CN103215372A

CN103215372A - 基于dpo引物检测布氏杆菌的引物序列及其检测试剂盒

Info

Publication number: CN103215372A
Application number: CN2013101655608A
Authority: CN
Inventors: 徐义刚; 李丹丹; 张柏棋; 刘忠梅; 李苏龙
Original assignee: HEILONGJIANG CENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE TECHNICAL CENTER
Current assignee: HEILONGJIANG CENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE TECHNICAL CENTER
Priority date: 2013-05-08
Filing date: 2013-05-08
Publication date: 2013-07-24
Anticipated expiration: 2033-05-08
Also published as: CN103215372B

Abstract

本发明公开了一种基于DPO引物检测布氏杆菌的PCR方法及其DPO引物序列。选择布氏杆菌属（Brucella）Omp25基因为靶基因，通过基因序列的BLAST分析，选取靶基因序列的保守区设计合成双启动寡核苷酸引物（DPO)，DPO引物的核苷酸序列为：BO-DPOF：5′-CTTTTGCTGCCGACGCCATCCIIIIIAGGAACAGC-3′，BO-DPOR：5′-TTCGTCGTCCAAGCCGTTGTTAAIIIIIGCTTGATCT-3′，建立DPO-PCR检测方法，可对布氏杆菌进行精确定性检测。本发明还涉及检测用试剂盒，具有检测特异性高、准确性高、灵敏度好的优点。

Description

基于DPO引物检测布氏杆菌的引物序列及其检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种基于DPO引物检测布氏杆菌的引物序列及其检测试剂盒。

背景技术

布氏杆菌属（Brucella）是一类革兰氏阴性短小杆菌，可感染多种家畜和野生动物，主要引起母畜传染性流产。同时也可感染人，特别是羊布氏杆菌对人的威胁最大，引起相似的临床症状和病理损伤，如睾丸炎或附睾炎、不育、生殖器官及胎膜发炎、流产、不孕、关节炎、气管炎及各种组织的局部病灶等，导致巨大的经济损失和严重的公共卫生问题。

现有的布氏杆菌检测方法：

细菌学检测，初步分离时，须在5%~10%二氧化碳环境中才能生长，且待检样本中必须存在大量活菌才能被分离出，细菌培养周期长，因此该检测方法已逐渐被淘汰。血清学检测，凝集试验操作简便、检测时间短，但由于IgM在中性或弱酸性时凝集能力最活跃，所以凝集试验往往因抗体的交叉反应易出现假阳性结果，2000年OIE取消了凝集试验作为布氏杆菌病的诊断方法；沉淀试验由于人为进行结果观察，所以存在判定结果的主观性，有时会出现误判，也不是一种理想的检测方法；补体结合试验主要用以检测牛、羊和猪布氏杆菌病，操作中对温度和试剂滴加量要求高，也无法避免假阳性结果。

变态反应，主要用于山羊和绵羊检疫，但山羊的变态反应不如绵羊变态反应易判定结果，仅对中、后期病山羊的诊断意义较大，适于山羊布氏杆菌病的筛检，不作个体的诊断依据。

ELISA方法，竞争ELISA尚无诊断标准，间接ELISA是一种先进、快速、可靠的检测方法，但存在无法区别疫苗抗体与致病株抗体的不足。

PCR方法，是用于细菌DNA检测最可靠的方法。PCR技术作为一种高度灵敏、快速简便的检测方法在诸多领域得到了广泛应用，尤其在病原体检测方面取得了革命性的成果，成为核酸快速检测的金标准，并在此基础之上，又发展了DNA探针技术、实时荧光PCR技术和PCR结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术等，而PCR引物的设计又成为了制约该类检测方法成败的关键性因素。常规的PCR引物设计，不仅需要反复比对引物的特异性，而且需要优化引物的各项参数与反应条件，尤其是退火温度，以防止非特异性扩增，特别是涉及多重PCR时，需要大量的实验以验证检测方法的特异性，费时又费力。

