CN109680079A - 检测副溶血性弧菌的rpa引物、探针、试剂盒和方法 - Google Patents

检测副溶血性弧菌的rpa引物、探针、试剂盒和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供检测副溶血性弧菌的RPA引物、探针、试剂盒和方法。本发明检测副溶血性弧菌的RPA引物包括针对irgb基因的上游引物Seq ID No.1和下游引物Seq ID No.2。相对于现有技术，本发明的试剂盒及检测方法，可快速检测样品中是否存在副溶血性弧菌核酸。操作简单，无需特殊昂贵的仪器，在疾病监测、临床诊断和食品安全监测等领域具有重要的应用价值。

Description

检测副溶血性弧菌的RPA引物、探针、试剂盒和方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及检测副溶血性弧菌的RPA引物和探针、试剂盒及RPA等温快速检测方法。
背景技术
副溶血性弧菌 (Vibrio parahaemolyticus,Vp) 是一种革兰氏阴性嗜盐菌，属弧菌科弧菌属，是最重要的食源性致病菌之一，它广泛分布于近海区域、鱼、贝类等海产品以及腌制食品中，是沿海地区引起食物中毒的重要病原菌，可以导致患者出现腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐和头疼等典型胃肠炎反应，严重者可以引起败血症。国家食源性疾病监测网数据显示，副溶血弧菌引起的食物中毒在发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势，已经高居微生物性食物中毒之首，因此，开发副溶血性弧菌的快速检测方法对该菌的预防和检测非常重要。
目前副溶血性弧菌的检测方法主要是传统培养方法和PCR方法。虽然传统培养方法对实验设备的要求不高，但是检测的周期较长，操作繁琐，需要分离获得纯培养物后进行嗜盐实验等系列生化鉴定实验，检测效率低，无法满足当前检测工作中对样品进行快速检测的要求。而随着分子生物学检测技术的发展，PCR检测方法也随之而出现，但PCR方法在于扩增反应受多种因素的影响，需要投入比较昂贵的仪器，易出现非特异性扩增，检测时间相对较长。这些方法均不利于现场快速检测。为确保食品安全的快速发展，急需有关副溶血性弧菌的快速检测方法。
重组酶聚合酶等温扩增技术( recombinase polymerase amplification, RPA)是近年发展起来的一种新型的等温扩增技术，其原理是在恒温下，重组酶与寡核苷酸引物结合，形成酶和引物的复合体，酶促使引物定位到DNA 双链模板的同源靶序列上，并在单链DNA 结合蛋白的协助下，解链模板DNA，随后在DNA 聚合酶的作用下，形成新的DNA 互补链。该方法的主要特点在等温条件下即可高效、快速、高特异、高灵敏的扩增靶基因。目前RPA技术已经应用到病毒、细菌、支原体、寄生虫等的快速检测中，然而目前并没有被应用于副溶血性弧菌的检测应用中。而对于RPA方法来说，引物探针的特异性是其检测特异性和灵敏性的基础。
irgb为铁调节毒力监管蛋白基因，是2010新报道的副溶血性弧菌的特有的分子标记基因，相比于tlh，toxR，gyrb，pR72H等基因更具特异性，与弧菌属的其他非副溶血性弧菌无交叉，特异性强、灵敏度高，适合应用于副溶血性弧菌的分子检测。
发明内容
为了解决上述提及的副溶血性弧菌检测时效和特异性问题，本发明提供一种方便快速的检测副溶血性弧菌的RPA引物、探针、试剂盒和检测方法。
一种检测副溶血性弧菌的RPA引物，针对irgb基因包括
