacattgcctctttaccggaagagcgtagccgcgaaattgaggtgctggagttcgttccggccgccgatgtggacccgatgatgttcgaccgcagctattttttagaaccggacagcaagagcagcaaaagctacgtgttactggccaaaactttagccgaaaccgatcgtatggccatcgtgcattttactttacgcaataaaacccgtttagccgctttacgcgtgaaagacttcggcaaacgtgaagtgatgatggtgcacaccttactgtggccggatgagattcgcgatccggattttccggtgctggaccagaaggtggaaatcaaaccggccgagctgaaaatggctggtcaagttgtggatagcatggcagacgactttaacccggatcgctatcacgacacctatcaagaacagctgcaagaactgattgatacaaagctggagggtggccaagcttttaccgccgaagatcagccgcgtttactggatgaaccggaggatgtgagtgatctgctggctaaactggaagcaagcgtgaaggcccgcagcaaagcaaacagcaatgtgcctaccccgccgtaaAAGCCGAGACCTCCTGTGTGAAA；

SEQ ID NO.10(Nmu-Ku)：

CCCAGTCACGACGGTCTCAAAAAatgcgcagcatctggaaaggcagcgtggcctttggtttagttaatgtgccggtgaaactgtacagcgcaaccgaagagaaggacatccgctttcatcaagttcatgcccaagatggtggccgcatcaaatataaacgcgtgtgcgatctggacggcgaggaagtgccgtatgccgatattgccaaagcctacgaaagcgacgatggtcgcacaatcatgctgaccgatgaggattttgctcagctgccggccagcagcagccgcgaaatcgatgttgtgagctttgtgcctagtgaccaagttgatcccgttctgtatgataaaacctactatctggagcccgctagcaccagcaccaaagcctatgtgttactgcgccagactttagaacagaccgaccgtattgccatcgtgaacttcgcactgcgccagaaaacccgtttagcagctttacgtgttcgtgatgatgtgctggtgatccagacactgctgtggccggatgaagtgcgcgccgcagaatttgcctctttagaggaaagcgtgagcattaaaccggccgaactgaagatggccagcatgctggtggatagtttcgccgatgacttccacccggaggactataccgatgagtatcgcgaagagctgcagcaactgatcgaagccaaactggaaggcggcgaagcctttgaaactccggaaaaaccggatgaaggtgaggatgctgaagtggttgatctgctggcagctctgcagcgcagcgttgagcgccataaaaaagctggtgcaagcaccggcgatgatagtggcgatggcgccgatgatagtccgaaaaagagcccgcgcaccagcagcgcaaaaacccgcaccaaagccaccgatgaaaccggtgaccaagataaagacgaggcaaaaccgccgacacgccgtcgtagtccggcacgtaaaaccggttaaAAGCCGAGACCTCCTGTGTGAAA；

SEQ ID NO.11(Nda-Ku)：

CCCAGTCACGACGGTCTCAAAAAatggttaatccggtgtgggtgggcacactgatgtttggtcgcgtgccggtgggtgtgcgtttatatagcgcacgtgagcgtcgtggcccggttctgcaccagtttgaacgcggtaccgccgatcgcattcgttatgtgcgcgtgaacgaacgtaccggcgaagaagtggctggtgaagatgtggtgcgtggtgcacgtaccggcgtggaggatgagtacgttgtgctggagccggaagaactggaagaaattttaccgcatggtagccgcacaatggaactgaccggctttttaagtcaaggtgccgttgacgcactgtggtacgccagtacatactatgtggcaccgcgtgccgccgcagatgccaaagcctatcagctgctgtataccgctttagaacagacccgccgtaccggtgtggccaccatcgttctgcgcgatcgcgaataccccgttctgatcgaaccgaatcgcggtgtgctgagcgccagtacactgtggtggccggatgaggttcgcgaaccggatgatgtgatgccgcccgttgcccatgccgcactggccaagagcgaactggaactggcccgcgaactggtgcgtagtctgagcattgagtgggatccggaagattacagcgacagctacggccagcgtctgacagaactggtgcgcgcaaaagcacgtggccgcaccttcacccatcgtccggagcaagctgtgccgcccgaagatgccgatggtctgggtgaagcactgcgccagtctttacccgctcaacgcacacgcggtgcacgtagtcgtggccctcgtgcaagtaccggtgcagaaggtgccggtcgcgcacgtgaacctcgtggtaccggtgcacgtggcgcacgtgtggaacgtcgcggtgaaggtcgcgccaccaaacgcgaactgctgcaacgcgcaagcgagctggatgttcccggtcgtagcaaaatgagccgtgagcagctggaagaagccgttggtttaaatggcgccgaagcccgtcgttaaAAGCCGAGACCTCCTGTGTGAAA；

SEQ ID NO.12(Pbh-Ku)：

CCCAGTCACGACGGTCTCAAAAAatggcacatatgatctggaaaggcgccatcagctttggtctggtgcatgtgccggtgcagctgtaccccgctaccaaaagcgagaaggtgggctttaatctgctggacaaacgcaccatcgacccgatcggctataagcagatcaacaaacgcaccggcaaagacgtgacccgtgagaatatcgtgcgcggctttgaatatgaaaaagatcattatgtggttctgagcgacgatgagatccgcagcgccaatccggagagcacccagaccgtggacattctggcctttgtggatgccaccgatatcagctttttatatttagacacaccgtattttttaacaccggatcgcaagggtgaaaaagtgtacgctttactgcgcgaagccatgacagccagcggtaaaatcggtgtggccagcgtggtgctgcataataaacagcatttagccgcactgattcctctgggcccgatgctggctttaaatactttacgttgggccgatgaggttcgcggtctggacgagtttaaagtgccgccggaaggcatgaaagcagccggtgtgagcgccaaagagctggatatggctaaaaaactgatttatgatatgtctgaaacttgggatccgatgcagtatcatgataccttccgcgacgacatcatggcactggtggaacgcaagattcaagctggtaaaaccgaggaagtgaccgaagtggaagccccgcacgaaagccgtaaaagcgccgacattttagatctgagcgatctgctgaaacgttctttaggccgtggcaaaggtaaacaagctgcaactggtcgcaaacgcgctgccgatgaggatgaggatcagaccgatagcgaagccgacgaggaacccgctgcaccggcccgtaaacgtgcacgtgcaaccagcaccgcccgtagccgtagcggtagtggtggtagcgcccgcgttaccagcaaaacaaccgccacaagccgcaaacgccgtgcagcagcctaaAAGCCGAGACCTCCTGTGTGAAA；

SEQ ID NO.13(Psi-Ku)：

CCCAGTCACGACGGTCTCAAAAAatgcgcgccatttggaaaggtgccatcgcctttggtttagtgaacgtgccggtgaaagtgtacagtgcaaccgaggaccacgatatctctttacaccaagttcacaacgccgacggtggtcgtatccgctatcagcgccgctgcgaggtgtgcagccaagtgattgattacagcgacatcgagaaggcatacgaagaggatggtaaaaccgtggtgttaagcaaggatgagctgcaagctattccggccgaaaacagccacgaaatcgaggtggtgcaatttgtgcctagcgaacagctggaaccgatgatgttcgagaagagctattatctggaaccggacagcaagagcccgaaagcctacgttctgctgcgtcgcgctttagaggataccgatcgcgtggccattgtgcagttcgctttacgtgagaaaacccgtctgggcgctttacgcatcaaagacgacgtgctggtgctgcagtctttactgtggccggatgaagttcgtgaggccaatttcccgtctttagatgtgagcatcaagatcagcccgcaagaacgtgatatgagcgccgcactggttgaaagcatggccgccgacttcgacccggaacacttcaccgatgattatcaagttcagctgcgccagctgatcgaagccaaactggaacaaggtgatgcactggacaccgatgaaacttttggcgttgaagccggtgagggtggcaaaggtgaggttatcgatttaatggaagctttaaaacgctctttagatcgcaaacgcggtggtggtagcggtacagctggtagtggcagcggtgaagaagcagcagacagcgacgatgaagaagaaggcaaaccggcccctaaacgtgcaaccgctggtaaaaccgccgcagccaaaagcgatggtaccaagagtaccgccgcacgtagcaccgccgcaaaaactggtaccggcaagaccgccaccaagtctaccagcaaagccgcagataccaaaaccggcgcagccaaaaccaccgccgccaaaagcaccgccaagtctaccgccggcaaaaccgcagataaaccggcagccaagaccacagctggtaaagcaaccggcacccgcgcacgtaaaccggcctaaAAGCCGAGACCTCCTGTGTGAAA。

优化后的ligD蛋白的CDS编码序列具有SEQ ID NO.14～24所示的核苷酸序列，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

SEQ ID NO.14(Bsu-ligD)：

CCCAGTCACGACGAAGACGCAAAAatggcattcaccatgcagccggtgttaacaagcagcccgcctatcggtgcagagtggcgctatgaggtgaagtacgacggttaccgctgcattctgcgtattcatagcagcggcgtgactttaaccagtcgtaacggtgttgagctgagcagtacattcccggagatcacccagttcgccaaaaccgcatttcagcatctggaaaaggaactgccgctgactttagatggtgaaattgtgtgtctggtgaacccgtgtcgcgcagatttcgagcatctgcaagttcgtggtcgtttaaagcgcccggataaaatccaagaaagtgccaacgcccgcccgtgttgttttctggccttcgatttactggaacgtagcggcgaagatgtgactttactgagctatttagaccgcaagaaatctctgcgtgagctgatcagcgccgcaaaactgccggccagccccgatccgtacgccaaggaaaccatccaaagcatcccgtgctacgaccatttcgatcagctgtgggagatggtgatcaagtacgacggcgaaggcatcgtggcaaagaaaaccaacagcaagtggctggaaaagaaacgcagcagcgattggctgaaatacaaaaactttaaacaagcttacgtttgtattaccggctttaatcctaataatggctttttaaccgtgagcgttctgaaaaacggcatcatgacaccgattgcaagcgtgagtcacggcatgcgcgatgaggagaaaagtgcaattcgcgagattatggaacagcacggtcaccagacaccgagcggcgagttcactttagaaccgagtatttgtgccgcagtgcagtatttaaccattctgcaaggtaccttacgtgaagtgagcttcatcggctttgagttccagatggactggacagagtgcacctatgcccaagttatccgccatagcaaaccggtgcaccctaagctgcagtttaccagtctggataagattatctttgagaaaaataagaaaaccaaagaagatttcattcaatatatgatcgaggtgagtgattatctgctgccgtttctgaagaatcgcgccgtgaccgtgatccgttatccgcacggcagtcgcagcgaaagcttttttcagaagaacaaaccggactacgcccccgattttgtgcagagcttttacgatggcagccacgagcacatcgtttgcgaagatatgagcacactgctgtggctgtgcaatcagctggcactggagttccatgtgccgtttcagacaatcaagagccgccgtccggcagagattgttatcgatttagacccgcctagccgcgacgattttttaatggccgtgcaagctgccaatgagctgaaacgtctgctggatagcttcggtatcaccagttacccgaagctgagcggtaacaagggcatccagctgtatatccctctgagcccggaggcatttacctacgaagaaacccgccagttcacacagctgattgccgagtactgcaccaacgcatttcccgaactgttcacaaccgagcgtttaatcaaaaaccgtcattgcaaactgtatctggattatttacagcacgccgaaggcaaaaccattatctgcccgtacagcacccgtggtaatgagttaggtaccgtggccgcaccgctgtattggcatgaagttcagagtagtctgaccccggctttattcacaattgacaccgttattgatcgtattaaaaaacaaggttgcccgttttttgatttctatcgcaacccgcaagatgaaccgctgagcgccattctgcaccagttaaagaagaaatcttaaCACAAGGTCTTCTCCTGTGTGAAA；

SEQ ID NO.15(Bve-ligD)：

CCCAGTCACGACGAAGACGCAAAAatggttctgacaatgcagccgattttaaccagcgagccccccgaaggtagtgaatggcgttacgaggtgaagtacgacggtttccgctgtttactgcgtatcgacgaaagtggtgttactttaacaagccgcaatggtcagactttaaccaaccagttcccggaaattaccgcattcgccgcccgctgcttccagcatatgaaggatcgttttccgatcactttagacggtgagctggtgtatctgatcaatccgtatcgcgccgactttgaacatttacagattcgcggccgcttaaaacgtacagaaagcatcgaaagcacagccgatcgccgtccgtgtcgttttctggcctttgatttactggtgttagagggcgccggtaccgtttctttaccgtatgtgaaacgcaagcgcgcactgagcaaactgttcaaagaggccaatctgccggcttgtccgcaccatctggcagaagaggccatccagtacattccggaacataccgatttcgacgctttatgggataaagtggtgcgccatgatggtgaaggcgttgtggccaaacgcgccagtagtggttgggcagagaacaagcgtagcccggactggcaaaaatacaaacatatgaaaactgctcatgttctgctgaccggctttaaccctaagaacggctacgtgaccgcaagcgtgctgaaagatggcaccgccattcctattgccagcgtgagccatggtatgcaagctgaggaaaagaatgcagtgcgcaccattatggaaactcacggcaaaaagcagaagagtggtgaatatactttagagccgagcatttgcatgaccgtgcaatatttaaccattttacaagatactttacgcgaggtgagctttgtgagcttccaatttgaaatggattggacagagtgcacctaccagcaactgattctgcgcagcaagactttaccgccgaaactgcagtttacctctttagacaaaattgtttttaaaaaacgcgaaaaaaccaaagcagatttcttaagctacatggtgaaaatgagcgattttttaatgccttttctgaaagaccgcgccgtgaccgttatccgctatccgcatggtgcacccggtgaaagtttcttccagaaaaataagccggactacaccccggactttgttagtagcgtgtttgacggcagccacgaacacatcgtttgtagtagcattccgtctttactgtggctggcaaaccagctggctttagagtttcacgttccgtttcagaccgtgcatagcgaacgcccggccgaaatcgttattgatttagatccgcctagccgcaacgatttcccgatggccgtggaagcagcacacgttctgaagcagctgtttgacagcttcagcatcaccagtttcccgaaactgagcggcaacaagggcattcagctgtacattcctctgagcccggaggcctttacctacgaagaaacccgcgcctttaccatgctgatcgcagactactgtgttcgcacacgccccgatttatttacaaccgagcgcttcatcaaaaaccgcaatggccgtctgtatctggactatctgcagcacgccgagggtaagacaattattgccccgtatagtacccgcggtaacgaactgggcacagttgccgcaccgctgtactggagcgaggtgaacagctctttaacccccgatgactatactatcgacacagtggtgaaccgcgtgcgcaccgaaggcgatccgttctacgacttctatcgcaatccgcaagatggcccgctgagcatcgtgttagagcagattaagcgtaaaagctaaCACAAGGTCTTCTCCTGTGTGAAA；

SEQ ID NO.16(Cne-ligD)：

CCCAGTCACGACGAAGACGCAAAAatggccggcgcaaaacagcaagtggaggtggaaggtcgccgcattactttaaccaatttagataaggtgttatatccggccaccggtaccacaaaaggtgacgttattgcctattacgcagccatcgccccgcacatgattcctcatttacgtgatcgtccggtgacccgtaaacgctgggtggatggtgttggcaccgatgaacacccggccaaaatgttttttcagaaggatctggatgcccacacacccgaatgggttctgcgccgtgcaatccagcatcgtgaccatgcaaacgactatccgctggccaatgacgtggccacactgacttggctgggccagatcgcagccttagaactgcatgtgcctcagtggcgctttggtcgtaccggtgatgttcgtcgccccgatcgcttagtgctggatctggatccgggtccgggtgctggtctgcccgaatgtgtggaagttgccaaagccgcccgtgcaattctgcgtgatatgggtttagaaccgtaccccgttacaagcggcagcaaaggcattcatctgtatgccgcactggatggcagtcatgatgcagacgcaatcagcgaagttgcccatgaactggcccgtgctttagaagcagatcatccggatttagtggttagcgatatgcgcaaagctttacgtgaaggtaaggttctggtggactggagtcagaacaatccggccaaaacaaccgtggccccgtattctttacgcggtcgtagccgtccgacagttgcagttccgcgtacttggcgtgagctggcaagtccgacactgcgtcatctggaactggatgaagtggttgcccgtatgcgcacacgtgaggatcctttagccccggttgaagaaggccaccgtgaatctttagaaccgacacgcgaacgtttagccggtttcgcacataaggacgccgatgcagctggtgatcgtctggccacctatcgcagtaagcgcgacgccgcaaaaacaagcgagccggtgccggccgatgcaccggcaccgagcgatggcagcagctttgtgatccaagaacaccatgcacgcgctttacattgggatttccgtttagagcatgatggcgttctggtgagctgggctttacctaagggtgtgccgacagagcatggcaccaatcatttagcagtgcagacagaagatcatccgctggagtacggcagcttcgaaggcaccattccggccggcgaatatggtggcggcgaagttaccatctgggacgctggtacctttgagttagagaaatggcgcgatggccatgaagtgattgccacactgcatggccgcggccatggtaccggcattgatggtccgcgtcgctacgcactgatccataccggtggtcacggcaaggcagacgcaaattggctgatccatttaatggaaccggcagatgccccggccgcacatcacccgaaacccgctcgccccgctgcactggccaaagctggtggccgcacacgtgttggcgcccgtcgtaaaggtcgtgccgcctttgccgcagccccgatgttagccacagccgcaaccggcgctggtttagatagcgatgaggaatgggcagtggagatgaagtgggatggttatcgtgccattgcagcagtggccgacggtcgtgccaccattacaagccgtaatggtgtggatttaaccgccgcatttccggaactggccgatctgccggatcagctggcagccgacgccgttctggatggtgagattgttgttctgggcgatggtggccgcccggattttggtttactgcagacccgtttaggtctgactggtgaaaaggatattgcccgtgcccgcaaagcagcaccggtgcatttaatgctgttcgatgctttagccattggtgatcgcgtgctggttggcgaaccgtatcgcgaacgccgcgcagcactgttagatgcagttacaagccccggtcgcggccgcattcaagttccgccggcatttgatggtgatctggatggtgctttagcaacaagtcgcgagctgggtctggaaggcgttgttgccaaacgcgttgacgcaccgtacgaaagcggtcgccgcagcagcgcttggatcaaaatcaaacaccaccgtgcccaagaagtggtggtgggtggttggcgtccgggtagcggtagtcgtagcagcggtattggctctttactggttggtgttccgggtccggatggtttaatgtatgccggccgcgttggtaccggctttacagaacgcgatctggccgacgcactgcgtcgtttccgccctctggcccgtaaaaccagcccgttcgccgatgttcccgctgccgaagcacgtgatgcacactggatcacacctcgtttagtgggcgaagttgaattcgcagagtggaccagcaccggtcgtttacgtcaagctagttggcgcggctggcgtcatgataagagtccggacgaggtggttcgtgaggattaaCACAAGGTCTTCTCCTGTGTGAAA；