双启动寡核苷酸引物（Dual priming oligonucleotide，DPO）的设计方法简化了建立常规PCR方法的操作步骤。该DPO引物的设计分为两部分，中间用多聚次黄嘌呤肌苷连接，5'-端长18-25bp，3'-端长6-15bp。由于该类引物特殊的结构，引物自身以及引物间难形成二级结构且对退火温度不敏感，试验过程中不需要对引物进行筛选以及对退火温度进行优化。同时，DPO引物与模板发生错配的几率小，因为只要有3个以上碱基发生错配，就不会成功扩增，比常规PCR引物的特异性更强，所以利用DPO引物建立的PCR方法，其检测结果比常规PCR方法更为精确。

在此情况下，采用DPO引物建立DPO-PCR方法对布氏杆菌实施精准检测，对保障公共卫生安全具有重要意义。本发明根据布氏杆菌属（Brucella）Omp25靶基因的保守区设计合成了DPO鉴定引物，通过反应体系与反应条件的优化，建立了布氏杆菌DPO-PCR精准检测方法。本发明可用于临床病例的快速诊断和流行病学调查，具有一定的实用性。

发明内容

基于以上不足之处，本发明的目的在于提供一种基于DPO引物检测布氏杆菌的引物序列及其检测试剂盒。

本发明所采用的技术如下：

一种基于DPO引物检测布氏杆菌的PCR方法检测用引物对，

上游引物BO-DPOF：如序列表Seq No.1所示，

下游引物BO-DPOR：如序列表Seq No.2所示。

本发明还具有如下特征：

1、一种基于DPO引物检测布氏杆菌的PCR方法制备阳性对照品的PCR扩增引物，

上游引物BO-F：如序列表Seq No.3所示，

下游引物BO-R：如序列表Seq No.4所示。

2、一种基于DPO引物检测布氏杆菌的PCR方法阳性对照品pMD-T-Omp25，如序列表Seq No.5所示。

3、一种基于DPO引物检测布氏杆菌的PCR方法阳性对照品pMD-T-Omp25的制备方法，包括以下步骤：

（1）、PCR模板的制备：布氏杆菌基因组DNA的提取和纯化；

（2）、选择布氏杆菌属（Brucella）Omp25基因作为靶基因，设计阳性对照品的PCR扩增引物：上游引物BO-F ，如序列表Seq No.3所示和下游引物BO-R，如序列表Seq No.4所示，并进行靶基因的PCR扩增；

（3）、阳性对照品pMD-T-Omp25的制备；

步骤（2）中，靶基因的PCR反应体系如下：

10×PCR Buffer	2.5μL
		dNTP (2.5mM for each)	2.0μL
上游引物BO-F (10μM)	1.0μL
		下游引物BO-R (10μM)	1.0μL
TaqDNA Polymerase(5U/μL)	0.5μL
		DNA模板	0.5μL
ddH₂O	17.5μL

PCR的反应条件为：95℃ 5min；94℃ 30s、60.5℃ 45s、72℃ 45s，进行35个循环；72℃延伸10min。

步骤（3）中，阳性对照品的制备过程，包括如下步骤：将步骤（2）中所得PCR产物与克隆载体pMD-19-T vector连接，转化大肠杆菌感受态JM109，获得阳性克隆菌株，并制备质粒pMD-T-Omp25作为阳性对照品。

4、一种基于DPO引物检测布氏杆菌的PCR方法检测用引物对，检测布氏杆菌的PCR反应体系如下：

10×PCR Buffer (Mg²⁺ free)	2.5 μL
		dNTP (2.5mM for each)	1.5 μL
Mg²⁺(25mM)	2.0 μL
		上游引物BO-DPOF(10μM)	1.0 μL
下游引物BO-DPOF(10μM)	1.0 μL
		TaqDNA Polymerase (5U/μL)	0.1 μL
DNA模板	1.0 μL
		ddH₂O	15.9 μL

