CN105420353B - 基于dpo引物的实时荧光pcr检测屎肠球菌的dpo引物、方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测屎肠球菌的试剂盒及方法，属于PCR检测领域。本发明的试剂盒包括用于检测屎肠球菌特异性引物其核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑2所示。本试剂盒具有检测准确，灵敏度高，特异性强，简便快速的特点，具有良好的标本检测能力。为快速，准确检测屎肠球菌提供了新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及菌株检测领域，特别涉及检测样品中屎肠球菌或者含有屎肠球菌DNA的方法以及用于该方法的引物、含有该引物的组合物和试剂盒。
背景技术
屎肠球菌(Enterococcus Faecium)是一种常见的病原菌。目前屎肠球菌的检测主要依靠传统生理生化和分子生物学方法进行。传统生理生化耗时耗力，不能满足实际检测的需要。基于特异性引物的PCR的方法具备快速、准确、低成本的优点，目前被广泛用于转基因、食源性微生物、医学病原菌等方面的检测。目前PCR法已经被应用于屎肠球菌的检测，但普通PCR需要凝胶电泳判断结果，耗时耗力。另外，而不同实验室之间由于仪器、人员等差异，可能会无法精确重复出试验的各项条件，导致检测特异性受到影响，可能照成误判。
SYBR Green I是一种小分子DNA染料，游离时不会发射任何荧光信号，但当与双链DNA特异地结合时，荧光染料掺入DNA双链，发射出强烈的荧光信号，同时PCR产物的特异性可以用熔解曲线分析进一步确认，利用SYBR Green I这一特性建立的实时荧光PCR在植物病原菌检测方面已广泛应用。DPO(Dual priming oligonucleotide)引物技术的主要原理为其引物包含两个各自独立的特异性引物区域，5′端序列由18-25个碱基组成并与靶基因序列配对，3′端序列由6-12个碱基用来引导PCR反应的特异性延伸，这两段独立的特异性区域利用寡聚次黄嘌呤(Inosine，I)进行连接，由于次黄嘌呤比一般碱基的退火温度低，在退火时寡聚次黄嘌呤形成类似泡状的结构，从而使5′和3′区域形两个独立功能的双特异性引物结构，并且研究表明5′和3′引物区域中任何有3个及以上碱基的错配，PCR反应将不能进行。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、具备定量能力、通用性和实用性强的基于DPO引物的实时荧光PCR用于检测屎肠球菌方法，本发明还提供了用于该方法的DPO引物和含有该DPO引物的试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
基于DPO引物的实时荧光PCR检测屎肠球菌的DPO引物，
所述DPO引物上游引物EF-DPO-F设为SEQ ID NO.1，5′-GGCGGACATGCTAACCATTCAIIIIICTGGGAAATC-3′，下游引物EF-DPO-R设为SEQ ID NO.2，5′-CCATCAATGGAGAATCTTGATTTGIIIIIGAGGTAATAGC-3′，其中I碱基为次黄嘌呤。
一种检测样品中屎肠球菌的方法，该方法包括如下步骤：
(1)待测细菌样品基因组DNA的提取；
(2)实时荧光PCR反应：以含有DNA的样品为模板与DPO引物进行实时荧光PCR反应，所述DPO引物为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；
(2)判断待检样品。
所述实时荧光PCR反应的反应体系优选如下：
所述实时荧光PCR反应的程序如下：95℃预变性30s、95℃变性5s、50-60℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环。优选的，所述的退火温度为55℃。
一种基于DPO引物或至少包含DPO引物的细菌样品检测试剂盒。
本发明的有益效果包括：(1)本发明针对屎肠球菌的SodA基因设计特异性DPO引物，建立了实时荧光PCR法；(2)本发明将SYBR GreenⅠ实时荧光PCR和DPO引物检测技术相结合，吸收了DPO引物高特异性且引物之间难以形成二聚体等优点，成功建立了一种特异性强、灵敏度高的屎肠球菌的检测方法；(3)本发明的DPO引物的特异性在较低退火温度(50℃)和较高的退火温度下(60℃)下结果一致，这大大增强了本发明的DPO引物和方法在不同实验室之间的通用性；(4)本发明将DPO引物和SYBR Green I的实时荧光PCR结合起来，检测结果易于判断，无需凝胶电泳，这也增强了本方法的实用性。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1为特异性图；其中1-10分别为为屎肠球菌(ATCC 35667)、粪肠球菌(ATCC29212)、溶藻弧菌(ATCC 17749)、副溶血弧菌(ATCC17802)、奇异变形杆菌(ATCC 29245)、大肠杆菌(ATCC 11229)、单增李斯特菌(ATCC 7644)、金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)、伤寒沙门氏菌(ATCC 14028)、枯草芽孢杆菌(ATCC 21332)。
