CN108384866A

CN108384866A - 一种宋内志贺菌特异核苷酸pcr检测试剂盒

Info

Publication number: CN108384866A
Application number: CN201810335347.XA
Authority: CN
Inventors: 王磊; 经馥怿; 刘倩; 曹勃阳; 冯露
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2018-04-16
Filing date: 2018-04-16
Publication date: 2018-08-10

Abstract

本发明涉及一种对宋内志贺菌的wzy和wbgV基因特异核苷酸的检测应用试剂盒，所述核苷酸为：SEQ ID NO:1所示的核苷酸和/或SEQ ID NO:2所示的核苷酸；SEQ ID NO:3所示的核苷酸和/或SEQ ID NO:4所示的核苷酸。这些核苷酸可用于制备检测宋内志贺菌的PCR试剂盒。本发明对宋内志贺菌的wzy和wbgV基因特异的核苷酸及包含该核苷酸的PCR试剂盒的实用性强。PCR试剂盒具有配制方法简便，检测周期短、速度快，可操作性强，准确性高，灵敏度高的特点，且易于商品化生产，检测成本却相对较低。

Description

一种宋内志贺菌特异核苷酸PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种对宋内志贺菌 (Shigella sonnei) 的wzy基因(假定多糖聚合酶，Putative polysaccharide polymerase，以下简称wzy基因)和wbgV基因（假定蛋白）特异的核苷酸及其应用，通过这些特异的核苷酸可以准确的将宋内志贺氏菌从其他类志贺邻单胞菌13个血清型中区别鉴别出来。

背景技术

宋内志贺菌是志贺菌四个群之一，抗原单一，只有一个血清型。在我国，宋内志贺菌是引起细菌性痢疾的主要致病菌。宋内志贺菌有I相和II相两个交叉变异相。I相呈S菌落，对小鼠有致病力，多自急性期感染病人标本中分离得。II相为R型菌落，对小鼠不致病，常从慢性患者或带菌者检出。

目前对类志贺邻单胞菌的分型鉴定主要根据有：细菌的形态学特征、细菌的生理生化特征、血清学反应等方法，类志贺邻单胞菌的O抗原分型属于血清学反应的一种。由于环境和抗体的多样性，形成了O抗原的多样性，而根据O抗原的多样性可以对类志贺邻单胞菌的不同菌株进行分型鉴定。

在类志贺邻单胞菌的若干个已知的血清型中O17与宋内志贺菌较难鉴别，还没有快速鉴别的方法。所以本发明旨在先将O17类志贺邻单胞菌与宋内志贺菌从其他类志贺邻单胞菌血清型区分开来，再将O17类志贺邻单胞菌与宋内志贺菌区分开来。

随着分子技术特别是PCR技术的发展，许多分子生物学方法被用于类志贺邻单胞菌分子分型和流行病学研究。目前已用于类志贺邻单胞菌分型的4种常用分子分型技术为：随机扩增多态性 DNA (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)、脉冲场凝胶电泳(Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE)、扩增片段长度多态性(Amplified fragmentlength polymorphism，AFLP)、核酸测序分型(Sequence-based typing，SBT)。由于其一次即可分离出大量DNA片段，且具有操作简便，重复率好等优势，先后用于类志贺邻单胞菌分子分型和流行病学调查。

聚合酶链式反应技术(Polymerase chain reaction，简称PCR技术)作为微生物检测的技术目前正在得到认同和推广，该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的预增菌或增菌过程，再通过离心及裂解制备细菌DNA模板，就可以在高特异性引物介导下的PCR过程中扩增目标序列，达到检测样品中是否含有待测的致病性微生物的目的。PCR的扩增过程仅需2个小时。这对检验检疫部门和临床检验无疑极大提高了工作速度和降低了工作成本。

系统的分析显示出wzy基因是O抗原基因所独有的特征基因，可以被用来作为分子分型的目标基因。wbgV基因参与脂多糖的O抗原的合成，也可以作为目标基因鉴别不同的血清型。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对宋内志贺菌的wzy基因和wbgV基因特异的核苷酸，可以通过技术手段借此区分出宋内志贺菌与类志贺邻单胞菌其他血清型。所述核苷酸为：

1）SEQ ID NO:1所示的核苷酸和/或SEQ ID NO:2所示的核苷酸；SEQ ID NO:3所示的核苷酸和/或SEQ ID NO:4所示的核苷酸

2）与1）所示的核苷酸互补的核苷酸。

上述核苷酸可以用于制备检测宋内志贺菌的wzy基因和wbgV基因的PCR试剂盒；所述宋内志贺菌可以取样于自来水、矿泉水、空调冷却水的培养物的粗提液，或是宋内志贺菌的纯培养物的粗提液等，均采用常规的酚氯仿法制备。