PCR反应条件为：95℃ 5min；95℃ 30s、45℃-70℃ 30s、72℃ 30s，进行35个循环；72℃延伸10min。

5、一种基于DPO引物检测布氏杆菌的PCR方法检测用引物对，所述的引物对退火温度不敏感，有效温度范围为45℃-70℃。

6、一种基于DPO引物检测布氏杆菌的PCR方法检测用试剂盒，

包括引物对：上游引物BO-DPOF：如序列表Seq No.1所示，

下游引物BO-DPOR：如序列表Seq No.2所示、

阳性对照品（pMD-T-Omp25）：如序列表Seq No.5所示、

阴性对照品(ddH₂O)和

PCR反应液：10×PCR Buffer；2.5mM的dNTP，25mM的Mg²⁺，

10μM上游引物BO-DPOF，10μM下游引物BO-DPOF和5U/μL TaqDNA Polymerase。

本发明分别以牛布氏杆菌(分离株)、羊布氏杆菌(分离株)、猪布氏杆菌(分离株)、嗜水气单胞菌(ATCC7966)、空肠弯曲菌(ATCC33560)、大肠杆菌(ATCC25922)、肠出血性大肠杆菌O157:H7 (ATCC35150、ATCC43889、ATCC43895)、肠毒素性大肠杆菌(ATCC35401)、肠侵袭性大肠杆菌(ATCC43893)、肠致病性大肠杆菌(ATCC11775、ATCC43887)、阪崎肠杆菌(ATCC51329)、单核细胞增生李斯特菌(ATCC19111)、绵羊李斯特菌(ATCC33090)、英诺克李斯特菌(ATCC19119)、威尔斯李斯特菌(ATCC35897)、西尔李斯特菌(ATCC35967)、类志贺邻单胞菌(ATCC14030)、变形杆菌(ATCC49027)、猪霍乱沙门氏菌(ATCC10708)、福氏志贺氏菌(ATCC12022)、金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、溶血性链球菌(CMCC32121)、霍乱弧菌(ATCC14035)、副溶血性弧菌(ATCC27519)、溶藻性弧菌(ATCC33839)、创伤弧菌(ATCC33149)和小肠结肠炎耶尔森氏菌(ATCC9610)的基因组DNA进行实验，以检验该方法的特异性。结果显示，本发明方法能够对布氏杆菌属致病菌进行特异性检测，且设计合成的引物对之间以及引物与其他细菌之间无交叉反应，证明本发明方法具有较强的检测特异性。本发明的检测试剂盒还具有准确性高、灵敏度好的优点。

将已知菌体浓度的布氏杆菌进行10倍梯度稀释，采用细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取每级稀释度菌体的基因组DNA，各取1μL作为模板进行DPO-PCR检测，以检验该方法的灵敏性。结果显示，该方法对布氏杆菌的最低检出限为1.24×10²CFU/mL，说明本检测方法具有较高的检测灵敏性。

利用本发明方法重复检测同一阳性标准品30次，检测结果均相同；两次（时间间隔60天）检测同一批次制备的阳性标准品，检测结果均相同，可见本发明方法具有良好的重复性和稳定性。

将本发明方法应用于检验检疫实践工作中，其结果与布氏杆菌行业标准检测法（SN/T 1088-2010 布氏杆菌检疫技术规范）进行比较，验证该检测方法的可靠性与实用性。结果显示，利用本发明方法对采集的229份羊脏器样本、77份牛脏器样本、170份猪脏器样本、295份禽类脏器样本、50份牛肉样本、50份猪肉样本和85份禽肉样本进行了检测，共检测出27份布氏杆菌阳性样本，本发明方法的检测结果与行业标准法检测结果符合率为100%。实践证明，本发明方法比布氏杆菌行标法中常规检测方法的敏感度更高，检测速度更快，具有潜在的实用价值。

附图说明

图1是布氏杆菌DPO-PCR检测方法的建立示意图，

其中，M为DNA Marker 100 ladder，1-4为DPO-PCR检测阳性结果，5-7为 DPO-PCR检测阴性结果。

图2是布氏杆菌DPO-PCR检测方法退火温度不敏感性结果示意图，

其中，M为 DNA Marker DL2000，1为45℃，2为 47℃，3为 49℃，4为52℃，5为 55℃，6为 58℃，7为 61℃，8为64℃，9为67℃，10为70℃。

