CN105255879A - 基于dpo引物的实时荧光pcr检测鼠李糖乳杆菌的方法、引物及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种引物对，其中一条引物包含SEQ？ID？NO：1所示的核苷酸序列，另一条引物包含SEQ？ID？NO：2所示的核苷酸序列。本发明还提供了所述的引物对在制备检测鼠李糖乳杆菌的试剂盒中的用途以及基于DPO引物的实时荧光PCR检测鼠李糖乳杆菌的方法。本发明针对鼠李糖乳杆菌设计特异性DPO引物，建立了实时荧光PCR法，成功实现了种水平的鉴定，灵敏度高；本发明将SYBR？Green？Ⅰ实时荧光PCR和DPO引物检测技术相结合，成功建立了一种特异性强、灵敏度高、具备定量能力的鼠李糖乳杆菌的检测方法；本发明的DPO引物和方法在不同实验室之间具有通用性；本发明将DPO引物和SYBR？Green？I的实时荧光PCR结合起来，检测结果易于判断，增强了本方法的实用性。

Description

基于DPO引物的实时荧光PCR检测鼠李糖乳杆菌的方法、引物及试剂盒

技术领域

本发明涉及菌株检测领域，特别涉及检测样品如微生物肥料、食品、医用益生菌制剂等中鼠李糖乳杆菌或者含有鼠李糖乳杆菌DNA的方法以及用于该方法的引物、含有该引物的组合物和试剂盒。

背景技术

鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)是一种广泛使用的益生菌，具有维持肠道微生态平衡，提高机体免疫力等功效，目前已经被应用于食品、医用益生菌制剂等领域。近年来，该菌的功能不断被开发，目前鼠李糖乳杆菌已经应用在微生物肥料领域，对这些产品中微生物的准确鉴定是产品质量控制的重要依据，因此建立一种快速、准确的鉴定方法具有重要意义。

目前鼠李糖乳杆菌的检测主要依靠传统生理生化和分子生物学方法进行。

传统生理生化耗时耗力，而且由于乳杆菌属许多种非常相似，生理生化特征也存在许多相似之处，实际检测过程中难以判断，不能满足实际检测的需要。

基于特异性引物的PCR的方法具备快速、准确、低成本的优点，目前被广泛用于转基因、食源性微生物、医学病原菌等方面的检测。目前PCR法已经被应用于鼠李糖乳杆菌的检测，Kwon等建立用于检测鼠李糖乳杆菌的特异性引物，但需要另外一对引物将鼠李糖乳杆菌与干酪乳杆菌区分开；杨小红等建立了普通PCR法检测鼠李糖乳杆菌，并用40株标准菌株验证了方法的特异性，并将该特异性引物成功转化成为农业部标准NY/T2066-2011。以往报道的特异性引物检测鼠李糖乳杆菌全部使用的是普通引物，需要严格控制反应条件尤其是退火温度，退火温度的变化可能会影响到引物的特异性，例如农业部标准NY/T2066-2011中所使用的鼠李糖乳杆菌特异性引物以较高的退火温度(67℃)来保证引物的特异性。而不同实验室之间由于仪器、人员等差异，可能会无法精确重复出试验的各项条件，导致检测特异性受到影响，可能照成误判，而且普通PCR法需要进一步凝胶电泳判断结果，增加了检测所需时间。

实时荧光PCR中使用TaqMan探针能检测PCR中的特异性扩增产物，而不受非特异性扩增产物的影响，因此被广泛应用于微生物的定性及定量检测，但一条有效的荧光探针需要具备很高的保守性、合适的GC含量和长度、以及合适的Tm值等，而且不同乳杆菌之间的差异较小，这使探针设计的难度大大增加。另外，探针合成的价格比较昂贵，因而在一定程度上限制了特异性荧光探针的使用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、具备定量能力、通用性和实用性强的基于DPO引物的实时荧光PCR用于检测鼠李糖乳杆菌的方法，本发明还提供了用于该方法的DPO引物和含有该DPO引物的试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

本发明提供了一种引物对，其中一条引物包含SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，另一条引物包含SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。