上游引物Seq ID No.1: 5’- CGCCAAACTACATCGGAAAACATGGCCCCATC -3’和下游引物Seq ID No.2：5’- CTAGAAAAAACTCCCCTTGTTCTGGGTGCGAG -3’。
优选的，所述下游引物Seq ID No.2在5’端进行biotin修饰。
一种检测副溶血性弧菌的RPA引物，采用所述的引物中的上游引物、下游引物中的至少一种，或选自所述的引物中的上游引物、下游引物序列或上游引物、下游引物序列的互补链序列中单条序列同源性为50%及以上的碱基序列。
一种检测副溶血性弧菌的RPA探针，针对irgb基因，其包括探针序列Seq ID No.3：5’- CCACCCGAGAGAACTAAACAAACATCCGTGGATAGATTTTGGGTCG -3’
所述探针序列Seq ID No.3的5’端31bp 的位置处采用dSpacer 修饰，dSpacer分子两侧的胸腺嘧啶分别被荧光基团和淬灭基团取代，所述探针序列Seq ID No.3的3’末端通过阻塞基团C3Spacer或磷酸化进行修饰。
优选的，所述荧光基因采用FAM-dT荧光标记基团，所述淬灭基团采用BHQ1-dT荧光标记基团。
一种检测副溶血性弧菌的RPA探针，针对irgb基因，包括探针序列Seq ID No.3：5’- CCACCCGAGAGAACTAAACAAACATCCGTGGATAGATTTTGGGTCG -3’，所述探针序列在5’端标记荧光报告基团，在3’端进行C3Spacer或磷酸化修饰。
一种检测副溶血性弧菌的RPA探针，包括所述的探针序列或其互补链序列中单条序列同源性为50%及以上的碱基序列。
一种检测副溶血性弧菌的RPA试剂盒，包括含有所述的引物和所述的探针以冻干粉形式的RPA反应组分、RPA反应缓冲液。
一种检测副溶血性弧菌的RPA的方法，包括如下步骤：
（1）提取待测样品基因组DNA；
（2）采用权利要求6所述的试剂盒、步骤(1)提取的待测样品基因组DNA以及醋酸镁，配制成RPA反应体系；
（3）将步骤（2）配置的反应体系在恒温下进行扩增反应，整个反应过程收集荧光信号；
（4）根据扩增反应结果确定待测样品基因组DNA中是否含有副溶血性弧菌。
优选的，所述步骤（2）中的RPA反应体系以50uL计为：
。
优选的，所述RPA反应体系的反应恒温条件为37 ℃-42℃，反应时间为15-20分钟。
优选的，所述RPA反应体系进一步包括阳性质控品和阴性质控品。
相对于现有技术，本发明的技术方案克服现有有关副溶血性弧菌的检测技术存在检测周期长，特异性差等问题，充分利用分子生物学相关的信息及数据库，设计特异性的RPA引物及探针，建立副溶血性弧菌的RPA检测方法，并在此基础上提供一种高灵敏度，高特异的RPA检测试剂盒。
本发明针对副溶血性弧菌的irgb基因序列的保守区域特异的靶序列设计RPA引物和探针，本发明的试剂盒，可以用来快速检测样品中是否存在副溶血性弧菌的核酸，可以在15分钟就得到扩增结果，从而克服了现有技术对副溶血性弧菌快速检测的限制和分子检测中所选靶标基因特异性不强的问题。可为副溶血性弧菌的疾病监测、临床诊断和食品安全监测等提供实验依据和技术支撑。
附图说明
图1为利用本发明所述的RPA引物探针所建立的RPA反应体系的检测结果图。
图2为利用本发明所述的RPA引物探针所建立的RPA反应体系对弧菌属副溶血性弧菌特异性实验结果图。
图3为利用本发明所述的RPA引物探针所建立的RPA反应体系对非副溶血性弧菌特异性验证实验结果图。
图4为本发明所述的RPA引物探针所建立的RPA反应体系的灵敏度实验分析结果图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明：
实施例1 ：靶基因的选取与RPA引物探针