图3为布氏杆菌DPO-PCR检测方法灵敏度结果示意图，

其中，M为 DNA Marker 100 ladder，1为模板浓度1.24×10⁶CFU/mL，2为模板浓度1.24×10⁵CFU/mL，3为模板浓度1.24×10⁴CFU/mL，4为模板浓度1.24×10³CFU/mL，5为模板浓度1.24×10²CFU/mL，6为模板浓度1.24×10¹CFU/mL，7为模板浓度1.24×10⁰CFU/mL。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例1

布氏杆菌DNA模板的制备

参照TIANamp Bacteria DNA Kit 说明书进行细菌基因组DNA的提取和纯化，按顺序加入相应试剂：

（1）取1.5mL菌液，10000r/min 离心1min，弃上清，加入200μL缓冲液GA，彻底悬浮菌体；

（2）加入20μL蛋白酶K (20mg/mL)，并加入220μL 缓冲液GB，充分混匀，70℃水浴作用10min；

（3）加入220μL无水乙醇，充分混匀15s，简短离心后将所得溶液（包括絮状沉淀）转移至吸附柱CB3中，12000r/min离心30s，弃去收集管中的液体；

（4）向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD（含无水乙醇），12000r/min离心30s，弃去收集管中的液体；

（5）向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW（含无水乙醇），12000r/min离心30s，弃去收集管中的液体；

（6）重复上步操作；

（7）将吸附柱CB3放回收集管中，12000r/min离心2min，室温放置2-5min，晾干残留的漂洗液；

（8）将吸附柱CB3转入新的收集管中，在吸附膜中央加入100μL缓冲液TE，室温放置2-5min，12000r/min离心2min，收集DNA洗脱液。

实施例2 PCR引物的设计与合成

选择布氏杆菌属（Brucella）Omp25基因作为靶基因，设计合成下列引物，进行靶基因扩增：

（1）布氏杆菌Omp25基因阳性对照品制备PCR扩增引物：

BO-F：5′-TCGTAATCGTCTCGGCTGCGT-3′，

BO-R：5′-GGATGTTGTCCGTCAGCTTGG-3′。

（2）对布氏杆菌属（Brucella）Omp25基因序列进行BLAST分析，选取靶基因序列的保守区设计合成DPO鉴定引物（PCR产物大小为405bp），引物核苷酸序列为：

BO-DPOF：5′-CTTTTGCTGCCGACGCCATCCIIIIIAGGAACAGC-3′，

BO-DPOF：5′-TTCGTCGTCCAAGCCGTTGTTAAIIIIIGCTTGATCT-3′。

实施例3 阳性对照品的制备

以BO-F和BO-R为引物，采用PCR法扩增布氏杆Omp25基因。PCR反应体系为：

经琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，PCR产物大小为501bp。

将PCR产物与pMD-19-T vector连接，转化感受态大肠杆菌JM109，获得阳性重组菌，参照华舜小量质粒DNA提取试剂盒说明书制备阳性质粒：

（1）挑取阳性克隆单菌落，接种于5mL含100μg/mL Amp^r的LB培养基中，37℃培养过夜；

（2）取1～3mL过夜培养菌液，12000r/min离心5min，弃上清，加入250μL 的Buffer P1（含RNase）充分振荡菌体沉淀至其彻底悬浮；

（3）加入250μL 的Buffer P2，立即温和地上下颠倒离心管6-10次，混匀，室温静置2-4min；

（4）加入350μL 的Buffer P3，温和反复颠倒离心管6-10次，混匀，12000r/min离心10min；

（5）将上清液移入吸附柱中，12000r/min离心30s，弃滤液，将吸附柱放入收集管中；

（6）加入500μL B1液，12000r/min离心30s，弃滤液，将吸附柱放入收集管中；

（7）加入500μL W1液（含无水乙醇），12000r/min离心30s，弃滤液，将吸附柱放入收集管中；

（8）加入500μL W1液（含无水乙醇），室温静置1min，12000r/min离心30s，弃滤液，将吸附柱放入收集管中，12000r/min空载离心1min；