图2为灵敏度图；1-6分别为100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL。
具体实施方式
除非特殊说明，本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。
本发明通过检测屎肠球菌的SodA基因来检测样品中的屎肠球菌。由此，运用本方法可以快速的检测出样品中的屎肠球菌。
本发明检测屎肠球菌的SodA基因是通过实时荧光定量PCR来实现的。
为了实现上述目的，本发明针对屎肠球菌的SodA基因设计了特异性DPO引物。
在一个具体实施例中，所用的特异性DPO引物包含SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
本发明DPO引物的特异性在较低退火温度(50℃)和较高的退火温度下(60℃)下的结果一致，这大大增强了本方法在不同实验室之间的通用性。
在一个具体方面，本发明涉及一种检测样品中屎肠球菌的方法，该方法包括：
(1)实时荧光PCR反应
以含有DNA的样品为模板与DPO引物进行实时荧光PCR反应，所述DPO引物为SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2；
(2)判断待检样品
在步骤(1)之前还可以包括DNA的提取步骤。
所述实时荧光PCR反应的反应体系优选如下：
所述实时荧光PCR反应的反应体系优选如下：所述实时荧光PCR反应的程序如下：95℃预变性30s；95℃变性5s、50-60℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环。
下面参考具体实施例和附图，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1、本实施例提供了样品中屎肠球菌的检测方法，包括如下步骤：
步骤一：基因组DNA的提取
采用细菌基因组DNA提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司，货号为DP302)对样品提取DNA，参照说明书的要求操作。
步骤二：实时荧光PCR反应
实时荧光PCR反应体系如下：
所述SYBR Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)购自宝生物工程(大连)有限公司，货号为RR820Q。
所述DPO引物：根据上述DPO引物设计的要求，用屎肠球菌的SodA基因序列在美国国立生物技术信息中心NCBI上进行BLAST序列相似搜索，根据比对结果在其保守区域设计DPO引物，上游引物EF-DPO-F设为SEQ ID NO.1，
5′-GGCGGACATGCTAACCATTCAIIIIICTGGGAAATC-3′，下游引物EF-DPO-R设为SEQ IDNO:2，5′-CCATCAATGGAGAATCTTGATTTGIIIIIGAGGTAATAGC-3′，产物大小为235bp；
由上海生工生物技术有限公司合成。其中I碱基为次黄嘌呤。
实时荧光PCR反应程序如下：
95℃预变性30s；95℃变性5s、55℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环。
采用LightCycle Roche 480荧光定量PCR仪(瑞士罗氏公司)进行实时荧光PCR反应。
步骤三：判断待检样品
在每个循环的72℃阶段结束后收集荧光信号并进行分析，结果为阳性(Ct＜40)代表样品中含有屎肠球菌，结果为阴性(Ct≥40或无扩增信号)则代表样品中未含屎肠球菌。
实施例2、本实施例对实施例1的检测方法进行了特异性的验证，所用的供试材料：屎肠球菌(ATCC 35667)、粪肠球菌(ATCC 29212)、溶藻弧菌(ATCC 17749)、副溶血弧菌(ATCC17802)、奇异变形杆菌(ATCC 29245)、大肠杆菌(ATCC 11229)、单增李斯特菌(ATCC7644)、金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)、伤寒沙门氏菌(ATCC 14028)、枯草芽孢杆菌(ATCC21332)共10株细菌，编号依次为1，2，3，…，9，10，均保存于伊犁出入境检验检疫局。
特异性验证方法如下：将上述的10株标准菌株在LB液体培养基(购自广东环凯微生物科技有限公司，货号为027312)增菌培养24h后，取1mL菌液用于DNA的提取，DNA的提取方法以及实时荧光PCR反应按照实施例1所示进行。