利用生物信息学知识以及相关分析软件，对副溶血性弧菌常见的靶标基因进行分析，诸如tlh，toxR，gyrb，pR72H等，通过对副溶血性弧菌的这些基因与其他微生物进行比对分析，将irgb作为靶基因，并选择其特异性保守区域作为引物探针设计的靶标区域。根据RPA对引物和探针的设计要求，设计特异性引物及探针，之后将引物与探针的序列在https://www.thermofisher.com中进行多重引物和探针二级结构的分析比对，将选定好的引物探针在NCBI上进行blat以验证其特异性。本实施例中的引物和探针由上海生物工程有限公司合成。
本发明的引物具体如下：
所述引物包括针对irgb基因的上游引物Seq ID No.1: 5’- CGCCAAACTACATCGGAAAACATGGCCCCATC -3’和下游引物Seq ID No.2：5’- CTAGAAAAAACTCCCCTTGTTCTGGGTGCGAG -3’。优选地，所述下游引物Seq ID No.2：5’- CTAGAAAAAACTCCCCTTGTTCTGGGTGCGAG -3’在5’端进行biotin修饰。
替代实施例中，所述引物可以为所述上游引物、下游引物中的至少一种，或上游引物、下游引物序列或上游引物、下游引物序列的互补链序列中单条序列同源性为50%及以上的碱基序列。
本发明的探针具体如下：
针对irgb基因，其包括探针序列Seq ID No.3：5’- CCACCCGAGAGAACTAAACAAACATCCGTGGATAGATTTTGGGTCG -3’。
本实施例中，所述探针序列Seq ID No.3的5’端31bp 的位置处采用dSpacer 修饰，dSpacer分子两侧的胸腺嘧啶分别被荧光基团FAM和淬灭基团BHQ1取代，并且在探针序列Seq ID No.3的3’末端也通过阻塞基团C3Spacer或磷酸化等进行修饰。
本实施例中，所述荧光基因采用FAM-dT荧光标记基团，所述淬灭基团采用BHQ1-dT荧光标记基团。修饰后的探针序列表达为: 5’- CCACCCGAGAGAACTAAACAAACATCCG(FAM-dT)G(dSpacer)A(BHQ1-dT)AGATTTTGGGTCG- C3spacer-3’。
替代实施例中，所述探针序列在5’端标记荧光报告基团，在3’端进行C3Spacer或磷酸化等修饰。
替代实施例中，所述探针序列还可以采用所述的探针序列或其互补链序列中单条序列同源性为50%及以上的碱基序列及其他荧光标记基团。
实施例2：检测副溶血性弧菌的RPA试剂盒
本实施例提供一种检测副溶血性弧菌的RPA试剂盒，包括针对irgb基因的引物、探针以及RPA反应缓冲液。所述引物可以包括的上游引物Seq ID No.1: 5’- CGCCAAACTACATCGGAAAACATGGCCCCATC -3’和下游引物Seq ID No.2：5’- CTAGAAAAAACTCCCCTTGTTCTGGGTGCGAG-3’中的一种或上游引物Seq ID No.1、下游引物Seq ID No.2序列的互补链序列中单条序列同源性为50%及以上的碱基序列。所述探针序列为Seq ID No.3：5’- CCACCCGAGAGAACTAAACAAACATCCGTGGATAGATTTTGGGTCG -3’或其互补链序列中单条序列同源性为50%及以上的碱基序列。较佳的，所述探针序列Seq ID No.3的5’端31bp 的位置处采用dSpacer 修饰，dSpacer分子两侧的胸腺嘧啶分别被荧光基团和淬灭基团取代，所述探针序列Seq ID No.3的3’末端通过阻塞基团C3Spacer进行修饰。所述荧光基因采用ROX-dT荧光标记基团或其他荧光标记基团，所述淬灭基团采用BHQ1-dT荧光标记基团或其他荧光标记基团。本实施例中，试剂盒的引物和探针为冻干粉形式的RPA反应组分。较佳实施方式中，所述试剂盒种的RPA反应组分还可以包括冻干粉形式的酶、阳性质控品和阴性质控品。