（9）将吸附柱转移至一个洁净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入150μL去离子水，室温静置2min，12000r/min离心1min，洗脱收集质粒DNA。

将提取的质粒DNA进行定量，作为试剂盒阳性质控标准品-20℃保存备用。定量计算公式为：阳性质粒拷贝数copies/μL= (OD₂₆₀×50×10^-9×稀释倍数×6.02×10²³) / (660×碱基数)，式中：50代表用直径1cm比色杯在OD₂₆₀等于1时相对应的双链DNA浓度为50μg/mL；660代表双链DNA碱基对平均分子量。

实施例4 DPO-PCR检测反应体系的建立与优化

DPO-PCR反应体系为25μL：10×PCR Buffer (Mg²⁺free) 2.5μL，将Mg²⁺、dNTP、Taq DNA Polymerase和引物制备成不同浓度的组合，用ddH₂O补充至25μL。Mg²⁺、dNTP、Taq DNA Polymerase和引物的浓度范围依次为：Mg²⁺浓度范围设定在1.0mmol/L-8mmol/L，以0.5mmol/L递增；dNTP浓度范围设定在0.1mmol/L-0.8mmol/L，以0.05mmol/L递增；Taq DNA Polymerase浓度范围设定在0.5U-3.5U，以0.5U单位递增；引物浓度范围设定在0.1μmol/L-0.6μmol/L，以0.1μmol/L递增，采用矩阵法进行对比试验，以确定最佳的反应体系组成。经琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增结果，如图1所示。确定的布氏杆菌DPO-PCR检测方法的反应体系为：

确定布氏杆菌DPO-PCR的反应条件为：95℃ 5min；95℃ 30s、45℃-70℃ 30s、72℃ 30s，进行35个循环；72℃延伸10min 。DPO-PCR对退火温度不敏感，PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示。

实施例5 DPO-PCR检测布氏杆菌特异性试验

利用所建立的基于DPO引物精准检测布氏杆菌的PCR方法分别检测牛布氏杆菌(分离株)、羊布氏杆菌(分离株)、猪布氏杆菌(分离株)、嗜水气单胞菌(ATCC7966)、空肠弯曲菌(ATCC33560)、肠出血性大肠杆菌O157:H7 (ATCC35150、ATCC43889、ATCC43895)、大肠杆菌(ATCC25922)、肠毒素性大肠杆菌(ATCC35401)、肠侵袭性大肠杆菌(ATCC43893)、肠致病性大肠杆菌(ATCC11775、ATCC43887)、阪崎肠杆菌(ATCC51329)、单核细胞增生李斯特菌(ATCC19111)、绵羊李斯特菌(ATCC33090)、英诺克李斯特菌(ATCC19119)、威尔斯李斯特菌(ATCC35897)、西尔李斯特菌(ATCC35967)、类志贺邻单胞菌(ATCC14030)、变形杆菌(ATCC49027)、猪霍乱沙门氏菌(ATCC10708)、福氏志贺氏菌(ATCC12022)、金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、溶血性链球菌(CMCC32121)、霍乱弧菌(ATCC14035)、副溶血性弧菌(ATCC27519)、溶藻性弧菌(ATCC33839)、创伤弧菌(ATCC33149)和小肠结肠炎耶尔森氏菌(ATCC9610)，以探究该检测方法的特异性。结果显示，本发明方法能够对布氏杆菌属病原菌进行特异性的检测，且设计合成的引物对之间以及引物与其他细菌之间无交叉反应，证明本发明方法具有较强的检测特异性，结果如表1所示。

表1 DPO-PCR方法特异性实验结果

实施例6 DPO-PCR检测布氏杆菌灵敏度试验

将已知菌体浓度为1.24×10⁷CFU/mL的布氏杆菌进行10倍梯度稀释，采用细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取每级稀释度菌体的基因组DNA，各取1μL作为模板利用建立的DPO-PCR方法进行检测，以检验该方法的灵敏性。结果显示，该方法对布氏杆菌的最低检出限为1.24×10²CFU/mL，说明本检测方法具有较高的检测灵敏性，结果如图3所示。