SEQ ID NO.17(Mde-ligD)：

CCCAGTCACGACGAAGACGCAAAAatggcactggagacataccgtaagaagcgcgattttagcgttacaccggaacctcaaggtcgtcgtgcccctaaagctggtaacagctttgtgatccaaaaacatgatgcccgccgtttacactatgatttccgtctggagatggacggcgttctgaaaagttgggccgtgacaaaaggcccgagcttaatccccggtgaaaaacgtttagccgtgcacgttgaggatcatccgctggagtacggtggtttcgaaggcacaattccgaaaggcgaatacggtggtggtaccgttattttatgggaccgcggtacatggacccctatcggcgatgcacgccgcggctatgcaaaaggccatctggatttcgaattacatggcgagaaactgggcggtagctggcatttagttcgcatggctggtaaaccgcgcgagaaacgtgagaactggctgctgattaagggtgatgacgatgccgcccgcacagaggatgacccggacattttagacgaacgcccggaaagtattgccaccggccgtaagatcgaagatgttgctggtgaggaaccgggttggagcagtaaaaccggtcgtatccgcaagcgtcgtggtggtcgcactggtgccgcaccccccgaagagcagccggcaaccgtgagtgttccggaaccgagcaaaattaagggcgcaaagaaagccgctttaccggatttcgtggaaccgacactggccactttagttagtagcgccccgagtggtcaacgctggctgcacgagatcaaattcgatggctatcgtttacaagctcgcgtggaggctggtcgtgttaaactgctgacccgtagcggtttagattggacaaaaaagttcggtaaagccatcgttagtgctttagcagatttaccggttggtaccgcactgatcgacggtgagttagtggttgagacaagcgctggtgccagcgacttcagtgaattacaagctgatctgagtgagggccgtagcgatcgcttccgtttatacgttttcgatttactgcatttagatggttatgatctgcgcgatgtggcaagcatccagcgcaaggaactgctggagaagattatcggcagcggcagcggcatcattagctacagtggtcactttgaagaagatggtccgctggttctgcgtcatgcttgtcgtctgtctttagaaggtgtggtgagtaaactgcgcgatgcaccttaccgtgctggtcgtagcaagaactgggtgaaaagcaagtgcagcgcccgccaagaatttgtggtggccggctatgtgcctagcaccaccagccgtaatgcaattggcagtctggtgctgggcgtgtatgacgatggcaaactgcaccacgttggccgtgtgggtaccggctacacagcagccgttgccgaaggtttattcaagaagctggaacgcatccgtattccgagtagcccgttcgatgaacgtttaagcgccgaagaaactcgccaagttcgttatgtgcgtccggagctggttgccgagattgaattccgtgcttggacagcagatggcaatttacgccacgcaagcttccgtggcttacgcgaggacaagccggcaaaggagattgtgcgtgaaactccgaaaacaaaagcagccgcaaaaccgcagcgtcgtaccgtgaagctgacccacccggatcgtttatattggccggaccaaggtgttaccaaagagggtttagccgactactataccgaagtgtggcgctacgccagcccttatctggtgggtcgcgcactggcactgttacgttgtcctagtggcattagcggcgagcaattcttccagaaacatgcatggaaaggtttaaacccgaacatcgtgctggtgcatgatccgaaggatcctccggacgaacgtctgattagcatcaatgatttagacggcttaattggcttagtgcagagcgcagccttagaaatccatccgtggggcagtatggttagcgactgggagcgtccggataccattatcatggatctggatccgggcgaggatgtttcttgggaggcagtgattgcagcagccgtggaaacccgcgatcgtttaaaagatgccggtttagtgccgtttattaagaccagtggcggcaaaggtctgcacgtggttgcaccgctgaagccgaaggcagagtggccggcagcaaaagcctttaccaaggccatcgcagatgccatggcagccgatagcccgggtcgctatgttagtaccatcaccaaaagcaaacgccgcggcaagattctggtggattatttacgcaatcagcgtggtgccaccgcagttgcaccttatagtacccgcgcccgtcccggtgcagcagtgagtatgcctctggcatgggatgaactgggcccgggtattggcccggcatattttaccgtggagaacaccccgacacgtttagcatctttaagcagtgatccgtggcaagactttcgtgccgccgccgtgccgattgaagatcgcgccaatcgtcgcgaaaaagccgcctaaCACAAGGTCTTCTCCTGTGTGAAA；

SEQ ID NO.18(Mfo-ligD)：

CCCAGTCACGACGAAGACGCAAAAatggaacgctatgaacgtgtgcgtttaaccaaccccgataaggttctgtaccccgctagcagcaccaccaaagcagaggtgtttgattattatctgagcatcgccgaagttatgctgccgcatattgccggtcgtccggttacccgtaaacgttggccgaatggtgtggcagaagccagcttcttcgaaaagcaactggccagtagtgcaccggattggctggaacgtggcaccattgtgcataagagcggcaccaccacctaccctatcgttaacacccgcgaaggcttagcatggatcgcccagcaagcttctttagagctgcatgttccgcaatggcgctttagcagcgatggcagccaaggtccggcaacccgtatcgtgttcgatttagatccgggtgaaggcgttacaatgcctcagctgtgcgaggttgcccaagccgtgcgcgaactgatgagcgacatcggcttaatgacctatccgctgaccagtggtagcaaaggtttacatttatacgttccgctggcagaccctatcagcagccgcggtgcaagcgttctggccaagcgcgttgcagtgcagctggagcaagctatgccgaagctggttaccgcaaccatgacccgcagtctgcgcgcccagaaagtgtttttagactggagtcagaataatgcagccaagaccacaatcgcaccgtattctttacgcggtcgtgattacccgaccgttgcagcaccgcgtacatgggatgaaattggcgacccggatttacgccatctgcgtttcgacgaagttctgcagcgcatcagtgacgatggcgatttattagctggtttagatgacgatgccccggttgccgataaactgaccacctatcgcagcatgcgcgatgcaacaaaaaccccggaacccgttccgcgcgatatcccggttcgcggtaacaacgatcgtttcgttattcaagaacatcacgcacgtcgtttacattatgatctgcgtctggaacgtgatggcgtgctggttagctgggcagttccgaaaaatttaccggacaccaccgccgttaatcatttagccgtgcacacagaagatcaccctatcgagtatttaacctttcacggcacaattccgaagggcgagtatggtgctggtaatatggtgatctgggacaccggtacctatgaggccgagaaattccgcgttccggccgatccggatgacagcgatgcaccgaagggtgaagttatcttcactttaaatggtaaccgcatcgatggccgttacgcactgatccagaccgaaggtaagaactggctggcacatcgcatgaaggatcagagcagcgccgcacccgaaccgaaagacttcgccccgatgttagcaaccgaaggcagtgtggccaagctgaaggccacccagtgggccttcgaaggtaaatgggacggctaccgcttactggtggaggccgaacatggtcgcttacaactgcgtagtcgccgcggccgtgatgttaccgccgagtatccgcagtttgaagcactggccgccgatctggccgatcatcatgtggtgctggatggtgaagccgttgccttagacgatcacggcatgccgagcttccgcgagatgcagaaccgcgcacgcagtacacgtgttgagttctgggcctttgatattttatggctggatggtcgctctttactgcgcgcaaaatacacagaccgccgcaaactgctggaagcactggcagctggtggtggtctgattgtgccggaacagctggctggtgatggtccggaggccatggaacacgcacgtgagcacaaattcgagggcgtggtggctaaaaaacgcgatagcacctaccagcccggtcgtcgtagtgccagctggatcaaagacaaaatctggaacacccaagaagttgttatcggcggttggcgccaaggcgaaggtggccgtagcagtggcattggcgctttagttctgggtgtgccgggtcctcatggtttacaatttgctggtcgtgttggcaccggcttcaccgaaaaggaactgaccaaactgaaaggtatgctgaaaccgctgcacaccaaagagagcccgtttgataagccgctgccgaaactggatgccaaaggcgtgaccttcgtgcgccccgaactggttggcgaggtgcgctatagtgaacgtacaaccgaccaccgtttacgccagcctagttggcgtggtctgcgtccggacaaagcaccggacgaagtggtgtgggagtaaCACAAGGTCTTCTCCTGTGTGAAA；

SEQ ID NO.19(Msm-ligD)：

CCCAGTCACGACGAAGACGCAAAAatggaacgctacgaacgtgtgcgtttaaccaaccccgataaggtgctgtaccccgctaccggcaccaccaaagccgaagtgtttgattattatttaagcattgcacaagttatggtgccgcacatcgccggtcgtccggttacacgtaaacgctggccgaatggcgtggccgaagaagcattctttgagaagcagctggccagcagtgccccgagttggttagaacgcggcagcattacccataaaagcggcaccaccacctaccctatcattaacacccgcgaaggtctggcatgggttgcccagcaagcttctttagaagtgcatgtgccgcagtggcgctttgaagatggtgaccaaggtccggcaacccgtatcgttttcgatttagacccgggtgagggcgtgaccatgacccagctgtgcgaaatcgcccacgaagtgcgcgctttaatgaccgatctggatttagagacatacccgctgacaagcggcagcaaaggtttacatctgtacgttccgctggcagaaccgattagcagccgtggtgcaagcgttctggcacgccgtgtggcacagcagctggaacaagctatgccgaaactggttaccgccaccatgaccaaatctttacgtgctggtaaggtgtttctggattggagccagaacaacgcagcaaaaaccaccatcgccccgtatagtttacgcggtcgtgaccatcctacagtggccgcccctcgcacttgggacgaaattgccgatccggaactgcgccatttacgctttgatgaggtgctggaccgtctggacgaatacggtgatctgctggcacctctggacgcagacgccccgattgccgataagctgacaacctaccgtagtatgcgcgacgcaagtaaaaccccggaaccggtgccgaaagaaattccgaaaactggtaataatgacaaattcgtgatccaagaacatcatgcccgtcgtttacactacgacttacgtttagagcgcgacggcgtgctggttagtttcgccgtgcctaaaaatttaccggaaaccaccgcagaaaaccgtttagccgttcacaccgaagatcacccgattgaatatttagccttccacggtagcatccctaaaggcgagtatggtgccggcgatatggtgatttgggacagcggcagttatgaaaccgagaaattccgcgtgccggaagaactggataacccggacgacagccacggtgaaatcatcgtgactttacacggcgaaaaggttgacggccgttacgctttaattcaaaccaagggcaaaaactggctggcccaccgtatgaaagaccagaaaaacgcccgtccggaggattttgcccctatgctggccaccgaaggcagtgtggccaaatacaaggccaaacaatgggccttcgagggtaaatgggatggctaccgtgtgattatcgacgccgatcatggtcagctgcagatccgtagccgtaccggccgtgaagttaccggcgagtatccgcagtttaaagctttagccgcagatctggcagagcatcacgttgttctggacggcgaggccgttgccttagatgagagcggcgtgccgagttttggccagatgcagaatcgcgcccgtagcacccgtgtggagttttgggccttcgatattttatggttagacggtcgttctttactgcgtgcaaagtatagcgatcgccgtaaaattttagaagctttagcagacggtggtggtctgattgtgcccgatcaactgccgggtgacggccccgaagccatggaacacgtgcgtaaaaagcgcttcgagggtgtggttgccaaaaagtgggatagcacctaccagcccggtcgtcgcagcagcagctggatcaaagataaaatttggaatacccaagaagttgttattggcggttggcgtcaaggtgagggtggtcgcagcagtggtattggcgctttagttctgggcattccgggtcccgaaggtttacagttcgtgggtcgtgttggcaccggttttaccgaaaaagaactgagtaagctgaaagatatgctgaagccgctgcataccgatgaaagcccgttcaacgcaccgctgccgaaagtggatgcccgtggcgtgacctttgtgcgccccgaactggtgggcgaagtgcgttatagcgagcgcaccagcgatggtcgtttacgtcaacctagttggcgtggtttacgcccggataagacaccggatgaggtggtttgggaataaCACAAGGTCTTCTCCTGTGTGAAA；

SEQ ID NO.20(Mtb-ligD)：

CCCAGTCACGACGAAGACGCAAAAatgggcagcgcaagcgaacagcgcgttaccttaaccaacgccgacaaagtgctgtatccggcaaccggtaccaccaaaagcgacattttcgactactatgctggtgtggcagaggtgatgctgggtcatattgccggtcgcccggcaacccgtaaacgctggccgaatggcgttgatcagccggcatttttcgagaagcagctggctttaagtgcacccccttggctgagccgtgccaccgttgcacaccgtagtggtaccaccacctaccctatcattgatagcgccaccggtctggcttggattgcacagcaagccgcactggaagtgcacgtgccgcagtggcgtttcgtggccgaaccgggtagtggcgaattaaatcccggtccggctacccgtttagtgttcgatctggatccgggcgagggtgtgatgatggcacagctggccgaagttgcacgcgcagtgcgtgacttactggcagacattggcttagtgacctttccggtgacaagcggcagtaaaggtctgcatttatacaccccgctggatgaaccggtgagtagtcgcggcgccacagtgctggcaaaacgtgttgcacagcgtttagagcaagcaatgcccgctctggtgaccagcacaatgaccaaaagtctgcgcgccggcaaggtgtttgtggattggagtcagaacagcggcagcaagaccacaattgcaccttatagtctgcgcggtcgtacccatccgaccgttgcagccccgcgtacatgggcagaactggacgatcccgctctgcgccagctgagctatgacgaagttctgacacgcattgcccgcgatggcgatctgctggaacgtttagatgcagatgcaccggttgcagatcgtttaacccgctaccgtcgtatgcgtgatgcaagcaaaacccccgaaccgatcccgaccgccaagcccgttaccggtgacggtaacacattcgtgattcaagaacatcatgcccgtcgcccgcactatgattttcgtttagaacgtgatggcgtgctggtgagttgggccgttccgaaaaatctgccggataacaccagcgttaaccatttagccattcacaccgaggatcacccgctggagtatgccacctttgagggcgcaattcctagcggtgaatatggtgccggcaaagtgatcatctgggacagtggcacctatgataccgagaaatttcatgatgacccgcacaccggtgaggtgatcgttaatttacatggtggccgtatcagcggtcgctacgcactgattcgcaccaatggcgaccgctggctggcccatcgtttaaagaatcagaaagatcagaaagtgttcgagtttgataatctggcccctatgctggcaacccacggtacagtggccggtctgaaggccagccagtgggcatttgaaggcaaatgggatggctaccgcttactggttgaagcagatcacggtgcagtgcgtctgcgcagtcgtagcggccgtgatgtgaccgccgaatatccgcagctgcgcgctttagcagaagatttagcagatcatcacgttgtgctggatggtgaggccgtggttctggacagcagcggcgtgccgagtttcagccagatgcaaaaccgcggtcgtgacacacgcgtggaattctgggcctttgacttactgtatctggatggccgtgcactgctgggcacccgttatcaagatcgccgtaaactgttagaaactttagcaaacgcaacctctttaaccgttccggaactgttaccgggcgacggtgcccaagcttttgcttgtagtcgtaaacacggttgggaaggtgtgattgccaaacgtcgtgacagccgttatcagcccggtcgccgttgtgccagctgggttaaagataaacattggaatacccaagaagtggtgatcggtggctggcgtgctggtgaaggcggtcgtagcagcggtgtgggtagtttactgatgggcatcccgggtccgggtggtctgcagtttgctggtcgtgtgggtaccggcttaagcgaacgtgaactggccaatctgaaggagatgctggcaccgctgcacaccgatgagagtcctttcgacgtgccgttacccgctcgtgatgccaaaggcatcacctacgttaagccggcactggtggccgaagttcgctatagcgaatggacaccggaaggccgtttacgccagagtagctggcgtggtttacgtccggacaaaaaaccgagcgaggtggttcgcgagtaaCACAAGGTCTTCTCCTGTGTGAAA；

SEQ ID NO.21(Pae-ligD)：

CCCAGTCACGACGAAGACGCAAAAatgcctagtagcaagccgctggcagaatacgcacgcaaacgcgattttcgccagaccccggaacctagtggccgtaaacctcgcaaagacagcaccggtttactgcgttactgcgtgcagaagcatgatgcaagccgtctgcactatgacttccgtttagagttagacggtactttaaaaagctgggcagtgcctaaaggtccgtgtttagatccggccgtgaaacgtttagcagtgcaagttgaggatcatcctctggattacgccgattttgaaggcagcatcccgcaaggtcattatggcgctggtgacgttatcgtttgggatcgtggtgcttggaccccgctggatgatccgcgcgaaggtctggaaaagggccatttaagtttcgccttagatggtgagaaattaagcggccgctggcatttaatccgcacaaacttacgcggcaaacaacctcagtggtttctggttaaagccaaggacggcgaggcacgttctttagatcgcttcgacgtgttaaaggaacgtccggacagcgttctgagcgagcgcactttattacctcgccatggtgaaaccgccacccccgctgcacgtccggcacgtcgtggcaaaagtggcggcaaaaccccgatgccggagtggattgccccggaactggccagcttagttgaacagcctccgcgcggcgaatgggcctacgaactgaagttagacggctatcgtttaatgagccgcattgaggatggccacgttcgtctgctgacccgtaacggccatgactggaccgagcgcttaccgcatctggaaaaagcattagccggtttaggtctgcagcgtagctggctggatggcgagctggttgttctggacgaagagggccgccccgattttcaagctttacagaatgcattcgaagaaggtcgcggtgaaaatattttatacgtgctgttcgatttaccgtaccatgaaggcgaggatttacgcgatgttgctttagaggagcgtcgcgcacgcttagaggccttactggaaggtcgcgatgaagatccgctgcgcttcagtgccacactggcagaagatccgcgtgatctgctggcaagcgcttgtaagctgggcttagagggcgttattggcaagcgcttaggcagtgcataccgcagccgccgcagcaacgattggatcaaattaaagtgccagctgcgtcaagaattcgtgatcgtgggctatacagagccgaaaggtagccgccgtcatatcggtgctttactgttaggtctgtacagtccggacgaagaacgccgtttacgctatgctggtaaggtgggcagtggtttcaccgccgccagtctgaaaaaggtgcgcgaacgcttagaaccgctggccgttcgcagtagcccgttagccaaagttccgcccgctcgcgagactggtagtgtgcaatgggtgcgtccgcaacagctgtgcgaggtgagctacgcacagatgacccgcggtggtatcattcgccaagctgtttttcacggtctgcgtgaggataaaccggcacgtgaggtgaccggtgaacgtcccgctggtcctccgcctttacgcggcgcacgtaaagccggtagcggtgcaagccgtgcagcaaccgccggcgttcgtattagccacccgcaacgtttaatcgatccgagtatccaagcaagcaaactggagctggccgaatttcatgcccgctacgcagatctgctgctgcgcgatctgcgtgagcgtcccgttagtctggttcgtggcccggatggtatcggtggcgaactgtttttccaaaaacacgccgcacgtctgaaaatccccggtattgtgcagctggatccggcattagatccgggtcacccgccgctgttacagattcgtagcgccgaagctttagtgggtgcagtgcagatgggcagcatcgaatttcatacatggaacgccagtctggcaaatctggaacgcccggatcgtttcgtgctggatctggatccggatccggctttaccttggaagcgtatgctggaggcaacccagttatctttaactttactggatgagttaggcttacgcgcatttttaaaaacttctggtggtaaaggcatgcatttactggtgccgttagagcgtcgccatggttgggacgaagtgaaagacttcgcccaagctatcagccaacatctggcccgcttaatgccggaacgttttagcgccgttagtggtccgcgcaaccgtgttggcaaaattttcgtggactatttacgcaacagccgtggtgccagcaccgttgccgcctatagtgtgcgtgcccgtgaaggtttacccgttagcgtgccggtgtttcgtgaggagttagattctttacaaggtgccaaccagtggaatctgcgtagcttaccgcaacgcttagatgaactggccggcgatgatccgtgggcagattatgccggtacccgccagcgtatcagtgcagcaatgcgtcgtcagctgggtcgcggttaaCACAAGGTCTTCTCCTGTGTGAAA；