实施例3 ：副溶血性弧菌的RPA方法
（1）提取待测样品基因组DNA
本实施例将副溶血性弧菌CICC21617接种到3 % NaCl碱性蛋白胨水中，放置在摇床上，按照37 ℃培养过夜，吸取1 mL培养菌液滴加到1.5 mL离心管内，12000 转/分钟离心2 分钟，弃去上清液，加入500 µL无菌生理盐水，充分悬浮混匀，12000 转/分钟离心1 分钟，弃上清，重复添加无菌生理盐水，再离心，弃上清。添加50 µL生理盐水，100 ℃水浴10-15 分钟，待冷却室温12000 转/分钟离心1 分钟，上清液作为待测样品基因组DNA于-20 ℃保存备用。
其他实施例中可以对样本进行生长培养后提取DNA或直接提取NDA。样本要求为：临床样品类型包括患者腹泻标本和分离培养物；临床样本采集后应带冰运输，-20 ℃保存，避免反复冻融，从临床样本提取DNA，建议采用性能稳定可靠的商品化试剂盒，具体方法参照相应商品化试剂盒说明书，提取的DNA应立即检测，否则，应将DNA分装后存放于-80 ℃至-20 ℃保存。
（2）使用第2实施例所述的试剂盒、步骤(1)提取的待测样品基因组DNA以及醋酸 镁，配制成RPA反应体系，一较佳实施例反应体系，以50uL计配置如下：
DNA模板 2uL
上游引物、下游引物 420 nmoL/L
探针 420 nmoL/L
酶 10mg
1×反应缓冲液 45.5 uL
280mmol/L Mg<sup>2+</sup>缓冲液 2.5uL
本实施例的待测样品基因组DNA的模板为副溶血性弧菌CICC21617，具体配置为向含有冻干酶粉和引物探针的RPA反应管中加入再水化缓冲液45.5 uL、DNA模板2 uL、最后再加入醋酸镁溶液2.5 uL充分混匀，本实施例同时设置空白对照反应体系。
（3）将步骤（2）配置的反应体系在恒温下进行扩增反应，整个反应过程收集荧光信号，本实施例RPA反应体系的反应恒温条件为37 ℃-42℃，反应时间为15 -20分钟。
（4）根据扩增反应结果确定待测样品基因组DNA中是否含有副溶血性弧菌。较佳实施方式中，每次实验应设立阴、阳性对照，阴性对照无荧光值的增加，阳性对照有荧光值的增加，否则实验结果不成立。本实施例结果判读可疑包括阳性、阴性和可疑三种情况，具体定义如下。
阳性：出现“S”型扩增曲线，且荧光增量在400以上；
阴性：没有出现“S”型扩增曲线或者荧光增量在300以内；
可疑：出现“S”型扩增，且荧光增加量在300-400之间；对可疑结果，应重复实验，如果实验还是出现“S”型扩增，且荧光增加量在300-400之间，阴性对照没有污染，可判断为阳性。
本实施例, 待测样品基因组DNA检测结果如图1所示, 其中曲线1为待测样品基因组DNA；曲线2为空白对照。图1结果表明待测样品基因组DNA检测为阳性，含有副溶血性弧菌。
实施例4 ：副溶血性弧菌检测特异性评价
一实施例中检测特异性评价采用下表1中的菌株，本实施例中采用的标准菌株均由广州环凯微生物有限公司代为购买。
表1 用于RPA特异性分析的菌株
菌株名称 菌株编号 菌种来源
副溶血性弧菌 CICC21617 中国工业微生物菌种保藏管理中心
副溶血性弧菌 CGMCC1.1997 中国普通微生物菌种保藏管理中心
副溶血性弧菌 VP16144 深圳疾病控制中心分离
副溶血性弧菌 VP16145 深圳疾病控制中心分离
副溶血性弧菌 VP16146 深圳疾病控制中心分离
副溶血性弧菌 VP00171 中国疾病控制中心分离
副溶血性弧菌 VP00179 中国疾病控制中心分离
溶藻弧菌 CGMCC1.1607 中国普通微生物菌种保藏管理中心