实施例7 DPO-PCR检测布氏杆菌重复性试验

利用建立的基于DPO引物检测布氏杆菌的PCR方法重复30次检测同一阳性标准品，考察该方法检测的重复性和稳定性。结果显示，每次检测结果均相同。

利用建立的基于DPO引物检测布氏杆菌的PCR方法间隔60天检测同一批次制备的阳性标准品，考察该方法检测的重复性和稳定性。结果显示，两次检测结果均相同。

实施例8 DPO-PCR检测布氏杆菌实践验证试验

将本发明方法应用于检验检疫实践工作中，其结果与布氏杆菌行业标准检测法（SN/T 1088-2010 布氏杆菌检疫技术规范）进行比较，验证该检测方法的可靠性与实用性。结果显示，利用本发明方法对采集的229份羊脏器样本、77份牛脏器样本、170份猪脏器样本、295份禽类脏器样本、50份牛肉样本、50份猪肉样本和85份禽肉样本进行了检测，共检测出27份布氏杆菌阳性样本，本发明方法的检测结果与行业标准法检测结果符合率为100%，结果如表2所示。实践证明，本发明方法比布氏杆菌行标法中常规检测方法的敏感度更高，检测速度更快，具有潜在的实用价值。

表2 检测方法的实践应用结果

Figure 2013101655608100002DEST_PATH_IMAGE014

<110>黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>基于DPO引物检测布氏杆菌的引物序列及其检测试剂盒

<160>5

<210>1

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221> modified_base

<222>(22,23,24,25,26)

<223>I

<400>1

CTTTTGCTGC CGACGCCATC CIIIIIAGGA ACAGC 35

<210>2

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221> modified_base

<222>(24,25,26,27,28)

<223>I

<400>2

TTCGTCGTCC AAGCCGTTGT TAAIIIIIGC TTGATCT 37

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

TCGTAATCGT CTCGGCTGCG T 21

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

GGATGTTGTC CGTCAGCTTG G 21

<210>5

<211>3193

<212>DNA

<213>pMD-T-Omp25

<400>5

TCGCGCGTTT CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG GAGACGGTCA 60

CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG TCAGGGCGCG TCAGCGGGTG 120

TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC 180

ACCATATGCG GTGTGAAATA CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCGCC 240

ATTCGCCATT CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC TCTTCGCTAT 300

TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT AAGTTGGGTA ACGCCAGGGT 360

TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGAATT AGAACTCGGT ACGCGCGGAT 420