SEQ ID NO.22(Pbr-ligD)：

CCCAGTCACGACGAAGACGCAAAAatgggtcgtgaccaccctctgagtgcctaccacgccaaacgtgattttgcacacacccccgaaccggctggtgagaaacgcgtggccaaacgccgtggtaaggccgttcagcccgctttacagtttgttattcagcgccatcatgcccgtcgtctgcactacgattttcgtttagaatggggcggcacactgaaaagctgggcagttcctcgcggtcctagcttagatcccgatattcagcgtttagcagttgaagttgaagatcatccgctggattacgctggtttcgagggtacaattccgaaaggtcactatggcgctggtgatgtggcaatttgggatcgcggcgaatggattccggagggtgatgcagaagagggtttacgtcgtggcaagctgcatttcgaactgcgcggtacacgtctgcacggtgcttgggttttatttcgtctggccggcgagggtgaccaatggatgctgcgtaagcgccgcgatcagcatgcccgtatcggtgatggtgatgccgttctgcacgatcctccggaagcagaagcaccgcccgctcccgctcccgctcccgttgcagcaaagagcccgcgtagtagcgcagcaagtagccgtcgtcgtcgtgtgccggtgccggaatttgtggagccgcagttagccactttagtggatcgcccgcccgttagcgatgcatgggtgtacgagatcaaatacgacggctaccgcatgctggtgcgttgcgatggccgtcaagttcgtttattcagccgtaacggcattgaatggaccgaacgtttaccgagtctggttcaacgtctgagcgctttacaaagccatagcggctggctggacggcgagattgttgtgatggacgagcatggccataccgatttccatgctttacaagctacactggatagtggcgccccgcaagttgagtatgtggtgttcgacgtgccgtggtgggatggtgaagatttacgcgaccgtccgctgagtcatcgtttacaagctttagatgagatctttgccgcactgccggcacaacccggtttaagtcgtagtaaaccgctggatccgggttatgttggccaagctgttctgcaagctgcatgccagctgggtctggaaggtctgatcggcaagcgtctggatgcaccttatcgcagcggccgtagcccgcattggattaagctgaaatgccgcagcgaacaagaagttgttattggtggttacaccgagccgcgtggcagtcgcggccacttaggtgcactgttagtgggcgtgtggggtaaagatggccagctggattatgccggccgtgttggcagtggttttgatcaagctggtttacaagctatgcgtgaacgtctggcaccggatgaaaccgcacgctgtccgtttcgtagcaaaccttctttaccgggtgcccctaccgtgcattgggtggagccggtgcatgtggttcaagttcgctatgcaagttggacccaagaaggtttactgcgtcaagctagctttgtgggtgtgcgcgaggacaaaccggtgcgcaaggttgtgcgtgagctgccgcagaccgtggcacaagaagataccccgatgcgtcctagcgccacacgtctggctggtcgtccggcaagtccggcagccacagcagcacgcgcaagtctgcgccgtagtggtgccagcagcgacccgaaagcaaacagtgttggcggcgttcgtgttacacatccggagcgtctggtgttcagcgttcctcgcattaccaaactggaagttgttcgctatcatgaagatatcggtgaatatctgctgcctcatttagcagcccgccctctgagcttactgcgctgtccgcaaggcaccggcggtgagtgcttcttccaaaaacatgtggaaaccactttaccgagcggtgtggaaagcgttgaagttcccgctagtgacggtaccgacacactggtgatggtgaacagcgtggaaggtattgttgctttagcccagtacggcaacgttgaatttcacacttggggcgcacgtgcacctcgtcccgatcgtccggaccgtatcaccatggatctggatcccgatcccgatttaccgtgggcccaagttgtggaagccgcccagctgacccgtgttttactggaagaactgggtctggccgcctttttaaaaaccaccggcggcaagggtttacatatcgtgaccccgatcaaagccacccgtagttgggacgaagtgaaagccttcacaaagggtctggccagccgtctggccagtgttgcccctcagcgttttaccgcccgtctgagtaagagcagccgcggtggtcgtatttttattgactatttacgtaatggccgcggtgccacagcagtggcaagttattctttacgcgcacgtgaaggtgcaccggtgagcgttccgctgcattgggatgagttaagcgccaagaaagacgtgcgtgccgaacacttcaacttacgcaatgccgttgcccgtgcaccggagagtgaaaccgcatggcaagattatgccgcccagcgccgtaccttaacagttaagatgtttcgcgctttaggtgtggatccgggtagcgcagaaagctaaCACAAGGTCTTCTCCTGTGTGAAA；

SEQ ID NO.23(Ppu-ligD)：

CCCAGTCACGACGAAGACGCAAAAatggccaagccgctgcaagaatatgcacgcaagcgtgactttaacgcaaccccggaaccgagcggcaaacgcagtcgtggcaagaaggcacacgcactgcagttctgcatccagaaacacgatgccagccatttacattatgacttccgtttagaactgggcggcactttaaaaagctgggccattccgaagggcccgagcttagaccctaatgtgcgtcgtctggccgttcatgtggaagatcatccgctggactatgccgatttcgaaggccatattccggagggccactatggcgccggtgatgtgatcgtttgggaccgtggtatctgggaaccggagggcgatgcccaccaaggttatgccaaaggcaaattaaagttccgtttacaaggtgagaaactgagcggtgtttggcatttattccgtacacatttagctggtaaaaaagagcagtggatgctggtgaagagccatgatgcccaagctcgcagcgaggccgagtacagtattgttaacgcacagccggacagcgttctgagcgaccgtactttaattcctcgtaaaccggccgccaaacaagctgcagccaaacctcgtgccacacgtaaacgtcccggtaaggttcgccaagcagcattaccgaaccagctgcagccgcaattagccactttagttgatacacctccgcaaggtgactggcgttacgaggtgaagtttgatggctatcgcattctggcccgcatcgatggtgacgacgtgcgtctgtttacccgcaatggccacgattggagtagtaaaatgccgcgccagctggcagctttacgtgcactgggtatcgatagcgcttggctggatggcgaaatggtggtggccgatgaaaacggtgcagcagatttccaagctttacaaaatgcctttgataccgagcaagatgaacacatcacctactatgtgtttgatttaccgtttttaggcggtcaagatctgcgccatgcaccgctgcaagatcgtcgtgaaactttaaaaacattactggaccacgacgccagcgatgttctgaaatatagcgccgattttgatgagcccgttgatgcactgctggccagtgcatgccgtctggaactggagggtttaattggcaagcgcgccgacagcccgtatagtggtcgtcgcagtggcgactggattaaactgaagtgtaagcgccgccaagaattcgtgctggttggttacaccgacccgaaaggcagccgcagcggtttcggtgctttattactggctttacatgatcccgataacggcgaactgcgttatgccggcaaggttggcaccggttttacagcagcaactttagcaagcatccacacacgtttacaaccgctggagattgccaaaccggcagttacccgtcctccgagtggtgccgaagcacgcggcgttcactggctgaagccgcaattactggcagaagtggcctacgcccaaatgacacgcgacggtattgtgcgtcatagcgtgttccacggtctgcgtgacgacaaaccggccaccgcaattgatctggaacgccctatgagtaccaacaccacacctcgtcgtaaacgtggtaaagcagcacctctgagcgaggatttacatctgacccatccggatcgtgttattgacgccaccactggtgttacaaagcgtgatgtggccgagtactacgccgccgttagccagtggctgctgcctcagattcagcatcgtccggtggccttagttcgtgcaccggatggtctggctggtgagctgttcttccaaaagaacgccagccagctgcatttaccgaacgtgctggagtatgacaaagcccaagctggtcaagctgcaatggtgatcaatcgcgccgatactttactgggtgcagttcagatgaatatgctggaactgcacagctggaatgcaaccgacaaggatttcgacaagccggatcgctttgtgctggatttagatccggaccccgctttaccttggaaggcaatgctggaagcaacccagttaacactgactttattagacgagctgggtttaaaagtgttcatcaagaccagcggtggcaagggtattcatttagtggtgccgttaacccgtcgcgctggttgggatgaggttaaagcctttagccacgccatcgtggaatatctggccaagctgttccccgatcgtttaagcgccgttagtggtccgaaaaatcgtattggtcgtatttttattgactatctgcgtaatgcccgtggtgcaacaacagcttgtgcctactctttacgcgcacgtgaaggtatgccggtgagcgtgcctatttggcgtgaggagctgaccgcactgaaggccgcaaatcagtggaatatcgcaaatttacccgctcgtttagccgaagttgacgatccgtgggccgatctgggccgtgtgcgtcagagcatcacagcccgcatgcgtaagcaactgggtttagcctaaCACAAGGTCTTCTCCTGTGTGAAA；

SEQ ID NO.24(Pvi-ligD)：

CCCAGTCACGACGAAGACGCAAAAatggcaaagccggtgagtgaatatacccgcaagcgcaacttcgacattaccagcgagcccgctgaggctggtagtaaaatgcgcagcgccaaagcccacgcactgagcttcgttatccagaagcacgatgccagccatctgcactatgatttccgtctggagctggacggtacactgaagagctgggccgtgcctaagggccctagcttagatcctacccagaaacgtttagccgtgcatgttgaggatcatcctctgggttatgcaagcttcgaaggcagcattccgaagggccagtatggtggtggcgacgttattgtgtgggatcgcggtgtgtgggagccgcacggtgatcctcgcaaaacctacgccgaaggcaagctgaaattcacactgattggtgaaaagctgactggtgattgggctttagttcgtacccgtctgaagggtagcggtagcaaagagcagtggctgctgattaaggagaaggatagcgttgcccgcccggccgatgagtatgatatcattgaacagcagcctcaaagtgtgattagtggcgcccatgtgggcgttggtcgcgttccggcaagcaaagccaagccgcgcagcacaaaaaccaaaaccgataccgcaccggcaaaaccgagccgcatgagcagccgtaccaaggccaaagccgcactgcccgaactgttaaccccgcaactggcaacactggttgatgcccctccggctggtgaatggctgtacgagatcaaatttgatggctaccgcattctgacacgcatccaaggcgacgatgttcgtctgttcacccgcaatggtcacgattggaccgaacgtctgccggagctggcaaaagcaatcaaagctttaaaactgcaagatacttggttcgacggcgaagtggttgtgttaaacgatcaaggtttaccggattttcaagctttacagaacgccttcgaaatcggtcgcagcaaggatattttatattatttattcgatatgccgtatctgaccggcgaagatctgcgcgaggtgccgatcgaacaacgtcgcgatgctttaaagcaagttctgggtaagcagcgtagccgtttactgcgctttagcgatgcattccgtagcggccacaaagacattgttgagagcgccagcgcaatgggtctggagggcgtgattggcaaacgcgctggtagtccttatgtgagcaaacgcaatgccgactggatcaagctgaaatgtcgtctgcgccaagagttcgtgattgttggctatacagcccctcaaggtagccgcagtgcattcggcgcactgctgctggccgttaatgatgacgacggtctggtgtatgccggccgtgtgggcactggtttcaccagccagactttaaaacaactgcatgaccaactgcaacctttagagcgcgataccagtccgctggacaagaaactgaccagcgcacaagctcgtggcgtgcaatgggtggaaccgcgtttaatctgcgaagccgagtttgcagagtggacccgcgaaggcattctgcgccaagcagcctttgtgggtttacgcagcgacaaaccggcaagcgaggtggttcgcgaatatccgcagcccgctgacattgccagccgtccgaaagcagcaaaaagcagcaagaccaaggcattagaggcccccgttgcccgcaaaaccgcacgtggcaaagtgaatgtggctggtgtgggtattagccacagcgaccgcgtgattgatagcaagagcggcacccagaagatcgaactggcacaattctacgaaagcatcgccgattggattttaccgtatttaaacaatcgcccggttgcactgctgcgctgtccggaaggcattgacggcgagcaatttttccagaagcatagcgagcgtttagcaattccgcacattcgccagctggatcgcaaactggatccgggtcatgcagcactgatggaaatcgacaccgtgcaagctttagtgggtgccgcacagatgggtgccatcgaatttcacacttggggcgccaccagtgatcgtatcgagacacccgatcatctggtgctggatttagaccccgatccggccttaccgtggcgcagcatgatcgaagcaacccagatggtgctggccgttttagaggagctgggcttagaagcctttttaaaaaccagcggcggcaaaggcatgcatatcatcgtgcctttagcccgccacgcagattgggataccgtgaaaggcttcgccaaagccatcgccgaatttgttacccagcagctgccggaacgcttcaccgccacaatgggtcctaaaaaccgtgtgggccgcatcttcgttgattatctgcgtaatagccgtggcggcagtacagtgaccgcatacagcgttcgcgcccgccccggtctgcccgttagtgttccgatcgctttagacgaactggctggtttaacaagcagcgcccagtgggatgttacaaatttagagcagcgtctgcgcgaactgaagggcgacccgtgggagggttatcgtaatcgtcagcgcatcacacagaaaatgtggaagcagctgggtgcaaagcgtagttaaCACAAGGTCTTCTCCTGTGTGAAA。

(3)酶切pDual-Cas9-Parental质粒。

酶切反应体系如下：

37℃反应1h，反应结束后使用磁珠对酶切产物进行纯化。

(4)酶切11种Ku蛋白的CDS编码序列。

酶切反应体系如下：

37℃反应1h，反应结束后使用磁珠对酶切产物进行纯化。

(5)连接。

将步骤(4)纯化后的Ku蛋白的CDS编码序列按等分子数混合，再与步骤(3)纯化的酶切载体片段混合，进行连接。

连接反应体系如下：

22℃反应1h，反应结束后将连接产物转化Top10感受态细胞，涂布卡那霉素抗性LB平板，30℃培养过夜，次日将平板所有克隆刮板抽提质粒，将质粒进行NGS测序分析Ku蛋白的CDS编码序列的克隆情况，测序结果显示质粒文库含有11种Ku蛋白的CDS编码序列。

(6)酶切。

将步骤(5)中刮板抽提的质粒使用BbsⅠ进行酶切。

酶切反应体系如下：

37℃反应1h，反应结束后使用酚/氯仿/异丙醇沉淀的方法对酶切产物进行纯化。

(7)酶切11种ligD蛋白的CDS编码序列。

酶切反应体系如下：

37℃反应1h，反应结束后使用磁珠对酶切产物进行纯化。

(8)连接。

将步骤(7)纯化的ligD蛋白的CDS编码序列按等分子数混合，再与步骤(6)纯化后的载体片段混合，进行连接。

连接反应体系如下：

22℃反应1h，反应结束后将连接产物转化Top10感受态细胞，涂布卡那霉素抗性LB平板，30℃培养过夜，次日将平板所有克隆刮板抽提质粒，得到Ku+ligD质粒文库，将质粒进行NGS测序分析ligD蛋白的CDS编码序列的克隆情况、文库Ku+ligD组合的覆盖度情况，测序结果显示质粒文库含有121种Ku+ligD质粒，即Ku+ligD质粒文库构建成功。

实施例3从Ku+ligD质粒文库筛选在大肠杆菌体内有效的NHEJ系统

本实施例对在大肠杆菌中有效的NHEJ系统进行筛选，包括如下步骤：

(1)将实施例2构建的Ku+ligD质粒文库电转至MG1655大肠杆菌感受态细胞中，涂布卡那霉素抗性LB平板，30℃培养过夜。

(2)将平板所有克隆刮板并将菌液接种至LB培养基，于30℃、220rpm条件下培养，当菌液OD₆₀₀值达到0.6时，按照标准的电转感受态细胞制备方法制备感受态细胞。

(3)电转pDual-sgRNA-lacZ质粒至步骤(2)制备的电转感受态细胞，涂布含IPTG、X-gal、卡那霉素和氨苄青霉素的LB平板，30℃培养过夜。

(4)挑取192个白色单克隆至LB培养平板培养8小时，使用菌落PCR的方法扩增每个单克隆的Ku、ligD以及lacZ基因序列。

PCR扩增体系如下：

其中，lacZ基因的PCR扩增引物如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示。

SEQ ID NO.25：AGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGC；

SEQ ID NO.26：CTTCCAGATAACTGCCGTCACTCCAGCGC。

Ku基因的PCR扩增引物如SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示。

SEQ ID NO.27：CTTCAGCCATACTTTTCATACTC；

SEQ ID NO.28：AGCTGGACACCGTTTAAACTCAATG。

ligD基因的PCR扩增引物如SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示。

SEQ ID NO.29：TCTGTTGTTTGTCGGTGAACTG；

SEQ ID NO.30：CTGGTATTGGCACAAACCTGAT。

反应程序如下：

预变性：96℃，6min；

循环扩增：94℃，30s；58℃，30s；72℃，50/120s；循环35次；

循环外延伸：72℃，5min。

扩增产物于4℃保存。

其中，扩增lacZ和Ku基因，PCR延伸时间为50s；扩增ligD基因，PCR延伸时间为120s。

lacZ基因的扩增结果如图1所示，Ku基因的扩增结果如图2所示，ligD基因的扩增结果如图3所示，由上述图片可以看出，挑取的192个菌株中共有132个克隆的lacZ、Ku和ligD基因均扩增成功。

将lacZ、Ku和ligD基因均PCR扩增成功的克隆对应的PCR产物纯化后进行Sanger测序分析，lacZ基因的PCR产物使用SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26进行测序，Ku基因的PCR产物使用SEQ ID NO.28进行测序，ligD基因的PCR产物使用SEQ ID NO.30进行测序。

测序结果显示，132个克隆的lacZ基因均发生基因编辑，有不同长度的序列缺失或插入，132个克隆对应的Ku+ligD组合的结果如表1所示：

表1

由表1可知，共有24种Ku+ligD组合可以作为大肠杆菌的NHEJ系统，其中Mno-Ku+Mfo-ligD频数最高，达到32，Mbr-Ku+Mfo-ligD频数为18，均高于现有文献报道的Msm-Ku+Msm-ligD组合频数，表明Mno-Ku+Mfo-ligD、Mbr-Ku+Mfo-ligD作为大肠杆菌NHEJ系统，基因编辑效率优于Msm-Ku+Msm-ligD。此外，Mno-Ku+Msm-ligD频数和Msm-Ku+Msm-ligD相近。

实施例4计算NHEJ系统末端连接效率

本实施例分别以Mno-Ku+Mfo-ligD、Mbr-Ku+Mfo-ligD、Mno-Ku+Msm-ligD以及Msm-Ku+Msm-ligD作为大肠杆菌的NHEJ系统，计算四种NHEJ系统的连接效率，包括如下步骤：

(1)参考“实施例2”，使用BsaⅠ分别酶切pDual-Cas9-Parental质粒以及Mno-Ku、Mbr-Ku和Msm-Ku蛋白的CDS编码序列，使用T4 DNA连接酶分别将Mno-Ku、Mbr-Ku和Msm-Ku蛋白的CDS编码序列连接到pDual-Cas9-Parental质粒，最终得到pDual-Cas9-Mno-Ku、pDual-Cas9-Mbr-Ku和pDual-Cas9-Msm-Ku质粒，然后使用BbsⅠ分别酶切pDual-Cas9-Mno-Ku、pDual-Cas9-Mbr-Ku和pDual-Cas9-Msm-Ku质粒以及Mfo-ligD和Msm-ligD蛋白的CDS编码序列，通过T4 DNA连接酶分别将Mfo-ligD和pDual-Cas9-Mno-Ku、Mfo-ligD和pDual-Cas9-Mbr-Ku、Msm-ligD和pDual-Cas9-Mno-Ku、Msm-ligD和pDual-Cas9-Msm-Ku进行连接，最终得到pDual-Cas9-Mno-Ku+Mfo-ligD、pDual-Cas9-Mbr-Ku+Mfo-ligD、pDual-Cas9-Mno-Ku+Msm-ligD以及pDual-Cas9-Msm-Ku+Msm-ligD质粒。

(2)将pDual-Cas9-Mno-Ku+Mfo-ligD、pDual-Cas9-Mbr-Ku+Mfo-ligD、pDual-Cas9-Mno-Ku+Msm-ligD以及pDual-Cas9-Msm-Ku+Msm-ligD质粒分别电转MG1655大肠杆菌感受态细胞，涂布卡那霉素抗性LB平板，30℃培养过夜。