本发明还提供一种两步法PCR试剂盒，包括PCR引物、2x Taq MasterMix(含染料)，所述PCR引物包括上述的核苷酸；其中所述的PCR引物优选为如SEQ ID NO:1和/或SEQ IDNO:2所示的核苷酸与SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示的核苷酸。

SEQ NO:1 TTTTGTTCCTCTTCTAACTTTAG 是特异扩增宋内志贺菌和O17类志贺邻单胞菌的wzy基因上游引物。

SEQ NO:2 AACACCTAATCCAGTGCCAA 是特异扩增宋内志贺菌和O17类志贺邻单胞菌的wzy基因下游引物。

SEQ NO:3 TTTTGGAGTTCCTATTGGCT是特异扩增宋内志贺菌wzy-IS630-wbgV基因和O17类志贺邻单胞菌wzy-wbgV基因上游的引物。

SEQ NO:4 AACCTTTCACGCTTTCCTTTA特异扩增宋内志贺菌wzy-IS630-wbgV基因和O17类志贺邻单胞菌wzy-wbgV基因下游的引物。

上述针对宋内志贺菌的PCR试剂盒，整个检测需要进行两步PCR扩增。步骤包括样品基因组的提取、PCR扩增、电泳检测结果。两步PCR所需要的引物和PCR反应体系中的试剂已预先加入扩增管中，使用者只需分别将将预处理后的样本加入到两个扩增管启动扩增反应，简单快速的完成检测工作。

本发明进一步公开了PCR试剂盒在用于检测宋内志贺菌细菌性痢疾方面的应用。实验结果显示，应用该试剂盒能够快速有效的将宋内志贺菌从其他菌株里检测区别出来。判断依据两个标准：第一轮PCR的电泳结果显示出200bp左右的条带；第二轮PCR的电泳结果显示出2000bp左右的条带。当上述两个条件均满足时，即可判断该菌株是宋内志贺菌。

由上述的技术方案可见，本发明建立的一种PCR反应体系，可检测宋内志贺菌，该试剂盒有如下优点：

（1）方法简便，周期短、可操作性强: 本发明所配制的PCR试剂盒配制方法简便，检测周期短，可操作性强，易于产业化生产，而检测成本却较低，市场应用前景广。本发明PCR试剂盒若用宋内志贺菌的菌悬液进行PCR扩增，与经提取得到的DNA作为模板扩增所得结果一致，且敏感度和特异性无差别，可省去模板DNA的提取步骤，简化操作过程。同时，相比常规生化检测方法而言，本方法所采用的待测样品可以直接是临床样品培养液，或者对检测样品进行简单分离培养就可进行检测，节省了物力人力。

（2）检测灵敏度高：本发明提供的PCR检测试剂盒及其检测方法敏感性高，检测精度高，可以检测到1ng/μL的DNA模板。对常见致病菌可以进行全面、系统、准确的检测与鉴定。

（3）检测成本相对较低：可以推广应用于食品卫生监督、环境监测、商品检验检疫等领域，并为其他不同致病菌检测组合提供技术模式。

（4）准确性高：本发明根据宋内志贺菌的wzy基因和wbgV基因的特异核苷酸序列，设计出引物。从而利用引物组成复合PCR检测体系，能够快速准确的将宋内志贺菌和其他类志贺邻单胞菌血清型分开。

附图说明

图1为本发明试剂盒检测宋内志贺菌和类志贺邻单胞菌13个血清型标准菌株的第一步PCR产物（以SEQ NO:1和/或SEQ NO:2为引物进行扩增）电泳结果图，其中：Maker，DL2000 DNAmarker； 1，宋内志贺菌G1041；2，类志贺邻单胞菌O17型 G5878；3，类志贺邻单胞菌O12型 G5890；4，类志贺邻单胞菌O25型G5879；5，类志贺邻单胞菌O26型 G5889；6，类志贺邻单胞菌O33型G5881；7，类志贺邻单胞菌O37 型G5883；8，类志贺邻单胞菌O75型 G5885；9，类志贺邻单胞菌O76型 G5886；10，类志贺邻单胞菌O2型 G5877；11，类志贺邻单胞菌O10型 G5892；12，类志贺邻单胞菌O32型 G5880；13，类志贺邻单胞菌O34型 G5882；14，类志贺邻单胞菌O66型 G5270；