CTTCCAGAGA TTCGTAATCG TCTCGGCTGC GTTGCTGCCG TTCTCTGCGA CCGCTTTTGC 480

TGCCGACGCC ATCCAGGAAC AGCCTCCGGT TCCGGCTCCG GTTGAAGTAG CTCCCCAGTA 540

TAGCTGGGCT GGTGGCTATA CCGGTCTTTA CCTTGGCTAC GGCTGGAACA AGGCCAAGAC 600

CAGCACCGTT GGCAGCATCA AGCCTGACGA TTGGAAGGCT GGCGCCTTTG CTGGCTGGAA 660

CTTCCAGCAG GACCAGATCG TATACGGCGT TGAAGGTGAT GCAGGTTATT CCTGGGCCAA 720

GAAGTCCAAG GACGGCCTGG AAGTCAAGCA GGGCTTTGAA GGCTCGCTGC GTGCCCGCGT 780

TGGCTACGAC CTGAACCCGG TTATGCCGTA CCTCACGGCT GGTATTGCCG GTTCGCAGAT 840

CAAGCTTAAC AACGGCTTGG ACGACGAAAG CAAGTTCCGC GTGGGTTGGA CGGCTGGTGC 900

CGGTCTCGAA GCCAAGCTGA CGGACAACAT CCATCGTCGA ACGGCAGGCG TGCAAACTTG 960

GCGTAATCAT GGTCATAGCT GTTTCCTGTG TGAAATTGTT ATCCGCTCAC AATTCCACAC 1020

AACATACGAG CCGGAAGCAT AAAGTGTAAA GCCTGGGGTG CCTAATGAGT GAGCTAACTC 1080

ACATTAATTG CGTTGCGCTC ACTGCCCGCT TTCCAGTCGG GAAACCTGTC GTGCCAGCTG 1140

CATTAATGAA TCGGCCAACG CGCGGGGAGA GGCGGTTTGC GTATTGGGCG CTCTTCCGCT 1200

TCCTCGCTCA CTGACTCGCT GCGCTCGGTC GTTCGGCTGC GGCGAGCGGT ATCAGCTCAC 1260

TCAAAGGCGG TAATACGGTT ATCCACAGAA TCAGGGGATA ACGCAGGAAA GAACATGTGA 1320

GCAAAAGGCC AGCAAAAGGC CAGGAACCGT AAAAAGGCCG CGTTGCTGGC GTTTTTCCAT 1380

AGGCTCCGCC CCCCTGACGA GCATCACAAA AATCGACGCT CAAGTCAGAG GTGGCGAAAC 1440

CCGACAGGAC TATAAAGATA CCAGGCGTTT CCCCCTGGAA GCTCCCTCGT GCGCTCTCCT 1500

GTTCCGACCC TGCCGCTTAC CGGATACCTG TCCGCCTTTC TCCCTTCGGG AAGCGTGGCG 1560

CTTTCTCATA GCTCACGCTG TAGGTATCTC AGTTCGGTGT AGGTCGTTCG CTCCAAGCTG 1620 GGCTGTGTGC ACGAACCCCC CGTTCAGCCC GACCGCTGCG CCTTATCCGG TAACTATCGT 1680 CTTGAGTCCA ACCCGGTAAG ACACGACTTA TCGCCACTGG CAGCAGCCAC TGGTAACAGG 1740 ATTAGCAGAG CGAGGTATGT AGGCGGTGCT ACAGAGTTCT TGAAGTGGTG GCCTAACTAC 1800 GGCTACACTA GAAGAACAGT ATTTGGTATC TGCGCTCTGC TGAAGCCAGT TACCTTCGGA 1860 AAAAGAGTTG GTAGCTCTTG ATCCGGCAAA CAAACCACCG CTGGTAGCGG TGGTTTTTTT 1920 GTTTGCAAGC AGCAGATTAC GCGCAGAAAA AAAGGATCTC AAGAAGATCC TTTGATCTTT 1980 TCTACGGGGT CTGACGCTCA GTGGAACGAA AACTCACGTT AAGGGATTTT GGTCATGAGA 2040 TTATCAAAAA GGATCTTCAC CTAGATCCTT TTAAATTAAA AATGAAGTTT TAAATCAATC 2100 TAAAGTATAT ATGAGTAAAC TTGGTCTGAC AGTTACCAAT GCTTAATCAG TGAGGCACCT 2160 ATCTCAGCGA TCTGTCTATT TCGTTCATCC ATAGTTGCCT GACTCCCCGT CGTGTAGATA 2220 ACTACGATAC GGGAGGGCTT ACCATCTGGC CCCAGTGCTG CAATGATACC GCGAGACCCA 2280 CGCTCACCGG CTCCAGATTT ATCAGCAATA AACCAGCCAG CCGGAAGGGC CGAGCGCAGA 2340 AGTGGTCCTG CAACTTTATC CGCCTCCATC CAGTCTATTA ATTGTTGCCG GGAAGCTAGA 2400 GTAAGTAGTT CGCCAGTTAA TAGTTTGCGC AACGTTGTTG CCATTGCTAC AGGCATCGTG 2460 GTGTCACGCT CGTCGTTTGG TATGGCTTCA TTCAGCTCCG GTTCCCAACG ATCAAGGCGA 2520 GTTACATGAT CCCCCATGTT GTGCAAAAAA GCGGTTAGCT CCTTCGGTCC TCCGATCGTT 2580 GTCAGAAGTA AGTTGGCCGC AGTGTTATCA CTCATGGTTA TGGCAGCACT GCATAATTCT 2640 CTTACTGTCA TGCCATCCGT AAGATGCTTT TCTGTGACTG GTGAGTACTC AACCAAGTCA 2700 TTCTGAGAAT AGTGTATGCG GCGACCGAGT TGCTCTTGCC CGGCGTCAAT ACGGGATAAT 2760 ACCGCGCCAC ATAGCAGAAC TTTAAAAGTG CTCATCATTG GAAAACGTTC TTCGGGGCGA 2820 AAACTCTCAA GGATCTTACC GCTGTTGAGA TCCAGTTCGA TGTAACCCAC TCGTGCACCC 2880 AACTGATCTT CAGCATCTTT TACTTTCACC AGCGTTTCTG GGTGAGCAAA AACAGGAAGG 2940 CAAAATGCCG CAAAAAAGGG AATAAGGGCG ACACGGAAAT GTTGAATACT CATACTCTTC 3000 CTTTTTCAAT ATTATTGAAG CATTTATCAG GGTTATTGTC TCATGAGCGG ATACATATTT 3060 GAATGTATTT AGAAAAATAA ACAAATGGGG GTTCCGCGCA CATTTCCCCG AAAAGTGCCA 3120 CCTGACGTCT AAGAAACCAT TATTATCATG ACATTAACCT ATAAAAATAG GCGTATCACG 3180 AGGCCCTTTC GTC 3193