(3)分别挑取单克隆至LB培养基于30℃、220rpm条件下培养，当菌液OD₆₀₀值达到0.6时，按照标准的电转感受态细胞制备方法制备感受态细胞。

(4)使用EcoRⅤ限制酶酶切pUC57-Amp质粒。

酶切反应体系如下：

37℃反应1h，反应结束后使用磁珠对酶切产物进行纯化。

(5)分别电转50ng pUC57-Amp质粒以及50ng EcoRⅤ酶切后的pUC57-Amp质粒至步骤(3)制备的的100μL感受态细胞，加入500μL SOC培养基震荡培养，吸取1μL电转pUC57-Amp质粒的菌液至100μL LB培养基、100μL电转EcoRⅤ限制酶酶切后的pUC57-Amp质粒的菌液，涂布卡那霉素、氨苄青霉素LB平板，30℃培养过夜。同时将50ng EcoRⅤ酶切的pUC57-Amp质粒电转100μL MG1655感受态细胞，加入500μL SOC培养基震荡培养，菌液离心后全部涂布氨苄青霉素LB平板，30℃培养过夜(作为对照)。

(6)平板菌落生长情况如图4所示，统计每个平板的克隆数，计算NHEJ系统的连接效率，计算公式为：转化1ng EcoRⅤ酶切的pUC57-Amp质粒的克隆数与转化1ng pUC57-Amp质粒的克隆数的比值。

连接效率计算结果如表2所示。

表2

由表2可知，Mno-Ku+Mfo-ligD、Mbr-Ku+Mfo-ligD和Mno-Ku+Msm-ligD作为NHEJ系统，末端连接效率分别是Msm-Ku+Msm-ligD系统的4.6倍、2.5倍以及1.5倍，连接效率高，应用范围广。

实施例5使用筛选的NHEJ系统对大肠杆菌进行基因编辑

本实施例以Mno-Ku+Mfo-ligD、Mbr-Ku+Mfo-ligD和Mno-Ku+Msm-ligD分别作为大肠杆菌的NHEJ系统，对大肠杆菌的pcnB基因进行基因编辑，包括如下步骤：

(1)将pDual-Cas9-Mno-Ku+Mfo-ligD、pDual-Cas9-Mbr-Ku+Mfo-ligD以及pDual-Cas9-Mno-Ku+Msm-ligD质粒分别电转MG1655大肠杆菌感受态细胞，涂布卡那霉素抗性LB平板，30℃培养过夜。

(2)分别挑取单克隆至LB培养基于30℃、220rpm条件下培养，当菌液OD₆₀₀值达到0.6时，按照标准的电转感受态细胞制备方法制备感受态细胞。

(3)使用SpeⅠ限制酶酶切pDual-sgRNA-lacZ质粒。

酶切反应体系如下：

基因合成pcnB-sgRNA-for-Gibson序列，序列如SEQ ID NO.31所示。

SEQ ID NO.31(pcnB)：

tttaacttgctatttctagctctaaaacGGTTCACGCGCATATCGTTAactagtattatacctaggactgagctagctgtca。

使用Gibson Master Mix试剂盒将SpeⅠ酶切后的pDual-sgRNA-lacZ质粒和pcnB-sgRNA-for-Gibson序列进行连接反应，连接反应体系如下：

反应条件为50℃连接反应1h。

连接产物转化Top10感受态细胞，涂布氨苄青霉素抗性LB平板，37℃培养过夜，次日挑8个单克隆测序，将测序正确的质粒命名为pDual-sgRNA-pcnB。

(4)分别电转pDual-sgRNA-pcnB质粒至步骤(2)制备的三种电转感受态细胞，涂布卡那霉素、氨苄青霉素的LB平板，30℃培养过夜。

(5)挑单克隆至LB平板培养8小时，通过菌落PCR扩增pcnB基因，PCR扩增体系及反应程序参考实施例3的步骤(4)，延伸时间为50s。

pcnB基因的PCR扩增引物如SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33所示。

SEQ ID NO.32：GCCGCAAGGTGCTAAGCCGCGAGGAAAG；

SEQ ID NO.33：CAGGGCAGCATTGACCTGCTCCAGC。

PCR扩增结果如图5所示，将扩增成功的PCR产物纯化后进行Sanger测序分析。

pcnB基因的PCR产物使用SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33进行测序，测序结果显示：所有克隆的pcnB基因均出现不同长度的序列缺失或插入，基因编辑后的pcnB部分测序结果比对结果如下：

/>

/>

/>

/>

/>

其中，pcnB-1、pcnB-2和pcnB-3：转化pDual-Cas9-Mno-Ku+Mfo-ligD质粒的pcnB基因的编辑后的序列；

pcnB-4、pcnB-5和pcnB-6：转化pDual-Cas9-Mbr-Ku+Mfo-ligD质粒的pcnB基因的编辑后的序列；

pcnB-7、pcnB-8和pcnB-9：转化pDual-Cas9-Mno-Ku+Msm-ligD质粒的pcnB基因的编辑后的序列；

pcnB-Ref：MG1655大肠杆菌pcnB基因原始序列。

上述实验结果证明本发明筛选的Mno-Ku+Mfo-ligD、Mbr-Ku+Mfo-ligD以及Mno-Ku+Msm-ligD可以作为大肠杆菌的NHEJ系统，并用于大肠杆菌基因编辑中。

综上所述，本发明通过使大肠杆菌获得有效NHEJ系统的高通量筛选工具，可以迅速筛选出在大肠杆菌中有效的NHEJ系统，末端连接效率计算实验证明所述NHEJ系统具有良好的末端连接效率。本发明成功将外源NHEJ系统引入大肠杆菌，并可以进行高效的基因编辑，具有实际应用的价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 苏州金唯智生物科技有限公司

<120> 一种使大肠杆菌获得有效NHEJ系统的高通量筛选工具在大肠杆菌基因编辑中

的应用

<130> 2021

<160> 37

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 9687

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaacagacga agaatccatg ggtatggaca tgccgctcgc cttccatggg tatggacagt 60

tttccctttg atatgtaacg gtgaacagtt gttctacttt tgtttgttag tcttgatgct 120

tcactgatag atacaagagc cataagaacc tcagatcctt ccgtatttag ccagtatgtt 180

ctctagtgtg gttcgttgtt tttgcgtgag ccatgagaac gaaccattga gatcatactt 240

actttgcatg tcactcaaaa attttgcctc aaaactggtg agctgaattt ttgcagttaa 300

agcatcgtgt agtgtttttc ttagtccgtt atgtaggtag gaatctgatg taatggttgt 360

tggtattttg tcaccattca tttttatctg gttgttctca agttcggtta cgagatccat 420

ttgtctatct agttcaactt ggaaaatcaa cgtatcagtc gggcggcctc gcttatcaac 480

caccaatttc atattgctgt aagtgtttaa atctttactt attggtttca aaacccattg 540

gttaagcctt ttaaactcat ggtagttatt ttcaagcatt aacatgaact taaattcatc 600

aaggctaatc tctatatttg ccttgtgagt tttcttttgt gttagttctt ttaataacca 660

ctcataaatc ctcatagagt atttgttttc aaaagactta acatgttcca gattatattt 720

tatgaatttt tttaactgga aaagataagg caatatctct tcactaaaaa ctaattctaa 780

tttttcgctt gagaacttgg catagtttgt ccactggaaa atctcaaagc ctttaaccaa 840

aggattcctg atttccacag ttctcgtcat cagctctctg gttgctttag ctaatacacc 900

ataagcattt tccctactga tgttcatcat ctgaacgtat tggttataag tgaacgatac 960

cgtccgttct ttccttgtag ggttttcaat cgtggggttg agtagtgcca cacagcataa 1020

aattagcttg gtttcatgct ccgttaagtc atagcgacta atcgctagtt catttgcttt 1080

gaaaacaact aattcagaca tacatctcaa ttggtctagg tgattttaat cactatacca 1140

attgagatgg gctagtcaat gataattact agtccttttc ctttgagttg tgggtatctg 1200

taaattctgc tagacctttg ctggaaaact tgtaaattct gctagaccct ctgtaaattc 1260

cgctagacct ttgtgtgttt tttttgttta tattcaagtg gttataattt atagaataaa 1320

gaaagaataa aaaaagataa aaagaataga tcccagccct gtgtataact cactacttta 1380

gtcagttccg cagtattaca aaaggatgtc gcaaacgctg tttgctcctc tacaaaacag 1440

accttaaaac cctaaaggct taagtagcac cctcgcaagc tcggttgcgg ccgcaatcgg 1500

gcaaatcgct gaatattcct tttgtctccg accatcaggc acctgagtcg ctgtcttttt 1560

cgtgacattc agttcgctgc gctcacggct ctggcagtga atgggggtaa atggcactac 1620

aggcgccttt tatggattca tgcaaggaaa ctacccataa tacaagaaaa gcccgtcacg 1680

ggcttctcag ggcgttttat ggcgggtctg ctatgtggtg ctatctgact ttttgctgtt 1740

cagcagttcc tgccctctga ttttccagtc tgaccacttc ggattatccc gtgacaggtc 1800

attcagactg gctaatgcac ccagtaaggc agcggtatca tcaacggggt ctgacgctca 1860

gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac 1920

ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac 1980

ttggtctgac agttacgttt ccaaccaatt aaccaattct gattagaaaa actcatcgag 2040

catcaaatga aactgcaatt tattcatatc aggattatca ataccatatt tttgaaaaag 2100

ccgtttctgt aatgaaggag aaaactcacc gaggcagttc cataggatgg caagatcctg 2160

gtatcggtct gcgattccga ctcgtccaac atcaatacaa cctattaatt tcccctcgtc 2220

aaaaataagg ttatcaagtg agaaatcacc atgagtgacg actgaatccg gtgagaatgg 2280

caaaagctta tgcatttctt tccagacttg ttcaacaggc cagccattac gctcgtcatc 2340

aaaatcactc gcatcaacca aaccgttatt cattcgtgat tgcgcctgag cgagacgaaa 2400

tacgcgatcg ctgttaaaag gacaattaca aacaggaatc gaatgcaacc ggcgcaggaa 2460

cactgccagc gcatcaacaa tattttcacc tgaatcagga tattcttcta atacctggaa 2520

tgctgttttc ccggggatcg cagtggtgag taaccatgca tcatcaggag tacggataaa 2580

atgcttgatg gtcggaagag gcataaattc cgtcagccag tttagtctga ccatctcatc 2640

tgtaacatca ttggcaacgc tacctttgcc atgtttcaga aacaactctg gcgcatcggg 2700

cttcccatac aatcgataga ttgtcgcacc tgattgcccg acattatcgc gagcccattt 2760

atacccatat aaatcagcat ccatgttgga atttaatcgc ggcctcgagc aagacgtttc 2820

ccgttgaata tggctcataa caccccttgt attactgttt atgtaagcag acagttttat 2880

tgttcatgat gatatatttt tatcttgtgc aatgtaacat cagagatttt gagacacaac 2940

gtggctttcc ctgcagggtt tgcagtcaga gtagaataga agtatcaaaa aaagcaccga 3000

ctcggtgcca ctttttcaag ttgataacgg actagcctta ttttaacttg ctatgctgtt 3060

ttgaatggtt ccaacaagat tattttataa cttttataac aaataatcaa ggagaaattc 3120

aaagaaattt atcagccata aaacaatact taatactata gaatgataac aaaataaact 3180

actttttaaa agaattttgt gttataatct atttattatt aagtattggg taatattttt 3240

tgaagagata ttttgaaaaa gaaaaattaa agcatattaa actaatttcg gaggtcatta 3300

aaactattat tgaaatcatc aaactcatta tggatttaat ttaaactttt tattttagga 3360

ggcaaaaatg gataaaaaat acagtatcgg cttagatatt ggcactaata gcgtgggttg 3420

ggccgttatt accgatgaat ataaagttcc gagcaagaaa ttcaaagttc tgggtaatac 3480

cgatcgccac agtattaaga agaatctgat cggtgcactg ctgtttgata gcggcgagac 3540

agccgaagcc acacgtctga aacgtaccgc acgtcgccgt tatacccgtc gtaaaaatcg 3600

tatttgttac ctgcaagaga tttttagcaa tgaaatggcc aaagttgatg acagtttttt 3660

ccaccgtctg gaagaaagtt ttttagtgga agaagataag aaacacgaac gccatccgat 3720

cttcggcaac atcgttgacg aagttgccta ccacgaaaag taccctacaa tttatcacct 3780

gcgcaaaaaa ctggttgata gcaccgacaa agccgacctg cgcttaatct atctggccct 3840

ggcccacatg atcaaatttc gcggccactt tctgattgaa ggtgacttaa accctgataa 3900

cagtgacgtt gacaaattat tcattcagtt agttcaaacc tataaccagc tgtttgaaga 3960

aaacccgatc aacgccagtg gtgttgacgc aaaagccatc ctgagtgccc gcctgagtaa 4020

aagccgccgt ttagaaaact taatcgcaca attaccgggt gagaagaaaa atggcttatt 4080

cggcaacctg attgccctga gtctgggctt aacccctaat ttcaaaagta acttcgacct 4140

ggccgaggac gccaagttac aactgagtaa agacacttat gatgacgatc tggataattt 4200

actggcccaa atcggtgacc agtacgccga tctgttttta gccgccaaga atttaagcga 4260

tgccatcctg ctgagtgata ttctgcgtgt gaatacagaa attacaaaag ccccgctgag 4320

cgcaagcatg attaagcgct atgacgagca ccatcaggac ttaaccctgc tgaaggcctt 4380

agttcgccaa cagctgccgg agaagtataa agaaatcttt tttgatcaga gcaagaacgg 4440

ttacgccggt tatattgacg gcggtgccag ccaggaagag ttttacaagt tcatcaaacc 4500

gatcctggag aaaatggatg gcacagagga actgttagtg aagctgaacc gtgaagattt 4560

actgcgcaag cagcgcacct tcgacaatgg cagcattccg catcaaattc atctgggtga 4620

attacatgcc attttacgtc gtcaggaaga tttttatccg ttcctgaaag acaaccgtga 4680

gaagatcgag aagattctga ccttccgcat cccgtactat gtgggcccgt tagcacgcgg 4740

taacagccgt ttcgcatgga tgacacgtaa aagtgaagag acaattaccc cttggaattt 4800

cgaagaggtg gtggacaaag gtgccagcgc ccagtctttt atcgagcgca tgacaaactt 4860

cgataagaat ttacctaatg agaaagtttt acctaaacat agcctgctgt atgaatactt 4920

cacagtttac aatgagttaa ccaaagtgaa atatgtgacc gaaggtatgc gtaaaccggc 4980

cttcttaagc ggcgagcaaa agaaggcaat cgtggatctg ttattcaaaa ccaatcgcaa 5040

agttacagtg aaacaactga aagaggacta tttcaagaaa attgaatgct tcgatagcgt 5100

ggagattagt ggcgtggagg accgttttaa tgccagctta ggtacatacc atgatctgtt 5160

aaaaattatt aaagataaag attttctgga taacgaagaa aatgaagata ttctggaaga 5220

tatcgtgctg accctgaccc tgtttgaaga tcgcgaaatg atcgaagagc gtctgaaaac 5280

ctatgcccat ctgttcgacg acaaagtgat gaaacagctg aagcgtcgcc gctacaccgg 5340

ttggggtcgc ttaagtcgca agctgatcaa cggtattcgt gacaaacaga gcggtaaaac 5400

catcctggat tttctgaaaa gcgatggttt cgccaaccgt aactttatgc agttaatcca 5460

tgacgatagc ctgacattta aagaagatat tcaaaaggcc caggttagcg gccaaggtga 5520

tagcttacac gaacacattg ccaatctggc aggcagtccg gccattaaaa aaggtatttt 5580

acaaaccgtt aaggtggttg atgaattagt gaaagtgatg ggccgccaca agcctgaaaa 5640

tatcgtgatt gaaatggccc gtgagaacca gaccacccaa aaaggccaga aaaacagtcg 5700

tgaacgcatg aagcgtatcg aagaaggtat taaagaactg ggcagccaaa tcctgaaaga 5760

gcatccggtt gagaacacac agttacaaaa cgaaaaactg tatttatact atctgcaaaa 5820

tggccgcgat atgtatgtgg accaggagct ggatattaac cgcctgagtg attatgatgt 5880

tgatcacatt gttccgcagt cttttttaaa ggatgatagc atcgacaata aggtgctgac 5940

ccgtagcgac aagaatcgcg gcaagagcga taacgttccg agcgaagaag ttgtgaagaa 6000

aatgaaaaat tactggcgcc agttactgaa cgccaagctg atcacccaac gcaagttcga 6060

caatctgacc aaagcagagc gtggtggttt aagcgaactg gacaaggccg gcttcatcaa 6120

gcgtcagtta gtggaaaccc gtcagatcac aaaacacgtg gcccagattc tggatagccg 6180

tatgaatacc aaatacgacg agaatgataa actgattcgt gaagttaaag ttatcaccct 6240

gaagagtaag ctggtgagcg acttccgtaa agactttcag ttctacaaag ttcgcgaaat 6300

taataattat catcatgcac atgatgcata cctgaacgcc gttgttggca cagccctgat 6360

caagaagtat cctaaactgg aaagcgagtt tgtttatggc gattacaagg tgtatgatgt 6420

gcgcaaaatg atcgccaaga gtgagcagga aatcggtaaa gccaccgcca aatacttttt 6480

ctacagtaac attatgaatt ttttcaagac cgaaatcacc ttagcaaacg gcgagatccg 6540

caaacgcccg ctgatcgaaa ccaatggtga aaccggcgag attgtttggg ataagggtcg 6600

cgactttgca accgttcgca aggtgctgtc tatgcctcag gtgaatattg ttaagaaaac 6660

cgaagtgcaa accggcggct ttagtaaaga aagcatcctg ccgaaacgca atagcgacaa 6720

actgattgcc cgtaaaaaag actgggaccc taagaagtac ggcggttttg atagccctac 6780

cgtggcatac agcgttctgg ttgtggccaa agtggaaaag ggcaagagta agaagctgaa 6840

gagtgttaaa gagctgctgg gcatcaccat catggaacgt agcagcttcg agaaaaatcc 6900

gatcgatttc ctggaggcaa aaggttacaa agaagttaaa aaagatttaa tcatcaaatt 6960

acctaaatac agcctgttcg agctggagaa tggtcgcaaa cgtatgctgg caagcgccgg 7020

cgaattacaa aaaggtaatg aactggcact gccgagcaag tacgttaact tcttatattt 7080

agcaagccat tacgagaaat taaaaggtag tccggaggat aacgagcaga agcagttatt 7140

tgttgagcag cataaacatt acctggatga gattattgag cagattagtg agttcagcaa 7200

gcgcgtgatt ctggcagatg ccaacctgga taaggttctg agcgcctata acaaacaccg 7260

cgacaagccg attcgcgaac aagcagagaa cattattcat ctgttcacac tgaccaacct 7320

gggcgccccg gcagccttca agtattttga taccaccatc gaccgcaaac gctatacaag 7380

caccaaagag gttctggacg ccaccctgat tcaccaaagc attaccggct tatatgaaac 7440

ccgcatcgac ctgagtcagt taggcggtga ctaaagtata ttttagatga agattatttc 7500

ttaatctaga catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 7560

ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgcatcgat ttattatgac aacttgacgg 7620