结果对比：结果如图1所示，由图可知，仅屎肠球菌结果为阳性，另外9株标准菌株均为阴性，由此证明本发明设计的DPO引物特异性较好，进一步的，本发明建立的基于DPO引物的实时荧光PCR方法能够准确对屎肠球菌进行检测。
实施例3、本实施例对实施例1的检测方法进行了灵敏度的验证，其方法如下：对实施例2的屎肠球菌(ATCC 35667)进行DNA提取，DNA的提取方法见实施例1，并将DNA梯度稀释至浓度依次为：100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、0.01ng/μL、0.001ng/μL共6个梯度，每个梯度取1μL做模板，每个浓度设2管，进行实时荧光PCR灵敏度试验，实时荧光PCR按照实施例1所示进行。
本发明检测方法的灵敏度结果见图2，当DNA浓度稀释到0.001ng/μL时，取1μL DNA做模板仍可以检测到荧光信号的增加，表现为阳性扩增，说明本方法灵敏度高。
实施例4、本实施例对实施例1的检测方法中的退火温度的敏感性进行了验证，其方法如下：采用实施例2的10株标准菌株，DNA的提取方法以及实时荧光PCR反应按照实施例1所示进行，与实施例1不同的是，在实时荧光PCR反应程序中，退火温度设三个等级：50℃、55℃和60℃。
结果如表1所示：在50℃、55℃和60℃这三个退火温度下，本实施例建立的检测方法均顺利扩增，而且特异性高。由此可见本发明基于DPO引物建立的实时荧光PCR检测方法在50℃-60℃内退火温度不敏感，有利于在不同实验室之间得到准确和统一的检测结果。
表1
其中“+”表示为阳性，“－”表示为阴性
实施例5、本实施例提供了一种屎肠球菌的检测试剂盒，至少包括DPO引物：SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2。
优选的，还可以包括SYBR Premix Ex TaqTM、ddH2O、阳性对照、阴性对照，进一步优选的，还可以包括细菌基因组DNA提取试剂。
利用上述试剂盒检测屎肠球菌的具体步骤为：使用细菌基因组DNA提取试剂提取待测样品的DNA，以提取的DNA为模板与DPO引物进行实时荧光PCR反应，反应体系和反应条件如实施例1所示，同时设阳性对照、阴性对照，根据反应结果判断样品中是否含有屎肠球菌。
Claims (5)
1.基于DPO引物的实时荧光PCR检测屎肠球菌的DPO引物，其特征在于：
所述DPO引物上游引物LR-DPO-F为SEQ ID NO.1，5′-GGCGGACATGCTAACCATTCAIIIIICTGGGAAATC -3′，下游引物LR-DPO-R为SEQ ID NO.2，5′-CCATCAATGGAGAATCTTGATTTGIIIIIGAGGTAATAGC -3′，其中I碱基为次黄嘌呤。
2.一种检测样品中屎肠球菌的非诊断方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
（1）待测细菌样品基因组DNA的提取；
（2）实时荧光PCR反应：以含有DNA的样品为模板与DPO引物进行实时荧光PCR反应，所述DPO引物为SEQ ID NO .1和SEQ ID NO .2；
（2）判断待检样品。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述实时荧光PCR反应的反应体系如下：
SYBR Premix Ex TaqTM 10μL
DPO引物 终浓度为0.2μmol/L
DNA模板 50ng
ddH2O 补足至20μL。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述实时荧光PCR反应的程序如下：95℃ 预变性30s、95℃变性5s、50-60℃退火30s、72℃延伸30s，35个循环。
5.一种包含根据权利要求1所述的基于DPO引物的实时荧光PCR检测屎肠球菌的DPO引物的细菌样品检测试剂盒。
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| 基于双启动寡聚核苷酸引物的沙门菌、志贺菌、弯曲杆菌、耶尔森菌多重实时荧光PCR方法的建立;梁红等;《检验医学与临床》;20151031;第12卷(第20期);摘要，第2999页右栏 * |
| 屎肠球菌TaqMan荧光定量pcr检测方法的研究;金东等;《中国人兽共患病学报》;20130630;第29卷(第6期);551-555页 * |
| 猪源肠球菌多重pcr诊断方法的建立及应用;段志刚;《中国优秀硕士学位论文全文数据库》;20110615(第6期);实验一，第16-18页，第17页表格1-1和1-2 * |
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