本发明还提供了所述的引物对在制备检测鼠李糖乳杆菌的试剂盒中的用途。

进一步的，本发明还提供了一种检测样品中鼠李糖乳杆菌的试剂盒，所述试剂盒中含有权利要求1所述的引物对。

所述试剂盒还包括Taq酶和ddH₂O，所述Taq酶优选为与SYBR染料预混好的ExTaq酶。

所述试剂盒还包括细菌基因组DNA提取试剂。

更进一步的，本发明提供了一种检测样品中鼠李糖乳杆菌的方法，包括使用上述的引物对、上述试剂盒的步骤。

上述检测样品中鼠李糖乳杆菌的方法优选包括如下步骤：

1)实时荧光PCR反应

以含有DNA的样品为模板与DPO引物进行实时荧光PCR反应，所述DPO引物为SEQIDNO：1和SEQIDNO：2；

2)判断待检样品。

优选的，在步骤1)之前还包括DNA的提取步骤。

优选的，所述实时荧光PCR反应的反应体系如下：

SYBRPremixExTaq^TM10μL

DPO引物终浓度为0.2μmol/L

DNA模板50ng

ddH₂O补足至20μL。

优选的，所述实时荧光PCR反应的反应体系如下：所述实时荧光PCR反应的程序如下：95℃预变性30s；95℃变性5s、50-60℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环。

本发明的有益效果包括：

(1)本发明针对鼠李糖乳杆菌的gyrB基因设计特异性DPO引物，建立了实时荧光PCR法，成功实现了种水平的鉴定，其灵敏度高于农业部标准1个数量级。

(2)本发明将SYBRGreenⅠ实时荧光PCR和DPO引物检测技术相结合，吸收了DPO引物高特异性且引物之间难以形成二聚体等优点，成功建立了一种特异性强、灵敏度高、具备定量能力的鼠李糖乳杆菌的检测方法。

(3)本发明的DPO引物的特异性在较低退火温度(50℃)和较高的退火温度下(60℃)下结果均与农业部标准一致，这大大增强了本发明的DPO引物和方法在不同实验室之间的通用性。

(4)本发明将DPO引物和SYBRGreenI的实时荧光PCR结合起来，检测结果易于判断，无需凝胶电泳，这也增强了本方法的实用性。

附图说明

图1是基于DPO引物的鼠李糖乳杆菌的实时荧光PCR的扩增曲线，其中横坐标为循环数，纵坐标为荧光值，其中1-12分别代表表1中1-12号菌株。

图2是采用本发明的DPO引物对梯度稀释的鼠李糖乳杆菌的DNA进行实时荧光PCR的灵敏度检测结果，其中从左至右的DNA模板浓度依次为10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL，最右为阴性对照。

图3为利用农业部标准NY/T2066-2011对梯度稀释的鼠李糖乳杆菌的DNA进行常规PCR的灵敏度检测结果，其中M代表MarkerDL2000；1-4的DNA模板浓度按顺序从左至右分别是10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL，5为阴性对照。

具体实施方式：

除非特殊说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。

鼠李糖乳杆菌作为益生菌被广泛应用于食品、医药、农业等领域，因此建立这些产品中鼠李糖乳杆菌的检测方法具有重要意义。在细菌进化过程中，核糖体RNA(rRNA)基因的进化相对保守，因此被认为是对细菌进行亲缘关系分析的最理想的基因，该基因序列几乎可以对所有细菌进行属水平上的鉴定。然而，由于16SrRNA基因的高度保守性，对相似性极高的近源种无法做出进一步区分，很难设计出种特异性引物。单拷贝gyrB基因作为另外一种看家基因，由于其进化速度较16SrRNA基因快，目前已经被广泛应用于微生物鉴定中。

本发明通过检测鼠李糖乳杆菌的gyrB基因来检测样品中的鼠李糖乳杆菌。由此，运用本方法可以快速的检测出样品中的鼠李糖乳杆菌。

本发明检测鼠李糖乳杆菌的gyrB基因是通过实时荧光定量PCR来实现的。

为了实现上述目的，本发明针对鼠李糖乳杆菌的gyrB基因设计了特异性DPO引物。

在一个具体实施例中，所用的特异性DPO引物包含SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。

本发明DPO引物的特异性在较低退火温度(50℃)和较高的退火温度下(60℃)下的结果显示与农业部标准一致，这大大增强了本方法在不同实验室之间的通用性。

在一个具体方面，本发明涉及一种检测样品中鼠李糖乳杆菌的方法，该方法包括：

1)实时荧光PCR反应

以含有DNA的样品为模板与DPO引物进行实时荧光PCR反应，所述DPO引物为SEQIDNO：1和SEQIDNO：2；

2)判断待检样品

在步骤1)之前还可以包括DNA的提取步骤。

所述实时荧光PCR反应的反应体系优选如下：

所述实时荧光PCR反应的反应体系优选如下：所述实时荧光PCR反应的程序如下：95℃预变性30s；95℃变性5s、50-60℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环。