图2为本发明试剂盒检测宋内志贺菌和类志贺邻单胞菌13个血清型标准菌株的第二步PCR产物（以SEQ NO:3和/或SEQ NO:4为引物进行扩增）电泳结果图其中：Maker，DL2000 DNAmarker； 1，宋内志贺菌G1041；2，类志贺邻单胞菌O17型 G5878。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

引物的设计

宋内志贺菌的O抗原基因簇序列是本实验室自测的，通过比对分析，选取wzy和wbgV基因作为该菌的特异靶基因，针对宋内志贺菌型的wzy和wbgV基因的特异区设计引物；如表1所示，扩增宋内志贺菌和O17类志贺邻单胞菌wzy基因的上游引物是5’-TTTTGTTCCTCTTCTAACTTTAG -3’，见序列SEQ ID NO:1；下游引物是5’-AACACCTAATCCAGTGCCAA -3’，见序列SEQ ID NO:2。扩增宋内志贺菌wzy-IS630-wbgV基因的上游引物是5’-TTTTGGAGTTCCTATTGGCTA-3’，见序列SEQID NO:3; 扩增宋内志贺菌wzy- IS630-wbgV基因下游引物是5’-AACCTTTCACGCTTTCCTTTA-3’,见序列SEQID NO:4.

表1 宋内志贺菌的特异引物序列

阳性对照与阴性对照的筛选

收集了1株宋内志贺菌标准菌株作为阳性对照，13株类志贺邻单胞菌其它血清型的标准菌株作为阴性对照，菌株编号和来源见下表2

表2 供试的标准菌株

实施例1

1：基因组的提取

（1）在超净工作台中，从菌种保藏室取出菌种，冰上融化，1:1000接种到LB培养基中，37°C，180rpm摇床过夜培养。

（2）取1mL菌悬液吸到1.5 mL离心管中，8000 rpm离心5分钟，弃上清。

（3）加入250 μL 50 mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)重悬，12000 rpm离心5分钟，弃上清，重复一次。

（4）加入250 μL 50 mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)重悬，再加10 μL 0.45M EDTA(pH 8.0)，充分悬浮，37℃温浴20分钟。

（5）加入10 μL 20 mg/mL溶菌酶，37℃温浴20分钟。

（6）加入1.5 μL 20 mg/mL蛋白酶K，轻柔混匀。

（7）加入15 μL 10%SDS，50℃水浴2小时至溶液澄清，期间轻轻颠倒混匀若干次。

（8）加2 μL 20 mg/mL RNAse，65℃水浴30分钟。

（9）用剪去尖头的枪头将上述溶液移到新的洁净离心管中。

（10）在通风橱中加入250 μL苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），充分混匀，12000 rpm，4℃离心10分钟，上清液转移到新的离心管，重复一次。

（11）在通风橱中加入250 μL氯仿：异戊醇（24：1），充分混匀，12000 rpm，4℃离心10分钟，上清液转移到新的离心管。

（12）加入2.5倍体积的提前预冷的无水乙醇，轻摇，于-80℃沉淀DNA。12000 rpm ，4℃离心15 min。

（13）用1 mL 70%冰乙醇洗涤DNA沉淀，然后在65℃，10 min烘干。

（14）用30 μL TE溶解，并于-20 °C冰箱备用。

用1.0 %的琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取效果，同时用NanoDrop2000 OD仪测量DNA的纯度和浓度。

：PCR鉴定

PCR检测试剂盒

一、检测实验所需材料及设备的准备

1. 试剂盒组成：

其中2x Taq MasterMix(含染料)是北京康为世纪生物科技有限公司提供；引物为自行设计的序列提供给上海英骏生物技术公司合成； ddH₂O由我们自行制备。

使用上述PCR检测试剂盒进行宋内志贺菌检测的方法分为两部分的PCR反应包括以下步骤：

表3 一次检测试验PCR所使用的试剂盒中的试剂量

（1）第一步PCR:在PCR薄壁管中加入2x Taq MasterMix(含染料)、P1-P2引物、待测样品模板和ddH₂O，混匀，将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：

94℃ 2分钟

94℃ 30秒

56℃ 30秒

72℃ 15秒回到第二步，共30个循环

72℃ 2分钟

（2）第二步PCR:在PCR薄壁管中加入2x Taq MasterMix(含染料)、P3-P4引物、待测样品模板和ddH₂O，混匀，将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：

94℃ 2分钟

94℃ 30秒

56℃ 30秒

72℃ 60秒回到第二步，共30个循环

72℃ 2分钟

PCR体系分为两部分，每一部分的PCR体系为10 μM引物混合物2μL、2x Taq MasterMix(含染料)12.5μL及1 μL的待测样品模板到0.2 mL的薄壁PCR管中，最后用ddH₂O补足至25 μL。