创伤弧菌 CGMCC1.1758 中国普通微生物菌种保藏管理中心
拟态弧菌 CICC21613 中国医学微生物菌种保藏管理中心
创伤弧菌 CGMCC1.1758 中国普通微生物菌种保藏管理中心
霍乱弧菌 CICC23794 中国医学微生物菌种保藏管理中心
弗尼斯（氏）弧菌 CGMCC1.1612 中国普通微生物菌种保藏管理中心
美人鱼发光杆菌美人鱼亚种 NBRC15633 日本技术评价研究所生物资源中心
沙门氏菌 CGMCC1.1552 中国普通微生物菌种保藏管理中心
乙型溶血性链球菌 CICC10373 中国医学微生物菌种保藏管理中心
小肠结肠炎耶尔森氏菌 CMCC(B)52204 中国医学细菌保藏管理中心
阪崎肠杆菌 ATCC29544 美国典型微生物菌种保藏中心
志贺氏菌 CMCC(B)51572 中国医学细菌保藏管理中心
金黄色葡萄球菌 ATCC6538 美国典型微生物菌种保藏中心
单核细胞增生李斯特菌 ATCC19115 美国典型微生物菌种保藏中心
大肠 O157 ATCC3895 美国典型微生物菌种保藏中心
以表1中菌株DNA作为RPA反应模板，利用实施例2中的RPA试剂盒进行RPA扩增。
本实施例RPA扩增体系为：向含有冻干酶粉和引物探针的RPA反应管中加入再水化缓冲液45.5 uL、模板2 uL、最后再加入醋酸镁溶液2.5 uL。
RPA的反应条件：将上述RPA反应体系充分混匀，在39℃条件下，扩增15分钟。
特异性扩增结果如图2和图3所示，图2中曲线1-8依次为副溶血性弧菌CICC21617，副溶血性弧菌CGMCC1.1997，副溶血性弧菌VP16144，副溶血性弧菌VP16145，副溶血性弧菌VP16146，副溶血性弧菌VP00171，副溶血性弧菌VP00179，空白对照的扩增结果。图3中曲线1为副溶血性弧菌CICC21617，曲线2-16依次分别为溶藻弧菌CGMCC1.1607，创伤弧菌CGMCC1.1758，拟态弧菌CICC21613，霍乱弧菌CICC23794，弗尼斯（氏）弧菌CGMCC1.1612，美人鱼发光杆菌美人鱼亚种NBRC15633，沙门氏菌CGMCC1.1552，乙型溶血性链球菌CICC10373，小肠结肠炎耶尔森氏菌CMCC(B)52204，阪崎肠杆菌ATCC29544，志贺氏菌CMCC(B)51572，金黄色葡萄球菌ATCC6538，单核细胞增生李斯特菌ATCC19115，大肠 O157ATCC3895以及空白对照的扩增结果。从结果中可以知道，只有副溶血性弧菌的扩增结果呈阳性，非副溶血性弧菌的检测结果与空白对照的扩增结果无差异，呈现阴性。图2和图3的结果表明，本发明RPA引物、RPA探针、试剂盒以及RPA方法的特异性良好。
实施例5 ：副溶血性弧菌的RPA方法检测限
本实施例中，以副溶血性弧菌CICC21617 为DNA模板，利用实施例2中的RPA试剂盒进行扩增，其中不同反应中，DNA模板的总含量分别为200ng/反应,20ng/反应、2ng/反应、0.2ng/反应、0.02ng/反应，0.002ng/反应，0.0002ng/反应。
灵敏度的实验结果如图4所示，曲线1：副溶血性弧菌200ng/反应，曲线2：20ng/反应，曲线3：2ng/反应，曲线4：0.2ng/反应，曲线5：0.02ng/反应，曲线6：0.002ng/反应。曲线7：0.0002ng/反应，曲线8：空白对照。由图4结果可知，本发明RPA法的检测下限可以达到0.002ng/反应。
相对于现有技术，本发明的技术方案克服现有有关副溶血性弧菌的检测技术存在检测周期长，特异性差等问题，充分利用分子生物学相关的信息及数据库，设计特异性的RPA引物及探针，建立副溶血性弧菌的RPA检测方法，并在此基础上提供一种高灵敏度，高特异的RPA检测试剂盒。