上述提到的样品可以包括但不限于是食品、医用益生菌制剂、微生物肥料等。

下面参考具体实施例和附图，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供了样品中鼠李糖乳杆菌的检测方法，包括如下步骤：

步骤一：基因组DNA的提取

采用细菌基因组DNA提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司，货号为DP302)对样品提取DNA，参照说明书的要求操作。

步骤二：实时荧光PCR反应

实时荧光PCR反应体系如下：

所述SYBRPremixExTaq^TMII(TliRNaseHPlus)购自宝生物工程(大连)有限公司，货号为RR820Q。

所述DPO引物：根据上述DPO引物设计的要求，用鼠李糖乳杆菌的gyrB基因序列(GenBankID:AP011548.1)在NCBI上进行BLAST，根据比对结果在其保守区域设计DPO引物，上游引物LR-DPO-F设为SEQIDNO：1：

5′-CAATTCGCGGTAAGATTCTGAATGTIIIIIAAGCCTCC-3′，下游引物LR-DPO-R设为SEQIDNO：2：5′-CATCGGTCATGATGATCAACTTGTGIIIIIGGGCCTTGCTA-3′，产物大小为159bp；由上海生工生物技术有限公司合成。其中I碱基为次黄嘌呤。

实时荧光PCR反应程序如下：

95℃预变性30s；95℃变性5s、55℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环。

采用LightCycleRoche480荧光定量PCR仪(瑞士罗氏公司)进行实时荧光PCR反应。

步骤三：判断待检样品

在每个循环的72℃阶段结束后收集荧光信号并进行熔融曲线的分析，结果为阳性(Ct＜35)代表样品中含有鼠李糖乳杆菌，结果为阴性(Ct≥35)则代表样品中未含鼠李糖乳杆菌。

实施例2

本实施例对实施例1的检测方法进行了特异性的验证，所用的供试材料：鼠李糖乳杆菌(ATCC53103)、鼠李糖乳杆菌(ATCC9595)、格氏乳杆菌(ATCC33323)、约氏乳杆菌(ATCC33200)、嗜酸乳杆菌(ATCC314)、德氏乳杆菌(ATCC4797)、发酵乳杆菌(ATCC9338)、植物乳杆菌(ATCC14917)、沙克乳杆菌(ATCC15521)、詹氏乳杆菌(ATCC25258)、副干酪乳杆菌(ATCC25598)、干酪乳杆菌(ATCC393)共12株乳杆菌，编号依次为1，2，3，…，11，12，均保存于暨南大学理工学院食品科学与工程系，均购买于北京中原公司。

特异性验证方法如下：

将上述的12株乳杆菌标准菌株在MRS液体培养基(购自广东环凯微生物科技有限公司，货号为027312)增菌培养24h后，取1mL菌液用于DNA的提取，DNA的提取方法以及实时荧光PCR反应按照实施例1所示进行。

结果对比：

结果如图1所示，由图可知，仅2株鼠李糖乳杆菌结果为阳性，另外10株乳杆菌均为阴性，由此证明本发明设计的DPO引物特异性较好，进一步的，本发明建立的基于DPO引物的实时荧光PCR方法能够准确对鼠李糖乳杆菌进行检测。

实施例3

本实施例对实施例1的检测方法进行了灵敏度的验证，其方法如下：

对实施例2的鼠李糖乳杆菌ATCC53103进行DNA提取，DNA的提取方法见实施例1，并将DNA梯度稀释至浓度依次为：10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL共4个梯度，每个梯度取1μL做模板，且每个梯度均做一平行对照，同时设阴性对照，进行实时荧光PCR灵敏度试验，实时荧光PCR按照实施例1所示进行。