ctacatcatt cactttttct tcacaaccgg cacggaactc gctcgggctg gccccggtgc 7680

attttttaaa tacccgcgag aagtagagtt gatcgtcaaa accaacattg cgaccgacgg 7740

tggcgatagg catccgggtg gtgctcaaaa gcagcttcgc ctggctgata cgttggtcct 7800

cgcgccagct taagacgcta atccctaact gctggcggaa aagatgtgac agacgcgacg 7860

gcgacaagca aacatgctgt gcgacgctgg cgatatcaaa attgctgtct gccaggtgat 7920

cgctgatgta ctgacaagcc tcgcgtaccc gattatccat cggtggatgg agcgactcgt 7980

taatcgcttc catgtgccgc agtaacaatt gctcaagcag atttatcgcc agcagctccg 8040

aatagcgccc ttccccttgc ccggcgttaa tgatttgccc aaacaggtcg ctgaaatgcg 8100

gctggtgcgc ttcatccggg cgaaagaacc ccgtattggc aaatattgac ggccagttaa 8160

gccattcatg ccagtaggcg cgcggacgaa agtaaaccca ctggtgatac cattcgcgag 8220

cctccggatg acgaccgtag tgatgaatct ctcctggcgg gaacagcaaa atatcacccg 8280

gtcggcaaac aaattctcgt ccctgatttt tcaccacccc ctgaccgcga atggtgagat 8340

tgagaatata acctttcatt cccagcggtc ggtcgataaa aaaatcgaga taaccgttgg 8400

cctcaatcgg cgttaaaccc gccaccagat gggcattaaa cgagtatccc ggcagcaggg 8460

gatcattttg cgcttcagcc atacttttca tactcccgcc attcagagaa gaaaccaatt 8520

gtccatattg catcagacat tgccgtcact gcgtctttta ctggctcttc tcgctaacca 8580

aaccggtaac cccgcttatt aaaagcattc tgtaacaaag cgggaccaaa gccatgacaa 8640

aaacgcgtaa caaaagtgtc tataatcacg gcagaaaagt ccacattgat tatttgcacg 8700

gcgtcacact ttgctatgcc atagcatttt tatccataag attagcggat cctacctgac 8760

gctttttatc gcaactctct actgtttctc catacccgtt tttttgggaa ttcgagctct 8820

aaggaggtta taaaaaagag accattccat tccggtctca aagcttgggc ccgaacaaaa 8880

actcatctca gaagaggatc tgaatagcgc cgtcgaccat catcatcatc atcattgagt 8940

ttaaacggtg tccagcttgg ctgttttggc ggatgagaga agattttcag cctgatacag 9000

attaaatcag aacgcagaag cggtctgata aaacagaatt tgcctggcgg cagtagcgcg 9060

gtggtcccac ctgaccccat gccgaactca gaagtgaaac gccgtagcgc cgatggtagt 9120

gtggggtgtc cccatgcgag agtagggaac tgccaggcat caaataaaac gaaaggctca 9180

gtcgaaagac tgggcctttc gttttatctg ttgtttgtcg gtgaactgga tccttactcg 9240

agaagaaacc aattgtccat attgcatcag acattgccgt cactgcgtct tttactggct 9300

cttctcgcta accaaaccgg taaccccgct tattaaaagc attctgtaac aaagcgggac 9360

caaagccatg acaaaaacgc gtaacaaaag tgtctataat cacggcagaa aagtccacat 9420

tgattatttg cacggcgtca cactttgcta tgccatagca tttttatcca taagattagc 9480

ggatcctacc tgacgctttt tatcgcaact ctctactgtt tctccatacc cgtttttttg 9540

ggaattcgag ctctaaggag gttataaaaa aagtcttcat tccattccga agacaacaca 9600

aagcatcttc tgttgagtta agaacgagta tcgagatggc acatagcctt gctcaaattg 9660

gaatcaggtt tgtgccaata ccagtag 9687

<210> 2

<211> 2403

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaaaagct tctgcaggtc gactctagag aattcaaaaa 180

aagcaccgac tcggtgccac tttttcaagt tgataacgga ctagccttat tttaacttgc 240

tatttctagc tctaaaactc gttttacaac gtcgtgacac tagtattata cctaggactg 300

agctagctgt caaggatcca gcatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga 360

aaataccgca tcaggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca 420

ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 480

taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc 540

agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 600

cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac 660

tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc 720

tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata 780

gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc 840

acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca 900

acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag 960

cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta 1020

gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg 1080

gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc 1140

agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt 1200

ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa 1260

ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat 1320

atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga 1380

tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac 1440

gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg 1500

ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg 1560

caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt 1620

cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct 1680

cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat 1740

cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta 1800

agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca 1860

tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat 1920

agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac 1980

atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa 2040

ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt 2100

cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg 2160

caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat 2220

attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt 2280

agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct 2340

aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc 2400

gtc 2403

<210> 3

<211> 982

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cccagtcacg acggtctcaa aaaatgaatc gcacaccgtc tttacacacc aaagagaaaa 60

aaggcttcat cgacatgcac accatgtgga aaggcagcat cagctttggt ttagtgaaca 120

tcccgattaa gctgtacgca gccaccgaag ataaagatat taaattacgc tctttacata 180

aagaagatca tgccccgatt aaatatgaaa aagtgtgtac caactgcgag aaaactttaa 240

gccccgatga gatcgtgaaa ggctatgagt atgtgaaagg caagtatgtg gtgctgaccg 300

atgaggatct gaagagtctg aagcaagaac atgaggaaaa ggccgttgag atcgtggact 360

tcgttcagct gcaagaaatc gacccgatct acttcaaccg cagctacttt gtgggccccg 420

gtgataacgg caccaaagcc tataccttac tgcgcgaagc tttacgcagc accggtaaaa 480

tcggcattgc caacatgacc attcgcagca agcaacagct ggccattctg cgtgtgtacg 540

agaactgcat cgtgatggag agcatccatt atccggacga agtgcgtagc gcagcacaag 600

ttccgggtgt tccggaccag agcaacgtga acgacaaaga gctgcagacc gcaattactt 660

taattgatga gctgaccgcc aagttcgagc cggaaaaata cgaggacacc taccgtcaag 720

ctttactgca gcgcgtgaac gataagctgg aaaacaagga aaccgcagtg accccggata 780

aagcaccgcc gcgcgaagat gttatcgatc tggtgagtgc tttacaagct agcattgatc 840

gtacccgtcg cccgaatcgt gaaacacccg ctgcagcacc ggcacaagct gcagaaccga 900

agggtgccgg tgacaaaaaa cagaaaacca cccgcaaaaa agcaagcggc accagctaaa 960

agccgagacc tcctgtgtga aa 982

<210> 4

<211> 1072

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cccagtcacg acggtctcaa aaaatggccc atatgatctg gaaaggcgcc attagttttg 60

gtttagttca cgtgccggtt cagctgtatc cggccacccg tagcgagaaa gtgggcttca 120

atttactgga caaacgcacc atcgatccgg tgggttataa acagatcaat aaacgtaccg 180

gtaaagacgt gacccgcgat aacattgtgc gcggttttga atatgaaaaa gataaatatg 240

tggtgctgac cgatgaagaa atccgcgccg ccaatccgga aagtacccag accgtggata 300

ttctggcctt cgttgatgca ccggacatca gctttctgta tttagatacc ccgtactttc 360

tgacaccgga ccgcaaaggc gaaaaagtgt acgcactgct gcgtgaggcc atgaaaagta 420

gcggcaaagt tggtgtggcc agcgttgttc tgcacaacaa acagcatctg gccgctttaa 480

ttcccgttgg tccggtttta gctttaaata cactgcgctg ggcagaagaa gtgcgtgact 540

ttgatgagtt taaactgccg gccgagggtg caaaagccgc tggtgttagc gcccgcgaac 600

tggacatggc ccagaaactg atcgatgaca tgagcgacac ttgggatccg agtaagtatc 660

acgacacctt tcgcgacgac atcatggctt tagttgatcg taaggttcgc gagggcaaaa 720

ccgaagagat caccgatatt gaagccccgc gtgaggcacg tcaaagcgca gatattctgg 780

atttaagcga tctgctgaag cgttctttag gtcgcggcaa aaataaaccg gccagcggca 840

gtcgcaaacg tgccgcagat gatgaagccg acgacggcaa tgccgatgca gaagatgatg 900

gcggtagcac cccggcacgc aagaaacctc gcacagcccg cagtaccggt agcgcacgta 960

caagccgtag cagcagcggc agtagtagcg gtggtcgcgc agcaaccaaa agcacaaccg 1020

ccgcacgcaa acgtcgtgca gcagcctaaa agccgagacc tcctgtgtga aa 1072

<210> 5

<211> 985

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cccagtcacg acggtctcaa aaaatgcgca gcatctggaa aggcagtatc gcattcggtt 60

tagttaacgt gccggtgaaa gtttacagcg ccaccgagga tcacgacatc aagttccacc 120

aagttcatgc caaagacaat ggccgcatcc gctataaacg cgtgtgcgaa gtgtgcggcg 180

aagtggtgga atttcgcgat attaataaag cctatgaaag cgacgacggt cagatggtgg 240

tgattaccga cgaggatatt gctactttac cggaagaacg tagtcgcgag attgaggtgg 300

tggagtttat cccggccgaa caactggatc cgctgatgta cgataagagc tactttctgg 360

agccggatag caaaagcagc aagagctacg tgctgctggc aaaaacttta gccgaaactg 420

aacgcgttgc cattgtgcac ttcagcttac gcaataaaac ccgtttagca gcactgcgcg 480

ttaaggattt cagcaagcgc aacgtgatgg tgatccatac tttactgtgg ccggatgaaa 540

ttcgtgaccc ggattttccg gtgctggaca aggaagtgga gatcaaaccg gccgaactga 600

agatggccgg ccaagttgtg gaaagcatga ccgacgattt ccacccggac cagtttcgcg 660

atgattatca agctcagctg tatgagctgg ttcaagccaa actggaaggc ggcgaagcat 720

tcagtgtgga agaacagccg gccgatctgg atgaaaccga ggatgtttct gatctgctgg 780

ccaagctgga agccagcgtg aaagcccgta aaggcggtgg tagcgcaaaa agcgataagg 840

acagcgacga ggatagcgat aaggatagcg atgacgagga agcaaagccg gccaaaaagg 900

caccggctaa aaaagcagca gccaagaaag ccccggctaa aaaagccgcc gccaaaaaat 960

aaaagccgag acctcctgtg tgaaa 985

<210> 6

<211> 1039

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cccagtcacg acggtctcaa aaaatgcgcg caatttggaa aggcgccgtt agctttggtt 60

tagttagcat tggcgtgaaa gtgtacagcg ccaccgagga aaaggacatc cgtttccacc 120

aagttcatcg tgaagatggc ggccgcatcc gctataagcg cacatgtagc gtgtgcggcg 180

aagaggttac ctacgacgac atcgccaaag gctatgacat tggcggtggt gagatggtga 240

ttttaaccga cgaggatttt gcagatctgc cgctgagcac cagtcatgcc atcgatgtgc 300

tggaattcgt gccggccgag caagtggacc cgattttata caataaggcc tactttttag 360

agccggaggg cagcgcaacc aaaccgtacg ttctgctgcg tgacgcttta agcgatagcg 420

aacgcgtggc cattgtgaag gttgcactgc gtcagcgcga acagttagcc actttacgcg 480

ttcgtgaggg tgtgctgctg ctgaacacaa tgctgtggcc ggatgaaatt cgccgcccgg 540

atttcggctt tctggatgag gatctgaagg tgcgtccgcc ggaactggca atggcaagct 600

ctttaatcga tagcatggct ggtgaatttg aaccggatgc cttcaccgat gactatcgcg 660

ccgctttaca agaagttatt gacgcaaaag tggaaggccg tgaagttgtg cagccggaag 720

aagaagaggc cgcacccgct gccgcagttg atctgatggc cgcactgaaa gccagcgttg 780

aacgtgcacg tgcagcccgc ggtgaagcac ctagtggtgg cggtgccgaa ccgacaccga 840

ttagcagcgc acgcagcgct aaaaaagctg ccaaaaaagc ccccgctaaa aaggccgaac 900

cggccaaaaa gaccaccgcc aaaaaggcac cggcaaagaa aaccgcagcc aagaaagccg 960

agccggctaa gaaaactgcc gccaaaaaga ctcccgctaa gaaaaagacc gcctaaaagc 1020

cgagacctcc tgtgtgaaa 1039

<210> 7

<211> 1009

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cccagtcacg acggtctcaa aaaatgcgca gtatttggaa gggtagcatt gccttcggtt 60

tagtgaatgt tccggtgaag gtgtatagcg cccagcaaga tcacgacgtg aagttccacc 120

aagttcacgc caaagataat ggccgcatcc gctataagcg tgtgtgcgaa atcgacggtg 180

aagaagttga gtatcgcgat attgcccgcg cctatgaaag cgacgatggt cagaccgtga 240

tcatcacaga tgaggacatc gccacactgc cggaagagcg tagtcgcgag atcgaggtgc 300

tggaatttgt tccggccgcc gacattgacc cgatgatgta cgatcgcagc tactttttag 360

agccggaagg taaaagcagc aagagctacg tgctgctgac caaaacttta aaggaaaccg 420

atcgcgttgc catcgttcac tttgctttac gcaataagac acgtctggca gcactgcgcg 480

tgcaagattt cagcaagcgc gatgtgatgg tgatccagac tttactgtgg ccggatgaaa 540

tccgtgatcc ggatttcccg gttctggaca aagaagtgga tattaaaccg gcagaactga 600

aaatggccac acaagttgtg gacagcatga ccgacgactt taacccggat cgctatcacg 660

acgactatca agaacagctg cgcgaactga ttcaagctaa actggaaggc ggtgaagcct 720

ttacaacaga ggaacagccg caagaactgg acgaaaccga ggatgtttct gatctgctgg 780

caaaactgga agccagcgtt aaagcacgcc gcgaaggtcg tggtggtagc aaaagcagcg 840

acgacgacga taaacccgcc aaaaaagctc ccgctaagaa atctgccgct aagaaaactg 900

ccgccaagaa aactccggct aaaaaagctg ccaagaagag taccgccaaa aagagtccgg 960

ccaagaagag cgcagccaaa aaataaaagc cgagacctcc tgtgtgaaa 1009

<210> 8

<211> 1033

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cccagtcacg acggtctcaa aaaatgaatc gtgcagtgcg ccataccggt ctgatgcgca 60

gcatctggaa aggtagcatc gcatttggtt tagtgaatgt gccggtgaaa gtgtacagcg 120

ccaccgaaga tcacgatatc aaatttcatc aagttcatgc caaggataac ggccgcatcc 180

gttacaaacg tgtgtgcgag gtgtgcggcg aagtggtgga atatcgtgat atcaataaag 240

cctttgaaag tgatgacggc cagatggtgg tgattaccga tgaggacatc gcaactttac 300

ccgaagaacg cagccgtgag attgaagtgg tggagttcat cccggcagag caactggatc 360

cgctgatgta cgacaagagc tacttcttag agccggacag caagagcagc aagagttatg 420

tgctgctggc caaaacctta gccgaaaccg accgcatcgc aatcgtgcac ttttctttac 480

gcaataaaag ccgtttagca gctttacgcg tgaaagactt cagcaagcgc gacgtgatga 540

tgattcacac tttactgtgg ccggatgaga tccgcgaccc ggattttccg attttagata 600

aagaagttca gatcaaaccg gccgagctga aaatggctgg tcaagttgtg gagagcatga 660

ccgacgactt caagcccgat ctgtaccacg atgactacca agaacagtta cgtgaactgg 720

tgcaagctaa actggaaggt ggcgaagcat tcagcgtgga agaacagccg gccgaactgg 780

atgaaggtac cgaggacgtg agcgatctgt tagccaagct ggaagcaagc gtgaaagccc 840

gtaagggcgg caaaagcgat agcaaggacg atagcgacag cgagagcgac agcaaagaga 900

gcaaaagcga cagtaagccg gccaaaaaag cccccgctaa gaaagccgca gccaagaaaa 960

gcaccgctaa aaaagccccg gctaaaaaag cagccgccaa gaaatcttaa aagccgagac 1020

ctcctgtgtg aaa 1033

<210> 9

<211> 868

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cccagtcacg acggtctcaa aaaatgcgtg ccatttggac cggcagcatt gcatttggtt 60

tagtgaatgt gccggtgaaa gtttacagcg ccaccgcaga tcacgatatt cgtttccacc 120

aagttcatgc caaggataat ggccgcatcc gctataaacg cgtttgcgag gcatgtggcg 180

aagtggtgga ttatcgcgat ctggcacgtg cctatgagag cggtgatggc cagatggtgg 240

ccattaccga tgacgacatt gcctctttac cggaagagcg tagccgcgaa attgaggtgc 300

tggagttcgt tccggccgcc gatgtggacc cgatgatgtt cgaccgcagc tattttttag 360

aaccggacag caagagcagc aaaagctacg tgttactggc caaaacttta gccgaaaccg 420

atcgtatggc catcgtgcat tttactttac gcaataaaac ccgtttagcc gctttacgcg 480

tgaaagactt cggcaaacgt gaagtgatga tggtgcacac cttactgtgg ccggatgaga 540

ttcgcgatcc ggattttccg gtgctggacc agaaggtgga aatcaaaccg gccgagctga 600

aaatggctgg tcaagttgtg gatagcatgg cagacgactt taacccggat cgctatcacg 660

acacctatca agaacagctg caagaactga ttgatacaaa gctggagggt ggccaagctt 720

ttaccgccga agatcagccg cgtttactgg atgaaccgga ggatgtgagt gatctgctgg 780

ctaaactgga agcaagcgtg aaggcccgca gcaaagcaaa cagcaatgtg cctaccccgc 840

cgtaaaagcc gagacctcct gtgtgaaa 868

<210> 10

<211> 1000

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cccagtcacg acggtctcaa aaaatgcgca gcatctggaa aggcagcgtg gcctttggtt 60

tagttaatgt gccggtgaaa ctgtacagcg caaccgaaga gaaggacatc cgctttcatc 120

aagttcatgc ccaagatggt ggccgcatca aatataaacg cgtgtgcgat ctggacggcg 180

aggaagtgcc gtatgccgat attgccaaag cctacgaaag cgacgatggt cgcacaatca 240

tgctgaccga tgaggatttt gctcagctgc cggccagcag cagccgcgaa atcgatgttg 300

tgagctttgt gcctagtgac caagttgatc ccgttctgta tgataaaacc tactatctgg 360

agcccgctag caccagcacc aaagcctatg tgttactgcg ccagacttta gaacagaccg 420

accgtattgc catcgtgaac ttcgcactgc gccagaaaac ccgtttagca gctttacgtg 480

ttcgtgatga tgtgctggtg atccagacac tgctgtggcc ggatgaagtg cgcgccgcag 540

aatttgcctc tttagaggaa agcgtgagca ttaaaccggc cgaactgaag atggccagca 600

tgctggtgga tagtttcgcc gatgacttcc acccggagga ctataccgat gagtatcgcg 660

aagagctgca gcaactgatc gaagccaaac tggaaggcgg cgaagccttt gaaactccgg 720

aaaaaccgga tgaaggtgag gatgctgaag tggttgatct gctggcagct ctgcagcgca 780

gcgttgagcg ccataaaaaa gctggtgcaa gcaccggcga tgatagtggc gatggcgccg 840

atgatagtcc gaaaaagagc ccgcgcacca gcagcgcaaa aacccgcacc aaagccaccg 900

atgaaaccgg tgaccaagat aaagacgagg caaaaccgcc gacacgccgt cgtagtccgg 960

cacgtaaaac cggttaaaag ccgagacctc ctgtgtgaaa 1000

<210> 11

<211> 1069

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cccagtcacg acggtctcaa aaaatggtta atccggtgtg ggtgggcaca ctgatgtttg 60