本发明针对副溶血性弧菌的irgb基因序列的保守区域特异的靶序列设计RPA引物和探针，本发明的试剂盒，可以用来快速检测样品中是否存在副溶血性弧菌的核酸，可以在15分钟就得到扩增结果，从而克服了现有技术对副溶血性弧菌快速检测的限制。可为副溶血性弧菌的疾病监测、临床诊断和食品安全监测等提供实验依据。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种检测副溶血性弧菌的RPA引物，其特征在于，针对irgb 基因包括
上游引物Seq ID No.1: 5’- CGCCAAACTACATCGGAAAACATGGCCCCATC -3’和下游引物Seq ID No.2：5’- CTAGAAAAAACTCCCCTTGTTCTGGGTGCGAG -3’。
2.如权利要求1所述的检测副溶血性弧菌的RPA引物，其特征在于，所述下游引物SeqID No.2在5’端进行biotin修饰。
3.一种检测副溶血性弧菌的RPA引物，其特征在于，采用权利要求1或2所述的引物中的上游引物、下游引物中的至少一种，或选自权利要求1或2所述的引物中的上游引物、下游引物序列或上游引物、下游引物序列的互补链序列中单条序列同源性为50%及以上的碱基序列。
4.一种检测副溶血性弧菌的RPA探针，其特征在于，针对irgb基因，其包括探针序列SeqID No.3：5’ CCACCCGAGAGAACTAAACAAACATCCGTGGATAGATTTTGGGTCG -3’
所述探针序列Seq ID No.3的5’端31bp的位置处采用dSpacer 修饰，dSpacer分子两侧的胸腺嘧啶分别被荧光基团和淬灭基团取代，所述探针序列Seq ID No.3的3’末端通过阻塞基团C3Spacer或磷酸化进行修饰。
5.如权利要求4所述的检测副溶血性弧菌的RPA探针，其特征在于，所述荧光基因采用FAM-dT荧光标记基团，所述淬灭基团采用BHQ1-dT荧光标记基团。
6.一种检测副溶血性弧菌的RPA探针，其特征在于，针对irgb基因，其特征在于，包括探针序列Seq ID No.3：5’- CCACCCGAGAGAACTAAACAAACATCCGTGGATAGATTTTGGGTCG -3’，所述探针序列在5’端标记荧光报告基团，在3’端进行C3Spacer或磷酸化修饰。
7.一种检测副溶血性弧菌的RPA探针，其特征在于，采用权利要求4或6所述的探针序列或其互补链序列中单条序列同源性为50%及以上的碱基序列。
8.一种检测副溶血性弧菌的RPA试剂盒，其特征在于，包括含有如权利要求1所述的引物和如权利要求4或6所述的探针以冻干粉形式的RPA反应组分、RPA反应缓冲液。
9.一种检测副溶血性弧菌的RPA方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）提取待测样品基因组DNA；
（2）采用权利要求8所述的试剂盒、步骤(1)提取的待测样品基因组DNA以及醋酸镁，配制成RPA反应体系；
（3）将步骤（2）配置的反应体系在恒温下进行扩增反应，整个反应过程收集荧光信号；
（4）根据扩增反应结果确定待测样品基因组DNA中是否含有副溶血性弧菌。
10.如权利要求9所述的检测副溶血性弧菌的RPA方法，其特征在于，所述步骤（2）中的RPA反应体系以50uL计为：
。
11.如权利要求10所述的检测副溶血性弧菌的RPA方法，其特征在于，所述RPA反应体系的反应恒温条件为37 ℃-42℃，反应时间为15-20分钟。
12.如权利要求10所述的检测副溶血性弧菌的RPA方法，其特征在于，所述RPA反应体系进一步包括阳性质控品和阴性质控品。
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