结果对比：

本发明检测方法的灵敏度结果见图2，当DNA浓度稀释到0.01ng/μL时，取1μLDNA做模板仍可以检测到荧光信号的增加，Ct值在30～35之间，表现为阳性扩增，而空白对照没有荧光信号增加。同时采用农业部标准NY/T2066-2011中鼠李糖乳杆菌的特异性引物RhaF/RhaR及反应条件对上述梯度稀释的鼠李糖乳杆菌进行灵敏度验证，其中农业部标准引物序列为RhaF：5′-GACGCAGCCGGTTGACCCAA-3′；RhaR：

5′-GGCGGCAGTTGCCCCAGAAT-3′，产物大小为376bp。结果见图3所示，当DNA浓度稀释到0.1ng/μL时，取1μLDNA做模板有微弱条带扩增。

以上结果说明本发明建立的实时荧光PCR的方法比常规PCR检测灵敏度至少高10倍。

实施例4

本实施例对实施例1的检测方法中的退火温度的敏感性进行了验证，其方法如下：

采用实施例2的12株乳杆菌标准菌株，DNA的提取方法以及实时荧光PCR反应按照实施例1所示进行，与实施例1不同的是，在实时荧光PCR反应程序中，退火温度设三个等级：50℃、55℃和60℃。

结果如表1所示：在50℃、55℃和60℃这三个退火温度下，本实施例建立的检测方法均顺利扩增，而且特异性高。由此可见本发明基于DPO引物建立的实时荧光PCR检测方法在50℃-60℃内退火温度不敏感，有利于在不同实验室之间得到准确和统一的检测结果。

表1

其中“+”表示为阳性，“－”表示为阴性

实施例5

本实施例提供了一种鼠李糖乳杆菌的检测试剂盒，至少包括DPO引物：SEQIDNO：1和SEQIDNO：2。

优选的，还可以包括SYBRPremixExTaq^TM、ddH₂O、阳性对照、阴性对照，进一步优选的，还可以包括细菌基因组DNA提取试剂。

利用上述试剂盒检测鼠李糖乳杆菌的具体步骤为：使用细菌基因组DNA提取试剂提取待测样品的DNA，以提取的DNA为模板与DPO引物进行实时荧光PCR反应，反应体系和反应条件如实施例1所示，同时设阳性对照、阴性对照，根据反应结果判断样品中是否含有鼠李糖乳杆菌。

SEQUENCELISTING

<110>中华人民共和国汕头出入境检验检疫局；中华人民共和国伊犁出入境检

验检疫局

<120>基于DPO引物的实时荧光PCR检测鼠李糖乳杆菌的方法、引物及试剂

盒

<130>ZSZ001-15P101066

<160>2

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>38

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>SEQIDNO：1

<400>1

caattcgcggtaagattctgaatgtiiiiiaagcctcc38

<210>2

<211>41

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>SEQIDNO：2

<400>2

catcggtcatgatgatcaacttgtgiiiiigggccttgcta41。

Claims (10)

1.一种引物对，其中一条引物包含SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，另一条引物包含SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的引物对在制备检测鼠李糖乳杆菌的试剂盒中的用途。

3.一种检测样品中鼠李糖乳杆菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1所述的引物对。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：还包括Taq酶和ddH₂O，所述Taq酶为与SYBR染料预混好的ExTaq酶。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：还包括细菌基因组DNA提取试剂。

6.一种检测样品中鼠李糖乳杆菌的方法，其特征在于：包括使用权利要求1所述的引物对、权利要求3-5中任一项所述试剂盒的步骤。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)实时荧光PCR反应

以含有DNA的样品为模板与DPO引物进行实时荧光PCR反应，所述DPO引物为SEQIDNO：1和SEQIDNO：2；

2)判断待检样品。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：在步骤1)之前还包括DNA的提取步骤。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述实时荧光PCR反应的反应体系如下：

SYBRPremixExTaq^TM10μL

DPO引物终浓度为0.2μmol/L

DNA模板50ng

ddH₂O补足至20μL。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述实时荧光PCR反应的反应体系如下：所述实时荧光PCR反应的程序如下：95℃预变性30s；95℃变性5s、50-60℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环。