gtcgcgtgcc ggtgggtgtg cgtttatata gcgcacgtga gcgtcgtggc ccggttctgc 120

accagtttga acgcggtacc gccgatcgca ttcgttatgt gcgcgtgaac gaacgtaccg 180

gcgaagaagt ggctggtgaa gatgtggtgc gtggtgcacg taccggcgtg gaggatgagt 240

acgttgtgct ggagccggaa gaactggaag aaattttacc gcatggtagc cgcacaatgg 300

aactgaccgg ctttttaagt caaggtgccg ttgacgcact gtggtacgcc agtacatact 360

atgtggcacc gcgtgccgcc gcagatgcca aagcctatca gctgctgtat accgctttag 420

aacagacccg ccgtaccggt gtggccacca tcgttctgcg cgatcgcgaa taccccgttc 480

tgatcgaacc gaatcgcggt gtgctgagcg ccagtacact gtggtggccg gatgaggttc 540

gcgaaccgga tgatgtgatg ccgcccgttg cccatgccgc actggccaag agcgaactgg 600

aactggcccg cgaactggtg cgtagtctga gcattgagtg ggatccggaa gattacagcg 660

acagctacgg ccagcgtctg acagaactgg tgcgcgcaaa agcacgtggc cgcaccttca 720

cccatcgtcc ggagcaagct gtgccgcccg aagatgccga tggtctgggt gaagcactgc 780

gccagtcttt acccgctcaa cgcacacgcg gtgcacgtag tcgtggccct cgtgcaagta 840

ccggtgcaga aggtgccggt cgcgcacgtg aacctcgtgg taccggtgca cgtggcgcac 900

gtgtggaacg tcgcggtgaa ggtcgcgcca ccaaacgcga actgctgcaa cgcgcaagcg 960

agctggatgt tcccggtcgt agcaaaatga gccgtgagca gctggaagaa gccgttggtt 1020

taaatggcgc cgaagcccgt cgttaaaagc cgagacctcc tgtgtgaaa 1069

<210> 12

<211> 1051

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cccagtcacg acggtctcaa aaaatggcac atatgatctg gaaaggcgcc atcagctttg 60

gtctggtgca tgtgccggtg cagctgtacc ccgctaccaa aagcgagaag gtgggcttta 120

atctgctgga caaacgcacc atcgacccga tcggctataa gcagatcaac aaacgcaccg 180

gcaaagacgt gacccgtgag aatatcgtgc gcggctttga atatgaaaaa gatcattatg 240

tggttctgag cgacgatgag atccgcagcg ccaatccgga gagcacccag accgtggaca 300

ttctggcctt tgtggatgcc accgatatca gctttttata tttagacaca ccgtattttt 360

taacaccgga tcgcaagggt gaaaaagtgt acgctttact gcgcgaagcc atgacagcca 420

gcggtaaaat cggtgtggcc agcgtggtgc tgcataataa acagcattta gccgcactga 480

ttcctctggg cccgatgctg gctttaaata ctttacgttg ggccgatgag gttcgcggtc 540

tggacgagtt taaagtgccg ccggaaggca tgaaagcagc cggtgtgagc gccaaagagc 600

tggatatggc taaaaaactg atttatgata tgtctgaaac ttgggatccg atgcagtatc 660

atgatacctt ccgcgacgac atcatggcac tggtggaacg caagattcaa gctggtaaaa 720

ccgaggaagt gaccgaagtg gaagccccgc acgaaagccg taaaagcgcc gacattttag 780

atctgagcga tctgctgaaa cgttctttag gccgtggcaa aggtaaacaa gctgcaactg 840

gtcgcaaacg cgctgccgat gaggatgagg atcagaccga tagcgaagcc gacgaggaac 900

ccgctgcacc ggcccgtaaa cgtgcacgtg caaccagcac cgcccgtagc cgtagcggta 960

gtggtggtag cgcccgcgtt accagcaaaa caaccgccac aagccgcaaa cgccgtgcag 1020

cagcctaaaa gccgagacct cctgtgtgaa a 1051

<210> 13

<211> 1177

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cccagtcacg acggtctcaa aaaatgcgcg ccatttggaa aggtgccatc gcctttggtt 60

tagtgaacgt gccggtgaaa gtgtacagtg caaccgagga ccacgatatc tctttacacc 120

aagttcacaa cgccgacggt ggtcgtatcc gctatcagcg ccgctgcgag gtgtgcagcc 180

aagtgattga ttacagcgac atcgagaagg catacgaaga ggatggtaaa accgtggtgt 240

taagcaagga tgagctgcaa gctattccgg ccgaaaacag ccacgaaatc gaggtggtgc 300

aatttgtgcc tagcgaacag ctggaaccga tgatgttcga gaagagctat tatctggaac 360

cggacagcaa gagcccgaaa gcctacgttc tgctgcgtcg cgctttagag gataccgatc 420

gcgtggccat tgtgcagttc gctttacgtg agaaaacccg tctgggcgct ttacgcatca 480

aagacgacgt gctggtgctg cagtctttac tgtggccgga tgaagttcgt gaggccaatt 540

tcccgtcttt agatgtgagc atcaagatca gcccgcaaga acgtgatatg agcgccgcac 600

tggttgaaag catggccgcc gacttcgacc cggaacactt caccgatgat tatcaagttc 660

agctgcgcca gctgatcgaa gccaaactgg aacaaggtga tgcactggac accgatgaaa 720

cttttggcgt tgaagccggt gagggtggca aaggtgaggt tatcgattta atggaagctt 780

taaaacgctc tttagatcgc aaacgcggtg gtggtagcgg tacagctggt agtggcagcg 840

gtgaagaagc agcagacagc gacgatgaag aagaaggcaa accggcccct aaacgtgcaa 900

ccgctggtaa aaccgccgca gccaaaagcg atggtaccaa gagtaccgcc gcacgtagca 960

ccgccgcaaa aactggtacc ggcaagaccg ccaccaagtc taccagcaaa gccgcagata 1020

ccaaaaccgg cgcagccaaa accaccgccg ccaaaagcac cgccaagtct accgccggca 1080

aaaccgcaga taaaccggca gccaagacca cagctggtaa agcaaccggc acccgcgcac 1140

gtaaaccggc ctaaaagccg agacctcctg tgtgaaa 1177

<210> 14

<211> 1884

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cccagtcacg acgaagacgc aaaaatggca ttcaccatgc agccggtgtt aacaagcagc 60

ccgcctatcg gtgcagagtg gcgctatgag gtgaagtacg acggttaccg ctgcattctg 120

cgtattcata gcagcggcgt gactttaacc agtcgtaacg gtgttgagct gagcagtaca 180

ttcccggaga tcacccagtt cgccaaaacc gcatttcagc atctggaaaa ggaactgccg 240

ctgactttag atggtgaaat tgtgtgtctg gtgaacccgt gtcgcgcaga tttcgagcat 300

ctgcaagttc gtggtcgttt aaagcgcccg gataaaatcc aagaaagtgc caacgcccgc 360

ccgtgttgtt ttctggcctt cgatttactg gaacgtagcg gcgaagatgt gactttactg 420

agctatttag accgcaagaa atctctgcgt gagctgatca gcgccgcaaa actgccggcc 480

agccccgatc cgtacgccaa ggaaaccatc caaagcatcc cgtgctacga ccatttcgat 540

cagctgtggg agatggtgat caagtacgac ggcgaaggca tcgtggcaaa gaaaaccaac 600

agcaagtggc tggaaaagaa acgcagcagc gattggctga aatacaaaaa ctttaaacaa 660

gcttacgttt gtattaccgg ctttaatcct aataatggct ttttaaccgt gagcgttctg 720

aaaaacggca tcatgacacc gattgcaagc gtgagtcacg gcatgcgcga tgaggagaaa 780

agtgcaattc gcgagattat ggaacagcac ggtcaccaga caccgagcgg cgagttcact 840

ttagaaccga gtatttgtgc cgcagtgcag tatttaacca ttctgcaagg taccttacgt 900

gaagtgagct tcatcggctt tgagttccag atggactgga cagagtgcac ctatgcccaa 960

gttatccgcc atagcaaacc ggtgcaccct aagctgcagt ttaccagtct ggataagatt 1020

atctttgaga aaaataagaa aaccaaagaa gatttcattc aatatatgat cgaggtgagt 1080

gattatctgc tgccgtttct gaagaatcgc gccgtgaccg tgatccgtta tccgcacggc 1140

agtcgcagcg aaagcttttt tcagaagaac aaaccggact acgcccccga ttttgtgcag 1200

agcttttacg atggcagcca cgagcacatc gtttgcgaag atatgagcac actgctgtgg 1260

ctgtgcaatc agctggcact ggagttccat gtgccgtttc agacaatcaa gagccgccgt 1320

ccggcagaga ttgttatcga tttagacccg cctagccgcg acgatttttt aatggccgtg 1380

caagctgcca atgagctgaa acgtctgctg gatagcttcg gtatcaccag ttacccgaag 1440

ctgagcggta acaagggcat ccagctgtat atccctctga gcccggaggc atttacctac 1500

gaagaaaccc gccagttcac acagctgatt gccgagtact gcaccaacgc atttcccgaa 1560

ctgttcacaa ccgagcgttt aatcaaaaac cgtcattgca aactgtatct ggattattta 1620

cagcacgccg aaggcaaaac cattatctgc ccgtacagca cccgtggtaa tgagttaggt 1680

accgtggccg caccgctgta ttggcatgaa gttcagagta gtctgacccc ggctttattc 1740

acaattgaca ccgttattga tcgtattaaa aaacaaggtt gcccgttttt tgatttctat 1800

cgcaacccgc aagatgaacc gctgagcgcc attctgcacc agttaaagaa gaaatcttaa 1860

cacaaggtct tctcctgtgt gaaa 1884

<210> 15

<211> 1884

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cccagtcacg acgaagacgc aaaaatggtt ctgacaatgc agccgatttt aaccagcgag 60

ccccccgaag gtagtgaatg gcgttacgag gtgaagtacg acggtttccg ctgtttactg 120

cgtatcgacg aaagtggtgt tactttaaca agccgcaatg gtcagacttt aaccaaccag 180

ttcccggaaa ttaccgcatt cgccgcccgc tgcttccagc atatgaagga tcgttttccg 240

atcactttag acggtgagct ggtgtatctg atcaatccgt atcgcgccga ctttgaacat 300

ttacagattc gcggccgctt aaaacgtaca gaaagcatcg aaagcacagc cgatcgccgt 360

ccgtgtcgtt ttctggcctt tgatttactg gtgttagagg gcgccggtac cgtttcttta 420

ccgtatgtga aacgcaagcg cgcactgagc aaactgttca aagaggccaa tctgccggct 480

tgtccgcacc atctggcaga agaggccatc cagtacattc cggaacatac cgatttcgac 540

gctttatggg ataaagtggt gcgccatgat ggtgaaggcg ttgtggccaa acgcgccagt 600

agtggttggg cagagaacaa gcgtagcccg gactggcaaa aatacaaaca tatgaaaact 660

gctcatgttc tgctgaccgg ctttaaccct aagaacggct acgtgaccgc aagcgtgctg 720

aaagatggca ccgccattcc tattgccagc gtgagccatg gtatgcaagc tgaggaaaag 780

aatgcagtgc gcaccattat ggaaactcac ggcaaaaagc agaagagtgg tgaatatact 840

ttagagccga gcatttgcat gaccgtgcaa tatttaacca ttttacaaga tactttacgc 900

gaggtgagct ttgtgagctt ccaatttgaa atggattgga cagagtgcac ctaccagcaa 960

ctgattctgc gcagcaagac tttaccgccg aaactgcagt ttacctcttt agacaaaatt 1020

gtttttaaaa aacgcgaaaa aaccaaagca gatttcttaa gctacatggt gaaaatgagc 1080

gattttttaa tgccttttct gaaagaccgc gccgtgaccg ttatccgcta tccgcatggt 1140

gcacccggtg aaagtttctt ccagaaaaat aagccggact acaccccgga ctttgttagt 1200

agcgtgtttg acggcagcca cgaacacatc gtttgtagta gcattccgtc tttactgtgg 1260

ctggcaaacc agctggcttt agagtttcac gttccgtttc agaccgtgca tagcgaacgc 1320

ccggccgaaa tcgttattga tttagatccg cctagccgca acgatttccc gatggccgtg 1380

gaagcagcac acgttctgaa gcagctgttt gacagcttca gcatcaccag tttcccgaaa 1440

ctgagcggca acaagggcat tcagctgtac attcctctga gcccggaggc ctttacctac 1500

gaagaaaccc gcgcctttac catgctgatc gcagactact gtgttcgcac acgccccgat 1560

ttatttacaa ccgagcgctt catcaaaaac cgcaatggcc gtctgtatct ggactatctg 1620

cagcacgccg agggtaagac aattattgcc ccgtatagta cccgcggtaa cgaactgggc 1680

acagttgccg caccgctgta ctggagcgag gtgaacagct ctttaacccc cgatgactat 1740

actatcgaca cagtggtgaa ccgcgtgcgc accgaaggcg atccgttcta cgacttctat 1800

cgcaatccgc aagatggccc gctgagcatc gtgttagagc agattaagcg taaaagctaa 1860

cacaaggtct tctcctgtgt gaaa 1884

<210> 16

<211> 2553

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cccagtcacg acgaagacgc aaaaatggcc ggcgcaaaac agcaagtgga ggtggaaggt 60

cgccgcatta ctttaaccaa tttagataag gtgttatatc cggccaccgg taccacaaaa 120

ggtgacgtta ttgcctatta cgcagccatc gccccgcaca tgattcctca tttacgtgat 180

cgtccggtga cccgtaaacg ctgggtggat ggtgttggca ccgatgaaca cccggccaaa 240

atgttttttc agaaggatct ggatgcccac acacccgaat gggttctgcg ccgtgcaatc 300

cagcatcgtg accatgcaaa cgactatccg ctggccaatg acgtggccac actgacttgg 360

ctgggccaga tcgcagcctt agaactgcat gtgcctcagt ggcgctttgg tcgtaccggt 420

gatgttcgtc gccccgatcg cttagtgctg gatctggatc cgggtccggg tgctggtctg 480

cccgaatgtg tggaagttgc caaagccgcc cgtgcaattc tgcgtgatat gggtttagaa 540

ccgtaccccg ttacaagcgg cagcaaaggc attcatctgt atgccgcact ggatggcagt 600

catgatgcag acgcaatcag cgaagttgcc catgaactgg cccgtgcttt agaagcagat 660

catccggatt tagtggttag cgatatgcgc aaagctttac gtgaaggtaa ggttctggtg 720

gactggagtc agaacaatcc ggccaaaaca accgtggccc cgtattcttt acgcggtcgt 780

agccgtccga cagttgcagt tccgcgtact tggcgtgagc tggcaagtcc gacactgcgt 840

catctggaac tggatgaagt ggttgcccgt atgcgcacac gtgaggatcc tttagccccg 900

gttgaagaag gccaccgtga atctttagaa ccgacacgcg aacgtttagc cggtttcgca 960

cataaggacg ccgatgcagc tggtgatcgt ctggccacct atcgcagtaa gcgcgacgcc 1020

gcaaaaacaa gcgagccggt gccggccgat gcaccggcac cgagcgatgg cagcagcttt 1080

gtgatccaag aacaccatgc acgcgcttta cattgggatt tccgtttaga gcatgatggc 1140

gttctggtga gctgggcttt acctaagggt gtgccgacag agcatggcac caatcattta 1200

gcagtgcaga cagaagatca tccgctggag tacggcagct tcgaaggcac cattccggcc 1260

ggcgaatatg gtggcggcga agttaccatc tgggacgctg gtacctttga gttagagaaa 1320

tggcgcgatg gccatgaagt gattgccaca ctgcatggcc gcggccatgg taccggcatt 1380

gatggtccgc gtcgctacgc actgatccat accggtggtc acggcaaggc agacgcaaat 1440

tggctgatcc atttaatgga accggcagat gccccggccg cacatcaccc gaaacccgct 1500

cgccccgctg cactggccaa agctggtggc cgcacacgtg ttggcgcccg tcgtaaaggt 1560

cgtgccgcct ttgccgcagc cccgatgtta gccacagccg caaccggcgc tggtttagat 1620

agcgatgagg aatgggcagt ggagatgaag tgggatggtt atcgtgccat tgcagcagtg 1680

gccgacggtc gtgccaccat tacaagccgt aatggtgtgg atttaaccgc cgcatttccg 1740

gaactggccg atctgccgga tcagctggca gccgacgccg ttctggatgg tgagattgtt 1800

gttctgggcg atggtggccg cccggatttt ggtttactgc agacccgttt aggtctgact 1860

ggtgaaaagg atattgcccg tgcccgcaaa gcagcaccgg tgcatttaat gctgttcgat 1920

gctttagcca ttggtgatcg cgtgctggtt ggcgaaccgt atcgcgaacg ccgcgcagca 1980

ctgttagatg cagttacaag ccccggtcgc ggccgcattc aagttccgcc ggcatttgat 2040

ggtgatctgg atggtgcttt agcaacaagt cgcgagctgg gtctggaagg cgttgttgcc 2100

aaacgcgttg acgcaccgta cgaaagcggt cgccgcagca gcgcttggat caaaatcaaa 2160

caccaccgtg cccaagaagt ggtggtgggt ggttggcgtc cgggtagcgg tagtcgtagc 2220

agcggtattg gctctttact ggttggtgtt ccgggtccgg atggtttaat gtatgccggc 2280

cgcgttggta ccggctttac agaacgcgat ctggccgacg cactgcgtcg tttccgccct 2340

ctggcccgta aaaccagccc gttcgccgat gttcccgctg ccgaagcacg tgatgcacac 2400

tggatcacac ctcgtttagt gggcgaagtt gaattcgcag agtggaccag caccggtcgt 2460

ttacgtcaag ctagttggcg cggctggcgt catgataaga gtccggacga ggtggttcgt 2520

gaggattaac acaaggtctt ctcctgtgtg aaa 2553

<210> 17

<211> 2595

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cccagtcacg acgaagacgc aaaaatggca ctggagacat accgtaagaa gcgcgatttt 60