Claims

1.一种基于DPO引物检测布氏杆菌的PCR方法检测用引物对，其特征在于，

上游引物BO-DPOF：如序列表Seq No.1所示，

下游引物BO-DPOR：如序列表Seq No.2所示。

2.一种基于DPO引物检测布氏杆菌的PCR方法制备阳性对照品的PCR扩增引物，其特征在于，

上游引物BO-F：如序列表Seq No.3所示，

下游引物BO-R：如序列表Seq No.4所示。

3.一种基于DPO引物检测布氏杆菌的PCR方法阳性对照品pMD-T-Omp25，其特征在于，如序列表Seq No.5所示。

4.根据权利要求3所述的一种基于DPO引物检测布氏杆菌的PCR方法阳性对照品pMD-T-Omp25的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）、PCR模板的制备：布氏杆菌基因组DNA的提取和纯化；

（3）、阳性对照品pMD-T-Omp25的制备；

步骤（2）中，靶基因的PCR反应体系如下：

PCR的反应条件为：95℃ 5min；94℃ 30s、60.5℃ 45s、72℃ 45s，进行35个循环；72℃延伸10min，步骤（3）中，阳性对照品的制备过程，包括如下步骤：将步骤（2）中所得PCR产物与克隆载体pMD-19-T vector连接，转化大肠杆菌感受态JM109，获得阳性克隆菌株，并制备质粒pMD-T-Omp25作为阳性对照品。

5.根据权利要求1所述的一种基于DPO引物检测布氏杆菌的PCR方法检测用引物对，其特征在于：

检测布氏杆菌的PCR反应体系如下：

6.根据权利要求1所述的一种基于DPO引物检测布氏杆菌的PCR方法检测用引物对，其特征在于：所述的引物对退火温度不敏感，有效温度范围为45℃-70℃。

7.一种基于DPO引物检测布氏杆菌的PCR方法检测用试剂盒，其特征在于：

包括引物对：上游引物BO-DPOF：如序列表Seq No.1所示，

下游引物BO-DPOR：如序列表Seq No.2所示、

阳性对照品（pMD-T-Omp25）：如序列表Seq No.5所示、

阴性对照品(ddH₂O)和

PCR反应液：10×PCR Buffer(Mg²⁺ free)；2.5mM的dNTP，25mM的Mg²⁺，

10μM上游引物BO-DPOF，10μM下游引物BO-DPOF和5U/μL Taq DNA Polymerase。