所用引物SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2在宋内志贺菌和O17血清型类志贺邻单胞菌的模板中，Maker200bp左右得到阳性结果，在其它组中没有得到200bp左右PCR产物条带；所用引物为SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4时，宋内志贺菌扩增出来的条带比O17类志贺邻单胞菌多500bp左右,所以这些寡核苷酸片段是高度特异的。

：DNA电泳与胶图结果分析

分别将两次PCR的产物在电泳设备中进行电泳，记录结果

①取1μL扩增产物（由于含有染液，无需再加上样loading buffer）上样于1％的琼脂糖凝胶上

②将琼脂糖凝胶电泳130V稳压电泳约25分钟，用DL2000 Marker进行对照

③观察并记录结果

电泳结果显示，只有在两步PCR产物中皆有产物条带产生的待测样品被鉴定为宋内志贺菌，如没有产物条带或只有一步PCR有产物条带则判定待测样品的血清型不为宋内志贺菌。

依据如下条件进行结果判断，宋内志贺菌与其他血清型类志贺邻单胞菌在第一步PCR中，把P1-P2作为引物，只有以宋内志贺菌与O17类志贺邻单胞菌作为模板的扩增产物在250bp处有一条带，这样就可以将宋内志贺菌与O17类志贺邻单胞菌从其他菌株中区别开来。在第二步PCR中，宋内志贺菌与O17类志贺邻单胞菌为待测样品。在P3-P4作为引物的条件下，以宋内志贺菌作为模板的扩增产物在2000bp处有一条带，以O17类志贺邻单胞菌作为模板的扩增产物在1500处有一条带。

标准菌株电泳结果记录见图1，图2所示：所有标准菌株除宋内志贺菌与O17类志贺邻单胞菌有250bp片段外，其他菌株均无扩增产物，取宋内志贺菌与O17类志贺邻单胞菌基因组做模板进行第二步PCR，宋内志贺菌在2000bp处有一条带，O17类志贺邻单胞菌在1500处有一条带。这说明采用PCR检测方法可排除假阳性反应，根据有无以上片段进行的宋内志贺菌的检测鉴定，检测准确度提高了，避免了因检测失误而导致的损失。

胶图中其余未提及的条带是引物非特异性结合所产生的，可以忽略不计。

本发明通过配制一种可检测宋内志贺菌，可商品化生产的PCR试剂盒，将PCR检测方法需要使用的成分组合在一起，使用时，提取待测样品，进行两步PCR的操作程序就能进行灵敏、快速、简便的检测，检测试剂盒中各组分的用量和浓度均为试验所得，用该试剂盒检测宋内志贺菌所使用的试验设备简单，检测成本低。

仪器设备

SANYO高压灭菌锅（SANYO公司）；T Gradient PCR仪（Biometra公司）；

各种型号移液器（Eppendorf公司）；Sigma1-13K离心机（Sigma公司）；5804R高速冷冻离心机（Eppendorf公司）；ND-2000 NanoDrop OD仪器（ NanoDrop公司）；SIM-F124制冰机（日本SANYO）；超纯水净化系统（Milli-Q）；凝胶成像仪（UVP公司）和0.2mL PCR薄壁管。

利用上述实验步骤得到的杂交试剂盒，可用于检测宋内志贺菌。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 南开大学

<120> 一种宋内志贺菌特异核苷酸PCR检测试剂盒

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttttgttcct cttctaactt tag 23

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aacacctaat ccagtgccaa 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttttggagtt cctattggct a 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aacctttcac gctttccttt a 21

Claims

1.一种对宋内志贺菌的wzy和wbgV基因特异的核苷酸，其特征在于，所述的核苷酸为：SEQ ID NO:1所示的核苷酸和/或SEQ ID NO:2 所示的核苷酸与SEQ ID NO:3所示的核苷酸和/或SEQ ID NO:4所示的核苷酸。

2.一种PCR试剂盒，包括PCR引物、2x Taq MasterMix(含染料)，所述PCR引物

中，SEQ NO:1为特异扩增宋内志贺菌和O17类志贺邻单胞菌的wzy基因上游引物；SEQNO:2为特异扩增宋内志贺菌和O17类志贺邻单胞菌的wzy基因下游引物；SEQ NO:3 为特异扩增宋内志贺菌的wzy-IS630-wbgV基因上游引物；SEQ NO:4为特异扩增宋内志贺菌的wzy- IS630-wbgV基因下游引物。

3.权利要求2所述的PCR试剂盒在用于检测宋内志贺菌细菌性痢疾方面的应用。