agcgttacac cggaacctca aggtcgtcgt gcccctaaag ctggtaacag ctttgtgatc 120

caaaaacatg atgcccgccg tttacactat gatttccgtc tggagatgga cggcgttctg 180

aaaagttggg ccgtgacaaa aggcccgagc ttaatccccg gtgaaaaacg tttagccgtg 240

cacgttgagg atcatccgct ggagtacggt ggtttcgaag gcacaattcc gaaaggcgaa 300

tacggtggtg gtaccgttat tttatgggac cgcggtacat ggacccctat cggcgatgca 360

cgccgcggct atgcaaaagg ccatctggat ttcgaattac atggcgagaa actgggcggt 420

agctggcatt tagttcgcat ggctggtaaa ccgcgcgaga aacgtgagaa ctggctgctg 480

attaagggtg atgacgatgc cgcccgcaca gaggatgacc cggacatttt agacgaacgc 540

ccggaaagta ttgccaccgg ccgtaagatc gaagatgttg ctggtgagga accgggttgg 600

agcagtaaaa ccggtcgtat ccgcaagcgt cgtggtggtc gcactggtgc cgcacccccc 660

gaagagcagc cggcaaccgt gagtgttccg gaaccgagca aaattaaggg cgcaaagaaa 720

gccgctttac cggatttcgt ggaaccgaca ctggccactt tagttagtag cgccccgagt 780

ggtcaacgct ggctgcacga gatcaaattc gatggctatc gtttacaagc tcgcgtggag 840

gctggtcgtg ttaaactgct gacccgtagc ggtttagatt ggacaaaaaa gttcggtaaa 900

gccatcgtta gtgctttagc agatttaccg gttggtaccg cactgatcga cggtgagtta 960

gtggttgaga caagcgctgg tgccagcgac ttcagtgaat tacaagctga tctgagtgag 1020

ggccgtagcg atcgcttccg tttatacgtt ttcgatttac tgcatttaga tggttatgat 1080

ctgcgcgatg tggcaagcat ccagcgcaag gaactgctgg agaagattat cggcagcggc 1140

agcggcatca ttagctacag tggtcacttt gaagaagatg gtccgctggt tctgcgtcat 1200

gcttgtcgtc tgtctttaga aggtgtggtg agtaaactgc gcgatgcacc ttaccgtgct 1260

ggtcgtagca agaactgggt gaaaagcaag tgcagcgccc gccaagaatt tgtggtggcc 1320

ggctatgtgc ctagcaccac cagccgtaat gcaattggca gtctggtgct gggcgtgtat 1380

gacgatggca aactgcacca cgttggccgt gtgggtaccg gctacacagc agccgttgcc 1440

gaaggtttat tcaagaagct ggaacgcatc cgtattccga gtagcccgtt cgatgaacgt 1500

ttaagcgccg aagaaactcg ccaagttcgt tatgtgcgtc cggagctggt tgccgagatt 1560

gaattccgtg cttggacagc agatggcaat ttacgccacg caagcttccg tggcttacgc 1620

gaggacaagc cggcaaagga gattgtgcgt gaaactccga aaacaaaagc agccgcaaaa 1680

ccgcagcgtc gtaccgtgaa gctgacccac ccggatcgtt tatattggcc ggaccaaggt 1740

gttaccaaag agggtttagc cgactactat accgaagtgt ggcgctacgc cagcccttat 1800

ctggtgggtc gcgcactggc actgttacgt tgtcctagtg gcattagcgg cgagcaattc 1860

ttccagaaac atgcatggaa aggtttaaac ccgaacatcg tgctggtgca tgatccgaag 1920

gatcctccgg acgaacgtct gattagcatc aatgatttag acggcttaat tggcttagtg 1980

cagagcgcag ccttagaaat ccatccgtgg ggcagtatgg ttagcgactg ggagcgtccg 2040

gataccatta tcatggatct ggatccgggc gaggatgttt cttgggaggc agtgattgca 2100

gcagccgtgg aaacccgcga tcgtttaaaa gatgccggtt tagtgccgtt tattaagacc 2160

agtggcggca aaggtctgca cgtggttgca ccgctgaagc cgaaggcaga gtggccggca 2220

gcaaaagcct ttaccaaggc catcgcagat gccatggcag ccgatagccc gggtcgctat 2280

gttagtacca tcaccaaaag caaacgccgc ggcaagattc tggtggatta tttacgcaat 2340

cagcgtggtg ccaccgcagt tgcaccttat agtacccgcg cccgtcccgg tgcagcagtg 2400

agtatgcctc tggcatggga tgaactgggc ccgggtattg gcccggcata ttttaccgtg 2460

gagaacaccc cgacacgttt agcatcttta agcagtgatc cgtggcaaga ctttcgtgcc 2520

gccgccgtgc cgattgaaga tcgcgccaat cgtcgcgaaa aagccgccta acacaaggtc 2580

ttctcctgtg tgaaa 2595

<210> 18

<211> 2325

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cccagtcacg acgaagacgc aaaaatggaa cgctatgaac gtgtgcgttt aaccaacccc 60

gataaggttc tgtaccccgc tagcagcacc accaaagcag aggtgtttga ttattatctg 120

agcatcgccg aagttatgct gccgcatatt gccggtcgtc cggttacccg taaacgttgg 180

ccgaatggtg tggcagaagc cagcttcttc gaaaagcaac tggccagtag tgcaccggat 240

tggctggaac gtggcaccat tgtgcataag agcggcacca ccacctaccc tatcgttaac 300

acccgcgaag gcttagcatg gatcgcccag caagcttctt tagagctgca tgttccgcaa 360

tggcgcttta gcagcgatgg cagccaaggt ccggcaaccc gtatcgtgtt cgatttagat 420

ccgggtgaag gcgttacaat gcctcagctg tgcgaggttg cccaagccgt gcgcgaactg 480

atgagcgaca tcggcttaat gacctatccg ctgaccagtg gtagcaaagg tttacattta 540

tacgttccgc tggcagaccc tatcagcagc cgcggtgcaa gcgttctggc caagcgcgtt 600

gcagtgcagc tggagcaagc tatgccgaag ctggttaccg caaccatgac ccgcagtctg 660

cgcgcccaga aagtgttttt agactggagt cagaataatg cagccaagac cacaatcgca 720

ccgtattctt tacgcggtcg tgattacccg accgttgcag caccgcgtac atgggatgaa 780

attggcgacc cggatttacg ccatctgcgt ttcgacgaag ttctgcagcg catcagtgac 840

gatggcgatt tattagctgg tttagatgac gatgccccgg ttgccgataa actgaccacc 900

tatcgcagca tgcgcgatgc aacaaaaacc ccggaacccg ttccgcgcga tatcccggtt 960

cgcggtaaca acgatcgttt cgttattcaa gaacatcacg cacgtcgttt acattatgat 1020

ctgcgtctgg aacgtgatgg cgtgctggtt agctgggcag ttccgaaaaa tttaccggac 1080

accaccgccg ttaatcattt agccgtgcac acagaagatc accctatcga gtatttaacc 1140

tttcacggca caattccgaa gggcgagtat ggtgctggta atatggtgat ctgggacacc 1200

ggtacctatg aggccgagaa attccgcgtt ccggccgatc cggatgacag cgatgcaccg 1260

aagggtgaag ttatcttcac tttaaatggt aaccgcatcg atggccgtta cgcactgatc 1320

cagaccgaag gtaagaactg gctggcacat cgcatgaagg atcagagcag cgccgcaccc 1380

gaaccgaaag acttcgcccc gatgttagca accgaaggca gtgtggccaa gctgaaggcc 1440

acccagtggg ccttcgaagg taaatgggac ggctaccgct tactggtgga ggccgaacat 1500

ggtcgcttac aactgcgtag tcgccgcggc cgtgatgtta ccgccgagta tccgcagttt 1560

gaagcactgg ccgccgatct ggccgatcat catgtggtgc tggatggtga agccgttgcc 1620

ttagacgatc acggcatgcc gagcttccgc gagatgcaga accgcgcacg cagtacacgt 1680

gttgagttct gggcctttga tattttatgg ctggatggtc gctctttact gcgcgcaaaa 1740

tacacagacc gccgcaaact gctggaagca ctggcagctg gtggtggtct gattgtgccg 1800

gaacagctgg ctggtgatgg tccggaggcc atggaacacg cacgtgagca caaattcgag 1860

ggcgtggtgg ctaaaaaacg cgatagcacc taccagcccg gtcgtcgtag tgccagctgg 1920

atcaaagaca aaatctggaa cacccaagaa gttgttatcg gcggttggcg ccaaggcgaa 1980

ggtggccgta gcagtggcat tggcgcttta gttctgggtg tgccgggtcc tcatggttta 2040

caatttgctg gtcgtgttgg caccggcttc accgaaaagg aactgaccaa actgaaaggt 2100

atgctgaaac cgctgcacac caaagagagc ccgtttgata agccgctgcc gaaactggat 2160

gccaaaggcg tgaccttcgt gcgccccgaa ctggttggcg aggtgcgcta tagtgaacgt 2220

acaaccgacc accgtttacg ccagcctagt tggcgtggtc tgcgtccgga caaagcaccg 2280

gacgaagtgg tgtgggagta acacaaggtc ttctcctgtg tgaaa 2325

<210> 19

<211> 2316

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cccagtcacg acgaagacgc aaaaatggaa cgctacgaac gtgtgcgttt aaccaacccc 60

gataaggtgc tgtaccccgc taccggcacc accaaagccg aagtgtttga ttattattta 120

agcattgcac aagttatggt gccgcacatc gccggtcgtc cggttacacg taaacgctgg 180

ccgaatggcg tggccgaaga agcattcttt gagaagcagc tggccagcag tgccccgagt 240

tggttagaac gcggcagcat tacccataaa agcggcacca ccacctaccc tatcattaac 300

acccgcgaag gtctggcatg ggttgcccag caagcttctt tagaagtgca tgtgccgcag 360

tggcgctttg aagatggtga ccaaggtccg gcaacccgta tcgttttcga tttagacccg 420

ggtgagggcg tgaccatgac ccagctgtgc gaaatcgccc acgaagtgcg cgctttaatg 480

accgatctgg atttagagac atacccgctg acaagcggca gcaaaggttt acatctgtac 540

gttccgctgg cagaaccgat tagcagccgt ggtgcaagcg ttctggcacg ccgtgtggca 600

cagcagctgg aacaagctat gccgaaactg gttaccgcca ccatgaccaa atctttacgt 660

gctggtaagg tgtttctgga ttggagccag aacaacgcag caaaaaccac catcgccccg 720

tatagtttac gcggtcgtga ccatcctaca gtggccgccc ctcgcacttg ggacgaaatt 780

gccgatccgg aactgcgcca tttacgcttt gatgaggtgc tggaccgtct ggacgaatac 840

ggtgatctgc tggcacctct ggacgcagac gccccgattg ccgataagct gacaacctac 900

cgtagtatgc gcgacgcaag taaaaccccg gaaccggtgc cgaaagaaat tccgaaaact 960

ggtaataatg acaaattcgt gatccaagaa catcatgccc gtcgtttaca ctacgactta 1020

cgtttagagc gcgacggcgt gctggttagt ttcgccgtgc ctaaaaattt accggaaacc 1080

accgcagaaa accgtttagc cgttcacacc gaagatcacc cgattgaata tttagccttc 1140

cacggtagca tccctaaagg cgagtatggt gccggcgata tggtgatttg ggacagcggc 1200

agttatgaaa ccgagaaatt ccgcgtgccg gaagaactgg ataacccgga cgacagccac 1260

ggtgaaatca tcgtgacttt acacggcgaa aaggttgacg gccgttacgc tttaattcaa 1320

accaagggca aaaactggct ggcccaccgt atgaaagacc agaaaaacgc ccgtccggag 1380

gattttgccc ctatgctggc caccgaaggc agtgtggcca aatacaaggc caaacaatgg 1440

gccttcgagg gtaaatggga tggctaccgt gtgattatcg acgccgatca tggtcagctg 1500

cagatccgta gccgtaccgg ccgtgaagtt accggcgagt atccgcagtt taaagcttta 1560

gccgcagatc tggcagagca tcacgttgtt ctggacggcg aggccgttgc cttagatgag 1620

agcggcgtgc cgagttttgg ccagatgcag aatcgcgccc gtagcacccg tgtggagttt 1680

tgggccttcg atattttatg gttagacggt cgttctttac tgcgtgcaaa gtatagcgat 1740

cgccgtaaaa ttttagaagc tttagcagac ggtggtggtc tgattgtgcc cgatcaactg 1800

ccgggtgacg gccccgaagc catggaacac gtgcgtaaaa agcgcttcga gggtgtggtt 1860

gccaaaaagt gggatagcac ctaccagccc ggtcgtcgca gcagcagctg gatcaaagat 1920

aaaatttgga atacccaaga agttgttatt ggcggttggc gtcaaggtga gggtggtcgc 1980

agcagtggta ttggcgcttt agttctgggc attccgggtc ccgaaggttt acagttcgtg 2040

ggtcgtgttg gcaccggttt taccgaaaaa gaactgagta agctgaaaga tatgctgaag 2100

ccgctgcata ccgatgaaag cccgttcaac gcaccgctgc cgaaagtgga tgcccgtggc 2160

gtgacctttg tgcgccccga actggtgggc gaagtgcgtt atagcgagcg caccagcgat 2220

ggtcgtttac gtcaacctag ttggcgtggt ttacgcccgg ataagacacc ggatgaggtg 2280

gtttgggaat aacacaaggt cttctcctgt gtgaaa 2316

<210> 20

<211> 2328

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cccagtcacg acgaagacgc aaaaatgggc agcgcaagcg aacagcgcgt taccttaacc 60

aacgccgaca aagtgctgta tccggcaacc ggtaccacca aaagcgacat tttcgactac 120

tatgctggtg tggcagaggt gatgctgggt catattgccg gtcgcccggc aacccgtaaa 180

cgctggccga atggcgttga tcagccggca tttttcgaga agcagctggc tttaagtgca 240

cccccttggc tgagccgtgc caccgttgca caccgtagtg gtaccaccac ctaccctatc 300

attgatagcg ccaccggtct ggcttggatt gcacagcaag ccgcactgga agtgcacgtg 360

ccgcagtggc gtttcgtggc cgaaccgggt agtggcgaat taaatcccgg tccggctacc 420

cgtttagtgt tcgatctgga tccgggcgag ggtgtgatga tggcacagct ggccgaagtt 480

gcacgcgcag tgcgtgactt actggcagac attggcttag tgacctttcc ggtgacaagc 540

ggcagtaaag gtctgcattt atacaccccg ctggatgaac cggtgagtag tcgcggcgcc 600

acagtgctgg caaaacgtgt tgcacagcgt ttagagcaag caatgcccgc tctggtgacc 660

agcacaatga ccaaaagtct gcgcgccggc aaggtgtttg tggattggag tcagaacagc 720

ggcagcaaga ccacaattgc accttatagt ctgcgcggtc gtacccatcc gaccgttgca 780

gccccgcgta catgggcaga actggacgat cccgctctgc gccagctgag ctatgacgaa 840

gttctgacac gcattgcccg cgatggcgat ctgctggaac gtttagatgc agatgcaccg 900

gttgcagatc gtttaacccg ctaccgtcgt atgcgtgatg caagcaaaac ccccgaaccg 960

atcccgaccg ccaagcccgt taccggtgac ggtaacacat tcgtgattca agaacatcat 1020

gcccgtcgcc cgcactatga ttttcgttta gaacgtgatg gcgtgctggt gagttgggcc 1080

gttccgaaaa atctgccgga taacaccagc gttaaccatt tagccattca caccgaggat 1140

cacccgctgg agtatgccac ctttgagggc gcaattccta gcggtgaata tggtgccggc 1200

aaagtgatca tctgggacag tggcacctat gataccgaga aatttcatga tgacccgcac 1260

accggtgagg tgatcgttaa tttacatggt ggccgtatca gcggtcgcta cgcactgatt 1320

cgcaccaatg gcgaccgctg gctggcccat cgtttaaaga atcagaaaga tcagaaagtg 1380

ttcgagtttg ataatctggc ccctatgctg gcaacccacg gtacagtggc cggtctgaag 1440

gccagccagt gggcatttga aggcaaatgg gatggctacc gcttactggt tgaagcagat 1500

cacggtgcag tgcgtctgcg cagtcgtagc ggccgtgatg tgaccgccga atatccgcag 1560

ctgcgcgctt tagcagaaga tttagcagat catcacgttg tgctggatgg tgaggccgtg 1620

gttctggaca gcagcggcgt gccgagtttc agccagatgc aaaaccgcgg tcgtgacaca 1680

cgcgtggaat tctgggcctt tgacttactg tatctggatg gccgtgcact gctgggcacc 1740

cgttatcaag atcgccgtaa actgttagaa actttagcaa acgcaacctc tttaaccgtt 1800

ccggaactgt taccgggcga cggtgcccaa gcttttgctt gtagtcgtaa acacggttgg 1860

gaaggtgtga ttgccaaacg tcgtgacagc cgttatcagc ccggtcgccg ttgtgccagc 1920

tgggttaaag ataaacattg gaatacccaa gaagtggtga tcggtggctg gcgtgctggt 1980

gaaggcggtc gtagcagcgg tgtgggtagt ttactgatgg gcatcccggg tccgggtggt 2040

ctgcagtttg ctggtcgtgt gggtaccggc ttaagcgaac gtgaactggc caatctgaag 2100

gagatgctgg caccgctgca caccgatgag agtcctttcg acgtgccgtt acccgctcgt 2160

gatgccaaag gcatcaccta cgttaagccg gcactggtgg ccgaagttcg ctatagcgaa 2220

tggacaccgg aaggccgttt acgccagagt agctggcgtg gtttacgtcc ggacaaaaaa 2280

ccgagcgagg tggttcgcga gtaacacaag gtcttctcct gtgtgaaa 2328

<210> 21

<211> 2571

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cccagtcacg acgaagacgc aaaaatgcct agtagcaagc cgctggcaga atacgcacgc 60

aaacgcgatt ttcgccagac cccggaacct agtggccgta aacctcgcaa agacagcacc 120

ggtttactgc gttactgcgt gcagaagcat gatgcaagcc gtctgcacta tgacttccgt 180

ttagagttag acggtacttt aaaaagctgg gcagtgccta aaggtccgtg tttagatccg 240

gccgtgaaac gtttagcagt gcaagttgag gatcatcctc tggattacgc cgattttgaa 300

ggcagcatcc cgcaaggtca ttatggcgct ggtgacgtta tcgtttggga tcgtggtgct 360

tggaccccgc tggatgatcc gcgcgaaggt ctggaaaagg gccatttaag tttcgcctta 420

gatggtgaga aattaagcgg ccgctggcat ttaatccgca caaacttacg cggcaaacaa 480

cctcagtggt ttctggttaa agccaaggac ggcgaggcac gttctttaga tcgcttcgac 540

gtgttaaagg aacgtccgga cagcgttctg agcgagcgca ctttattacc tcgccatggt 600

gaaaccgcca cccccgctgc acgtccggca cgtcgtggca aaagtggcgg caaaaccccg 660

atgccggagt ggattgcccc ggaactggcc agcttagttg aacagcctcc gcgcggcgaa 720

tgggcctacg aactgaagtt agacggctat cgtttaatga gccgcattga ggatggccac 780

gttcgtctgc tgacccgtaa cggccatgac tggaccgagc gcttaccgca tctggaaaaa 840

gcattagccg gtttaggtct gcagcgtagc tggctggatg gcgagctggt tgttctggac 900

gaagagggcc gccccgattt tcaagcttta cagaatgcat tcgaagaagg tcgcggtgaa 960

aatattttat acgtgctgtt cgatttaccg taccatgaag gcgaggattt acgcgatgtt 1020

gctttagagg agcgtcgcgc acgcttagag gccttactgg aaggtcgcga tgaagatccg 1080

ctgcgcttca gtgccacact ggcagaagat ccgcgtgatc tgctggcaag cgcttgtaag 1140

ctgggcttag agggcgttat tggcaagcgc ttaggcagtg cataccgcag ccgccgcagc 1200

aacgattgga tcaaattaaa gtgccagctg cgtcaagaat tcgtgatcgt gggctataca 1260

gagccgaaag gtagccgccg tcatatcggt gctttactgt taggtctgta cagtccggac 1320

gaagaacgcc gtttacgcta tgctggtaag gtgggcagtg gtttcaccgc cgccagtctg 1380

aaaaaggtgc gcgaacgctt agaaccgctg gccgttcgca gtagcccgtt agccaaagtt 1440

ccgcccgctc gcgagactgg tagtgtgcaa tgggtgcgtc cgcaacagct gtgcgaggtg 1500

agctacgcac agatgacccg cggtggtatc attcgccaag ctgtttttca cggtctgcgt 1560

gaggataaac cggcacgtga ggtgaccggt gaacgtcccg ctggtcctcc gcctttacgc 1620

ggcgcacgta aagccggtag cggtgcaagc cgtgcagcaa ccgccggcgt tcgtattagc 1680

cacccgcaac gtttaatcga tccgagtatc caagcaagca aactggagct ggccgaattt 1740

catgcccgct acgcagatct gctgctgcgc gatctgcgtg agcgtcccgt tagtctggtt 1800

cgtggcccgg atggtatcgg tggcgaactg tttttccaaa aacacgccgc acgtctgaaa 1860

atccccggta ttgtgcagct ggatccggca ttagatccgg gtcacccgcc gctgttacag 1920

attcgtagcg ccgaagcttt agtgggtgca gtgcagatgg gcagcatcga atttcataca 1980

tggaacgcca gtctggcaaa tctggaacgc ccggatcgtt tcgtgctgga tctggatccg 2040

gatccggctt taccttggaa gcgtatgctg gaggcaaccc agttatcttt aactttactg 2100

gatgagttag gcttacgcgc atttttaaaa acttctggtg gtaaaggcat gcatttactg 2160

gtgccgttag agcgtcgcca tggttgggac gaagtgaaag acttcgccca agctatcagc 2220

caacatctgg cccgcttaat gccggaacgt tttagcgccg ttagtggtcc gcgcaaccgt 2280

gttggcaaaa ttttcgtgga ctatttacgc aacagccgtg gtgccagcac cgttgccgcc 2340

tatagtgtgc gtgcccgtga aggtttaccc gttagcgtgc cggtgtttcg tgaggagtta 2400

gattctttac aaggtgccaa ccagtggaat ctgcgtagct taccgcaacg cttagatgaa 2460

ctggccggcg atgatccgtg ggcagattat gccggtaccc gccagcgtat cagtgcagca 2520

atgcgtcgtc agctgggtcg cggttaacac aaggtcttct cctgtgtgaa a 2571

<210> 22

<211> 2670

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

cccagtcacg acgaagacgc aaaaatgggt cgtgaccacc ctctgagtgc ctaccacgcc 60

aaacgtgatt ttgcacacac ccccgaaccg gctggtgaga aacgcgtggc caaacgccgt 120

ggtaaggccg ttcagcccgc tttacagttt gttattcagc gccatcatgc ccgtcgtctg 180

cactacgatt ttcgtttaga atggggcggc acactgaaaa gctgggcagt tcctcgcggt 240

cctagcttag atcccgatat tcagcgttta gcagttgaag ttgaagatca tccgctggat 300

tacgctggtt tcgagggtac aattccgaaa ggtcactatg gcgctggtga tgtggcaatt 360

tgggatcgcg gcgaatggat tccggagggt gatgcagaag agggtttacg tcgtggcaag 420

ctgcatttcg aactgcgcgg tacacgtctg cacggtgctt gggttttatt tcgtctggcc 480

ggcgagggtg accaatggat gctgcgtaag cgccgcgatc agcatgcccg tatcggtgat 540

ggtgatgccg ttctgcacga tcctccggaa gcagaagcac cgcccgctcc cgctcccgct 600

cccgttgcag caaagagccc gcgtagtagc gcagcaagta gccgtcgtcg tcgtgtgccg 660

gtgccggaat ttgtggagcc gcagttagcc actttagtgg atcgcccgcc cgttagcgat 720

gcatgggtgt acgagatcaa atacgacggc taccgcatgc tggtgcgttg cgatggccgt 780

caagttcgtt tattcagccg taacggcatt gaatggaccg aacgtttacc gagtctggtt 840

caacgtctga gcgctttaca aagccatagc ggctggctgg acggcgagat tgttgtgatg 900

gacgagcatg gccataccga tttccatgct ttacaagcta cactggatag tggcgccccg 960

caagttgagt atgtggtgtt cgacgtgccg tggtgggatg gtgaagattt acgcgaccgt 1020

ccgctgagtc atcgtttaca agctttagat gagatctttg ccgcactgcc ggcacaaccc 1080

ggtttaagtc gtagtaaacc gctggatccg ggttatgttg gccaagctgt tctgcaagct 1140

gcatgccagc tgggtctgga aggtctgatc ggcaagcgtc tggatgcacc ttatcgcagc 1200

ggccgtagcc cgcattggat taagctgaaa tgccgcagcg aacaagaagt tgttattggt 1260

ggttacaccg agccgcgtgg cagtcgcggc cacttaggtg cactgttagt gggcgtgtgg 1320

ggtaaagatg gccagctgga ttatgccggc cgtgttggca gtggttttga tcaagctggt 1380

ttacaagcta tgcgtgaacg tctggcaccg gatgaaaccg cacgctgtcc gtttcgtagc 1440

aaaccttctt taccgggtgc ccctaccgtg cattgggtgg agccggtgca tgtggttcaa 1500

gttcgctatg caagttggac ccaagaaggt ttactgcgtc aagctagctt tgtgggtgtg 1560

cgcgaggaca aaccggtgcg caaggttgtg cgtgagctgc cgcagaccgt ggcacaagaa 1620

gataccccga tgcgtcctag cgccacacgt ctggctggtc gtccggcaag tccggcagcc 1680

acagcagcac gcgcaagtct gcgccgtagt ggtgccagca gcgacccgaa agcaaacagt 1740

gttggcggcg ttcgtgttac acatccggag cgtctggtgt tcagcgttcc tcgcattacc 1800

aaactggaag ttgttcgcta tcatgaagat atcggtgaat atctgctgcc tcatttagca 1860

gcccgccctc tgagcttact gcgctgtccg caaggcaccg gcggtgagtg cttcttccaa 1920

aaacatgtgg aaaccacttt accgagcggt gtggaaagcg ttgaagttcc cgctagtgac 1980

ggtaccgaca cactggtgat ggtgaacagc gtggaaggta ttgttgcttt agcccagtac 2040

ggcaacgttg aatttcacac ttggggcgca cgtgcacctc gtcccgatcg tccggaccgt 2100

atcaccatgg atctggatcc cgatcccgat ttaccgtggg cccaagttgt ggaagccgcc 2160

cagctgaccc gtgttttact ggaagaactg ggtctggccg cctttttaaa aaccaccggc 2220

ggcaagggtt tacatatcgt gaccccgatc aaagccaccc gtagttggga cgaagtgaaa 2280

gccttcacaa agggtctggc cagccgtctg gccagtgttg cccctcagcg ttttaccgcc 2340

cgtctgagta agagcagccg cggtggtcgt atttttattg actatttacg taatggccgc 2400

ggtgccacag cagtggcaag ttattcttta cgcgcacgtg aaggtgcacc ggtgagcgtt 2460

ccgctgcatt gggatgagtt aagcgccaag aaagacgtgc gtgccgaaca cttcaactta 2520

cgcaatgccg ttgcccgtgc accggagagt gaaaccgcat ggcaagatta tgccgcccag 2580

cgccgtacct taacagttaa gatgtttcgc gctttaggtg tggatccggg tagcgcagaa 2640

agctaacaca aggtcttctc ctgtgtgaaa 2670

<210> 23

<211> 2550

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

cccagtcacg acgaagacgc aaaaatggcc aagccgctgc aagaatatgc acgcaagcgt 60

gactttaacg caaccccgga accgagcggc aaacgcagtc gtggcaagaa ggcacacgca 120

ctgcagttct gcatccagaa acacgatgcc agccatttac attatgactt ccgtttagaa 180

ctgggcggca ctttaaaaag ctgggccatt ccgaagggcc cgagcttaga ccctaatgtg 240

cgtcgtctgg ccgttcatgt ggaagatcat ccgctggact atgccgattt cgaaggccat 300

attccggagg gccactatgg cgccggtgat gtgatcgttt gggaccgtgg tatctgggaa 360

ccggagggcg atgcccacca aggttatgcc aaaggcaaat taaagttccg tttacaaggt 420

gagaaactga gcggtgtttg gcatttattc cgtacacatt tagctggtaa aaaagagcag 480

tggatgctgg tgaagagcca tgatgcccaa gctcgcagcg aggccgagta cagtattgtt 540

aacgcacagc cggacagcgt tctgagcgac cgtactttaa ttcctcgtaa accggccgcc 600

aaacaagctg cagccaaacc tcgtgccaca cgtaaacgtc ccggtaaggt tcgccaagca 660

gcattaccga accagctgca gccgcaatta gccactttag ttgatacacc tccgcaaggt 720

gactggcgtt acgaggtgaa gtttgatggc tatcgcattc tggcccgcat cgatggtgac 780

gacgtgcgtc tgtttacccg caatggccac gattggagta gtaaaatgcc gcgccagctg 840

gcagctttac gtgcactggg tatcgatagc gcttggctgg atggcgaaat ggtggtggcc 900

gatgaaaacg gtgcagcaga tttccaagct ttacaaaatg cctttgatac cgagcaagat 960

gaacacatca cctactatgt gtttgattta ccgtttttag gcggtcaaga tctgcgccat 1020

gcaccgctgc aagatcgtcg tgaaacttta aaaacattac tggaccacga cgccagcgat 1080

gttctgaaat atagcgccga ttttgatgag cccgttgatg cactgctggc cagtgcatgc 1140

cgtctggaac tggagggttt aattggcaag cgcgccgaca gcccgtatag tggtcgtcgc 1200

agtggcgact ggattaaact gaagtgtaag cgccgccaag aattcgtgct ggttggttac 1260

accgacccga aaggcagccg cagcggtttc ggtgctttat tactggcttt acatgatccc 1320

gataacggcg aactgcgtta tgccggcaag gttggcaccg gttttacagc agcaacttta 1380

gcaagcatcc acacacgttt acaaccgctg gagattgcca aaccggcagt tacccgtcct 1440

ccgagtggtg ccgaagcacg cggcgttcac tggctgaagc cgcaattact ggcagaagtg 1500

gcctacgccc aaatgacacg cgacggtatt gtgcgtcata gcgtgttcca cggtctgcgt 1560

gacgacaaac cggccaccgc aattgatctg gaacgcccta tgagtaccaa caccacacct 1620

cgtcgtaaac gtggtaaagc agcacctctg agcgaggatt tacatctgac ccatccggat 1680

cgtgttattg acgccaccac tggtgttaca aagcgtgatg tggccgagta ctacgccgcc 1740

gttagccagt ggctgctgcc tcagattcag catcgtccgg tggccttagt tcgtgcaccg 1800

gatggtctgg ctggtgagct gttcttccaa aagaacgcca gccagctgca tttaccgaac 1860

gtgctggagt atgacaaagc ccaagctggt caagctgcaa tggtgatcaa tcgcgccgat 1920

actttactgg gtgcagttca gatgaatatg ctggaactgc acagctggaa tgcaaccgac 1980

aaggatttcg acaagccgga tcgctttgtg ctggatttag atccggaccc cgctttacct 2040

tggaaggcaa tgctggaagc aacccagtta acactgactt tattagacga gctgggttta 2100

aaagtgttca tcaagaccag cggtggcaag ggtattcatt tagtggtgcc gttaacccgt 2160

cgcgctggtt gggatgaggt taaagccttt agccacgcca tcgtggaata tctggccaag 2220

ctgttccccg atcgtttaag cgccgttagt ggtccgaaaa atcgtattgg tcgtattttt 2280

attgactatc tgcgtaatgc ccgtggtgca acaacagctt gtgcctactc tttacgcgca 2340

cgtgaaggta tgccggtgag cgtgcctatt tggcgtgagg agctgaccgc actgaaggcc 2400

gcaaatcagt ggaatatcgc aaatttaccc gctcgtttag ccgaagttga cgatccgtgg 2460

gccgatctgg gccgtgtgcg tcagagcatc acagcccgca tgcgtaagca actgggttta 2520

gcctaacaca aggtcttctc ctgtgtgaaa 2550

<210> 24

<211> 2649

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

cccagtcacg acgaagacgc aaaaatggca aagccggtga gtgaatatac ccgcaagcgc 60

aacttcgaca ttaccagcga gcccgctgag gctggtagta aaatgcgcag cgccaaagcc 120

cacgcactga gcttcgttat ccagaagcac gatgccagcc atctgcacta tgatttccgt 180

ctggagctgg acggtacact gaagagctgg gccgtgccta agggccctag cttagatcct 240

acccagaaac gtttagccgt gcatgttgag gatcatcctc tgggttatgc aagcttcgaa 300

ggcagcattc cgaagggcca gtatggtggt ggcgacgtta ttgtgtggga tcgcggtgtg 360

tgggagccgc acggtgatcc tcgcaaaacc tacgccgaag gcaagctgaa attcacactg 420

attggtgaaa agctgactgg tgattgggct ttagttcgta cccgtctgaa gggtagcggt 480

agcaaagagc agtggctgct gattaaggag aaggatagcg ttgcccgccc ggccgatgag 540

tatgatatca ttgaacagca gcctcaaagt gtgattagtg gcgcccatgt gggcgttggt 600

cgcgttccgg caagcaaagc caagccgcgc agcacaaaaa ccaaaaccga taccgcaccg 660

gcaaaaccga gccgcatgag cagccgtacc aaggccaaag ccgcactgcc cgaactgtta 720

accccgcaac tggcaacact ggttgatgcc cctccggctg gtgaatggct gtacgagatc 780

aaatttgatg gctaccgcat tctgacacgc atccaaggcg acgatgttcg tctgttcacc 840

cgcaatggtc acgattggac cgaacgtctg ccggagctgg caaaagcaat caaagcttta 900

aaactgcaag atacttggtt cgacggcgaa gtggttgtgt taaacgatca aggtttaccg 960

gattttcaag ctttacagaa cgccttcgaa atcggtcgca gcaaggatat tttatattat 1020

ttattcgata tgccgtatct gaccggcgaa gatctgcgcg aggtgccgat cgaacaacgt 1080

cgcgatgctt taaagcaagt tctgggtaag cagcgtagcc gtttactgcg ctttagcgat 1140

gcattccgta gcggccacaa agacattgtt gagagcgcca gcgcaatggg tctggagggc 1200

gtgattggca aacgcgctgg tagtccttat gtgagcaaac gcaatgccga ctggatcaag 1260

ctgaaatgtc gtctgcgcca agagttcgtg attgttggct atacagcccc tcaaggtagc 1320

cgcagtgcat tcggcgcact gctgctggcc gttaatgatg acgacggtct ggtgtatgcc 1380

ggccgtgtgg gcactggttt caccagccag actttaaaac aactgcatga ccaactgcaa 1440

cctttagagc gcgataccag tccgctggac aagaaactga ccagcgcaca agctcgtggc 1500

gtgcaatggg tggaaccgcg tttaatctgc gaagccgagt ttgcagagtg gacccgcgaa 1560

ggcattctgc gccaagcagc ctttgtgggt ttacgcagcg acaaaccggc aagcgaggtg 1620

gttcgcgaat atccgcagcc cgctgacatt gccagccgtc cgaaagcagc aaaaagcagc 1680

aagaccaagg cattagaggc ccccgttgcc cgcaaaaccg cacgtggcaa agtgaatgtg 1740

gctggtgtgg gtattagcca cagcgaccgc gtgattgata gcaagagcgg cacccagaag 1800

atcgaactgg cacaattcta cgaaagcatc gccgattgga ttttaccgta tttaaacaat 1860

cgcccggttg cactgctgcg ctgtccggaa ggcattgacg gcgagcaatt tttccagaag 1920

catagcgagc gtttagcaat tccgcacatt cgccagctgg atcgcaaact ggatccgggt 1980

catgcagcac tgatggaaat cgacaccgtg caagctttag tgggtgccgc acagatgggt 2040

gccatcgaat ttcacacttg gggcgccacc agtgatcgta tcgagacacc cgatcatctg 2100

gtgctggatt tagaccccga tccggcctta ccgtggcgca gcatgatcga agcaacccag 2160

atggtgctgg ccgttttaga ggagctgggc ttagaagcct ttttaaaaac cagcggcggc 2220

aaaggcatgc atatcatcgt gcctttagcc cgccacgcag attgggatac cgtgaaaggc 2280

ttcgccaaag ccatcgccga atttgttacc cagcagctgc cggaacgctt caccgccaca 2340

atgggtccta aaaaccgtgt gggccgcatc ttcgttgatt atctgcgtaa tagccgtggc 2400

ggcagtacag tgaccgcata cagcgttcgc gcccgccccg gtctgcccgt tagtgttccg 2460

atcgctttag acgaactggc tggtttaaca agcagcgccc agtgggatgt tacaaattta 2520

gagcagcgtc tgcgcgaact gaagggcgac ccgtgggagg gttatcgtaa tcgtcagcgc 2580

atcacacaga aaatgtggaa gcagctgggt gcaaagcgta gttaacacaa ggtcttctcc 2640

tgtgtgaaa 2649

<210> 25

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

agcatctggt cgcattgggt caccagc 27

<210> 26

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cttccagata actgccgtca ctccagcgc 29

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

cttcagccat acttttcata ctc 23

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

agctggacac cgtttaaact caatg 25

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

tctgttgttt gtcggtgaac tg 22

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

ctggtattgg cacaaacctg at 22

<210> 31

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

tttaacttgc tatttctagc tctaaaacgg ttcacgcgca tatcgttaac tagtattata 60

cctaggactg agctagctgt ca 82

<210> 32

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

gccgcaaggt gctaagccgc gaggaaag 28

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

cagggcagca ttgacctgct ccagc 25

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

cccagtcacg acggtctcaa aaa 23

<210> 35

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

aagccgagac ctcctgtgtg aaa 23

<210> 36

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

cccagtcacg acgaagacgc aaaa 24

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

cacaaggtct tctcctgtgt gaaa 24

Claims (5)

1.一种在大肠杆菌中有效的NHEJ系统在大肠杆菌基因编辑中的应用，其特征在于，所述NHEJ系统包括：

同时连接有Ku蛋白和ligD蛋白的CDS编码序列的pDual-Cas9-Ku-ligD质粒载体，和靶向目的基因的pDual-sgRNA质粒载体；

所述pDual-sgRNA质粒载体：顺次连接有靶向目的基因的sgRNA序列、组成型表达的强启动子J23119启动子、复制子和氨苄青霉素抗性基因；

所述pDual-Cas9-Ku-ligD质粒载体的骨架载体：顺次连接有Rep101基因、pSC101复制子、卡那霉素抗性基因、Cas9基因、araC基因、2个阿拉伯糖启动子、用于克隆Ku基因的BsaⅠ限制酶识别位点和用于克隆ligD基因的BbsⅠ限制酶识别位点；

所述Ku蛋白和ligD蛋白的CDS编码序列选自：Mno-Ku+Mfo-ligD的组合、Mbr-Ku+Mfo-ligD的组合或Mno-Ku+Msm-ligD的组合中任意一种；

所述Mno-Ku+Mfo-ligD的组合中Ku蛋白的CDS编码序列如SEQ ID NO.7所示，ligD蛋白的CDS编码序列如SEQ ID NO.18所示；

所述Mbr-Ku+Mfo-ligD的组合中的Ku蛋白的CDS编码序列如SEQ ID NO.5所示，ligD蛋白的CDS编码序列如SEQ ID NO.18所示；

所述Mno-Ku+Msm-ligD的组合中的Ku蛋白的CDS编码序列如SEQ ID NO.7所示，ligD蛋白的CDS编码序列如SEQ ID NO.19所示。

2.一种计算NHEJ系统连接效率的方法，其特征在于，所述计算NHEJ系统连接效率的方法包括：

将权利要求1中的NHEJ系统转化大肠杆菌，挑取单克隆培养后，制备感受态细胞；

将酶切后与未酶切的质粒分别转染制备的感受态细胞，培养；

统计平板上的克隆数，计算NHEJ系统的连接效率；所述NHEJ系统的连接效率的计算公式为：转化1 ng酶切后的质粒的克隆数与转化1 ng未酶切的质粒的克隆数的比值。

3.根据权利要求2所述的计算NHEJ系统连接效率的方法，其特征在于，所述酶切包括限制酶酶切。

4.根据权利要求3所述的计算NHEJ系统连接效率的方法，其特征在于，所述酶切包括EcoRⅤ限制酶酶切。

5.一种通过NHEJ系统对大肠杆菌进行基因编辑的方法，其特征在于，所述基因编辑的方法包括：

将权利要求1中的同时连接有Ku蛋白和ligD蛋白的CDS编码序列的pDual-Cas9-Ku-ligD质粒载体转化大肠杆菌，挑取单克隆培养后，制备感受态细胞；

构建靶向目的基因的pDual-sgRNA质粒载体；

将构建的所述靶向目的基因的pDual-sgRNA质粒载体转化制备的感受态细胞，培养；

挑取克隆进行验证，分析基因编辑的情况。